ES2279510T5

ES2279510T5 - Generación de insulina humana.

Info

Publication number: ES2279510T5
Application number: ES95907193T
Authority: ES
Inventors: Jacob R. Hartman; Simona Mendelovitz; Marian Gorecki
Original assignee: Ferring International Center SA; Ferring BV
Current assignee: Ferring International Center SA; Ferring BV
Priority date: 1994-12-29
Filing date: 1994-12-29
Publication date: 2012-01-19
Anticipated expiration: 2014-12-29
Also published as: HK1013594A1; DE69434909D1; BR9408638A; JP4624495B2; ES2279510T3; EP0871474A1; CZ203197A3; DK0871474T4; JPH10511849A; DE69434909T2; EP0871474B1; DK0871474T3; AU698872B2; CA2208095A1; PL180818B1; DE95907193T1; HU223718B1; WO1996020724A1; NZ279002A; HUT78070A

Abstract

SE DESCRIBE UN PROCEDIMIENTO MEJORADO Y EFICAZ PARA LA PRODUCCION DE INSULINA HUMANA RECOMBINANTE MEDIANTE EL PLEGAMIENTO DE UN POLIPEPTIDO HIBRIDO DE PROINSULINA.

Description

Antecedentes de la Invención

A través de esta memoria descriptiva, se hace referencia a varias publicaciones con números arábigos entre paréntesis. Las citas completas de estas referencias pueden encontrarse al final de la memoria descriptiva inmediatamente antes de las reivindicaciones.

La insulina es una hormona de polipéptidos esencial para el control del metabolismo de la glucosa y se administra diariamente a pacientes que padecen diabetes mellitus, un trastorno metabólico que se caracteriza por un suministro inadecuado de insulina.

In vivo, la hormona se sintetiza en primer lugar como una molécula precursora larga, posteriormente se trata para dar forma biológicamente activa, que consiste en una cadena A y una cadena B. Con mayor detalle, el gen de la preproinsulina se transcribe en las células beta del páncreas endocrino para dar un precursor de ARNm, que luego se corta y empalma para producir ARNm maduro. Este ARNm se traduce para dar preproinsulina (NH2-pre-región-cadena B-péptido C-cadena ACOOH), que se trata secuencialmente para obtener proinsulina y finalmente insulina. El primer paso en el tratamiento es la eliminación proteolítica de la pre-región, que sirve como secuencia de señal hidrófoba para la transferencia de la cadena naciente a través de las membranas microsomales del retículo endoplasmático rugoso. En la preproinsulina humana, la longitud de la pre-región es de 24 aminoácidos.

En la proinsulina, las dos regiones de la cadena de polipéptidos que se convertirá en la insulina madura, las cadenas B y A se conectan entre sí mediante el péptido C (o cadena C), que comprende en los extremos terminales N y C dos pares de aminoácidos básicos. En la mayoría de los péptidos C, esos pares son Arg-Arg y Lys-Arg. El péptido C humano, incluidos los dos pares flanqueantes de aminoácidos básicos, contiene 35 aminoácidos. El péptido C conecta a las dos partes del polipéptido con el fin de ayudar a la formación del puente de disulfuro apropiado entre los segmentos B y A. Por lo tanto, el papel del péptido C no depende en gran medida de su estructura. De hecho, su sustitución por un puente sintético más corto todavía permite el plegado adecuado de la molécula de proinsulina (1,2).

La proinsulina se pliega con la oxidación concomitante de dos enlaces de disulfuro entre cadenas y un enlace de disulfuro dentro de la cadena A. En la última fase de maduración, las enzimas proteolíticas se escinden en los aminoácidos básicos para liberar el péptido C y formar la insulina madura (3). En la insulina humana, la cadena A tiene 21 aminoácidos de largo mientras que la cadena B tiene 30 aminoácidos de largo.

La demanda mundial de insulina supera varias toneladas anuales y hay una grave escasez en el suministro. Tradicionalmente, la insulina se producía a partir de fuentes animales limitadas, principalmente preparaciones pancreáticas bovinas y porcinas, que difieren de la insulina humana y pueden provocar una reacción inmunitaria adversa.

Los estudios realizados durante la década de 1960, demostraron la producción in vitro de insulina. La síntesis de la insulina se logró combinando las cadenas A y B y sus formas S-sulfonadas (4) o mediante la reoxidación espontánea de la proinsulina reducida (5). Este último método no era práctico para la producción de insulina a gran escala debido a una concentración muy baja de proteína en la mezcla de oxidación. La insulina podría recuperarse posteriormente siguiendo el tratamiento con tripsina y carboxipeptidasa B (6).

Recientemente se han vuelto disponibles la insulina humana semisintética y biosintética (recombinante). La insulina humana semisintética se produce a partir de insulina porcina mediante el intercambio catalizado por tripsina de alanina con treonina en la posición 30 de la cadena B (la única diferencia entre la insulina porcina y humana). La insulina humana recombinante producida ya sea en E. coli o en levadura sustituirá eventualmente cualquier otra vía de fabricación. La insulina humana recombinante biosintética se fabrica actualmente mediante dos vías: ya sea produciendo las cadenas A y B por separado en E. coli y posteriormente combinándolas (7, 8) o mediante conversión enzimática de polipéptidos similares a la proinsulina expresados ya sea en E. coli (1, 8) o en levadura (2,9).

En la mayoría de los casos la proinsulina se produce como una proteína híbrida que se acumula como proteína intracelular precipitada. Normalmente, este híbrido se purifica y se escinde mediante CNBr con el fin de liberar el polipéptido de proinsulina. Ésta última se modifica adicionalmente mediante sulfitólisis oxidativa para dar S-sulfonato de proinsulina. A continuación, se purifica la S-sulfonato de proinsulina y se pliega, en condiciones reductoras, para dar proinsulina (8). La conversión de la proinsulina para dar insulina se logra mediante la acción combinada de la tripsina y la carboxipeptidasa B (6). La publicación de patente número EP 195691 B1, asignada a Novo Nordisk A/S describe una proinsulina con fórmula B-LysArg-A y el uso de la misma para la preparación de insulina en levadura.

La publicación de patente número EP 196056 B1, asignada a Chiron Corp., describe una proteína de SODh-proinsulina producida por levadura. La proteína de la SODh-proinsulina se somete a escisión con bromuro de cianógeno y sulfitólisis antes del plegado.

Hoechst describe en la publicación EPO número 379162 que “los recombinantes falsos de los precursores de la insulina” (esto es, productos de la insulina recombinante con puentes intermoleculares de sulfuro incorrectos o parcialmente incorrectos) pueden convertirse en productos de insulina “correctos” sin sulfitólisis haciendo reaccionar a los recombinantes falsos con exceso de mercaptano en un medio acuoso en presencia de un sistema redox orgánico. La etapa original de la sulfitólisis se produce después de que el radical de péptido o aminoácido se elimine por escisión (química o enzimáticamente) del polipéptido de fusión (lo que se produce después de la lisis de la célula huésped) debido a que entonces las seis cisteínas del precursor de insulina se convierten en sus S-sulfonatos. En una etapa posterior de renaturalización, se produce proinsulina natural a partir de este S-sulfonato de proinsulina mediante la formación de los tres puentes de disulfuro correctos. Durante esta etapa de renaturalización, se producen los denominados “recombinantes falsos”.

Hoechst describe además, en la publicación internacional PCT número WO 91/03550, un procedimiento para la preparación de proteínas de fusión que contienen una proteína deseada (por ejemplo, proinsulina) y un “constituyente de lastre”. La sulfitólisis se realiza antes del plegado mientras que el “constituyente de lastre” se elimina mediante escisión concomitantemente con la cadena C de la proinsulina después del plegado.

Además, Hoechst describe en el documento EP 347781 B1, una “mini-proinsulina” (B-Arg-A) y el uso de la misma para la preparación de mono-Arg insulina e insulina. Describen además proteínas de fusión que comprenden B-Arg-A y un “constituyente de lastre”. El “constituyente de lastre” se elimina mediante escisión mediante bromuro de cianógeno y la sulfitólisis se realiza antes del plegado del polipéptido.

La invención objeto describe la producción de insulina humana recombinante mediante un procedimiento mejorado y eficaz. Los polipéptidos híbridos de proinsulina recombinante que comprenden una secuencia líder como se definen en las reivindicaciones se sintetizan en E. coli. Después de purificación parcial, se pliegan con el péptido líder todavía unido en condiciones que permiten el plegado correcto. Se produce a continuación insulina humana biológicamente activa mediante el tratamiento combinado con tripsina y carboxipeptidasa B en el que estas enzimas eliminan mediante escisión el péptido líder y la cadena C de manera concomitante. La insulina humana purificada producida de esta manera es idéntica a la insulina humana que se produce en la naturaleza.

Los procedimientos peligrosos y engorrosos implicados en la escisión con CNBr de los polipéptidos híbridos y la sulfitólisis empleada para proteger los grupos SH abundantes se excluyen de este procedimiento novedoso, ya que todo el polipéptido híbrido de proinsulina puede plegarse eficazmente para dar su estructura nativa aun en presencia del péptido líder y los restos no protegidos de cisteína. La insulina humana recombinante activa se libera mediante escisión enzimática y a continuación se purifica.

Breve descripción de las figuras

Los mapas de restricción de los tres plásmidos mostrados en las figuras 3-5 no identifican todos los sitios de restricción presentes en estos plásmidos. Sin embargo, se muestran aquellos sitios de restricción necesarios para un entendimiento completo de la invención.

Figura 1: generación de insulina humana mediante escisión enzimática del polipéptido híbrido de proinsulina plegado, con enlaces disulfuro, producida mediante expresión del plásmido pBAST-R. Sólo se indica parte de la secuencia líder SOD.

Figura 2: generación de insulina humana mediante escisión enzimática del polipéptido híbrido de proinsulina plegado, con enlaces disulfuro, producida mediante expresión del plásmido pDBAST-LAT o el plásmido pλBAST-LAT. Sólo se indica parte de la secuencia líder SOD.

Figura 3: estructura del plásmido pBAST-R, un plásmido de expresión que codifica un polipéptido híbrido de SOD-proinsulina depositado en la ATCC con el número de registro ATCC 69362.

Figura 4: estructura de pDBAST-LAT, un plásmido de expresión que codifica un polipéptido híbrido de SOD-proinsulina depositado en la ATCC con el número de registro ATCC 69361.

Figura 5: estructura de pλBAST-LAT, un plásmido de expresión que codifica un polipéptido híbrido de SOD-proinsulina depositado en la ATCC con el número de registro ATCC 69363.

Figura 6: secuencia de aminoácidos y del nucleótido de ADN correspondiente del polipéptido híbrido de SOD-proinsulina expresados por el plásmido pBAST-R.

Figura 7: secuencia de aminoácidos y del nucleótido de ADN correspondiente del polipéptido híbrido de SOD-proinsulina expresados por los plásmidos pDBAST-LAT y pλBAST-LAT.

Figura 8: producción de insulina humana, a partir del polipéptido híbrido de proinsulina expresado por el plásmido pBAST-R, como función del pH de la mezcla de plegado.

Se realizó el plegado del polipéptido híbrido de insulina (producido tal como se describe en el ejemplo 2) a varios pH tal como se indica en el tampón de glicina 100 mM a 4C durante aproximadamente 16 horas o bien con 1 mg/ml o bien con 0,5 mg/ml del polipéptido híbrido. Se trató el material plegado con tripsina (1:500 p/p) (Sigma) y carboxipeptidasa B (CPB, Sigma, 1:200 p/p) durante 30 minutos a 37C a pH 9 y se sometió a ensayo para determinar la insulina inmunorreactiva (IR) mediante radioinmunoensayo utilizando como patrón 125I-insulina (Amersham) e insulina humana recombinante (Calbiochem).

Figura 9: producción de insulina humana a partir del polipéptido híbrido de proinsulina expresado por el plásmido pDBAST-LAT

Se disolvió el polipéptido híbrido de proinsulina (producido tal como se describe en el ejemplo 2) en urea 8 M, HCl 5 mM a una concentración de aproximadamente 30 mg/ml y se diluyó hasta 1 mg/ml en glicina-NaOH 100 mM, pH 11,0. Se realizó el plegado a 22C (temperatura ambiente) durante 20 horas. Entonces se ajustó la disolución hasta pH 8,8 con HCl. Se añadieron carboxipeptidasa B (1:10000 p/p, Sigma) y tripsina (1:2000 p/p, Sigma) y se incubó la mezcla de reacción a 37C durante 60 minutos. Se acidificaron las mezclas de digestión hasta pH 3 antes de diluirse con HCl 10 mM. Se analizaron alícuotas de 150 µl mediante cromatografía de líquidos de alta resolución en fase inversa (RP-HPLC) en una columna de 250x4 mm, Licroesfera 100 RP-8 de 5µ (Merck) que se equilibró con fosfato de tetraetilamonio 50 mM, NaClO4 162 mM, pH 3, que contenía acetonitrilo al 31,5% (v/v). Se reveló la columna con un gradiente lineal de acetonitrilo al 31,5-40,5% durante 75 minutos a una velocidad de flujo de 1 ml/minuto. Se monitorizó la absorbancia a 220 nm.

A: 5 �g de insulina habitual (Boehringer-Mannheim);

B: insulina humana recombinante producida tras el tratamiento enzimático;

C: polipéptido híbrido de SOD-proinsulina plegado.

Figura 10: producción de insulina humana a partir del polipéptido híbrido de proinsulina expresado por el plásmido pDBAST-LAT como función del pH de la mezcla de plegado

Se diluyó el polipéptido híbrido de proinsulina (producido tal como se describe en el ejemplo 2) hasta 1 mg/ml en tampón de glicina-NaOH 100 mM que tiene los valores indicados de pH y se plegó a 22C durante 16 horas. El tratamiento con enzimas y el análisis mediante RP-HPLC se realizaron tal como se describe en la figura 9. La cantidad de insulina humana recombinante producida a partir del polipéptido híbrido se calculó según el área del pico que tenía el mismo tiempo de retención que la insulina habitual.

Figura 11: Producción de insulina humana a partir del polipéptido híbrido de proinsulina expresado por el plásmido pDBAST-LAT como función de la concentración del ácido ascórbico en la mezcla de plegado

Se realizó el plegado del polipéptido híbrido SOD-proinsulina (producido tal como se describe en el ejemplo 2) a 1 mg/ml en glicina-NaOh 100 mM a 22C, pH 11,2 en presencia de las concentraciones indicadas de ácido ascórbico. Las muestras se trataron con tripsina y carboxipeptidasa B (tal como en la figura 9) tras períodos de plegado de 5 y 25 horas. Se analizó la producción de insulina humana recombinante mediante RP-HPLC (tal como en la figura 9).

Figura 12: Autenticidad de la insulina humana producida a partir del polipéptido híbrido de proinsulina expresado por el plásmido pDBAST-LAT

Se realizó el plegado del polipéptido híbrido de SOD-proinsulina (producido tal como se describe en el ejemplo 2) a 1 mg/ml en glicina-NaOH 100 mM, pH 11,2 y ácido ascórbico 1,2 mM a 22C durante 16 horas. Después del tratamiento enzimático (tal como en la figura 9), se cromatografió la mezcla en una columna de DEAE-Sepharose equilibrada en Tris-HCl 20 mM, pH 8. Se eluyó la insulina humana recombinante con un gradiente lineal de NaCl 0-0,4 M en Tris-HCl 20 mM, pH 8. Se combinaron las fracciones de los picos y se acidificaron con HCl hasta pH 3. Se purificó adicionalmente la insulina humana recombinante de las moléculas similares a la insulina mediante RP-HPLC tal como se describió para la figura 9. Se recogió el pico principal, se eliminaron las sales en una columna Sephadex G-25 en ácido acético 0,25 M y se liofilizó. Se prepararon muestras (5 �g de insulina humana recombinante) se prepararon en HCl 10 mM y se analizaron mediante RP-HPLC en las mismas condiciones.

A: insulina habitual;

B: insulina humana recombinante purificada mediante HPCL;

C: muestra combinada de insulina habitual e insulina humana recombinante purificada mediante HPCL.

Figura 13: Producción de insulina humana a partir del polipéptido híbrido de proinsulina expresado por el plásmido pDBAST-LAT como función de la concentración de proteína en la mezcla de plegado

El polipéptido híbrido de SOD-proinsulina (producido tal como se describe en el ejemplo 2) se plegó a en glicina-NaOH 100 mM, pH 11,2 a una concentración final de proteína de desde 0,5 mg/ml hasta 10 mg/ml según se indique. Cada mezcla de plegado se suplementó con 2,5 moles de ácido ascórbico por mol de grupo SH. El plegado se realizó a 24C (temperatura ambiente) durante 16 horas. El tratamiento enzimático y el análisis RP-HPLC se realizaron tal como se describió para la figura

9.

Figura 14: Producción de insulina humana a partir del polipéptido híbrido de proinsulina expresada por el plásmido pDBAST-LAT a partir del precipitado intracelular crudo como función del tiempo de plegado

Se disolvió el precipitado intracelular en glicina-NaOH 20 mM, EDTA 33 µM, pH 11,2 a una concentración de aproximadamente 2,6 A280 por ml. Se ajustó el pH hasta 12 con hidróxido de sodio 10 N. Se dejó la disolución en agitación durante 10 minutos. Se ajustó el pH hasta 11,2 con ácido clorhídrico concentrado. Se añadió carbón vegetal activado (lavado con ácido, Sigma) hasta la concentración final del 0,1% p/v y se agitó la mezcla durante 30 minutos. Se centrifugó la suspensión (20 min., 12000 rpm) a 20C. El sobrenadante aclarado tenía un A280 de aproximadamente 2,15. Se suplementó ácido ascórbico hasta una concentración final de 3 mM. Se llevó a cabo el plegado del polipéptido híbrido de proinsulina tal como se muestra, con agitación vigorosa a temperatura ambiente (22-23C). En varios puntos de tiempo a lo largo del experimento (a partir de la disolución) se retiraron alícuotas de 10 ml, se ajustaron hasta pH 8,8 y se digirieron con carboxipeptidasa B (1:1000 p/p) y tripsina (1:2000 p/p) durante 1 hora a 37C en presencia de ZnCl2 50 µM. La digestión se terminó mediante acidificación. Se determinó el contenido de insulina en cada muestra digerida mediante análisis de RP-HPLC tal como se describe en la figura 9. El avance de la reacción de plegado se manifiesta en el aumento de insulina (después de la digestión), y la disminución del nivel de grupos tiol libres, sometiéndose estos últimos a ensayo mediante la reacción de Ellman (16).

Breve descripción de la invención

La invención objeto proporciona un método para producir insulina humana tal como se describe en las reivindicaciones que comprende plegar un polipéptido híbrido que comprende proinsulina en condiciones que permiten la formación del enlace de disulfuro correcto, someter al polipéptido híbrido plegado, con enlaces de disulfuro, a escisión enzimática para producir insulina humana activa y purificar la insulina humana activa.

También se describe en el presente documento un polipéptido que comprende proinsulina y un péptido líder unido al extremo N-terminal de la proinsulina, en el que el polipéptido se pliega y contiene los enlaces de disulfuro correctos.

Descripción detallada de la invención

Se depositaron los plásmidos pBAST-R, pDBAST-LAT y p�BAST-LAT en E. coli de acuerdo con, y satisfaciendo, los requisitos del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para Fines de Procedimiento de Patentes con la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, con los números de registro ATCC 69362, 69361 y 69363, respectivamente, el 26 de julio de 1993.

Tal como se usa en el presente documento, un polipéptido híbrido comprende un péptido líder unido covalentemente a un polipéptido deseado. El polipéptido híbrido de la invención objeto comprende proinsulina, y comprende SOD como el péptido líder y es definido en las reivindicaciones.

Tal como se usa en el presente documento, el plegado comprende el plegado de un polipéptido híbrido que comprende proinsulina sin escisión con CNBr antes del plegado y sin sulfitólisis antes del plegado para proteger a los grupos SH, en el que el plegado permite la formación del enlace de disulfuro correcto en el polipéptido híbrido.

Tal como se usa en el presente documento, la formación del enlace de disulfuro correcto del polipéptido híbrido comprende la formación de tres enlaces de disulfuro entre CysB7-CysA7, CysB19-CysA20, y CysA6-CysA11 de la insulina (los restos de Cys se numeran según su numeración en la insulina madura).

Tal como se usa en el presente documento, proinsulina comprende un polipéptido que comprende, en orden desde el extremo N-terminal hasta el extremo C-terminal, las cadenas B, C y A de la insulina.

Tal como se usa en el presente documento, el péptido de cadena C de la insulina comprende el péptido C que se produce de manera natural y cualquier otro oligopéptido, dipéptido o aminoácido individual que puede eliminarse mediante escisión por tripsina y carboxipeptidasa B.

Tal como se usa en el presente documento, un péptido líder comprende un péptido o polipéptido unido covalentemente a la cadena B de la insulina que permite el plegado y la formación de enlace de disulfuro y que puede eliminarse mediante escisión por tripsina. El péptido líder es SOD como se define en las reivindicaciones.

El ADN que codifica SOD puede mutarse mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, Bauer et al. (1985), Gene 37: 73-81.

El péptido líder debe permitir el plegado y la formación del enlace de disulfuro correcto del polipéptido híbrido.

Tal como se usa en el presente documento, la insulina puede comprender un homólogo de insulina que se produce de manera natural.

Tal como se usa en el presente documento, la proinsulina puede comprender un homólogo de proinsulina que se produce de manera natural.

Tal como se usa en el presente documento, el término “homólogo” en relación con el polipéptido de insulina producido mediante los métodos de la invención objeto, es un polipéptido que tiene sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos y sustancialmente la misma actividad biológica que la insulina. Por lo tanto, un homólogo puede diferir del polipéptido de insulina producido mediante los métodos de la invención mediante la adición, deleción o sustitución de uno o más restos de aminoácidos no esenciales, siempre que el polipéptido resultante conserve la actividad biológica de la insulina. Los expertos en la técnica pueden determinar fácilmente qué restos de aminoácidos pueden añadirse, eliminarse o sustituirse (incluso con qué aminoácidos pueden realizase tales sustituciones) usando procedimientos establecidos bien conocidos, incluyendo, por ejemplo, métodos convencionales para el diseño y fabricación de secuencias de ADN que codifican la expresión bacteriana de los homólogos de polipéptido del polipéptido objeto, la modificación del ADNc y las secuencias genómicas mediante técnicas de mutagénesis dirigida al sitio, la construcción de proteínas recombinantes y vectores de expresión, la expresión bacteriana de polipéptidos, y la medición de la actividad bioquímica de los polipéptidos usando ensayos bioquímicos convencionales.

La definición anterior de los homólogos de la insulina se aplica igualmente a los homólogos de la proinsulina.

Son ejemplos de homólogos de insulina producidos por los métodos de la invención sujeto los homólogos por deleción que contienen menos de la totalidad de los restos de la insulina que se produce de manera natural, los homólogos por sustitución en los que uno o más restos especificados se remplazan por otros restos, y homólogos por adición en los que uno o más restos de aminoácidos se añaden a una parte terminal o media del polipéptido de insulina, todos los cuales comparten la actividad biológica de la insulina.

Ejemplos de homólogos son los análogos de insulina descritos en la Solicitud de Patente EPO EP 384472 y también el análogo de insulina “Humalog” de Eli Lilly tal como se describe en “Eli Lilly and Company Report to Shareholders 1992” (“Informe a los Accionistas de Eli Lilly and Company, 1992”).

En el presente documento se define sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos como que abarca sustituciones y/o deleciones y/o adiciones de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos y puede abarcar hasta diez (10) restos según el homólogo o grupos equivalentes tal como se describe, por ejemplo, por Albert L. Lehninger, Biochemistry, segunda edición, Worth Publishers Inc. (1975), Capítulo 4; Creighton, Protein Structure, a Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford, Inglaterra (1989); y Margaret O. Dayhoff, Atlas of Protein Sequence and Structure, Volumen 5, The National Biomedical Research Foundation (1972), Capítulo 9. Tales sustituciones se conocen por los expertos en la técnica.

El ADN que codifica el polipéptido de insulina puede mutarse mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, Bauer et al. (1985), Gene 37: 73-81. La secuencia mutada puede insertarse en vectores de expresión adecuados tal como se describe en el presente documento, que se introducen en las células que a continuación se tratan para que el ADN mutado dirija la expresión del homólogo del polipéptido. Los plásmidos de la invención sujeto que comprenden una secuencia que codifica un polipéptido híbrido que comprende proinsulina pueden adaptarse para la expresión en bacterias que adicionalmente comprenden los elementos reguladores necesarios para la expresión del gen clonado en las bacterias ubicadas en relación con el ácido nucleico que codifica el polipéptido híbrido , con el fin de permitir la expresión del mismo. Los elementos reguladores requeridos para la expresión incluyen secuencias promotoras para unir la ARNpolimerasa y un sitio de unión ribosómica para la unión a ribosomas.

Los plásmidos de la invención objeto expresan un polipéptido híbrido que comprende proinsulina.

Los expertos en la técnica entenderán que los plásmidos depositados en relación con esta solicitud pueden alterarse fácilmente con técnicas conocidas (por ejemplo, mediante mutagénesis dirigida al sitio o mediante inserción de ligadores) para codificar la expresión de los polipéptido homólogos. Tales técnicas se describen, por ejemplo, en Sambrook, J., Fritsch, E.F. y Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Los elementos reguladores adecuados se colocan dentro del plásmido en relación con el ADN que codifica el polipéptido híbrido que comprende a la proinsulina, de tal manera que se realiza la expresión del polipéptido híbrido en una célula huésped adecuada. En las realizaciones preferidas de la invención, los elementos reguladores se colocan cerca y en sentido 5’ del ADN que codifica el polipéptido híbrido.

En la invención objeto también se incluyen varios sitios de enlace ribosómico (RBS) para convertir al ARNm transcrito del ADN que codifica un polipéptido híbrido que comprende proinsulina que puede unirse a ribosomas dentro de la célula huésped, tal como el deo RBS.

Los plásmidos de la invención también contienen un codón de iniciación ATG. El ADN que codifica el polipéptido híbrido que comprende proinsulina se encuentra en fase con el codón de iniciación ATG.

Los plásmidos de la invención también incluyen una secuencia de ADN que comprende un origen de replicación de un plásmido bacteriano que puede replicarse de manera autónoma en la célula huésped. Pueden obtenerse orígenes de replicación adecuados a partir de varias fuentes, tales como del plásmido pBR322 (número de registro ATCC 37017).

Los plásmidos de la invención objeto también incluyen una secuencia de ADN que contiene un gen asociado con un rasgo fenotípico seleccionable o identificable que se manifiesta cuando el plásmido está presente en la célula huésped, tal como un gen de resistencia a fármacos, por ejemplo, resistencia a la ampicilina, clorafenicol o tetraciclina.

Ejemplos de los vectores que pueden usarse para expresar el ácido nucleico que codifica el polipéptido híbrido (que comprende proinsulina) son los virus tales como virus bacterianos, por ejemplo, bacteriófagos (tal como el fago lambda), cósmidos, plásmidos y otros vectores. Los genes que codifican polipéptidos híbridos que comprenden proinsulina se insertan dentro de vectores apropiados mediante métodos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, usando sitios de enzima de endonucleasa de restricción convencionales, los insertos y el vector de ADN pueden escindirse ambos para crear extremos complementarios que se unen mediante pares de bases entre si y luego se ligan entre sí con una ADN ligasa. Alternativamente, los ligadores sintéticos que albergan secuencias de bases complementarias a un sitio de restricción en el ADN del vector pueden ligarse con el ADN de inserto, que entonces se digiere con la enzima de restricción que corta en ese sitio. También están disponibles otros medios.

Las células huésped bacterianas preferidas son células de E. coli. Ejemplos de células de E. coli adecuadas son las cepas S733 (cytRstrA) o 4300, pero también pueden usarse otras cepas de E. coli y otras bacterias como huéspedes para los plásmidos.

Las bacterias usadas como huéspedes pueden ser de cualquier cepa incluyendo cepas auxotróficas (tal como A1645), porotróficas (tal como A4255) y líticas; cepas F+ y F-; cepas que albergan la secuencia represora cI857 del profago λ (tal como A1645 y A4255) y cepas desprovistas de represores deo y/o el gen deo, (véase la Publicación de Solicitud de Patente Europea número 0303972, publicada el 22 de febrero de 1989). La cepa SФ733 de E. coli y la cepa 4300 de E. coli se han depositado con los números de registro ATCC 69361 y 69363, respectivamente.

Todas las cepas huésped de E. coli descritas anteriormente pueden “curarse” de los plásmidos que albergan mediante métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, el método de bromuro de etidio descrito por R.P. Novick en Bateriol. Review 33, 210 (1969).

La invención objeto proporciona un método para producir insulina que comprende (a) tratar una célula bacteriana que contiene ADN que codifica un polipéptido híbrido como se define en las reivindicaciones que comprende proinsulina, de manera que el ADN dirige la expresión del mismo y recuperar el polipéptido híbrido de la célula; (b) plegar dicho polipéptido híbrido que comprende proinsulina sin someter en primer lugar el polipéptido híbrido a sulfitólisis en condiciones que permiten la formación del enlace de disulfuro correcto, en el que dichas condiciones comprenden un pH de aproximadamente 8,5-12,0; (c) someter al polipéptido híbrido plegado, con enlaces de disulfuro, resultante a escisión enzimática para producir insulina; (d) purificar la insulina así producida. La insulina tiene la actividad y las propiedades de la insulina humana comercialmente disponible.

En una realización preferida, el plegado comprende incubar el polipéptido híbrido a aproximadamente 4-37C durante un período de aproximadamente 1-30 horas.

En otra realización preferida, el plegado comprende incubar el polipéptido híbrido a aproximadamente 4-37C durante un período de aproximadamente 1-30 horas a un pH de aproximadamente 8,5-12,0 en presencia de ácido ascórbico.

En una realización especialmente preferida el pH durante el plegado es de 11,0-11,25.

En otra realización especialmente preferida la concentración de ácido ascórbico es de aproximadamente 2 moles por mol de grupo SH presente en la mezcla de plegado. Aún en otra realización el período de incubación es de aproximadamente 5 horas.

En otra realización el sometimiento comprende ajustar el pH hasta aproximadamente 8,8-9,0 y escindir el polipéptido híbrido con tripsina y carboxipeptidasa B a 16-37C durante aproximadamente de 30 minutos a 16 horas.

En otra realización, la purificación comprende cromatografía de DEAE-Sepharose y RP-HPLC.

Aún en otra realización, la purificación comprende además la ultrafiltración y cromatografía de CM-Sepharose.

En una realización especialmente preferida, la purificación comprende además cromatografía de DEAE-Sepharose y cromatografía de fenil-Sepharose.

En una realización especialmente preferida, el polipéptido híbrido se expresa mediante el plásmido pDBAST-LAT depositado con el número de registro ATCC 69361.

En otra realización preferida el polipéptido híbrido se expresa mediante el plásmido pλBAST-LAT depositado con el número de registro ATCC 69363.

En otra realización el polipéptido híbrido se expresa mediante el plásmido pBAST-R depositado con el número de registro ATCC 69362.

En una realización preferida el polipéptido híbrido se obtiene tratando una célula bacteriana que contiene el ADN que codifica el polipéptido híbrido, de tal manera que el ADN dirige la expresión del mismo y recuperando el polipéptido híbrido de la célula.

Se considera que el tratamiento comprenda fermentar en presencia de glucosa, glicerol o galactosa.

Se considera además que la recuperación del polipéptido híbrido de la célula comprenda romper la pared celular de la célula bacteriana o fragmentos de la misma para producir un lisado, aislar el precipitado intracelular del lisado por centrifugación, solubilizar el precipitando y purificar opcionalmente el polipéptido híbrido mediante cromatografía o ultrafiltración.

También se describe en el presente documento un polipéptido que comprende proinsulina y un péptido líder como se define en las reivindicaciones, unido al extremo N-terminal de la proinsulina, en el que el polipéptido está plegado y contiene los enlaces de disulfuro correctos.

El péptido líder es derivado del extremo N-terminal de CuZnSOD.

El péptido líder comprende 62 aminoácidos, estando precedido por el aminoácido Met y seguido por un resto de Arg.

La proinsulina puede comprender la cadena B de insulina unida a la cadena A de insulina mediante un único resto de Arg.

Alternativamente, la proinsulina puede comprender la cadena B de insulina unida a la cadena A de insulina mediante el dipéptido Lys-Arg.

Las dos moléculas de proinsulina anteriores tienen que producirse como proteínas híbridas, de otra manera los niveles de expresión son extremadamente bajos y sin significación comercial.

Los restos de cisteína del péptido son reemplazados por restos de serina.

Ejemplos

Los ejemplos siguientes se especifican para ayudar a entender pero no se pretende que, y no debe interpretarse que, limiten su alcance de ninguna manera. Los ejemplos no incluyen descripciones detalladas de los métodos convencionales empleados en la construcción de vectores, la inserción de genes que codifican polipéptidos en tales vectores o bien la introducción de los plásmidos resultantes en huéspedes. Además, los ejemplos no incluyen la descripción detallada de los métodos convencionales empleados en el ensayo de polipéptidos producidos por tales sistemas de vector huéspedes. Tales métodos se conocen bien por los expertos en la técnica y se describen en numerosas publicaciones, incluyendo a modo de ejemplo la siguiente: Sambrook, J. Fritsch, E.F. y Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Ejemplo 1. Construcción de plásmidos de producción pBAST-R, pDBAST-LAT y pλBAST-LAT que expresan polipéptidos híbridos de SOD-proinsulina

Se fabricaron vectores de expresión bacteriana, que producen en exceso proteínas híbridas en E. coli, bajo el control del promotor deo o bien P1P2 o bien λPL. Se produjo proinsulina como una proteína híbrida, ya que se descubrió que las bacterias que albergaban un vector de expresión que codificaba cadena B de insulina-Lys-Arg-cadena A de insulina no producían un polipéptido detectable. Las proteínas híbridas comprenden un péptido líder, de 62 aminoácidos de largo, derivado del extremo N-terminal de CuZnSOD (11), precedido en el extremo N-terminal por un resto de Met y seguido en el extremo C-terminal por un resto de Arg que lo une a la cadena B de insulina. La cadena B de insulina esta unida a la cadena A de a insulina mediante un péptido de cadena C corta que consta de Lys-Arg o Arg. Las dos cisteínas presentes originalmente en la porción SOD se reemplazaron por restos de serina.

A. Plásmido pBAST-R Se construyó una serie de plásmidos que culminó en el pBAST-R, el cual, después de la transformación de las células huésped de E. coli apropiadas, pudo dirigir la expresión eficaz de un polipéptido híbrido de proinsulina útil para la producción de insulina humana.

En la figura 3 se muestra la estructura del plásmido pBAST-R, que codifica el polipéptido híbrido SOD-cadena B de insulinaLys-Arg-cadena A de insulina; en la figura 6 se muestra la secuencia de ADN y la secuencia de aminoácidos correspondiente del polipéptido híbrido.

El plásmido pBAST-R tiene aproximadamente 4380 pb de largo y comprende los siguientes elementos (en una dirección opuesta a las agujas del reloj):

1.: Un fragmento de ADN, de 1521 pb de largo, que abarca los sitios AatII-MscI en pBR322 que incluye el gen de resistencia a la tetraciclina.

2.: Un fragmento de ADN, de 1497 pb de largo, que abarca los sitios ScaI-HaeII en pBR322 que incluye un gen truncado de resistencia a la ampicilina y el origen de replicación del ADN.

3.: Un fragmento de ADN, de 930 pb de largo, que abarca los sitios AvaII-NdeI en el ADN de E. coli que incluye los promotores deo P1P2 y el sitio de unión ribosómico (RBS) (13).

4.: Un fragmento de ADN, de 188 pb de largo, que abarca los sitios NdeI-PpuMI de ADNc de CuZnSOD humana. Las cisteína que se encuentran en las posiciones 6 y 57 del SOD maduro se sustituyeron con resto de serina mediante mutagénesis de oligonucleótidos dirigida al sitio (12).

5.: Un fragmento de ADN sintético, de 172 pb de largo, con extremos PpuMI y BamHI. Esta región codifica Arg-cadena B de insulina-Lys-Arg-cadena A de insulina.

6.: Un poliligador de sitio de clonación múltiple sintético de 36 pb con extremos BamHI y HindIII.

7.: Un oligonucleótido sintético de 44 pb que contiene el terminador de transcripción TrpA con extremos HindIII y AatII (10).

El plásmido pBAST-R, que confiere resistencia a la tetraciclina y codifica el polipéptido híbrido SOD-cadena B de insulina-LysArg-cadena A de insulina, se introdujo en la cepa SФ733 (cytRstrA) de E. coli y se depósito en el ATCC con el número de registro ATCC 69362 el 26 de julio de 1993.

B. Plásmido pDBAST-LAT Se construyó otra serie de plásmidos que culminó en el plásmido pDBAST-LAT, el cual, después de la transformación de las células huésped de E. coli apropiadas, pudo dirigir la expresión eficaz de alto nivel de un polipéptido híbrido de proinsulina útil para la producción de insulina humana.

En la figura 4 se muestra la estructura del plásmido pDBAST-LAT, que codifica el polipéptido híbrido SOD-cadena B de insulina-Arg-cadena A de insulina; en la figura 7 se muestra la secuencia de ADN y la secuencia de aminoácidos correspondiente del polipéptido híbrido.

El plásmido pDBAST-LAT tiene aproximadamente 4377 pb de largo y comprende los siguientes elementos (en una dirección opuesta a las agujas del reloj):

3.: Un fragmento de ADN, de 930 pb de largo, que abarca los sitios AvaII-NdeI en el ADN de E. coli que incluye los promotores deo P1P2 y el RBS (13).

4.: Un fragmento de ADN, de 188 pb de largo, que abarca los sitios NdeI-PpuMI de ADNc de CuZnSOD humana. Las cisteína que se encuentran en las posiciones 6 y 57 del SOD maduro se sustituyeron con restos de serina y el contenido en GC de este fragmento se redujo hasta el 38% mediante mutagénesis de oligonucleótidos dirigida al sitio (12).

5.: Un fragmento de ADN sintético, de 169 pb de largo, con extremos PpuMI y BamHI. Esta región codifica Arg-cadena B de insulina-Lys-Arg-cadena A de insulina.

6.: Un poli-ligador de sitio de clonación múltiple sintético de 36 pb con extremos BamHI y HindIII.

El plásmido pDBAST-LAT, que confiere resistencia a la tetraciclina y codifica el polipéptido híbrido SOD-cadena B de insulinaArg-cadena A de insulina se introdujo en la cepa SФ733 (cytRstrA) de E. coli y se depósito en el ATCC con el número de registro ATCC 69361 el 26 de julio de 1993.

C. Plásmido pλBAST-LAT Se construyó otra serie de plásmidos que culminó en el plásmido pλBAST-LAT, el cual, después de la transformación de las células huésped de E. coli diseñadas mediante ingeniería genética (que albergaban el represor cI857), pudo dirigir la expresión eficaz de un polipéptido híbrido de proinsulina útil para la producción de insulina humana.

En la figura 5 se muestra la estructura del plásmido pλBAST-LAT, que codifica el polipéptido híbrido SOD-cadena B de insulina-Arg-cadena A de insulina. En la figura 7 se muestra la secuencia de ADN y la secuencia de aminoácidos correspondiente del polipéptido híbrido.

El plásmido pλBAST-LAT tiene aproximadamente 3777 pb de largo y comprende los siguientes elementos (en una dirección opuesta a las agujas del reloj):

3.: Un fragmento de ADN, de 330 pb de largo, que abarca los sitios BamHI-EcoRI en el plásmido pSODα13 (14) que incluye el promotor λPL y un sitio de unión ribosómico de deo de 30 pares de bases de AvrII-NdeI.

5.: Un fragmento de ADN sintético, de 169 pb de largo, con extremos PpuMI y BamHI. Esta región codifica Arg-cadena B de insulina-Arg-cadena A de insulina.

El plásmido pλBAST-LAT, que confiere resistencia a la tetraciclina y codifica el polipéptido híbrido SOD-cadena B de insulinaArg-cadena A de insulina bajo control del promotor �PL se introdujo en la cepa 4300 (F-, bio, cI857) de E. coli y se depósito en el ATCC con el número de registro ATCC 69363 el 26 de julio de 1993.

Las células bacterianas se propagaron a 30C. Se indujo la producción del polipéptido híbrido al cambiar la temperatura hasta 42C.

Ejemplo 2. Fermentación, condiciones de crecimiento y purificación de los polipéptidos híbridos de SOD-proinsulina

I. Cultivos Madre Se hizo crecer el cultivo madre de la cepa SФ733 de E. coli que alberga el plásmido pDBAST-LAT (o pBAST-R) en un medio de caseína (hidrolizado de caseína 20 g/, extracto de levadura 10 g/l y NaCl 5 g/l) suplementado con tetraciclina (10 mg/l). Entonces se diluyeron los cultivos dos veces con medio congelante y se almacenaron a -80C.

Medio congelante: K2HPO4 6,3 g KH2PO4 1,8 g Citrato de Na 0,45 g MgSO4 • 7H2O 0,09 g

(NH4)2SO4 0,9 g Glicerol 44 g Por 500 ml

II. Inóculo El inóculo se propago en el medio de producción (véase a continuación). Se inoculó medio estéril en un matraz de agitación del cultivo madre y se incubó durante 15 horas en un agitador a 37C y aproximadamente 200 r.p.m. Si se requería, se realizaron etapas posteriores en la propagación del inóculo en fermentadores aireados con agitación. Se inoculó el medio estéril con cultivo de matraz al 2-10% y se incubó durante 15 horas a 37C, pH 7±0,5, con agitación y aireación para mantener el nivel de oxígeno disuelto por encima del 20% de la saturación de aire.

III. Producción

Medio de producción: K2HPO4 8 g/L KH2PO4 2 g/L Citrato de Na 2 g/L NH4Cl 3 g/L K2SO4 0,6 g/L FeSO4.7H2O 0,04 g/L MgSO4.7H2O 0,4 g/L CaCl2.2H2O 0,02 g/L Disolución de oligoelementos 3 ml/L Tetraciclina 0,01 g/L Glucosa 2 g/L Glicerol 1 ml/L

Disolución de oligoelementos: MnSO4.H2O 1 g/L ZnSO4.7H2O 2,78 g/L CoCl2.7H2O 2 g/L Na2MoO4.2H2O 2 g/L CaCl2.2H2O 3 g/L CuSO4.5H2O 1,85 g/L H3BO3 0,5 g/L HCl (32%) 100 ml/L

Se inoculó el medio de producción con cultivo de inóculo al 0,5-10% y se incubó a 37C. Las tasas de agitación-aireación se establecieron para mantener el nivel de oxígeno disuelto por encima del 20% de saturación de aire. El pH se mantuvo a 7±0,2 con NH3.

Se infundieron disoluciones estériles de glucosa al 50% y glicerol al 30% para proporcionar energía y fuentes de carbono. Una vez que la concentración celular alcanzó una DO660 de 25, se infundieron disoluciones estériles de glucosa al 10% y glicerol al 30% y el crecimiento continuó durante aproximadamente 5 horas hasta que la concentración celular alcanzó una DO660 aproximada de 60. Entonces se enfrió el cultivo y se recuperaron las células por centrifugación. La fermentación de la E. coli en presencia de uno cualquiera de glucosa, glicerol, galactosa o una combinación de los mismos, como fuente de carbono, facilitó la expresión de los polipéptidos híbridos de SOD-proinsulina.

IV. Purificación Los polipéptidos híbridos de SOD-proinsulina expresados por los plásmidos pBAST-R y pDBAST-LAT se acumularon en el precipitado intracelular que se aisló mediante el siguiente procedimiento: se suspendió 1 g (peso húmedo) de la torta bacteriana en 10 ml de tampón que contenía Tris-HCl 50 mM, pH 8, EDTA 10 mM y se trató con lisozima (Merck, 2500 u/ml) a 37C durante 2 horas. Entonces se sonicó la mezcla y se añadieron Nonidet-P-40 (Sigma) o Triton X 100 hasta una concentración final del 2% y se agitó durante 2 horas a temperatura ambiente. Se sedimentó el precipitado por centrifugación y se lavó con agua.

Se purificó el polipéptido híbrido hasta casi la homogeneidad mediante cromatografía de intercambio aniónico, de la siguiente manera. Se disolvió el precipitado en urea 8 M, Tris-HCl 20 mM, β-mercaptoetanol 200 mM, pH 8,2. Se aclaró la disolución mediante centrifugación y se cromatografió en una columna Fast-Flow con DEAE-Sepharose (Pharmacia LKB), previamente equilibrada en urea 8 M, Tris-HCl 20 mM, β-mercaptoetanol 20 mM, pH 8,2. Se recogió el material de flujo de paso y la proteína híbrida o bien se precipitó con (NH4)2SO4 a una saturación del 40% o bien se concentró por ultrafiltración sobre una membrana de 10 K seguido por una diafiltración contra Glicina-HCl 100 mM, pH 3,1.

Alternativamente, se purificó el polipéptido híbrido de SOD-proinsulina expresado por el plásmido pBAST-R se purificó hasta casi la homogeneidad por disolución en urea 8 M, ditiotreitol 20 mM, acetato de Na 50 mM, pH 5, y por ultrafiltración a través de una serie de membranas de 100 kD y 50 kD (Filtron). Se concentró el polipéptido híbrido en una membrana de 10 kD y se precipitó con (NH4)2SO4 a una saturación del 40%.

Ejemplo 3. Plegado y escisión enzimática de los polipéptidos híbridos de SOD-proinsulina

Se disolvieron los polipéptidos híbridos de proinsulina, obtenidos por la precipitación de (NH4)2SO4 o por ultrafiltración (ejemplo 2), en urea 8 M, HCl 5 mM y se diluyeron en tampón de glicina 100 mM, pH 8,5-12,0 a una concentración final de aproximadamente 1 mg/ml.

A. El plegado del polipéptido híbrido de SOD-proinsulina expresado por el plásmido pBAST-R tuvo lugar a aproximadamente 4-37C durante un período de aproximadamente 1-24 horas con el fin de permitir la formación del enlace de disulfuro correcto.

El pH de la disolución que contenía el polipéptido híbrido plegado, con enlaces de disulfuro, se ajustó hasta aproximadamente 8,8-9,0 con HCl y se trató la proteína con tripsina y carboxipeptidasa B a 16-37C durante 30-120 minutos.

Después de experimentación considerable, se descubrió que las condiciones óptimas eran las siguientes: se disolvió el polipéptido híbrido expresado por el plásmido pBAST-R en urea 8 M, HCl 5 mM y se diluyó en tampón de glicina 100 mM, pH 11,0 (figura 8) a una concentración final de aproximadamente 1 mg/ml, después de lo cual tuvo lugar el plegado del polipéptido híbrido durante 6-16 horas a 25C, a partir de lo cual se escindió el polipéptido híbrido plegado, con enlaces de disulfuro, con tripsina (1:500 p/p) y carboxipeptidasa B (1:200 p/p) a 37C durante 30-60 minutos.

En la figura 1 se muestra esquemáticamente la generación de insulina por segmentación enzimática del polipéptido híbrido de proinsulina plegado, con enlaces de disulfuro, expresado por el plásmido pBAST-R.

B. El plegado del polipéptido híbrido de SOD-proinsulina expresado por el plásmido pDBAST-LAT tuvo lugar a aproximadamente 31C durante un período de aproximadamente 5-30 horas con el fin de permitir la formación del enlace de disulfuro correcto.

Se ajustó el pH de la disolución que contenía el polipéptido híbrido plegado, con enlaces de disulfuro, hasta aproximadamente 8,8-9,0 con HCl y se trató la proteína con tripsina y carboxipeptidasa B a 22-37C durante de 30 minutos a 16 horas.

Después de experimentación considerable, se descubrió que las condiciones óptimas eran las siguientes: se disolvió el polipéptido híbrido expresado por el plásmido pBAST-R en urea 8 M, HCl 5 mM y se diluyó en tampón de glicina 100 mM, pH 11,0-11,25 (figura 8) a una concentración final de aproximadamente 1 mg/ml, después de lo cual tuvo lugar el plegado del polipéptido híbrido durante 5 horas a 25C, a partir de lo cual se escindió el polipéptido híbrido plegado, con enlaces de disulfuro, con tripsina (1:15.000 p/p) y carboxipeptidasa B (1:10.000 p/p) a 25C durante 16 horas.

En la figura 2 se muestra esquemáticamente la generación de insulina por escisión enzimática del polipéptido híbrido de proinsulina plegado, con enlaces de disulfuro, expresado por el plásmido pDBAST-LAT.

Ejemplos de las condiciones específicas tanto para A como para B se detallan en las leyendas de las figuras 8-14.

Ejemplo 4. Análisis de proteínas y purificación de insulina humana a partir del polipéptido híbrido de SOD-proinsulina expresado por el plásmido pBAST-R

La generación de insulina humana a partir del polipéptido híbrido de SOD-proinsulina expresado por el plásmido pBAST-R se determinó mediante radioinmunoensayo y RP-HPLC, utilizando como patrón insulina humana comercial (Calbiochem). El rendimiento teórico de insulina humana recombinante calculado según la secuencia de aminoácidos del polipéptido híbrido de proinsulina es del 45,6%. A partir de la figura 8, es evidente que el plegado óptimo se produce a pH 11. En este valor de pH, la producción de insulina alcanza aproximadamente el 80% del rendimiento teórico (que corresponde a aproximadamente el 40% del polipéptido híbrido de entrada). La insulina humana producida a partir del polipéptido híbrido de proinsulina expresado por el plásmido pBAST-R, se detectó mediante RP-HPLC. Se usó una columna Vydac 218TP54, de 250 x 4,6 mm de DI(Separation Group), 5 �m, tamaño de poro de 300 Å a temperatura ambiente con una velocidad de flujo de 1 ml/min. Se usó como eluyente A ácido trifluoracético (TFA) al 0,1% en H2O y TFA al 0,08% en acetonitrilo como eluyente B. Se lavó la

5 columna durante 5 minutos en el tampón de equilibración (eluyente B al 25%) seguido por un gradiente lineal de eluyente B del 20-50% durante 37,5 minutos. Se monitorizó la absorbancia a 220 nm o a 280 nm. El análisis de la insulina humana después de la digestión enzimática del polipéptido híbrido plegado, con enlaces de disulfuro, usando cromatografía de líquidos de alta resolución en fase inversa reveló un pico principal con el mismo tiempo de retención que la insulina humana habitual.

10 Se prepararon dos lotes a pequeña escala que produjeron, respectivamente, 26 mg y 13 mg de insulina humana. Se purificó la insulina humana de la disolución tratada con enzimas (pH 9) mediante ultrafiltración sobre membranas o bien de 3 K o bien de 5 dK (Filtron) seguida por cromatografía de CM-Sepharose (tampón de citrato, pH 3). Se eliminaron las sales de las fracciones de los picos, se liofilizaron y se sometieron a secuenciación N-terminal y análisis de aminoácidos. La composición de aminoácidos de ambos lotes de insulina humana recombinante era esencialmente idéntica a la insulina humana que se

15 produce de manera natural (véase la tabla 1, preparación 1). Se determinó la secuencia de los 5 aminoácidos del extremo amino-terminal de las preparaciones de insulina se determinó mediante degradación de Edman. Se encontró que era idéntica al extremo NH2-terminal tanto de la cadena A como de la B de insulina humana, lo que confirma la autenticidad del producto in vitro.

20 Sin embargo, los resultados de la secuenciación indicaron la presencia de un resto de Arg suplementario en la primera posición en aproximadamente el 25% de las moléculas. Este resultado corresponde a la escisión mediante tripsina entre Lys y Arg, dentro de la secuencia ligadora Lys-Arg, dejando así un resto adicional de Arg en el extremo amino-terminal de la cadena

A.

25 Se descubrió que la hidrólisis específica en el extremo C-terminal de Arg mediante tripsina puede lograrse realizando una reacción a pH 11. A este pH elevado, la mayoría de los grupos ε-amino de Lys no están cargados (pK = 10,3) permitiendo así la segmentación selectiva. Se obtuvieron dos lotes que produjeron 1 mg y 6,5 mg de insulina purificada llevando a cabo la etapa de tripsina a pH 11 (véase la tabla 1, preparación 2) seguido por la digestión con carboxipeptidasa B a pH 8,5. La secuenciación N-terminal reveló que la cantidad de insulina que comprendía una Arg suplementaria se redujo hasta

30 aproximadamente el 5%.

TABLA 1 Composición de aminoácidos de insulina humana recombinante Las preparaciones 1 y 2 muestran la composición de aminoácidos de la insulina híbrida recombinante producida a partir del polipéptido híbrido de proinsulina expresado por el plásmido pBAST-R. La escisión con tripsina se llevó a cabo o bien a pH 9 (preparación 1) o bien a pH 11 (preparación 2).

Aminoácido: Número de restos

Teóricos: Insulina habitual Preparación 1 Preparación 2

Asx: 3 3,20 3,38 3,26

Thr: 3 2,98 2,83 2,68

Ser: 3 2,84 2,53 2,77

Glx: 7 7,15 7,73 7,23

Pro: 1 1,28 1,13 1,09

Gly: 4 4,24 4,39 4,25

Ala: 1 1,00 1,28 1,04

Cys: 6 5,88 5,11 5,79

Val: 4 3,82 4,58 3,88

Ile: 2 2,04 1,96 1,96

Leu: 6 5,87 6,10 5,99

Tyr: 4 3,80 3,80 3,87

Phe: 3 3,15 3,56 3,03

His: 2 2,04 2,05 2,08

Lys: 1 1,01 1,05 1,02

Arg: 1 0,96 1,30 1,18

5

El análisis de los aminoácidos se realizó después de la oxidación con ácido perfórmico e hidrólisis en fase gaseosa de las preparaciones de insulina purificada.

Ejemplo 5.

10 Análisis de péptidos de insulina humana purificada producida a partir del polipéptido híbrido de SOD-proinsulina expresado por el plásmido pBAST-R

La insulina humana purificada producida tal como se describe en los ejemplos anteriores, se sometió a análisis de péptidos utilizando endoproteinasa Glu-C (Sigma), que hidroliza los enlaces peptídicos en el lado carboxilo de los restos de glutamilo.

15 Con mayor detalle, se digirieron muestras de insulina (100 µg), producidas mediante escisión del polipéptido híbrido de proinsulina plegado, con enlaces de disulfuro, expresado por el plásmido pBAST-R, con 5 µg de Glu-C durante 6 h a 37C en 100 µl de Tris-HCl 0,1 M, pH 7,8. Se realizó el análisis HPLC: se acidificaron muestras de insulina comercialmente disponible (control) e insulina producida mediante escisión del polipéptido híbrido de proinsulina plegado, con enlaces de disulfuro,

20 expresado por el plásmido pBAST-R hasta un pH de aproximadamente 3 y se separaron mediante RP-HPLC. Se usó una columna Vydac 218TP54, de 250 x 4,6 mm de DI, 5 µm, tamaño de poro de 300 Å. Se equilibró la columna con fosfato de tetraetilamonio 50 mM, NaClO4 162 mM, pH 3, que contenía acetonitrilo al 31,5% (v/v) y se desarrolló con un gradiente lineal de acetonitrilo del 35-45% durante 75 minutos a una velocidad de flujo de 1 ml/minuto. Se monitorizó la absorbancia a 220 nm.

25 Se generaron todos los péptidos esperados de acuerdo con la reacción de control aunque un hombro secundario tras el pico correspondiente a uno de los fragmentos está probablemente relacionado con la molécula des-Thr(B30) similar a insulina (15).

Los ejemplos 4 y 5 indican que el polipéptido recombinante expresado por el plásmido pBAST-R comprende la secuencia de la insulina humana que se produce de manera natural. Una parte secundaria de la proteína recombinante producida comprendía

30 formas tales como moléculas Arg(Ao), desamido o des-Thr(B30) similares a insulina.

Estos subproductos no deseados pueden eliminarse mediante procedimientos cromatográficos, tales como RP-HPLC, tal como se describió anteriormente.

35 Ejemplo 6. Análisis de proteínas y purificación de insulina humana producida a partir del polipéptido híbrido de proinsulina expresado por el plásmido pDBAST-LAT

Con el fin de evitar la generación del subproducto de insulina Arg(Ao) (ejemplos 4 y 5), se modificó el plásmido de expresión

40 pBAST-R para comprender ADN que codifica únicamente un resto de Arg entre las cadenas A y B del polipéptido híbrido de proinsulina en oposición a ADN que codifica Lys-Arg entre las cadenas A y B del polipéptido híbrido de proinsulina expresado por el plásmido pBAST-R. Esto dio como resultado plásmidos de expresión pDBAST-LAT (ejemplo 1B) y pλBAST-LAT (ejemplo 1C).

45 La producción eficaz de insulina se produjo después del plegado y el tratamiento enzimático con tripsina y CPB del polipéptido híbrido de proinsulina plegado, con enlaces disulfuro, expresado por el nuevo plásmido de expresión pDBAST-LAT. La presencia de contaminantes similares a la insulina fue baja (figura 9). El plegado fue óptimo a pH 11,25 (figura 10) y mejoró significativamente en presencia de aproximadamente 2 moles de ácido ascórbico por mol de grupo SH en la mezcla de reacción (figura 11).

5 El efecto de la concentración de proteína sobre el rendimiento de insulina producida a partir del polipéptido híbrido de proinsulina se determinó en una serie de reacciones en condiciones de plegado por lo demás óptimas. Se obtuvieron rendimientos óptimos cuando la concentración de proteína no superó 1,5 mg/ml (figura 13).

Se purificó la insulina mediante cromatografía de DEAE-Sepharose seguida por RP-HPLC (tal como se describe en la figura

10 9). Tal como es evidente en la figura 12, la insulina humana recombinante producida tuvo el mismo tiempo de retención que la insulina humana habitual (comercialmente disponible). La composición de aminoácidos de la preparación de insulina humana recombinante purificada es idéntica a la insulina habitual (véase la tabla 2, insulina recombinante).

Obsérvese que la tabla 2 indica que la insulina producida a partir del polipéptido híbrido de proinsulina expresado por el

15 plásmido pDBAST-LAT no tenía un resto de Arg suplementario unido a la cadena A de insulina (Arg(ao)insulina) tal como se describe en el ejemplo 4. Por lo tanto, el plásmido preferido para la producción de insulina es el plásmido pDBAST-LAT y la secuencia preferida para el polipéptido híbrido de proinsulina es la mostrada en la figura 7.

TABLA 2 20 Composición de aminoácidos de la insulina humana recombinante

Aminoácido: Número de restos

Teóricos: Insulina habitual Insulina recombinante

Asx: 3 3,20 3,32

Thr: 3 2,98 2,73

Ser: 3 2,84 2,71

Glx: 7 7,15 7,41

Pro: 1 1,28 1,02

Gly: 4 4,24 4,46

Ala: 1 1,00 1,09

Cys: 6 5,88 5,28

Val: 4 3,82 4,00

Ile: 2 2,04 1,91

Leu: 6 5,87 6,34

Tyr: 4 3,80 3,64

Phe: 3 3,15 3,06

His: 2 2,04 2,18

Lys: 1 1,01 1,02

Arg: 1 0,96 1,07

5

10

15

20

25

30

35

40

Se muestra la composición de aminoácidos de la insulina humana habitual y la insulina humana recombinante producida a partir del polipéptido híbrido de proinsulina expresado por el plásmido pDBAST-LAT.

El análisis de aminoácidos se realizó después de oxidación con ácido perfórmico e hidrólisis en fase gaseosa de las preparaciones de insulina purificada.

Ejemplo 7. Producción de insulina humana a partir del polipéptido híbrido de proinsulina expresado por el plásmido pDBAST-LAT a partir de precipitado intracelular bruto

Se llevó a cabo un método mejorado para plegar y convertir enzimáticamente el polipéptido híbrido de proinsulina para dar insulina usando precipitado intracelular bruto, omitiendo la necesidad de la etapa inicial de purificación tal como se describe en el ejemplo 2, parte IV. La producción eficaz de insulina se produjo después de la escisión enzimática del polipéptido híbrido de proinsulina plegado, con enlaces de disulfuro, con tripsina y carboxipeptidasa B (figura 14 y tabla 3). Se calcularon los rendimientos de insulina como el porcentaje de la concentración de proteína inicial (A280) determinada en la etapa de disolución del precipitado a pH 12 (figura 14). Se mostró que el plegado del polipéptido híbrido de SOD-proinsulina a partir del precipitado intracelular bruto es óptimo a aproximadamente 4,5 horas desde el inicio del experimento (figura 14).

La tabla 3 resume la purificación parcial de la insulina a partir del polipéptido híbrido de proinsulina expresado por el plásmido pBAST-LAT a partir del precipitado intracelular bruto preparado a partir de un litro de cultivo de fermentación a una DO660 de

45. La disolución y plegado se llevaron a cabo tal como se describe para la figura 14. A las 4,5 horas desde la disolución, se ajustó la disolución a granel plegada, que incluía el polipéptido híbrido de proinsulina plegado, con enlaces de disulfuro, hasta pH 8,8 con ácido clorhídrico concentrado. Se añadieron ZnCl2 (hasta 50 µM de concentración final), carboxipeptidasa B (1:4000 p/p) y tripsina (1:6000 p/p). Se realizó la digestión durante 3 horas a 37C y se terminó mediante adición de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) hasta una concentración final de 0,5 mM. El análisis mediante HPLC (tal como se describe en la figura 9) indicó un rendimiento de insulina de 169 mg. Se purificó la insulina mediante una secuencia de etapas de cromatografía de intercambio aniónico e hidrófoba. Se cargó la mezcla de plegado digerida en una columna con DEAE-Sepharose Fast Flow (Pharmacia) previamente equilibrada en tampón de Tris-HCl 20 mM, NaCl 10 mM pH 8, a aproximadamente 50 unidades A280 por ml de resina. Se lavó el material unido con tampón de Tris-HCl 20 mM, NaCl 100 mM, pH 8 y se eluyó la insulina con NaCl 250 mM en el mismo tampón. Las fracciones combinadas que contenían insulina representaron el 20% de la proteína cargada y tenían una pureza del 37,1%. Se añadió sulfato de amonio a la combinación de elución de DEAE hasta una concentración de 410 mM y se cargo en una columna de fenil-Sepharose de Fast Flow previamente equilibrada en Tris-HCl 20 mM, sulfato de amonio 540 mM a aproximadamente 12 unidades A280 por ml de resina. Se lavó el material unido con tampón de equilibración y se eluyó la insulina con tampón de Tris HCl 20 mM, sulfato de amonio 220 mM, pH 8. Las fracciones que contenían insulina representaron el 42,3% de la proteína cargada y tenían una pureza del 74,1%. Como resultado de este procedimiento de purificación parcial, se produjeron 120 mg de insulina, idéntica a la insulina habitual, lo que corresponde a un rendimiento de insulina del 5,16%. Puede llevarse a cabo una purificación adicional de insulina mediante el uso de métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, filtración en gel, RP-HPLC y cristalización (17).

TABLA 3 Purificación de insulina humana recombinante, producida a partir del polipéptido híbrido de proinsulina expresado por el plásmido pDBAST-LAT, tras la disolución de precipitado intracelular bruto, plegado y tratamiento enzimático con tripsina y carboxipeptidasa B.

Etapa de purificación: A280 cantidad mínima de insulina por HPLC - en mg % de pureza

Disolución del precipitado: 2326 - -

Tratamiento con carbón vegetal: 1915 - -

Plegado y tratamiento enzimático: 1915 169 8,8

Combinación de DEAE-Sepharose: 383 142 37,1

imagen1

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

A280 representa la absorbencia total a 280 nm en cada etapa de purificación. Se determinó la presencia de insulina mediante el análisis HPLC con respecto a la insulina habitual tal como se describe para la figura 9 y corresponde al pico principal de insulina de la insulina habitual.

Bibliografía

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2.: Thim, L., Hansen, M.T., Norris, K., Hoegh, I., Boel, E., Forstrom, J., Ammerer, G. and Fiil, N.P., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 83: 6766-6770, 1986.

3.: Davidson, H.W., Rhodes, C.J. and Hutton, J.C., Nature 333: 93-96, 1988.

4.: Panayotis, G., Katsoyannis, G. and Tometsko, A., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 55:1554-1561, 1966.

5.: Steiner, D.F. and Clark, J.L., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 60: 622-629, 1968.

6.: Kemmler, W., Peterson, J.D. and Steiner, D.F., J. Bio. Chem. 246: 6786-6791, 1971.

7.: Goeddel, D.V., Kleid, D.G., Bolivar, F., Heyneker, H.L., Yansura, D.G., Crea, R., Hirose, T., Kraszewski, A., Itakura,

K. and Riggs, A.D., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 76: 106-110, 1979.

8.: Frank, B.H. and Chance, R.E. (1985), The preparation and characterization of human insulin of recombinant DNA origin, in Therapeutic agents produced by genetic engineering, Quo Vadis Symposium, Sanofi Group, May 29-30, 1985, Toulouse-Labege, France, pp: 137-146.

9.: Cousens, L.S., Shuster, J.R., Gallegos, C., Ku, L., Stempien, M.M., Urdea, M.S., Sanchez-Pescador, R., Taylor, A. and TeKamp-Olson, P., Gene 61: 265-275, 1987.

10.: Yanofsky, C., Platt, T., Crawford, I.P., Nichols, B.P., Christie, G.E., Horowitz, H., Van Cleemput, M. and Wu, A.M., Nucleic Acids Res. 9: 6647-6668, 1981.

11.: Sherman, L., Dafni, L., Liehman-Hurwitz, J. and Groner, Y., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 80: 5465-5469, 1983.

12.: Morinaga, Y., Franceschini, T., Inouye, S. and Inouye, M., Biotechnology 2: 636-639, 1984.

13.: Fischer, M., Fytlovitch, S., Amit, B., Wortzel, A. and Beck, Y., Appl. Microbiol. Biotechnol. 33: 424-428, 1990.

14.: Hartman et al., U.S. Patent 5,143,836, September 1, 1992.

15.: Grau, U., Diabetes 34: 1174-1180, 1985.

16.: Ellman, G.L., Arch. Biochem. Biophys. 82: 70-77, 1959.

17.: Schlichtkrull, J., Acta Chem. Scand. 10: 1459-1464, 1956.

LISTA DE SECUENCIAS

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

(i): SOLICITANTES: HARTMAN, JACOB R. MENDELOVITZ, SIMONA GORECKI, MARIAN

(ii): TITULO DE LA INVENCIÓN: GENERACIÓN DE INSULINA HUMANA

(iii) NÚMERO DE SECUENCIAS: 6

(iv): DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:

(A): DESTINATARIO: COOPER & DUNHAM LLP

(B): CALLE: 1185 AVENUE OF THE AMERICAS

(C): CIUDAD: NUEVA YORK

(D): ESTADO: NUEVA YORK

(E): PAÍS: Estados Unidos

(F): CÓDIGO POSTAL: 10036

(v): FORMA LEGIBLE EN ORDENADOR:

(A): TIPO DE MEDIO: Disquete

(B): ORDENADOR: PC IBM compatible

(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

(D): SOFTWARE: Patent In Release #1.0, Versión #1.30

(vi): DATOS ACTUALES DE LA SOLICITUD:

(A): NÚMERO DE SOLICITUD: 95 90 7193.7

(B): FECHA DE PRESENTACIÓN:

(C): CLASIFICACIÓN:

(viii) INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE:

(A): NOMBRE: WHITE, JOHN P.

(B): NÚMERO DE REGISTRO: 28,678

(C) NÚMERO DE REFERENCIA / EXPEDIENTE: 41425-A-PCT-EPO5 (ix) INFORMACIÓN SOBRE COMUNICACIONES TELEFÓNICAS:

(A): TELÉFONO: 212-278-0400

(B): TELEFAX: 212-391-0525

(2) INFORMATION PARA LA SEQ ID NO:1:

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: 10 (A) LONGITUD: 55 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína15 (iii) HIPOTÉTICA: NO

(iv) ANTISENTIDO: NO

imagen2

20 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:2:

(i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 21 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(C): TIPO DE CADENA: sencilla 25 (D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(iii) HIPOTÉTICA: NO

(iv) ANTISENTIDO: NO

(v): TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal30 (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:2:

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:3:

(i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 30 aminoácidos 35 (B) TIPO: aminoácido

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

imagen3

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(iii) HIPOTÉTICA: NO 40 (iv) ANTISENTIDO: NO

19

(v): TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:3:

imagen3

5 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:4:

(i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 54 aminoácidos

(B): TIPO: aminoácido

(C): TIPO DE CADENA: sencilla 10 (D) TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(iii) HIPOTÉTICA: NO

(iv) ANTISENTIDO: NO

(v): TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal15 (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:4:

(A): LONGITUD: 354 pares de bases 20 (B) TIPO: ácido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NO 25 (iv) ANTISENTIDO: NO

(v): TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal

(ix): RASGO:

(A) NOMBRE/CLAVE: CDS

(B) UBICACIÓN: 1..354 30 (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:5:

imagen4

imagen3

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:6:

(i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 352 pares de bases 5 (B) TIPO: ácido nucleico

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

(D): TOPOLOGÍA: lineal

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NO 10 (iv) ANTISENTIDO: NO

(v): TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal

(ix): RASGO:

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

(B) UBICACIÓN: 1..352 15 (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO:6:

imagen3

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para producir insulina que comprende:

(a)tratar una célula bacteriana que contiene ADN que codifica un polipéptido híbrido que comprende un péptido líder covalentemente unido a proinsulina, en el que el péptido líder es SOD derivado del extremo N-terminal de CuZnSOD y comprende 62 aminoácidos, estando precedido por el aminoácido Met y seguido por un resto de Arg en el que los restos cisteína del péptido líder están reemplazados por restos serina de modo que el ADN dirige la expresión del mismo, y recuperar el polipéptido híbrido de la célula;

(b) plegar dicho polipéptido híbrido que comprende proinsulina sin someter en primer lugar al polipéptido híbrido a sulfitólisis en condiciones que permitan la formación del enlace de disulfuro correcto, en el que dichas condiciones comprenden un pH de 8,5-12 a 4 a 37ºC por un período de 1 a 30 horas;

(c)someter el polipéptido híbrido plegado con enlaces de disulfuro resultante a escisión enzimática para producir insulina;

(c)purificar la insulina así producida.
2.

El método según la reivindicación 1 en el que la incubación tiene lugar en presencia de ácido ascórbico.
3.

El método según la reivindicación 2 en el que el pH es de 11,0-11,25.
4.

El método según la reivindicación 2 en el que la concentración de ácido ascórbico es de aproximadamente 2 moles por mol de grupo SH presente en la mezcla de plegado.
5.

El método según la reivindicación 2 en el que el período de incubación es de 5 horas.
6.

Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en el que la etapa (c) comprende además: (i)ajustar el pH a 8,8-9,0; y (ii)escindir el polipéptido híbrido con tripsina y carboxipeptidasa B a 16-37C durante de 30 minutos a 16 horas.
7.

El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en el que la etapa (d) comprende además la purificación mediante:

(i)

cromatografía de DEAE-Sepharose y RP-HPLC;

(ii)

ultrafiltración y cromatografía de CM-Sepharose; o

(iii) cromatografía de DEAE-Sepharose y cromatografía de fenil-Sepharose.
8.

El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 en el que el polipéptido híbrido de proinsulina se expresa por:

(i)

el plásmido pDBAST-LAT depositado bajo el número de registro ATCC 69361;

(ii)

el plásmido p�BAST-LAT depositado bajo el número de registro ATCC 69363; o

(iii) el plásmido pBAST-R depositado bajo el número de registro ATCC 69362.
9.

El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 en el que el tratamiento en la etapa (a) comprende la fermentación en presencia de glucosa, glicerol o galactosa.
10. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 en el que dicha recuperación comprende:

(i)

romper la pared celular de la célula bacteriana o fragmentos de la misma para producir un lisado;

(ii)

aislar el precipitado intracelular del lisado mediante centrifugación; y

(iii) solubilizar el precipitado.