JP5245060B2 - 改善された発現特性を示す改変型ペルオキシダーゼ酵素遺伝子、及びそれを使用したペルオキシダーゼの生産方法 - Google Patents
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Description
(1)以下の(A)または(B)の塩基配列からなることを特徴とするDNA:
(A)配列番号10で示される塩基配列;
(B)配列番号10で示される塩基配列に対して90%以上相同な塩基配列であって、ペルオキシダーゼ酵素活性を持つタンパク質をコードする塩基配列。
(2)以下の(C)〜(G)からなる群より選択されるいずれかのアミノ酸配列をコードするDNAに続いて、(1)に記載のDNAを結合させて得られることを特徴とする融合DNA:
(C)配列番号11で示されるアミノ酸配列;
(D)配列番号12で示されるアミノ酸配列;
(E)配列番号13で示されるアミノ酸配列;
(F)配列番号14で示されるアミノ酸配列;
(G)配列番号15で示されるアミノ酸配列。
(3)(1)または(2)に記載のDNAを発現ベクターに挿入して得られることを特徴とする組換え発現ベクター。
(4)(3)に記載の組換え発現ベクターを微生物に導入して得られることを特徴とする形質転換体。
(5)組換え発現ベクターを導入した微生物が、担子菌門に分類される微生物であることを特徴とする(4)に記載の形質転換体。
(6)組換え発現ベクターを導入した微生物が、クリプトコッカス(Cryptococcus)属に分類される微生物であることを特徴とする(5)に記載の形質転換体。
(7)組換え発現ベクターを導入した微生物が、クリプトコッカスsp.S−2(Cryptococcus sp.S−2)(受託番号FERM BP−10961)であることを特徴とする(6)に記載の形質転換体。
(8)(4)〜(7)のいずれかに記載の形質転換体を培養し、得られた培養物からペルオキシダーゼ酵素活性を持つタンパク質を採取する工程を含むことを特徴とするペルオキシダーゼの生産方法。
(9)(1)または(2)のDNAが発現して得られるペルオキシダーゼ酵素タンパク質であって、糖鎖を含んで52kDa〜65kDaの分子量を有することを特徴とするタンパク質。
(A)配列番号10で示される塩基配列;
(B)配列番号10で示される塩基配列に対して90%以上相同な塩基配列であって、ペルオキシダーゼ酵素活性を持つタンパク質をコードする塩基配列。
(C)配列番号11で示されるアミノ酸配列;
(D)配列番号12で示されるアミノ酸配列:
(E)配列番号13で示されるアミノ酸配列;
(F)配列番号14で示されるアミノ酸配列;
(G)配列番号15で示されるアミノ酸配列。
(i)作用:メディエーター、過酸化水素存在下でペルオキシダーゼ酵素活性を示す。
(ii)分子量:糖鎖を含んで約55kDa(52kDa〜65kDa)である。
(iii)安定pH範囲:pH4.5〜11.0である。
(iv)熱安定性:55℃10分間の熱処理後に90%以上の残存活性を有する。
試験管に1.5mlの1mM ABTS/100mM酢酸ナトリウムバッファー(pH4.5)と1.5mlの5.8mM H2O2水溶液の混合溶液を調製し、25℃で約5分間予備加温する。この反応液に(50mMリン酸緩衝液(pH6.0)/0.1%Triton−X100)で適宜希釈したペルオキシダーゼ酵素溶液0.1mlを添加し緩やかに混和後、水を対象に25℃に制御された分光光度計で、405nmの吸光度変化を5分記録し、直線部分から1分間あたりの吸光度変化(ΔODtest)を測定する。盲検はPOD溶液の代わりにペルオキシダーゼを溶解、希釈する溶液を試薬混液に加えて、同様に1分間あたりの吸光度変化(ΔODblank)を測定する。これらの値から以下の式に従ってペルオキシダーゼ活性を求める。ここで、ペルオキシダーゼ活性における1単位(U)は、pH4.5、25℃条件下で1分間に1マイクロモルのABTSを酸化する酵素量として定義している。
U/ml=(ΔODtest−ΔODblank)×希釈倍率×3.1/(34.7×0.1×1.0)
なお、式中の3.1は反応試薬+酵素溶液の液量(ml)、34.7は本活性測定条件におけるミリモル吸光係数(cm2/マイクロモル)、0.1は酵素溶液の液量(ml)、1.0はセルの光路長(cm)を示す。
ペルオキシダーゼ遺伝子のコドンユーセージの最適化は、クリプトコッカスsp−S−2.の既知の遺伝子であるαアミラーゼ遺伝子、クチナーゼ遺伝子、キシラナーゼ遺伝子のコドンユーセージを参考に行った。最適化された遺伝子配列を配列番号1に示す。
組換え宿主にはクリプトコッカスsp.S−2. U−5株を使用した。本菌株は、形質転換体の選択のために、クリプトコッカスsp.S−2を自然変異によりウラシル要求性にしたものであり、pCsUX2プラスミドと共に独立行政法人酒類総合研究所において取得されたものである。なお、クリプトコッカスsp.S−2からのウラシル要求性株の取得は、クリプトコッカスsp.S−2にUVを照射し、5−フルオロオロト酸を含む培地で培養し、生き残った株を選抜することにより容易に行うことができる。
取得した形質転換体を、3ml液体培地(0.3%酵母エキス、0.3%麦芽エキス、0.5%ペプトン、1.0%グルコース)で25℃、230rpm、48時間培養し、前培養液とした。前培養液0.03mlを3ml液体培地(酵母エキス2%、キシロース5%)に植え継ぎ、25℃、230rpm、72時間培養し、ペルオキシダーゼ活性を確認した。
UXXsHRP(opt)−CTP株形質転換体を10L容ジャーファーメンターを用いて、培地(5%酵母エキス、2%ポリペプトン、5%キシロース、0.1mMヘミン)で25℃、68時間培養した。培養菌体をろ過した後、培養上清を採取し、以下の実験で粗酵素溶液として用いた。
上記の粗酵素溶液から、以下のステップ(1)〜(4)により、組換えペルオキシダーゼを単離精製した。
粗酵素溶液を分画分子量100000の限界濾過膜を透過させ、さらに、分画分子量30000の限界濾過膜で濃縮し、10mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH4.5)に置換して、粗酵素濃縮液を得た。
10mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH4.5)で予め平衡化させたSP−sepharose FastFlowカラムに粗酵素濃縮液を通液して、酵素を吸着させた。カラムを同緩衝液で洗浄したのち、同緩衝液から100mMの塩化ナトリウムを含む10mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH4.5)へのグラジエント溶出法で酵素を溶出させて、活性画分を回収した。
活性画分を、60%硫酸アンモニウム飽和(pH4.5)になるように調整後、遠心分離し、上清を得た。60%飽和硫酸アンモニウムを含む10mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH4.5)で予め平衡化させたOctyl−sepharose FastFlowカラムにこの上清を通液して、酵素を吸着させた。カラムを同緩衝液で洗浄したのち、同緩衝液から10mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH4.5)へのグラジエント溶出法で酵素を溶出させて、活性画分を回収した。
活性画分を分画分子量10000の限界濾過膜で濃縮し、イオン交換水に置換した。粗酵素液から得られた精製酵素の比活性は、約3450U/mgであり、酵素の精製倍率は、粗精製酵素の約460倍であった。
上記5.で単離した精製酵素の特性を評価した。また、対照として、西洋ワサビ由来の野生型ペルオキシダーゼの精製酵素(東洋紡績社製PEO302)についても同様に特性を評価した。
各精製酵素を、50mMクエン酸緩衝液(pH5.5)で20U/ml濃度に調製し、37℃〜65℃の温度で10分間処理し、残存活性を算出した。その結果、西洋ワサビ由来の野生型ペルオキシダーゼの精製酵素は60℃まで90%以上の活性を維持しているのに対して、担子菌組換えペルオキシダーゼ精製酵素は55℃まで90%以上の活性を維持していた。結果を図3に示す。
各精製酵素を、100mM酢酸緩衝液(pH3.5〜5.5)、100mMリン酸カリウム緩衝液(pH5.5〜7.5)、100mMTris−HCl緩衝液(pH7.0〜9.0)、または100mMグリシン−NaOH緩衝液(pH8.5〜11.0)、で140U/ml濃度に調製し、25℃で20分間処理し、残存活性を算出した。その結果、西洋ワサビ由来の野生型ペルオキシダーゼの精製酵素はpH3.5〜11.0の範囲で90%以上の活性を維持しているのに対して、担子菌組換えペルオキシダーゼ精製酵素はpH4.5〜11.0の範囲で90%以上の活性を維持していた。結果を図4に示す。
Nu−PAGE 4−12% Bis−Tris Gel(Invitrogen社製)を用いたSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、各精製酵素の分子量を求めた。また、脱糖鎖酵素(Roche社製、endoglycosidase H)を用いて本発明のペルオキシダーゼを脱糖鎖処理し、同様に電気泳動により、糖鎖除去後の分子量を求めた。結果を図5及び図6に示す。泳動サンプルは以下の通りである。
レーン1:分子量マーカー(Invitrogen社製、Mark12)
レーン2:クリプトコッカスsp.S−2組換えペルオキシダーゼ精製酵素
レーン3:西洋ワサビ由来の野生型ペルオキシダーゼ精製酵素(東洋紡績社製)
レーン4:クリプトコッカスsp.S−2組換えペルオキシダーゼ精製酵素
レーン5:脱糖鎖処理後のクリプトコッカスsp.S−2組換えペルオキシダーゼ精製酵素
レーン6:分子量マーカー(Invitrogen社製、Mark12)
Claims (8)
- 以下の(C)〜(G)からなる群より選択されるいずれかのアミノ酸配列をコードするDNAに続いて、以下の(A)または(B)の塩基配列からなるDNAを結合させて得られることを特徴とする融合DNA:
(A)配列番号10で示される塩基配列;
(B)配列番号10で示される塩基配列に対して90%以上相同な塩基配列であって、ペルオキシダーゼ酵素活性を持つタンパク質をコードする塩基配列;
(C)配列番号11で示されるアミノ酸配列;
(D)配列番号12で示されるアミノ酸配列;
(E)配列番号13で示されるアミノ酸配列;
(F)配列番号14で示されるアミノ酸配列;
(G)配列番号15で示されるアミノ酸配列。 - 請求項1に記載の融合DNAを発現ベクターに挿入して得られることを特徴とする組換え発現ベクター。
- 請求項2に記載の組換え発現ベクターを微生物に導入して得られることを特徴とする形質転換体。
- 組換え発現ベクターを導入した微生物が、担子菌門に分類される微生物であることを特徴とする請求項3に記載の形質転換体。
- 組換え発現ベクターを導入した微生物が、クリプトコッカス(Cryptococcus)属に分類される微生物であることを特徴とする請求項4に記載の形質転換体。
- 組換え発現ベクターを導入した微生物が、クリプトコッカスsp.S−2(Cryptococcus sp.S−2)(受託番号FERM BP−10961)であることを特徴とする請求項5に記載の形質転換体。
- 請求項3〜6のいずれか一項に記載の形質転換体を培養し、得られた培養物からペルオキシダーゼ酵素活性を持つタンパク質を採取する工程を含むことを特徴とするペルオキシダーゼの生産方法。
- 請求項1の融合DNAが発現して得られるペルオキシダーゼ酵素タンパク質であって、糖鎖を含んで52kDa〜65kDaの分子量を有することを特徴とするタンパク質。
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