JP7495083B2 - ペルオキシダーゼの組換え生産 - Google Patents
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Description
項1.
ALG3遺伝子、ALG11遺伝子、及びOCH1遺伝子が破壊された、クリプトコッカス属菌変異株。
項2.
西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼをコードする遺伝子で形質転換されている、項1に記載のクリプトコッカス属菌変異株。
項3.
更にURA5遺伝子、ADE1遺伝子、及び/又はKU70遺伝子が破壊されている、項1又は2に記載のクリプトコッカス属菌変異株。
項4.
SDS-PAGEで測定された分子量が約45kDaである西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼを生産する、項1~3のいずれかに記載のクリプトコッカス属菌変異株。
項5.
クリプトコッカス属菌のALG3遺伝子、ALG11遺伝子、及びOCH1遺伝子を破壊することを含む、クリプトコッカス属菌変異株を製造する方法。
項6.
西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼをコードする遺伝子でクリプトコッカス属菌を形質転換することを更に含む、項5に記載の方法。
項7.
クリプトコッカス属菌が西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼをコードする遺伝子で形質転換されている、項5に記載の方法。
項8.
ALG3遺伝子、ALG11遺伝子、及びOCH1遺伝子を破壊する前に、URA5遺伝子及び/又はADE1遺伝子を破壊することを含む、項5~7のいずれかに記載の方法。
項9.
更に、ALG遺伝子、ADE1遺伝子、及び/又はKU70遺伝子を破壊することを含む、項5~8のいずれかに記載の方法。
項10.
クリプトコッカス属菌変異株が、項1~4のいずれかに記載のクリプトコッカス属菌変異株である、項5~9のいずれかに記載の方法。
項11.
項1~4のいずれかに記載のクリプトコッカス属菌変異株を培養することを含む、西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼを製造する方法。
クリプトコッカス属菌変異株は、ALG3遺伝子、ALG11遺伝子、及びOCH1遺伝子が破壊されていることが好ましい。ALG3遺伝子、ALG11遺伝子、及びOCH1遺伝子が破壊されているとは、これらの遺伝子が発現しない状態を意味する。これらの遺伝子を破壊する手法は任意であり、特に制限されない。一実施形態において、遺伝子破壊は、相同組換えを利用して行うことが好ましく、例えば、特開2015-100327に開示された手法で実施することができる。
クリプトコッカス属菌のALG3遺伝子、ALG11遺伝子、及びOCH1遺伝子を破壊することにより、クリプトコッカス属菌変異株を製造することができる。ALG3遺伝子、ALG11遺伝子、及びOCH1遺伝子、クリプトコッカス属菌、並びに、前記遺伝子を破壊する手法は上述したとおりである。遺伝子の破壊は、西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼをコードする遺伝子で形質転換されているクリプトコッカス属菌に対して行ってもよく、当該形質転換がされていないクリプトコッカス属菌に対しておこなってもよい。後者の場合、遺伝子破壊工程の途中又は遺伝子破壊の後に、西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼをコードする遺伝子でクリプトコッカス属菌を形質転換することができる。
上述の西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼをコードする遺伝子で形質転換されたクリプトコッカス属菌変異株を培養することにより、西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼを製造することができる。
1-1.Cryptococcus sp.S-2株ゲノムDNAの調製
50mlのYM培地(酵母エキス0.3%、麦芽エキス0.3%、ポリペプトン0.5%、グルコース1.0%)を500mL坂口フラスコに入れ、オートクレーブで滅菌し、培地を調製した。予めYMプレート培地で復元したCryptococcus sp.S-2株をYM培地に一白金耳植菌し、25℃、180rpmで2日間振とう培養し、ミラクロス(メルク社製)により濾過することで菌体を取得した。取得した菌体を液体窒素中で凍結破砕し、5mlのフェノール:クロロフォルム:イソアミルアルコール(25:24:1、pH7.2)の混合液を加え、十分に懸濁した後、室温にて3000rpm20分遠心し、水層約4mlを試料とした。本試料を、MagExtoractor―PlantGenome-(東洋紡製)を用いてゲノムDNAを取得した。
1-1.で取得したゲノムDNAをNextera XT Sample prep kit(イルミナ社製)を用いて断片化し、タグメンテーションを実施した。タグメンテーションした断片化されたゲノムDNAをMiseq Reagent kit v2 300サイクル(イルミナ社)を使用して、フローセル上にクラスタリングし、Miseq(イルミナ社)を用いてデータ取得を実施した。取得したFASTQファイルを元に、CLC GENOMICS Workbench Ver7.5を使用し定法にそってデノボアッセンブルを行うことで、Cryptococcus sp.S-2株のホールゲノム情報を取得した。
1-2で取得したホールゲノム情報をもとに、既存の麹菌由来糖鎖合成遺伝子をQueryとしてBLASTサーチを実施し、ALG3遺伝子、ALG11遺伝子、及びOCH1遺伝子の塩基配列を同定した。ALG3遺伝子の塩基配列(配列番号1)並びにゲノムDNA上のその上流及び下流の塩基配列を図1に示す。ALG11遺伝子(配列番号2)並びにゲノムDNA上のその上流及び下流の塩基配列を図2に示す。OCH1遺伝子(配列番号3)並びにゲノムDNA上のその上流及び下流の塩基配列を図3に示す。
組換えペルオキシダーゼ生産菌株であるCryptococcus sp.OC106株を取得した育種過程を図4に示す。まずCryptococcus sp.S-2株を紫外線照射による変位処理に供し、ウラシル要求性となったCryptococcus sp.U5株を取得した。Cryptococcus sp.U5株に対し、特開2015-100327に記載されたPop in-Pop out法によってADE1遺伝子を除去し、Cryptococcus sp.A1U5株を取得した。Cryptococcus sp.A1U5株に対し、相同組換え効率を高めるためにウラシルマーカーをターゲットとしてKU70遺伝子をPop in-Pop out法によって除去し、Cryptococcus sp.AK223株を取得した。Cryptococcus sp.AK223に対し、アデニンマーカーをターゲットとして西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ遺伝子をPop in法によって導入し、Cryptococcus sp.ADE1-PEO株を取得した。Cryptococcus sp.ADE1-PEO株に対し、ALG3遺伝子及びALG11遺伝子をウラシルマーカーをターゲットとしてPop in-Pop out法によって除去し、Cryptococcus sp.AK223(Δalg3、Δalg11)株を取得した。Cryptococcus sp.AK223(Δalg3、Δalg11)株に対し、紫外線照射による変異処理を行って、ペルオキシダーゼの生産性を指標にして、Cryptococcus sp.3u-4P11G株を取得した。Cryptococcus sp.3u-4P11G株に対して、ペルオキシダーゼに付与される糖鎖含有量を指標に、OCH1遺伝子をウラシルマーカーをターゲットとしてPop in法によって破壊し、Cryptococcus sp.OC106株を取得した。
Cryptococcus sp.OC106株をSC(-ura)寒天培地(1.34% Yeast Nitrogen Base w/o Amino acids、0.154%-ura DO supplement、4% D-Glucose、3%寒天粉末)で25℃、3日間培養し、コロニーを取得した。得られたコロニーを60mL液体培地(1%グルファイナル、0.3%バクトイーストエキストラクト、0.5%バクトペプトン、0.3%マルトエキストラクト、0.04%アデアカノールLG-126、0.002%テトラサイクリン塩酸塩)で25℃、48hr培養し、種培養液とした。種培養液を10L容ジャーファーメンターを用いて、生産培地(7%ミーストP1G、0.011%硫酸第一鉄、0.035%ヘムロン2HiWS、0.04%アデカノールLG-126、4.0%キシロース、0.002%テトラサイクリン塩酸塩、50%キシロースを6mL/hrで流加)で25℃、6日間培養した。培養菌体をろ過した後、培養上清を粗酵素溶液として取得した。
(1)濃縮・脱塩
粗酵素溶液を分画分子量100000の限界濾過膜を透過させ、さらに、分画分子量30000の限界濾過膜で濃縮し、10mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH4.5)に置換して、粗酵素濃縮液を得た。
10mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH4.5)で予め平衡化させたSP-sepharose FastFlowカラムに粗酵素濃縮液を通液して、酵素を吸着させた。カラムを同緩衝液で洗浄したのち、同緩衝液から100mMの塩化ナトリウムを含む10mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH4.5)へのグラジエント溶出法で酵素を溶出させて、活性画分を回収した。
活性画分を、60%硫酸アンモニウム飽和(pH4.5)になるように調整後、遠心分離し、上清を得た。60%飽和硫酸アンモニウムを含む10mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH4.5)で予め平衡化させたOctyl-sepharose FastFlowカラムにこの上清を通液して、酵素を吸着させた。カラムを同緩衝液で洗浄したのち、同緩衝液から10mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH4.5)へのグラジエント溶出法で酵素を溶出させて、活性画分を回収した。
活性画分を分画分子量10000の限界濾過膜で濃縮し、イオン交換水に置換した。
試験3で精製した組換えペルオキシダーゼの酵素の特性を評価した。比較対照として、西洋ワサビ由来の野生型ペルオキシダーゼ(東洋紡社製PEO―302)についても同様に特性を評価した。
試験管に1.5mlの1mMABTS/100mM酢酸ナトリウムバッファー(pH4.5)と1.5mlの5.8mM H2O2水溶液の混合溶液を調製し、25℃で約5分間予備加温する。この反応液に(50mMリン酸緩衝液(pH6.0)/0.1%Triton-X100)で適宜希釈したペルオキシダーゼ酵素溶液0.1mlを添加し緩やかに混和後、水を対象に25℃に制御された分光光度計で、405nmの吸光度変化を5分記録し、直線部分から1分間あたりの吸光度変化(ΔODtest)を測定する。盲検はPOD溶液の代わりにペルオキシダーゼを溶解、希釈する溶液を試薬混液に加えて、同様に1分間あたりの吸光度変化(ΔODblank)を測定する。これらの値から以下の式に従ってペルオキシダーゼ活性を求める。ここで、ペルオキシダーゼ活性における1単位(U)は、pH4.5、25℃条件下で1分間に1マイクロモルのABTSを酸化する酵素量として定義している。
U/ml=(ΔODtest-ΔODblank)×希釈倍率×3.1/(34.7×0.1×1.0)
なお、式中の3.1は反応試薬+酵素溶液の液量(ml)、34.7は本活性測定条件におけるミリモル吸光係数(cm2/マイクロモル)、0.1は酵素溶液の液量(ml)、1.0はセルの光路長(cm)を示す。
Nu-PAGE 4-12% Bis-Tris Gel(Invitrogen社製)を用いたSDS-ポリアクリルアミドゲル電気動により、各精製酵素の分子量を求めた。泳動サンプルは以下の通りである。
レーン1:分子量マーカー(Thermo Sientific社製、Benchmark Protein Ladder)
レーン2:PEO-302(東洋紡社製、西洋ワサビ由来の野生型ペルオキシダーゼ精製酵素)
レーン3:rPEO(組換えペルオキシダーゼ精製酵素、ADE1-PEO株由来)
レーン4:rPEO(組換えペルオキシダーゼ精製酵素、Cryptococcus sp.OC106株由来)
20℃から70℃における酵素活性を測定した。その結果は、図6に示すとおり、西洋ワサビ由来の野生型ペルオキシダーゼとCryptococcus sp.OC106株由来の組換えペルオキシダーゼは共に至適温度は45℃であった。
西洋ワサビ由来の野生型ペルオキシダーゼとCryptococcus sp.OC106株由来の組換えペルオキシダーゼを、それぞれ100mM酢酸緩衝液(pH3.0~6.0)、100mMリン酸カリウム緩衝液(pH6.0~8.0)、で1U/ml濃度に調製した後、相対活性を算出した。その結果、図7に示すとおり、西洋ワサビ由来の野生型ペルオキシダーゼとCryptococcus sp.OC106株由来の組換えペルオキシダーゼの至適pHは共にpH6.5の範囲であった。
西洋ワサビ由来の野生型ペルオキシダーゼとCryptococcus sp.OC106株由来の組換えペルオキシダーゼを、それぞれ50mMリン酸カリウム緩衝液(pH6.0)で2U/ml濃度に調製し、37℃~80℃の温度で10分間処理し、残存活性を算出した。その結果、図8に示すとおり、西洋ワサビ由来の野生型ペルオキシダーゼとCryptococcus sp.OC106株由来の組換えペルオキシダーゼは共に50℃まで90%以上の活性を維持していた。
西洋ワサビ由来の野生型ペルオキシダーゼとCryptococcus sp.OC106株由来の組換えペルオキシダーゼを、それぞれ100mM酢酸緩衝液(pH3.5~6.0)、100mMリン酸カリウム緩衝液(pH6.5~8.0)、100mMグリシン-NaOH緩衝液(pH9.0~12.0)、で2U/ml濃度に調製し、25℃で20時間処理し、残存活性を算出した。その結果、図9に示すとおり、西洋ワサビ由来の野生型ペルオキシダーゼとCryptococcus sp.OC106株由来の組換えペルオキシダーゼは共にpH5.0~10.0の範囲で90%以上の活性を維持していた。
過酸化水素の濃度を適宜調整して、各精製酵素のKm値を算出した。結果、図10に示すとおり、西洋ワサビ由来の野生型ぺルオキシダーゼのKm値は1.5mMに対して、Cryptococcus sp.OC106株由来組換えペルオキシダーゼのKm値は1.6mMあり同等であった。
25mM PIPES-NaOH(pH7.5)でCryptococcus sp.OC106株由来の組換えペルオキシダーゼと西洋ワサビ由来の野生型ペルオキシダーゼを10U/mLに調製した後、4℃、1週間および37℃、3週間で保存した。その後、下記の試薬を調製し、5mg/dLクレアチニンを測定した。
25mM PIPES-NaOH(pH7.5)
0.39g/dL EDTA/3Na
3.3g/dL NaCl
1.0g/dL トリトンX-100
50U/mL クレアチンアミジノヒドロラーゼ (東洋紡社製CRH-221)
12U/mL ザルコシンオキシダーゼ (東洋紡社製SAO-351)
25mM PIPES-NaOH(pH7.5)
0.25g/dL NaN3
0.045g/dL Potassium Ferrocyanade
1.0g/dL トリトンX-100
300U/mLクレアチニンアミドヒドロラーゼ(東洋紡社製CNH-311)
0.0~1.2U/mLペルオキシダーゼ
Claims (4)
- ALG3遺伝子、ALG11遺伝子、及びOCH1遺伝子が破壊され、且つ配列番号10の塩基配列と90%以上の同一性を有する西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼをコードする遺伝子で形質転換されている、クリプトコッカス属菌変異株。
- クリプトコッカス属菌のALG3遺伝子、ALG11遺伝子、及びOCH1遺伝子を破壊すること、及び配列番号10の塩基配列と90%以上の同一性を有する西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼをコードする遺伝子でクリプトコッカス属菌を形質転換することを含む、クリプトコッカス属菌変異株を製造する方法。
- クリプトコッカス属菌のALG3遺伝子、ALG11遺伝子、及びOCH1遺伝子を破壊することを含み、前記クリプトコッカス属菌が配列番号10の塩基配列と90%以上の同一性を有する西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼをコードする遺伝子で形質転換されている、クリプトコッカス属菌変異株を製造する方法。
- 請求項1に記載のクリプトコッカス属菌変異株を培養することを含む、西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼを製造する方法。
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