JP6198997B1 - 新規グルコースデヒドロゲナーゼ - Google Patents
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Abstract
Description
以下の発明は、以上の成果及び考察に基づく。
[1]以下の特徴を備える、グルコースデヒドロゲナーゼ:
(1)作用: 電子受容体存在下でグルコースの水酸基を酸化してグルコノ−δ−ラクトンを生成する反応を触媒する;
(2)基質特異性: D-グルコースに対する反応性を100%としたときのD-キシロースに対する反応性が10%以下である;
(3)pH安定性: pH5〜8で安定である;
(4)アミノ酸配列: 配列番号1に示すアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と83%以上同一のアミノ酸配列を含む。
[2]アミノ酸配列が、配列番号1に示すアミノ酸配列と90%以上同一のアミノ酸配列である、[1]に記載のグルコースデヒドロゲナーゼ。
[3]以下の特徴を備える、グルコースデヒドロゲナーゼ:
(1)作用: 電子受容体存在下でグルコースの水酸基を酸化してグルコノ−δ−ラクトンを生成する反応を触媒する;
(2)基質特異性: D-グルコースに対する反応性を100%としたときのD-キシロースに対する反応性が10%以下である;
(3)pH安定性: pH5〜8で安定である;
(4)分子量: 約60kDa(SDS-PAGEによる)。
[4]下記の酵素化学的性質を更に有する、[3]に記載のグルコースデヒドロゲナーゼ:
(5)至適pH: 7.0;
(6)至適温度: 50℃;
(7)温度安定性: 20℃〜50℃の範囲で安定(pH5.0、1時間)。
[5]基質特異性が、D-グルコースに対する反応性を100%としたときのD-キシロースに対する反応性が8%以下である、[1]〜[4]のいずれか一項に記載のグルコースデヒドロゲナーゼ。
[6]アスペルギルス・イイズカエに由来する酵素である、[1]〜[5]のいずれか一項に記載のグルコースデヒドロゲナーゼ。
[7]アスペルギルス・イイズカエがアスペルギルス・イイズカエNBRC 8869株である、[6]に記載のグルコースデヒドロゲナーゼ。
[8]以下の(A)〜(C)からなる群より選択されるいずれかのDNAからなるグルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子:
(A)配列番号1に示すアミノ酸配列をコードするDNA;
(B)配列番号2に示す塩基配列からなるDNA;
(C)配列番号2に示す塩基配列と等価な塩基配列を有し、且つグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA。
[9][8]に記載のグルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子を含む組換えDNA。
[10][9]に記載の組換えDNAを保有する微生物。
[11]以下のステップ(1)及び(2)、或いは以下のステップ(i)及び(ii)を含む、グルコースデヒドロゲナーゼの製造法:
(1)アスペルギルス・イイズカエNBRC 8869株を培養するステップ;
(2)培養後の培養液及び/又は菌体より、グルコースデヒドロゲナーゼを回収するステップ;
(i)[10]に記載の微生物を、前記遺伝子がコードするタンパク質が産生される条件下で培養するステップ;
(ii)産生された前記タンパク質を回収するステップ。
[12][1]〜[7]のいずれか一項に記載のグルコースデヒドロゲナーゼを用いて試料中のグルコースを測定することを特徴とする、グルコース測定法。
[13][1]〜[7]のいずれか一項に記載のグルコースデヒドロゲナーゼを含む、グルコース測定用試薬。
[14][13]に記載のグルコース測定用試薬を含む、グルコース測定用キット。
[15][1]〜[7]のいずれか一項に記載のグルコースデヒドロゲナーゼを含む、グルコースセンサ。
[16][1]〜[7]のいずれか一項に記載のグルコースデヒドロゲナーゼを含有する酵素剤。
本明細書において用語「単離された」は「精製された」と交換可能に使用される。用語「単離された」は、天然の状態、即ち、自然界において存在している状態のものと区別するために使用される。単離するという人為的操作によって、天然の状態とは異なる状態である、「単離された状態」となる。単離されたものは、天然物自体と明確且つ決定的に相違する。
本発明の第1の局面はグルコースデヒドロゲナーゼ及びその生産菌を提供する。本発明のグルコースデヒドロゲナーゼ(以下、「本酵素」ともいう)は以下の特性を備える。まず、本酵素は次の反応、即ち、電子受容体存在下でグルコースの水酸基を酸化してグルコノ−δ−ラクトンを生成する反応を触媒する。一方、本酵素は基質特異性に優れ、D-グルコースに対して選択的に作用する。詳しくは、本酵素はD-キシロースに対する反応性が低い。具体的にはD-グルコースに対する反応性を100%としたときのD-キシロースに対する反応性が10%以下である。好ましくは当該反応性が8%以下である。更に好ましくは当該反応性が7%以下である。
本発明の第2の局面は本酵素に関連する核酸を提供する。即ち本酵素をコードする遺伝子、本酵素をコードする核酸を同定するためのプローブとして用いることができる核酸、本酵素をコードする核酸を増幅又は突然変異等させるためのプライマーとして用いることができる核酸が提供される。一態様において本発明の遺伝子は、配列番号1のアミノ酸配列をコードするDNAからなる。当該態様の具体例は、配列番号2に示す塩基配列からなるDNAである。
本発明の更なる局面はグルコースデヒドロゲナーゼの製造法を提供する。本発明の製造法の一態様では、アスペルギルス・イイズカエNBRC 8869株を培養するステップ(ステップ(1))及び培養後の培養液及び/又は菌体より、グルコースデヒドロゲナーゼを回収するステップ(ステップ(2))が行われる。
本発明の更なる局面は本酵素の用途に関する。この局面ではまず、本酵素を用いたグルコース測定法が提供される。本発明のグルコース測定法では本酵素による酸化還元反応を利用して試料中のグルコース量を測定する。この反応による変化が利用できる各種用途に本発明を適用可能である。
公的機関から入手した保存菌株や自然界から入手した菌株を含む13,000株を培養して得られた培養液を試料として、以下の条件、即ち、グルコースデヒドロゲナーゼ活性が高いこと、マルトースに反応しないこと、キシロースへの反応性が低いこと、及びグルコースオキシダーゼ活性を示さないこと、を満たすものを以下の方法で選出した。
(測定試液)
100 mmol/L PIPES cont. 0.1%(w/v) Triton X-100 pH 7.0: 24mL
3 mmol/L 1-Methoxy PMS(Phenazine methanesulfate): 2mL
6.6 mmol/L NTB(Nitrotetrazorium blue): 1mL
1 mol/L グルコース: 3mL
サンプルを20μLずつ96wellプレートに分注後、測定試液を1ウェルあたり200μLずつ添加し、37℃、60分後、570nmの吸光度をプレートリーダーで測定した。上記測定試液のうち、グルコースをマルトース又はキシロースへ変更して同様に測定し、マルトース、キシロースへの反応性も確認した。
(測定試液)
100 mmol/L PIPES cont. 0.1%(w/v) Triton X-100 pH 7.0: 23mL
5g/dL フェノール試液: 0.5mL
25u/mL PO“Amano”3(天野エンザイム株式会社)溶液: 3mL
0.5g/dL 4-アミノアンチピリン試液: 0.5mL
1 mol/L グルコース: 3mL
サンプルを20μLずつ96wellプレートに分注後、測定試液を1ウェルあたり200μLずつ添加し、37℃、60分後、500nmの吸光度をプレートリーダーで測定した。
以上の検討によって見出された、Aspergillus iizukae No.5453株の生産するグルコースデヒドロゲナーゼについて、その精製酵素を取得すべく、Aspergillus iizukae No.5453株を以下の培地で30℃、5日間培養した。得られた培養液から菌体を除去し、粗酵素液とした。
(培地)
グルコース: 15.0%(w/v)
酵母エキス: 3.0%(w/v)
大豆ペプトン: 6.0%(w/v)
KH2PO4: 0.3%(w/v)
K2HPO4: 0.2%(w/v)
ヒドロキノン(pH6.0): 4mM
上記2.で得た精製酵素の基質特異性を調べた。
(活性測定方法)
FAD-GDHは、電子受容体存在下でグルコースの水酸基を酸化してD-グルコノ-δ-ラクトンを生成する反応を触媒する。FAD-GDH活性の測定は下記の反応系で行った。
上記2.で得た精製酵素のpH安定性を調べた。1 U/mLになるように酵素液を各種pHの緩衝液で調製後、37℃、1時間加温処理した。その後、測定に用いる緩衝液で希釈し、上記3.と同じ方法で残存活性を測定した。
目的の酵素の活性ピークであるフラクションNo.34をSDS-PAGEで分離して得られたバンドについて、常法に従い、PVDF膜へブロッティングした後、N末アミノ酸解析を実施したところ、約60KDaのタンパク質(図1、矢印)で「SSSYDYIVIGGGTSGLTVAN(配列番号3)」の配列情報が得られた。同配列を問い合わせ配列として、NCBIが提供するBLAST解析を実施したところ、グルコースデヒドロゲナーゼである可能性が高いことが判明した。BLAST解析結果を図3に示す。
(i)電気泳動後のゲル試料を適当な大きさに切断する。
(ii)2-メルカプトエタノール及び4−ビニルピリジンを用いて還元アルキル化処理。
(iii)緩衝液(0.1mol/L炭酸水素アンモニウム)中でプロメガ社製Sequencing Grade Modified Trypsinを用いて消化後、ゲルからペプチド断片を抽出する。
高速液体クロマトグラフ(HPLC): LC-20Aシステム(株式会社島津製作所)
カラム: Cadenza CD-C18(2.0mmI.D.×150mm)(インタクト株式会社)
カラム温度: 50℃
検出波長: 214mm
注入量: 70μL
移動相流速: 0.2mL/min
移動相A: 水/トリフルオロ酢酸(1000/1)
移動相B: アセトニトリル/水/トリフルオロ酢酸(800/200/1)
上記5.で得られたN末アミノ酸解析結果とピークNo.5のアミノ酸解析結果に基づき、以下のプライマーを設計した。
プライマーGDH5453-F:TAYGAYTAYATHGTNATHGGNGGNGGNACNWSNGG(配列番号4)
プライマーGDH5453-5-1-R:NSWNGCDATRTGNACRTTNCC(配列番号5)
(反応液)
PrimeSTAR Max Premix(2×) 25μL
GDH5453-F 15 pmol
GDH5453-5-1-R 15 pmol
ゲノムDNA(1/1000希釈) 1μL
滅菌蒸留水で50μLに調整
(サイクル条件)
98℃で10秒、55℃で15秒、72℃で2分の条件で35サイクル
プライマーFS51R07F:AACCGTCTGTCTGAAGACCC(配列番号7)
プライマーFS51R07R:TACTTCCTTTTGCTCG(配列番号8)
Aspergillus iizukae No.5453株の生産するグルコースデヒドロゲナーゼの遺伝子配列がタカアミラーゼ改変CS3プロモーターとアスペルギルス・オリゼ由来FAD依存性グルコースデヒドロゲナーゼのターミネーター遺伝子の間に配置された発現カセットと、アスペルギルス・オリゼ由来オロチジン5'-リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子(pyrG遺伝子)がpUC19に挿入された発現プラスミドpUCPGDH5453を構築した。構築した発現プラスミドを用いて、アスペルギルス・オリゼRIB40のpyrG遺伝子欠損株をプロトプラスト-PEG法で形質転換した。ウリジン要求性を利用して形質転換株を取得した。可溶性でんぷんをC源にタカアミラーゼ誘導条件下で形質転換株を液体培養し、組換え酵素を含む培養液を回収した。回収した培養液を各種精製(塩析、疎水結合クロマト、イオン交換クロマトなど)し、精製酵素を取得した。精製酵素の各種特性を評価した。
2 U/mLの酵素液を各種pHの緩衝液で調製後、37℃、1時間加温処理した。その後、測定に用いる緩衝液で希釈し、残存活性を測定した。測定結果を図6に示す。精製酵素は、37℃、1時間処理において、pH3〜10で高い安定性を示した(残存活性が70%以上)。
使用する緩衝液を各種pHの緩衝液に置き換えて活性を測定し、至適pHを確認した。測定結果を図7に示す。酵素反応の至適pHは7.0であった。
各温度で活性を測定し、至適温度を確認した。測定結果を図8に示す。酵素反応の至適温度は50℃であった。
50mM 酢酸-NaOH(pH5.0)で2U/mLの酵素液を調製後、各温度で1時間加温処理した。処理後すぐに氷中に保存し、残存活性を測定した。測定結果を図9に示す。加温処理の温度が50℃以下であれば、高い安定性を示した(残存活性が80%以上)。
Claims (12)
- 以下の特徴を備える、グルコースデヒドロゲナーゼ:
(1)作用: 電子受容体存在下でグルコースの水酸基を酸化してグルコノ−δ−ラクトンを生成する反応を触媒する;
(2)基質特異性: D-グルコースに対する反応性を100%としたときのD-キシロースに対する反応性が10%以下である;
(3)pH安定性: pH5〜8で安定である;
(4)アミノ酸配列: 配列番号1に示すアミノ酸配列、又は該アミノ酸配列と90%以上同一のアミノ酸配列を含む。 - アスペルギルス・イイズカエに由来する酵素である、請求項1に記載のグルコースデヒドロゲナーゼ。
- アスペルギルス・イイズカエがアスペルギルス・イイズカエNBRC 8869株である、請求項2に記載のグルコースデヒドロゲナーゼ。
- 以下の(A)〜(C)からなる群より選択されるいずれかのDNAからなるグルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子:
(A)配列番号1に示すアミノ酸配列をコードするDNA;
(B)配列番号2に示す塩基配列からなるDNA;
(C)配列番号2に示す塩基配列と90%以上同一の塩基配列を有し、且つグルコースデヒドロゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA。 - 請求項4に記載のグルコースデヒドロゲナーゼ遺伝子を含む組換えDNA。
- 請求項5に記載の組換えDNAを保有する微生物。
- 以下のステップ(1)及び(2)、或いは以下のステップ(i)及び(ii)を含む、グルコースデヒドロゲナーゼの製造法:
(1)アスペルギルス・イイズカエNBRC 8869株を培養するステップ;
(2)培養後の培養液及び/又は菌体より、グルコースデヒドロゲナーゼを回収するステップ;
(i)請求項6に記載の微生物を、前記遺伝子がコードするタンパク質が産生される条件下で培養するステップ;
(ii)産生された前記タンパク質を回収するステップ。 - 請求項1〜3のいずれか一項に記載のグルコースデヒドロゲナーゼを用いて試料中のグルコースを測定することを特徴とする、グルコース測定法。
- 請求項1〜3のいずれか一項に記載のグルコースデヒドロゲナーゼを含む、グルコース測定用試薬。
- 請求項9に記載のグルコース測定用試薬を含む、グルコース測定用キット。
- 請求項1〜3のいずれか一項に記載のグルコースデヒドロゲナーゼを含む、グルコースセンサ。
- 請求項1〜3のいずれか一項に記載のグルコースデヒドロゲナーゼを含有する酵素剤。
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