JP5231777B2 - アポトーシス誘導作用を呈するテルペン誘導体及びその製造方法 - Google Patents

Description

この発明は、酸化還元電位がマイナス１ｍＶ〜マイナス６００ｍＶであるアポトーシス誘導作用を呈するテルペン誘導体及びその製造方法に関するものである。

癌は、日本人の死因の第一であり、１年間に約３０万人が癌により死亡し、また、医療費負担の原因となっている。このため、医師、製薬業界をはじめ厚生労働省や健康保健業界などが癌を解決すべく、様々な対策と研究開発を実施している。

さらに、癌に対する薬物治療として、種々の抗癌剤が開発され、癌細胞の増殖を抑制する作用、癌を分化させる作用、免疫力を回復させる作用、癌血管新生の抑制作用を持つ医薬品が開発され、病院などの医療現場でも利用されている。

このうち、癌細胞に特有に働く作用を持つ物質が望まれている。化学合成した抗癌剤の多くが増殖する正常細胞にも作用することにより、重篤な副作用が発症することが問題となっている。たとえば、シスプラチンや５−ＦＵは抗癌作用が強いものの、その副作用も重篤で、嘔吐、貧血、免疫低下、感染症などが発現する結果、抗癌剤の使用量と使用期間が制限されている。

癌細胞に特異的に作用するメカニズムとして、アポトーシスがある。アポトーシスとは癌細胞自己が自殺するように、癌細胞のＤＮＡが粉々に分解されて癌細胞が自然に死滅する現象であり、副作用は少ない。したがって、癌細胞に特異的にアポトーシスを誘発させる薬剤や天然物の探索が進められている。

アポトーシスを誘発する天然物、植物やハーブ由来の発明としては、ポリコ酸Ａ（化合物１）、ポリコ酸Ｂ（化合物２）、ポリコ酸Ｇ（化合物３)、ポリコ酸Ｈ（(化合物４)、デヒドロエブリコン酸（化合物５）、ツムロシン酸（化合物６）、デヒドロツムロシン酸（化合物７）及び３−エピデヒドロツムロシン酸（化合物８）からなる群から選んだ少なくとも１種のトリテルペン化合物を有効成分とすることを特徴とする、ＤＮＡ合成酵素及びＤＮＡトポイソメラーゼ阻害性組成物に関する発明がある（例えば、特許文献１参照。）。

また、異常増殖等を引き起こした滑膜細胞のアポトーシスを誘導し、その異常な増殖を抑制しうる薬剤に関する発明が報告されている（例えば、特許文献２参照。）。

アポトーシスに関する発明としては、ジテルペン化合物、ジテルペン化合物の有効量を含んでなる組成物がある（例えば、特許文献３参照。）。

また、１つまたは複数の単離されたトリテルペン・グリコシドを含む混合物、ａ）アカシア・ビクトリアエ（Ａｃａｃｉａ ｖｉｃｔｏｒｉａｅ）の組織から単離可能、 ｂ）分子量が約１８００〜２６００の範囲のトリテンペン・グリコシドをすくなくとも１つ含む、 ｃ）Ｊｕｒｋａｔ細胞に対して細胞毒性を誘発する能力、そして、ｄ）Ｊｕｒｋａｔ細胞に対してアポトーシスを誘発する能力の発明がある（例えば、特許文献４参照。）。

さらに、テルペン誘導体については、マスリン酸、エリトロジオール、ウバオール、ベツリン、それらの生理的に許容される塩及びそれらの誘導体からなる群より選ばれる化合物を有効成分として含有するアポトーシス誘導剤が報告されているものの、原料は柿の葉または松葉ではなく、また、還元作用や酸化還元電位についても言及されていない（例えば、特許文献５参照。）。

ＩＶ型アレルギー反応が関与する炎症の予防乃至治療用組成物の発明があり、柿の葉由来のテルペンについてアレルギーに対する改善作用があるものの、この発明では癌に対する作用については言及されていない。（例えば、特許文献６参照。）。

一方、アポトーシス誘発作用を有する柿の葉または松葉由来のテルペン誘導体は、還元作用が特徴であり、トリペプチドとの結合が構造的な特徴であり、かつ、発酵と還元処理を製造上の特徴とする製造方法について発明したので、以下に説明する。
特開２００５−８９３２８ 特開２００４−１６８７１３ 特表２００６−５１５２９２ 特表２００２−５１５４３０ ＷＯ２００３／０５７２２４ 特開２００４−１０５３１

前記したように化学合成されたシスプラチンや５−ＦＵなどの抗癌剤には重篤な副作用が存在し、患者のＱＯＬを低下させ、使用量と使用期間を限定させているという問題がある。

一方、天然由来の物質についてその安全性は高いものの、アポトーシス作用が軽度であるという問題がある。そこで、副作用が弱く、アポトーシス作用の優れた天然物由来物質が望まれている。

この発明は上記のような従来技術に存在する問題点に着目してなされたものである。その目的とするところは、副作用が弱く、優れたアポトーシス誘導作用を呈するテルペン誘導体を提供することである。

また、柿の葉粉末または松葉粉末に大豆粉末及び納豆素本舗製の納豆菌を添加し、発酵させた発酵液をアルカリ還元させる工程からな効率的なアポトーシス誘導作用を呈するテルペン誘導体の製造方法を提供することである。

上記の目的を達成するために、請求項１に記載の発明は、酸化還元電位がマイナス１ｍＶ〜マイナス６００ｍＶである下記の式（１）で示されるアポトーシス誘導作用を呈するテルペン誘導体に関するものである。

請求項２に記載の発明は、柿の葉粉末または松葉粉末に大豆粉末及び納豆素本舗製の納豆菌を添加し、発酵させた発酵液をアルカリ還元させる工程からなる請求項１に記載のアポトーシス誘導作用を呈するテルペン誘導体の製造方法に関するものである。

この発明は、以上のように構成されているため、次のような効果を奏する。

請求項１に記載のテルペン誘導体によれば、副作用が弱く、優れたアポトーシス誘導作用が発揮される。

請求項２に記載の製造方法によれば、効率良くテルペン誘導体を得ることができる。

以下、この発明を具体化した実施形態について詳細に説明する。

まず、酸化還元電位がマイナス１ｍＶ〜マイナス６００ｍＶである下記の式（１）で示されるアポトーシス誘導作用を呈するテルペン誘導体について説明する。

ここでいうテルペン誘導体とは、トリテルペン類に属し、かつ、水酸基に、トリペプチドがエステル結合している構造を示し、前記の式（１）で示される。

また、前記の式（１）で示されるテルペン誘導体は、ＳＨ基を有しているという特徴を有する。

さらに、水酸基に結合しているトリペプチドは、システインとグリシンとシステインであり、ペプチド結合により結合している。さらに、システインのカルボキシル基とテルペン骨格の水酸基がエステル結合している。

このテルペン誘導体は、テルペノイドとしての骨格による脂溶性とトリペプチドによる水溶性の両者の性質を呈することから、腸管からの吸収や皮膚からの吸収が高く、血中に移行しやすいという薬理学的特徴を有することから、好ましい。

このテルペン誘導体は、細胞膜に働き、脂溶性と水溶性の両方の性質を持ちつつ、細胞の核内やミトコンドリア内に侵入でき、標的部位に働くことができることから、吸収、動態に優れている点から好ましい。

また、このテルペン誘導体は、過剰に摂取した場合、エステラーゼにより分解されてトリペプチドとテルペノイドに分解され、トリペプチドはさらにアミノ酸、二酸化イオウと炭酸ガスに分解されて腎臓から***されることから、安全性が高く、より好ましい。

このテルペン誘導体は、癌細胞に対して、ミトコンドリアを刺激し、カスペース類を介し、アポトーシスを誘導するというメカニズムが明らかであり、その作用の安全性が確認できている点から安全性である。

また、このテルペン誘導体は、皮膚細胞の角質細胞に対し剥離を促進し、肌の再生を促進させる。加えて、メラニン産生細胞であるメラノサイトに働き、アポトーシスを誘発してメラノサイトを破壊させてシミやシミ産生を減少させる。

さらに、このテルペン誘導体は、酸化還元電位がマイナス１ｍＶ〜マイナス６００ｍＶであることから、強い還元作用があり、酸化生成物であるメラニンを分解し、シミの原因物質を消去する。

このマイナス１ｍＶ〜マイナス６００ｍＶの酸化還元電位は、アルカリ還元やイオン還元装置により作り出される。一方、酸化還元電位がプラスである場合、酸化により組織が障害されるおそれがあり、一方、酸化還元電位がマイナスであることは、酸化を抑制し組織を防御する点から好ましい。

このテルペン誘導体は酸化還元電位がマイナスであることから、皮膚の酸化や紫外線などの酸化ストレスを減少させ、アポトーシスの作用をより効果的にする。

ここでいうアポトーシス誘導作用を呈するテルペン誘導体は、化学的に合成することができ、さらに、植物細胞、動物細胞、酵母、微生物により発酵で得られ、生合成させて得ることができる。

また、植物を発酵させて抽出して得ることができる。さらに、柿の葉、柿の実、茎または根、松葉、緑茶葉などの植物体から抽出により得ることができる。

また、前記のテルペン酸誘導体を柿の葉、松葉、緑茶葉、ギョウジャニンニク、タマネギ、ニンニクとともに発酵させ、アルカリ還元させて得ることができる。たとえば、柿の葉、松葉、ギョウジャニンニク、タマネギまたはニンニクの粉砕物、大豆粉砕物及び納豆素本舗製の納豆菌を添加して発酵させた発酵物をアルカリ還元化して得ることは、廃棄物として廃棄される柿の葉、松葉を有効利用できることから好ましい。

さらに、植物から抽出する場合、柿の葉、松葉、緑茶葉、ドクダミ、ギョウジャニンニク、タマネギ、ニンニク、大豆、ギジギシ、カンゾウ、ツリフネソウ、ハナイカダ、大麦若葉、葛の花、トウガラシ、梨、栗、タラ、ワサビ、ワラビ、稲、小麦、トウモロコシ、ダイコン、菜の花、サクラ、マツ、アオキ、アカネ、アカメガシワ、アケビ、アマチャズル、アマドコロ、アロエ、イカリソウ、イタドリ、イノコズチ、イブキジャコウソウ、ウコギ、ウツボグサ、ウド、ウメ、ウラジロガシ、エビスグサ、オウレン、オオバコ、オケラ、オクラ、オトギリソウ、オナモミ、オミナエシ、カキドオシ、カラスウリ、カラスビシャク、カワラケツメイ、カワラナデシコ、カンアオイ、キクイモ、キキョウ、キササゲ、キハダ、キランソウ、キンミズヒキ、クガイソウ、クコ、クサボケ、クズ、クチナシ、コウホネ、コブシ、サイカチ、サボンソウ、サルトリイバラバッケツ、サンシュユ、ジャノヒゲ、シラン、スイカズラ、セリ、センブリ、タムシバ、タラノキ、タンポポ、チガヤ、ツリガネニンジン、ツワブキ、ドクダミ、トチノキ、トチバニンジン、ナンテン、ノイバラ、ハコベ、ハトムギ、ハハコグサ、ヒキオコシ、ヒシ、ヒトツバ、ビワ、フキ、フクジュソウ、フジ、マタタビ、メハジキ、ヤマノイモ、ユキノシタ、ヨモギ、リンドウ、レンギョウ、ロウバイ、ワレモコウなどの葉、茎、花または根は、入手しやすいことから好ましい。

藻類から抽出する場合、アオサ、アオノリ、アマノリ、アラメ、イワノリ、エゴノリ、オゴノリ、カワノリ、エナガオニコンブ、ガゴメコンブ、ナガコンブ、ホソメコンブ、マコンブ、ミツイシコンブ、リシリコンブ、スイゼンジノリ、テングサ、トサカノリ、ヒジキ、ヒトエグサ、フノリ、マツモ、ムカデノリ、オキナワモズク、モズク、ワカメ、クキワカメ、メカブワカメの葉部、茎または根は、入手しやすいことから好ましい。

柿の葉、柿の実、茎または根、松葉、松の樹皮、緑茶葉と大豆とともに、乳酸菌、ビール酵母、納豆素本舗製の納豆菌または枯草菌を発酵させて得ることができる。また、柿の葉、柿の実、茎または根、松葉、松の樹皮を大豆とともに、乳酸菌、ビール酵母、納豆素本舗製の納豆菌または枯草菌を発酵させて得られた発酵物をアルカリ還元して得ることができる。このようにすることにより、生成物は還元力及び抗酸化力の強い状態で得られ、酸化に対する抵抗力と保存性が高いことから好ましい。

ここでいうアポトーシス誘導作用を呈するテルペン誘導体は、液体または粉末して得られ、医薬品素材、食品素材、化粧品素材として利用できる。

医薬品素材として利用する場合、目的とするテルペン誘導体を分離精製することは、目的とするテルペン誘導体の純度が高まり、不純物を除去できる点から好ましい。

分離用担体または樹脂により分離され、分取されることにより目的とするテルペン誘導体が得られる。分離用担体または樹脂としては、表面が後述のようにコーティングされた、多孔性の多糖類、酸化珪素化合物、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリプロピレン、スチレン−ビニルベンゼン共重合体等が用いられる。０．１〜３００μｍの粒度を有するものが好ましく、粒度が細かい程、精度の高い分離が行なわれるが、分離時間が長い欠点がある。

例えば、逆相担体または樹脂として表面が疎水性化合物でコーティングされたものは、疎水性の高い物質の分離に利用される。陽イオン物質でコーティングされたものは陰イオン性に荷電した物質の分離に適している。また、陰イオン物質でコーティングされたものは陽イオン性に荷電した物質の分離に適している。特異的な抗体をコーティングした場合には、特異的な物質のみを分離するアフィニティ担体または樹脂として利用される。

アフィニティ担体または樹脂は、抗原抗体反応を利用して抗原の特異的な調製に利用される。分配性担体または樹脂は、シリカゲル（メルク社製）等のように、物質と分離用溶媒の間の分配係数に差異がある場合、それらの物質の単離に利用される。

これらのうち、製造コストを低減することができる点から、吸着性担体または樹脂、分配性担体または樹脂、分子篩用担体または樹脂及びイオン交換担体または樹脂が好ましい。さらに、分離用溶媒に対して分配係数の差異が大きい点から、逆相担体または樹脂及び分配性担体または樹脂はより好ましい。

分離用溶媒として有機溶媒を用いる場合には、有機溶媒に耐性を有する担体または樹脂が用いられる。また、医薬品製造または食品製造に利用される担体または樹脂は好ましい。

これらの点から吸着性担体としてダイヤイオン（三菱化学（株）社製）及びＸＡＤ−２またはＸＡＤ−４（ロームアンドハース社製）、分子篩用担体としてセファデックスＬＨ−２０（アマシャムファルマシア社製）、分配用担体としてシリカゲル、イオン交換担体としてＩＲＡ−４１０（ロームアンドハース社製）、逆相担体としてＤＭ１０２０Ｔ（富士シリシア社製）がより好ましい。これらのうち、ダイヤイオン、セファデックスＬＨ−２０及びＤＭ１０２０Ｔはさらに好ましい。

得られた抽出物は、分離前に分離用担体または樹脂を膨潤化させるための溶媒に溶解される。その量は、分離効率の点から抽出物の重量に対して１〜５０倍量が好ましく、３〜２０倍量がより好ましい。分離の温度としては物質の安定性の点から４〜３０℃が好ましく、１０〜２５℃がより好ましい。

分離用溶媒には、水、または、水を含有する低級アルコール、親水性溶媒、親油性溶媒が用いられる。低級アルコールとしては、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールが用いられるが、食用として利用されているエタノールが好ましい。

セファデックスＬＨ−２０を用いる場合、分離用溶媒には低級アルコールが好ましい。シリカゲルを用いる場合、分離用溶媒にはクロロホルム、メタノール、酢酸またはそれらの混合液が好ましい。

ダイヤイオン及びＤＭ１０２０Ｔを用いる場合、分離用溶媒はメタノール、エタノール等の低級アルコールまたは低級アルコールと水の混合液が好ましい。

アポトーシス誘導作用を指標として目的とするテルペン誘導体を含む画分を採取して乾燥または真空乾燥により溶媒を除去し、目的とするテルペン誘導体を粉末または濃縮液として得ることは溶媒による影響を除外できることから、好ましい。

医薬品として、注射剤または経口剤または塗布剤などの非経口剤として利用され、医薬部外品としては、錠剤、カプセル剤、ドリンク剤、石鹸、塗布剤、ゲル剤、歯磨き粉等に配合されて利用される。

経口剤としては、錠剤、カプセル剤、散剤、シロップ剤、ドリンク剤等が挙げられる。前記の錠剤及びカプセル剤に混和される場合には、結合剤、賦形剤、膨化剤、滑沢剤、甘味剤、香味剤等とともに用いることができる。前記の錠剤は、シェラックまたは砂糖で被覆することもできる。

また、前記のカプセル剤の場合には、上記の材料にさらに油脂等の液体担体を含有させることができる。前記のシロップ剤及びドリンク剤の場合には、甘味剤、防腐剤、色素香味剤等を含有させることができる。

非経口剤としては、軟膏剤、クリーム剤、水剤等の外用剤の他に、注射剤が挙げられる。外用剤の基材としては、ワセリン、パラフィン、油脂類、ラノリン、マクロゴールド等が用いられ、通常の方法によって軟膏剤やクリーム剤等とすることができる。

注射剤には、液剤があり、その他、凍結乾燥剤がある。これは使用時、注射用蒸留水や生理食塩液等に無菌的に溶解して用いられる。

これらの医薬品中における前記のテルペン誘導体の含有量は、０．１〜２０重量％が好ましく、１〜１５重量％がより好ましく、５〜１０重量％がさらに好ましい。

前記のテルペン誘導体の含有量が０．１重量％未満の場合には、テルペン誘導体の含有量が少なすぎることから作用を十分に発揮することができない。また、２０重量％を越える場合には、製剤の安定性に寄与している成分の含有量が相対的に低下する。

前記の医薬品は、他の医薬品と併用することができる。たとえば、シスプラチンと併用することにより異なる作用機序により相乗的なアポトーシス誘導作用及び抗癌効果が得られることから好ましい。

前記の食品製剤は、１日数回に分けて経口摂取される。１日の摂取量は０．１〜１０ｇが好ましく、０．３〜５ｇがより好ましく、０．５〜３ｇがさらに好ましい。１日の摂取量が、０．１ｇを下回る場合、十分な効果が発揮されないおそれがある。１日の摂取量が、１０ｇを越える場合、コストが高くなるおそれがある。上記の他に、飴、せんべい、クッキー、飲料、粉末等の形態で使用することができる。

得られた食品製剤は、保健機能食品として、栄養機能食品や特定保健用食品として利用されることは好ましい。

得られた食品製剤をイヌやネコなどのペットに利用する場合、柿の葉や松葉の抽出物に消臭作用や抗菌作用があることから好ましい。

化粧品として常法に従って界面活性化剤、溶剤、増粘剤、賦形剤等とともに用いることができる。例えば、油溶性クリーム、毛髪用ジェル、洗顔剤、美容液、化粧水等の形態とすることができる。化粧品の形態は任意であり、溶液状、クリーム状、ペースト状、ゲル状、ジェル状、固形状または粉末状として用いることができる。

化粧品として１日数回に分けて塗布、清拭または噴霧される。１日の使用量は０．０１〜５ｇが好ましく、０．０５〜３ｇがより好ましく、０．１〜１ｇがさらに好ましい。１日の使用量が、０．０１ｇを下回る場合、十分な効果が発揮されないおそれがある。１日の使用量が、５ｇを越える場合、コストが高くなるおそれがある。

得られた化粧品は、皮膚の角質改善と皮膚再生を促進する。また、メラニン産生細胞を破壊することにより、美白作用を呈することから、美白用化粧品や医薬部外品としても利用される。

次に、柿の葉粉末または松葉粉末に大豆粉末及び納豆素本舗製の納豆菌を添加し、発酵させた発酵液をアルカリ還元させる工程からなるアポトーシス誘導作用を呈するテルペン誘導体の製造方法について説明する。

ここでいうアポトーシス誘導作用を呈するテルペン誘導体とは、前記のテルペン誘導体であり、トリテルペン類に属し、かつ、水酸基に、トリペプチドがエステル結合している構造を示し、ＳＨ基を有しているという特徴を有する。

さらに、水酸基に結合しているトリペプチドは、システインとグリシンとシステインである。システインのカルボキシル基とテルペン骨格の水酸基がエステル結合している。

原料として用いる柿の葉の粉砕物とは、日本産、中国産、アメリカ産、アフリカ産の柿の葉のいずれも用いられる。

ここでいう柿とは、カキノキ科カキノキ属の富有柿、次郎柿、平核無柿、甲州百目柿、四溝柿、堂上蜂屋柿のいずれでも良い。

原料として用いる松葉とはアカマツ、ロウグロウ、モーリスアロボレイタムウィッチスブルーム、ジャノメアカマツ、シダレアカマツ、タンヨウショウ、タギョウショウ、クロマツの葉であり、松葉は神農本草経にも記載され、薬膳料理に古くから利用され、食経験が豊富であり、安全性が確認されている。

松葉の産地は、日本、中国、ヨーロッパ、アメリカ、カナダなどのいずれでも良く、無農薬で栽培された松葉が好ましい。

柿の葉と松葉は新鮮なもの、乾燥されたもののいずれでも良い。

採取された柿の葉と松葉は水道水で洗浄されることは好ましい。

柿の葉または松葉は、粉砕される。すなわち、柿の葉または松葉を乾燥後、粉砕機により粉砕されることは、反応を有効に実施できることから好ましい。

乾燥機として西村鐵工所製のＣＤドライヤー、株式会社大川原製作所製のバイブロンやロートスルー、株式会社奈良機械製作所製の旋回気流乾燥機、トルネッシュドライヤー、流動層乾燥機、粉砕機として株式会社奈良機械製作所製の自由ミル、スーパー自由ミル、サンプルミル、ゴブリン、スーパークリーンミル、マイクロス、減圧乾燥機として東洋理工製の小型減圧乾燥機、株式会社マツイ製の小型減圧伝熱式乾燥機ＤＰＴＨ−４０、エーキューエム九州テクノス株式会社製のクリーンドライＶＤ−７、ＶＤ−２０などが用いられる。

原料となる大豆粉末は、日本産、中国産、アメリカ産、ロシア産などいずれの産地の大豆でも利用でき、使用に際して中山技術研究所製ＤＭ−６などの粉砕機で粉砕される。

原料となる納豆素本舗製の納豆菌とは、納豆や食品の加工用に用いられる枯草菌の一種である。納豆素本舗製の納豆菌は発酵に適していることから、好ましい。

前記の発酵に関するそれぞれの添加量は、柿の葉粉末または松葉粉末１重量に対し、大豆粉末は０．５〜３重量が好ましく、納豆素本舗製の納豆菌は０．００１〜０．０３重量が好ましい。

前記の発酵は清浄な培養用タンクで実施され、水道水により前記の材料を混合することは好ましい。

また、この発酵は、３０〜５３℃に加温され、発酵は、２４〜９０時間行われる。発酵後に、抽出を効率良く実施するために、水道水で希釈される。

この発酵の工程によって、大豆由来のたんぱく質が分解されて得られたペプチドが柿の葉や松葉由来のテルペンと結合する。しかし、発酵によっては、酸化された状態であり、構造的に不安定であることから、還元されて、酸化還元電位が低く維持されることによって、その構造が安定する。

前記の発酵により生成された発酵物は３０〜６０℃の温水で抽出されることは、生成物を効率良く回収でき、次の工程が実施しやすいことから、好ましい。

得られた発酵物は凍結乾燥などにより、濃縮することは、好ましい。

この発酵物はアルカリ還元される。アルカリ還元の工程は、アルカリ還元装置やアルカリ還元整水器により実施されることが好ましい。たとえば、ゼマイティス製のアルカリ還元水・強酸化水連続生成器「プロテックＡＴＸ−５０１」、エヌアイシー製のアルカリ還元水製造装置「テクノスーパー５０２」、マルタカ製「ミネリア・ＣＥ−２１２」、クレッセント製「アキュラブルー」、株式会社日本鉱泉研究所製「ミネラル還元整水器「元気の水」」などの装置が好ましい。

この還元により、酸化還元電位がマイナス１ｍＶ〜マイナス６００ｍＶに還元され、目的とするテルペン誘導体が安定される。

前記の還元反応物から、目的とするテルペン誘導体を分離し、精製することは純度の高い物質として摂取量を減少させることができる点から好ましい。この精製の方法としては、分離用の樹脂などの精製操作を利用することが好ましい。

分離用担体または樹脂としては、表面がコーティングされた、多孔性の多糖類、酸化珪素化合物、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリプロピレン、スチレン−ビニルベンゼン共重合体等が用いられる。適切な分離用溶媒により分離し、精製され、有機溶媒を除去して目的とするテルペン誘導体を得ることは好ましい。

分離用溶媒としてはメタノール、エタノール、クロロホルム、ヘキサン、酢酸エチル、ベンゼン、エーテルなどが用いられ、このうち、食品加工用エタノールまたは含水エタノールはその利用範囲が高いことから好ましい。

このようにして得られたテルペン誘導体は、液体または粉末として得られる。

以下、前記実施形態を実施例及び試験例を用いて具体的に説明する。

岐阜県で無農薬栽培された富有柿の葉を採取した。これを水洗後、乾燥機により乾燥し、粉砕機（クイジナート）により粉砕して、柿の葉粉砕物１ｋｇを得た。

また、北海道産大豆をミキサー（クイジナート）に供し、大豆の粉砕物１ｋｇを得た。これらを清浄な発酵タンク（滅菌された発酵用丸形２０リットルタンク）の容器に、それぞれの１ｋｇを入れてさらに、水道水５ｋｇを添加し、攪拌した。

これに、粉末納豆菌（納豆素本舗製）５０ｇを発酵タンクに供し、攪拌後、３８〜４０℃の温度範囲で発酵させた。

発酵過程の途中段階で５回良く攪拌した。発酵終了の判定には、目的とするテルペン誘導体またはその酸化物の生成を指標とした。

その方法は、質量分析器付き高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ、島津製作所）に発酵液を供して分析し、目的とする物質の生成を確認した。

その結果、発酵４８時間後に、目的とするテルペン誘導体が十分量生成されたため、発酵時間を４８時間とし、発酵を終了させた。発酵液に４０℃の温水５ｋｇを添加した。

この発酵液を珪藻土を敷いたろ過器に供し、ろ過した。得られたろ過液をセルラキッス（株式会社ゼノン製）に供し、アルカリ還元装置（ゼマイティス製のアルカリ還元水・強酸化水連続生成器「プロテックＡＴＸ−５０１」）に供してアルカリ還元化させた。

こうして得られたアルカリ還元物を日本エフディ製の凍結乾燥機に供し、目的とするテルペン誘導体を粉末として７６８ｇ得た。これを検体１とした。

以下に、松葉粉末、大豆粉末と納豆素本舗製の納豆菌から得られるテルペン誘導体について述べる。

静岡県で無農薬栽培されたクロマツの葉を採取した。これを水洗後、乾燥機により乾燥し、粉砕機（クイジナート）により粉砕して、松葉の粉砕物１ｋｇを得た。

また、北海道産大豆をミキサーに供し、大豆の粉砕物１ｋｇを得た。これらを清浄な発酵タンクに、それぞれの１ｋｇを入れてさらに、水道水４ｋｇを添加し、攪拌した。

これに、粉末納豆菌（納豆素本舗製）４０ｇを発酵タンクに供し、攪拌後、３９〜４２℃の温度範囲で発酵させた。

発酵過程の途中段階で３回良く攪拌した。発酵終了の判定には、目的とするテルペン誘導体またはその酸化物の生成を指標とした。その方法は、質量分析器付き高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ、島津製作所）に発酵液を供して分析し、目的とする物質の生成を確認した。

その結果、発酵３９時間後に、目的とするテルペン誘導体が十分量生成されたため、発酵時間を４８時間とし、発酵を終了させた。これに４１℃の温水４ｋｇを添加した。

この発酵液を珪藻土の敷いたろ過器に供し、ろ過した。得られたろ過液をセルラキッス（株式会社ゼノン製）に供し、アルカリ還元装置（ゼマイティス製のアルカリ還元水・強酸化水連続生成器「プロテックＡＴＸ−５０１」）に供してアルカリ還元化させた。

こうして得られたアルカリ還元物を日本エフディ製の凍結乾燥機に供し、目的とするテルペン誘導体を粉末として５５０ｇ得た。これを検体２とした。

以下に、テルペン誘導体の構造解析に関する試験方法及び結果について説明する。
（試験例１）

上記のように得られた検体１及び検体２を抽出媒体に溶解し、質量分析器付き高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ、島津製作所）で分析し、さらに、核磁気共鳴装置（ＮＭＲ、ブルカー製、ＡＣ−２５０）で解析した。構造解析の結果、検体１及び検体２から目的とするトリペプチドを結合したテルペン誘導体が同定された。

以下に、ヒト癌細胞を用いたアポトーシス誘発試験について述べる。
（試験例２）

ＡＴＣＣより購入したヒト由来子宮癌細胞であるＨｅＬａ細胞を用いた。培養液としては、５％牛胎児血清含有ＭＥＭ培地（Ｓｉｇｍａ製）を用いて培養した、１００００個の細胞を３５ｍｍ培養シャーレに播種し、５％炭酸ガス下、３７℃で培養した。これに、前記の実施例１で得られた検体１及び実施例２で得られた検体２を０．０１ｍｇ／ｍｌ及び０．１ｍｇ／ｍｌの最終濃度で添加してさらに、４８時間培養した。

細胞を剥離後、細胞数を計数し、ヘキスト３３３５２で蛍光染色した。これを蛍光顕微鏡し、核が***したアポトーシスの細胞数を計数した。なお、シャーレは５枚を用いてその平均値を算出した。

その結果、検体１の０．０１ｍｇ／ｍｌの添加では、細胞数が対照群に比して平均値として６８％にまで、細胞数が減少し、アポトーシスの出現率は２９％であった。

また、検体１の０．１ｍｇ／ｍｌの添加では、細胞数が対照群に比して３４％にまで、細胞数が減少し、アポトーシスの出現率は７６％であった。

その結果、検体２の０．０１ｍｇ／ｍｌの添加では、細胞数が対照群に比して７１％にまで、細胞数が減少し、アポトーシスの出現率は２６％であった。

また、検体２の０．１ｍｇ／ｍｌの添加では、細胞数が対照群に比して３４％にまで、細胞数が減少し、アポトーシスの出現率は６０％であった。

以上の結果から、検体１と検体２にはアポトーシスによる癌細胞の破壊が観察された。一方、正常なヒト由来皮膚線維芽細胞で同様に試験した結果では、検体１及び検体２の添加によっても、細胞数に変化はなく、正常細胞に対する安全性が確認された。

以下に、マウス由来メラノーマ細胞Ｓ−１００を用いたマウス癌移植試験について述べる。
（試験例３）

ＡＴＣＣより購入したマウス由来メラノーマ細胞Ｓ−１００を用いた。この細胞を５％牛胎児血清含有ＭＥＭ培地（Ｓｉｇｍａ製）にて培養した、１０００００個の細胞をＩＣＲマウスの背部皮下に、注入した。このマウスに、前記の実施例１及び検体２で得られた検体１を０．１ｍｇ／ｋｇ及び１ｍｇ／ｋｇの投与量で経口投与した。投与は、２８日間毎日、１回ずつ経口投与した。なお、１群あたり１０匹の動物を用い、対照として蒸留水を投与した。

蒸留水投与群の腫瘍重量の平均値は、６．６３ｇであった。これに対して、検体１の０．１ｍｇ／ｋｇ投与の腫瘍重量の平均値は、２．１１ｇであった。さらに、検体１の１ｍｇ／ｋｇ投与の腫瘍重量の平均値は、０．５６ｇであった。

検体２の０．１ｍｇ／ｋｇ投与によって、その腫瘍重量の平均値は、３．５６ｇであった。さらに、検体２の１ｍｇ／ｋｇ投与によって、その腫瘍重量の平均値は、１．０２ｇであった。

これらの結果、検体１及び検体２の投与によって、腫瘍の縮小と重量の低下が認められ、検体１及び検体２には、アポトーシスを介した腫瘍縮小効果が確認された。

以下に、アポトーシス誘導作用を呈するテルペン誘導体からなる化粧品の実施例について説明する。

化粧品用混合機にモノステアリン酸ポリエチレングリコール１ｇ、親油型モノステアリン酸グリセリン１ｇ、馬油エステル２ｇ及びオレイン酸２ｇを加熱し、溶解した。

得られた溶液に、実施例１で得られた検体１の３０ｇ、α−トコフェロール０．１ｇ及び精製水６０ｇを添加した。これらを溶解した後、冷却して化粧品として乳液を得た。これを実施例３の検体３とした。対照の化粧品として実施例１で得られた検体１の粉末のみを除外した乳液を調製した。

以下に、化粧品の効果及び副作用について評価した試験例を示す。
（試験例４）

３１〜５７才の健常女性の１０人に、実施例３で得られた乳液１０ｍＬを顔面右半分に、１４日間塗布した。顔面左半分には実施例１のテルペン誘導体の粉末を除外した乳液を塗布した。

塗布前及び塗布１４日に、顔面左右それぞれの水分保持力（インテグラル製、ＣＭ８２５）及び皮膚弾性力（インテグラル製、衝撃波測定装置、ＲＶＭ６００）を測定した。

その結果、顔面左半分に比し、実施例３の化粧品を塗布した顔面右半分の水分保持力及び皮膚弾性力は、それぞれ１３４％及１４５％といずれの値も改善された。皮膚弾性力は皮膚の角質剥離と皮膚の再生に依存しているため、テルペン誘導体による肌細胞のアポトーシスが効果的であると考えられた。

これらの結果は、実施例３の化粧品は水分保持力と弾性力が向上されることが確認された。また、この化粧品の塗布による副作用は認められなかった。

本発明で得られる副作用が弱い、優れたアポトーシス誘導作用を呈するテルペン誘導体によれば、癌を改善する治療効果、発症の予防効果や肌改善効果が期待される。本発明のテルペン誘導体は、医薬品、食品製剤、化粧品に利用され、癌や肌の健康に悩む国民の生活を改善できる。したがって、本件は、医薬業界、食品業界、化粧品業界の発展に貢献できる発明である。

さらに、柿の葉や松の葉は廃棄物として焼却されて、環境破壊につながっている。柿の葉や松の葉を有効利用することにより、環境破壊を防御することができる。また、農業資源の開拓と産業の育成にもつながる。

Claims (2)

1. 酸化還元電位がマイナス１ｍＶ〜マイナス６００ｍＶである下記の式（１）で示されるアポトーシス誘導作用を呈するテルペン誘導体。
   

   
2. 柿の葉粉末または松葉粉末に大豆粉末及び納豆素本舗製の納豆菌を添加し、発酵させた発酵液をアルカリ還元させる工程からなる請求項１に記載のアポトーシス誘導作用を呈するテルペン誘導体の製造方法。