JP5124593B2 - 形質転換バチルス・リケニフォルミス細胞からの脂質アシルトランスフェラーゼの製造 - Google Patents
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Description
以下の関連出願、即ち、米国特許出願第2002−0009518号明細書、米国特許出願第2004−0091574明細書、国際公開第2004/064537号パンフレット、国際公開第2004/064987号パンフレット、国際公開第2005/066347号パンフレット、国際公開第2005/066351号パンフレット、2006年2月2日に出願した米国仮出願第60/764,430号及び国際公開第2006/008508号パンフレットを参照されたい。これらの各出願、及びこれらの各出願において引用された各文献(「出願引用文献」)、及び出願引用文献において文中で又はこれらの出願の審査手続の間で参照又は引用された各文献、並びにこのような審査手続中に提出された特許性を支持するすべての主張は、参照により本明細書に組み込まれる。様々な文献が本明細書でも引用されている(「本明細書引用文献」)。各本明細書引用文献、及び本明細書引用文献中で引用又は参照された各文献は、参照により本明細書に組み込まれる。
[技術分野]
(i)宿主細胞、好ましくは、バチルス・サブチリス以外の細胞、好ましくはバチルス・リケニフォルミス細胞であるバチルス宿主細胞を提供するステップと、
(ii)脂質アシルトランスフェラーゼをコードする異種ヌクレオチド配列で、宿主細胞、好ましくは、バチルス・サブチリス以外の細胞、好ましくはバチルス・リケニフォルミス細胞であるバチルス宿主細胞を形質転換するステップと、
(iii)プロモーター配列の制御下で細胞において脂質アシルトランスフェラーゼを発現させるステップと
を含む、脂質アシルトランスフェラーゼの製造方法に関する。
(i)宿主細胞、好ましくは、バチルス・サブチリス以外の細胞、好ましくはバチルス・リケニフォルミス細胞であるバチルス宿主細胞を提供するステップと、
(ii)脂質アシルトランスフェラーゼをコードする異種ヌクレオチド配列で、宿主細胞、好ましくは、バチルス・サブチリス以外の細胞、好ましくはバチルス・リケニフォルミス細胞であるバチルス宿主細胞を形質転換するステップと、
(iii)プロモーター配列の制御下で細胞において脂質アシルトランスフェラーゼを発現させるステップと
を含む、脂質アシルトランスフェラーゼの製造方法が提供される。
本発明の一実施形態では、本発明の方法及び/又は使用に用いる宿主細胞は、バチルス・リケニフォルミス宿主細胞である。
いくつかの適用では、本発明の宿主細胞、ベクター、方法及び/又は使用のいずれか1つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼ配列は、選択された宿主細胞(バチルス・リケニフォルミス細胞など)などによって、ヌクレオチド配列の発現を提供することができる調節配列に作動可能に連結することができる。
本発明により使用されるプロモーター配列は、脂質アシルトランスフェラーゼをコードする配列にとって異種又は同種であってよい。
脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列の発現により宿主細胞により生成される脂質アシルトランスフェラーゼは、使用される配列及び/又はベクターに応じて細胞内に分泌又は含有され得る。
用語「発現ベクター」は、インビボ又はインビトロで発現することができる構築物を意味する。
本発明の方法、ベクター及び/又は使用のいずれか1つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、天然脂質アシルトランスフェラーゼ又は変異体脂質アシルトランスフェラーゼをコードすることができる。
酵素が、エステル転移活性として定義することができるアシルトランスフェラーゼ活性を有し、これにより、脂質アシル供与体の最初のエステル結合のアシル部分が、アシルアクセプター、好ましくはグリセロール又はコレステロールに転移して新たなエステルを形成すること、及び
酵素が、アミノ酸配列モチーフGDSX(Xは、アミノ酸残基L、A、V、I、F、Y、H、Q、T、N、M又はSの1又は複数である)を含むこと
により特徴づけることができる。
(i)酵素が、エステル転移活性として定義することができるアシルトランスフェラーゼ活性を有し、これにより、脂質アシル供与体の最初のエステル結合のアシル部分が、アシルアクセプター、好ましくはグリセロール又はコレステロールへ転移されて新たなエステル、好ましくはそれぞれモノグリセリドエステル又はコレステロールエステルを形成すること、
(ii)酵素が、アミノ酸配列モチーフGDSX(Xは、アミノ酸残基L、A、V、I、F、Y、H、Q、T、N、M又はSの1又は複数である)を含むこと、
(iii)酵素がHis−309を含む、又は図2及び4(配列番号1又は配列番号3)に示されたアエロモナス・ヒドロフィラ脂質アシルトランスフェラーゼ酵素のHis−309に対応する位置にヒスチジン残基を含むこと
により特徴づけることができる脂質アシルトランスフェラーゼをコードする。
酵素が、エステル転移活性として定義することができるアシルトランスフェラーゼ活性を有し、これにより、第1の脂質アシル供与体の最初のエステル結合のアシル部分が、アシルアクセプターへ転移されて新たなエステルを形成すること、及び
酵素が、少なくともGly−32、Asp−33、Ser−34、Asp−134及びHis−309を含む、又は配列番号3若しくは配列番号1に示されたアエロモナス・ヒドロフィラ脂質アシルトランスフェラーゼ酵素の、それぞれGly−32、Asp−33、Ser−34、Asp−306びHis−309に対応する位置にグリシン、アスパラギン酸、セリン、アスパラギン酸及びヒスチジン残基を含むこと
により特徴づけることができる脂質アシルトランスフェラーゼをコードする。
(a)配列番号36で示されるヌクレオチド配列(図29参照)、
(b)配列番号38で示されるヌクレオチド配列(図31参照)、
(c)配列番号39で示されるヌクレオチド配列(図32参照)、
(d)配列番号42で示されるヌクレオチド配列(図35参照)、
(e)配列番号44で示されるヌクレオチド配列(図37参照)、
(f)配列番号46で示されるヌクレオチド配列(図39参照)、
(g)配列番号48で示されるヌクレオチド配列(図41参照)、
(h)配列番号49で示されるヌクレオチド配列(図57参照)、
(i)配列番号50で示されるヌクレオチド配列(図58参照)、
(j)配列番号51で示されるヌクレオチド配列(図59参照)、
(k)配列番号52で示されるヌクレオチド配列(図60参照)、
(l)配列番号53で示されるヌクレオチド配列(図61参照)、
(m)配列番号54で示されるヌクレオチド配列(図62参照)、
(n)配列番号55で示されるヌクレオチド配列(図63参照)、
(o)配列番号56で示されるヌクレオチド配列(図64参照)、
(p)配列番号57で示されるヌクレオチド配列(図65参照)、
(q)配列番号58で示されるヌクレオチド配列(図66参照)、
(r)配列番号59で示されるヌクレオチド配列(図67参照)、
(s)配列番号60で示されるヌクレオチド配列(図68参照)、
(t)配列番号61で示されるヌクレオチド配列(図69参照)、
(u)配列番号62で示されるヌクレオチド配列(図70参照)、
(v)配列番号63で示されるヌクレオチド配列(図71参照)
の1つ、
(w)又は
配列番号36、配列番号38、配列番号39、配列番号42、配列番号44、配列番号46、配列番号48、配列番号49、配列番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、配列番号57、配列番号58、配列番号59、配列番号60、配列番号61、配列番号62又は配列番号63で示される配列のいずれか1つと70%以上、好ましくは75%以上の同一性を有するヌクレオチド配列
であってよい。
(i)配列番号3で示されるアミノ酸配列
(ii)配列番号4で示されるアミノ酸配列
(iii)配列番号5で示されるアミノ酸配列
(iv)配列番号6で示されるアミノ酸配列
(v)配列番号7で示されるアミノ酸配列
(vi)配列番号8で示されるアミノ酸配列
(vii)配列番号9で示されるアミノ酸配列
(viii)配列番号10で示されるアミノ酸配列
(ix)配列番号11で示されるアミノ酸配列
(x)配列番号12で示されるアミノ酸配列
(xi)配列番号13で示されるアミノ酸配列
(xii)配列番号14で示されるアミノ酸配列
(xiii)配列番号1で示されるアミノ酸配列
(xiv)配列番号15で示されるアミノ酸配列
の1若しくは複数又は
配列番号1、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、若しくは配列番号15で示される配列のいずれか1つと75%、80%、85%、90%、95%、98%以上の同一性を有するアミノ酸配列
を含む脂質アシルトランスフェラーゼをコードすることができる。
(a)配列番号3又は配列番号1のアミノ酸残基1〜100で示されるアミノ酸配列、
(b)配列番号3又は配列番号1のアミノ酸残基101〜200で示されるアミノ酸配列、
(c)配列番号3又は配列番号1のアミノ酸残基201〜300で示されるアミノ酸配列、又は
(d)上記(a)〜(c)に定義されたアミノ酸配列のいずれか1つと75%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、さらにより好ましくは95%以上の同一性を有するアミノ酸配列
の1又は複数を含む脂質アシルトランスフェラーゼをコードすることができる。
(a)配列番号3又は配列番号1のアミノ酸残基28〜39で示されるアミノ酸配列、
(b)配列番号3又は配列番号1のアミノ酸残基77〜88で示されるアミノ酸配列、
(c)配列番号3又は配列番号1のアミノ酸残基126〜136で示されるアミノ酸配列、
(d)配列番号3又は配列番号1のアミノ酸残基163〜175で示されるアミノ酸配列、
(e)配列番号3又は配列番号1のアミノ酸残基304〜311で示されるアミノ酸配列、又は
(f)上記(a)〜(e)に定義されたアミノ酸配列のいずれか1つと75%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、さらにより好ましくは95%以上の同一性を有するアミノ酸配列
の1又は複数を含むことができる。
a)配列番号36に示されるヌクレオチド配列を含む核酸、
b)遺伝子コードの変性により配列番号36のヌクレオチド配列と関連した核酸、及び
c)配列番号36に示されるヌクレオチド配列と少なくとも70%の同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸
からなる群から選択される。
a)配列番号36に示されるヌクレオチド配列を含む核酸、
b)遺伝子コードの変性により配列番号36のヌクレオチド配列と関連した核酸、及び
c)配列番号36に示されるヌクレオチド配列と少なくとも70%の同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸
からなる群から選択される。
i)本発明の宿主細胞、ベクター、方法及び使用のいずれか1つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、GDSxモチーフ、より好ましくはGDSL又はGDSYモチーフから選択されるGDSxモチーフを有する脂質アシルトランスフェラーゼをコードし得、
且つ/又は
ii)本発明の宿主細胞、ベクター、方法及び使用のいずれか1つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、GANDYブロック、より好ましくはアミノ基GGNDx、より好ましくはGGNDA又はGGNDLを含むGANDYブロックを有する脂質アシルトランスフェラーゼをコードし得、
且つ/又は
iii)本発明の宿主細胞、ベクター、方法及び使用のいずれか1つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、好ましくはHTPブロックを有する脂質アシルトランスフェラーゼをコードし、
好ましくは、
iv)本発明の宿主細胞、ベクター、方法及び使用のいずれか1つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、好ましくはGDSx又はGDSYモチーフ、及びアミノ基GGNDx、好ましくはGGNDA又はGGNDLを含むGANDYブロック、及びHTPブロック(保存されたヒスタジン)を有する脂質アシルトランスフェラーゼをコードし得る。
好ましい実施形態では本発明の宿主細胞、ベクター、方法及び使用のいずれか1つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、変異体脂質アシルトランスフェラーゼである脂質アシルトランスフェラーゼをコードすることができる。
アミノ酸セット1:
アミノ酸セット1(これらは1IVNでのアミノ酸であることに注意−図53及び図54)
Gly8、Asp9、Ser10、Leu11、Ser12、Tyr15、Gly44、Asp45、Thr46、Glu69、Leu70、Gly71、Gly72、Asn73、Asp74、Gly75、Leu76、Gln106、Ile107、Arg108、Leu109、Pro110、Tyr113、Phe121、Phe139、Phe140、Met141、Tyr145、Met151、Asp154、His157、Gly155、Ile156、Pro158
アミノ酸セット2(アミノ酸の番号付けはP10480成熟配列でのアミノ酸を指すことに注意)
Leu17、Lys22、Met23、Gly40、Asn80、Pro81、Lys82、Asn87、Asn88、Trp111、Val112、Ala114、Tyr117、Leu118、Pro156、Gly159、Gln160、Asn161、Pro162、Ser163、Ala164、Arg165、Ser166、Gln167、Lys168、Val169、Val170、Glu171、Ala172、Tyr179、His180、Asn181、Met209、Leu210、Arg211、Asn215、Lys284、Met285、Gln289及びVal290。
アミノ酸セット3はセット2と同一であるが、アエロモナス・サルモニシダ(配列番号4)コード配列を指し、即ちアミノ酸残基番号数は、セット3では18多い。これは、シグナル配列(配列番号25)を含むタンパク質に比べた成熟タンパク質(配列番号34)でのアミノ酸番号付け間の差を反映するためである。
アミノ酸セット4は、S3、Q182、E309、S310、及び−318である。
F13S、D15N、S18G、S18V、Y30F、D116N、D116E、D157N、Y226F、D228N Y230F。
アミノ酸セット6は、Ser3、Leu17、Lys22、Met23、Gly40、Asn80、Pro81、Lys82、Asn87、Asn88、Trp111、Val112、Ala114、Tyr117、Leu118、Pro156、Gly159、Gln160、Asn161、Pro162、Ser163、Ala164、Arg165、Ser166、Gln167、Lys168、Val169、Val170、Glu171、Ala172、Tyr179、His180、Asn181、Gln182、Met209、Leu210、Arg211、Asn215、Lys284、Met285、Gln289、Val290、Glu309、Ser310、−318である。
アミノ酸セット7は、Ser3、Leu17、Lys22、Met23、Gly40、Asn80、Pro81、Lys82、Asn87、Asn88、Trp111、Val112、Ala114、Tyr117、Leu118、Pro156、Gly159、Gln160、Asn161、Pro162、Ser163、Ala164、Arg165、Ser166、Gln167、Lys168、Val169、Val170、Glu171、Ala172、Tyr179、His180、Asn181、Gln182、Met209、Leu210、Arg211、Asn215、Lys284、Met285、Gln289、Val290、Glu309、Ser310、−318、Y30X(Xは、A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、又はWから選択される)、Y226X(Xは、A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、又はWから選択される)、Y230X(Xは、A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、又はWから選択される)、S18X(Xは、A、C、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、W又はYから選択される)、D157X(Xは、A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W又はYから選択される)である。
S3E、A、G、K、M、Y、R、P、N、T又はG
E309Q、R又はA、好ましくはQ又はR
−318Y、H、S又はY、好ましくはY
の1又は複数を含む。
S3A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W、又はY;及び/又は
L17A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、又はY;及び/又は
S18A、C、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、W、又はY;及び/又は
K22A、C、D、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、又はY;及び/又は
M23A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W、又はY;及び/又は
Y30A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、又はW;及び/又は
G40A、C、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、又はY;及び/又は
N80A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W、又はY;及び/又は
P81A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W、又はY;及び/又は
K82A、C、D、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、又はY;及び/又は
N87A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W、又はY;及び/又は
N88A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W、又はY;及び/又は
W111A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W又はY;及び/又は
V112A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、W、又はY;及び/又は
A114C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、又はY;及び/又は
Y117A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、又はW;及び/又は
L118A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、又はY;及び/又は
P156A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W、又はY;及び/又は
D157A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W、又はY;及び/又は
G159A、C、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、又はY;及び/又は
Q160A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、R、S、T、V、W、又はY;及び/又は
N161A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M P、Q、R、S、T、V、W、又はY;及び/又は
P162A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W、又はY;及び/又は
S163A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W、又はY;及び/又は
A164C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、又はY;及び/又は
R165A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、W、又はY;及び/又は
S166A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W、又はY;及び/又は
Q167A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、R、S、T、V、W、又はY;及び/又は
K168A、C、D、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、又はY;及び/又は
V169A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、W、又はY;及び/又は
V170A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、W、又はY;及び/又は
E171A、C、D、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、又はY;及び/又は
A172C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、又はY;及び/又は
Y179A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、又はW;及び/又は
H180A、C、D、E、F、G、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W、又はY;及び/又は
N181A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W、又はY;及び/又は
Q182A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、R、S、T、V、W、又はY、好ましくはK;及び/又は
M209A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W、又はY;及び/又は
L210A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、又はY;及び/又は
R211A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、又はY;及び/又は
N215A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、又はY;及び/又は
Y226A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、又はW;及び/又は
Y230A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V又はW;及び/又は
K284A、C、D、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、又はY;及び/又は
M285A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W、又はY;及び/又は
Q289A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、R、S、T、V、W、又はY;及び/又は
V290A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、W、又はY;及び/又は
E309A、C、D、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、又はY;及び/又は
S310A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W、又はY
の1又は複数を含む。
S3、D157、S310、E309、Y179、N215、K22、Q289、M23、H180、M209、L210、R211、P81、V112、N80、L82、N88;N87
S3A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W又はY;好ましくはN、E、K、R、A、P又はM、最も好ましくはS3A
D157A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W又はY;好ましくはD157S、R、E、N、G、T、V、Q、K又はC
S310A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W又はY;好ましくはS310T〜318E
E309A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W又はY;好ましくはE309R、E、L、R又はA
Y179A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V又はW;好ましくはY179D、T、E、R、N、V、K、Q又はS、より好ましくはE、R、N、V、K又はQ
N215A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W又はY;好ましくはN215S、L、R又はY
K22A、C、D、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W又はY;好ましくはK22E、R、C又はA
Q289A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、R、S、T、V、W又はY;好ましくはQ289R、E、G、P又はN
M23A、C、D、E、F、G、H、I、K、L N、P、Q、R、S、T、V、W又はY;好ましくはM23K、Q、L、G、T又はS
H180A、C、D、E、F、G、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W又はY;好ましくはH180Q、R又はK
M209A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W又はY;好ましくはM209Q、S、R、A、N、Y、E、V又はL
L210A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、W又はY;好ましくはL210R、A、V、S、T、I、W又はM
R211A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、W又はY;好ましくはR211T
P81A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W又はY;好ましくはP81G
V112A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、W又はY;好ましくはV112C
N80A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W又はY;好ましくはN80R、G、N、D、P、T、E、V、A又はG
L82A、C、D、E、F、G、H、I、M、N、P、Q、R、S、T、V、W又はY;好ましくはL82N、S又はE
N88A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W又はY;好ましくはN88C
N87A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W又はY;好ましくはN87M又はG
の1又は複数から選択することができる。
S3N、R、A、G
M23K、Q、L、G、T、S
H180R
L82G
Y179E、R、N、V、K又はQ
E309R、S、L又はA
一態様では、本発明の方法は、脂質アシルトランスフェラーゼを回収する/単離する追加のステップを含む。したがって、製造された脂質アシルトランスフェラーゼは、単離された形態にあってよい。
一態様では、本発明の方法は、脂質アシルトランスフェラーゼを精製する追加のステップを含む。
本明細書に定義されている特定の特性を有するポリペプチド、又は修飾に適したポリペプチドのいずれかをコードするヌクレオチド配列は、前記ポリペプチドを生成する任意の細胞又は生物から単離することができる。ヌクレオチド配列を単離する様々な方法が当技術分野で知られている。
本発明は、本明細書に定義されている特定の特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を包含することもできる。本明細書では用語「ヌクレオチド配列」は、オリゴヌクレオチド配列又はポリヌクレオチド配列、並びに変異体、相同体、断片及びこれらの誘導体(これらの部分など)を指す。ヌクレオチド配列は、ゲノム起源又は合成起源又は組換え起源であってよく、センス鎖に相当しようとアンチセンス鎖に相当しようと2本鎖又は1本鎖であってよい。
酵素をコードするヌクレオチド配列が単離され、又は酵素をコードする推定ヌクレオチド配列が同定された後、選択されたヌクレオチド配列を修飾することが望ましい場合があり、例えば本発明による酵素を調製するために配列を変異させることが望ましい場合がある。
本発明はまた、本発明の宿主細胞、ベクター、方法及び/又は使用のいずれか1つに用いる脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列によりコードされたアミノ酸配列も包含する。
本明細書では、用語「相同体」は、対象アミノ酸及び対象ヌクレオチド配列と特定の相同性を有する実体を意味する。本明細書では、用語「相同性」は、「同一性」と見なすことができる。
本発明はまた、本発明の配列に相補的な配列、又は本発明の配列若しくはこれに相補的な配列にハイブリダイズできる配列も包含する。
本発明に用いるヌクレオチド配列、又は本明細書に定義されている特定の特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、複製可能な組換えベクターに組み込むことができる。ベクターは、適合した宿主細胞中で及び/又は宿主細胞から、ポリペプチドの形態で、ヌクレオチド配列を複製し、発現させるのに使用することができる。発現は、プロモーター/エンハンサー及び他の発現調節シグナルを含む制御配列を用いて制御することができる。原核生物プロモーター、及び真核細胞で機能するプロモーターを使用することができる。組織特異的又は刺激特異的プロモーターを使用することができる。上述の2つ以上の異なるプロモーター由来の配列要素を含むキメラプロモーターも使用することができる。
「結合体」、「カセット」及び「ハイブリッド」などの用語と同義である用語「構築物」は、プロモーターに直接又は間接的に結合した、本発明により用いる、本明細書に定義されている特定の特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。間接結合の例は、プロモーター及び本発明のヌクレオチド配列の中間にある、イントロン配列(Sh1−イントロン又はADHイントロンなど)などの適切なスペーサー基の提供である。同じことが、本発明に関して用語「融合された」にも当てはまり、直接又は間接結合を含む。いくつかのケースでは、これらの用語は、これらがどちらも自然環境にある場合、通常は野生型遺伝子プロモーターに関連するタンパク質をコードするヌクレオチド配列の自然の組合せを含まない。
本発明に関して用語「生物」は、本発明によるヌクレオチド配列、又は本明細書に定義されている特定の特性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、及び/又はこれらから得られる生成物を含み得る任意の生物を含む。
原核生物宿主の形質転換に関する教示は、当技術分野では十分に記載されており、例えば、Sambrook et al (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press)を参照されたい。原核生物宿主が使用される場合、ヌクレオチド配列は、イントロン除去によるなど、形質転換前に適切に修飾する必要があり得る。
ポリペプチドは、発現宿主から、酵素をより容易に回収することができる培養培地に分泌されることが望ましい場合が多い。本発明によれば、分泌リーダー配列は、所望の発現宿主に基づき選択することができる。ハイブリッドシグナル配列も、本発明の文脈で使用することができる。
アミノ酸配列発現を検出及び測定する様々なプロトコルが当技術分野で知られている。例には、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA, enzyme-linked immunosorbent assay)、放射性免疫アッセイ(RIA, radioimmunoassay)及び蛍光活性化細胞選別法(FACS, fluorescent activated cell sorting)が含まれる。
本発明の方法では、脂質アシルトランスフェラーゼは、融合タンパク質として生成して、例えばこの抽出及び精製に役立つことができる。融合タンパク質パートナーの例には、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GST)、6×His、GAL4(DNA結合及び/又は転写活性化ドメイン)及びβ−ガラクトシダーゼが含まれる。融合タンパク質配列の除去を可能にするため、融合タンパク質パートナーと所望のタンパク質配列との間にタンパク質分解性切断部位を含めることも好都合となり得る。好ましくは、融合タンパク質は、タンパク質配列の活性を妨げない。
脂質アシルトランスフェラーゼ(配列番号16、以後KLM3’と呼ぶ)をコードするヌクレオチド配列(配列番号49)を、バチルス・リケニフォルミス[アルファ]−アミラーゼ(LAT)のシグナルペプチドを有する融合タンパク質としてバチルス・リケニフォルミスで発現させた(図53及び54参照)。バチルスでの最適な発現のため、コドン最適化遺伝子構築物(no. 052907)をGeneart社(Geneart AG, Regensburg, Germany)で注文した。
Plat5XhoI_FW:
ccccgctcgaggcttttcttttggaagaaaatatagggaaaatggtacttgttaaaaattc ggaatatttatacaatatcatatgtttcacattgaaagggg
EBS2XhoI_RV:tggaatctcgaggttttatcctttaccttgtctcc
ベクター構築物
プラスミド構築物は、pCS32new N80Dである。これは、p32プロモーターの制御下、位置80でAsnがAspに置換する、及びCGTaseシグナル配列を有する、天然のアエロモナス・サルモニシダグリセロリン脂質−コレステロールアシルトランスフェラーゼの成熟形態をコードする配列を保有するpCCmini誘導体である。
50mg/lカナマイシンを補充した、LBブロス(カゼイン酵素消化物、10g/l;低ナトリウム酵母抽出物、5g/l;塩化ナトリウム、5g/l;不活性錠剤化助剤、2g/l)5mlを単一のコロニーに播種し、205rpmで6時間30℃にてインキュベートした。この培養物0.7mlを用いて、カナマイシン50mg/l及び高マルトースデンプン加水分解物溶液(60g/l)を補充したSAS培地(K2HPO4、10g/l;MOPS(3−モルホリノプロパンスルホン酸)、40g/l;塩化ナトリウム、5g/l;消泡剤(Sin260)、5滴/l;脱脂大豆粉、20g/l;Biospringer 106(100%dw YE)、20g/l)50mlをインキュベートした。インキュベーションを30℃、180rpmで40時間継続した後、培養上清を30分間19000rpmで遠心分離により分離した。上清をクリーンな試験管に移し、トランスフェラーゼ活性測定に直接使用した。
PC(Avanti Polar Lipid社製#441601)及びコレステロール(Sigma社製C8503)を比9:1でスケーリングし、クロロホルムに溶解し、蒸発乾固した。基質は、3%PC:コレステロール9:1を50mM HepesバッファーpH7に分散させて調製した。0.250ml基質溶液をネジ蓋付き3mlガラス試験管に移した。0.025ml培養上清を添加し、混合物を40℃で2時間インキュベートした。酵素の代わりに水を有する参照試料も調製した。反応混合物を沸騰水浴中で10分間加熱し、酵素反応を停止させた。99%エタノール2mlを反応混合物に添加した後、コレステロールアッセイ分析に供した。
コレステロールオキシダーゼ(SERVA Electrophoresis GmbH社製、cat.No 17109)1.4U/ml、ABTS(Sigma社製A-1888)0.4mg/ml、ペルオキシダーゼ(Sigma社製6782)6U/mlを含有する基質100μlの0.1M Tris−HCl、pH6.6及び0.5%Triton X-100(Sigma社製X-100)溶液を、37℃で5分間インキュベートした後、反応混合物試料5μlを添加し混合した。反応混合物をさらに5分間インキュベートし、OD405を測定した。コレステロール含量を、0.4mg/ml、0.3mg/ml、0.20mg/ml、0.1mg/ml、0.05mg/ml、及び0mg/mlコレステロールを99%EtOHに含有するコレステロール標準溶液の分析から計算した。
表は8種類の別個の発現培養物の平均を示す。
Claims (14)
- (i)バチルス・リケニフォルミス細胞を提供するステップと、
(ii)脂質アシルトランスフェラーゼをコードする配列番号49で示される異種ヌクレオチド配列でバチルス・リケニフォルミス細胞を形質転換するステップと、
(iii)プロモーター配列の制御下で前記細胞において脂質アシルトランスフェラーゼを発現させるステップと
を含む、脂質アシルトランスフェラーゼの製造方法。 - プロモーター配列が、脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列と天然には結合しない、請求項1に記載の方法。
- 脂質アシルトランスフェラーゼをコードする異種ヌクレオチド配列に、シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列が作動可能に連結されている、請求項1又は2に記載の方法。
- 脂質アシルトランスフェラーゼを単離/回収する追加のステップを含む、請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- プロモーター配列が宿主細胞と同種である、請求項1〜4のいずれかに記載の方法。
- プロモーター配列が、α−アミラーゼプロモーター配列、プロテアーゼプロモーター配列、サブチリシンプロモーター配列、グルタミン酸特異的プロテアーゼプロモーター配列及びレバンスクラーゼプロモーター配列からなる群から選択される、請求項1〜5のいずれかに記載の方法。
- プロモーター配列が、α−アミラーゼプロモーター配列である、請求項1〜6のいずれかに記載の方法。
- 異種の脂質アシルトランスフェラーゼをコードする配列番号49で示されるヌクレオチド配列を含むバチルス・リケニフォルミス宿主細胞。
- バチルス・リケニフォルミスと同種のプロモーター配列に作動可能に連結された脂質アシルトランスフェラーゼをコードする配列番号49で示されるヌクレオチド配列を含む発現ベクター。
- プロモーターが、脂質アシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列と天然には結合しない、請求項9に記載の発現ベクター。
- シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列が、脂質アシルトランスフェラーゼをコードする異種ヌクレオチド配列に作動可能に連結されている、請求項9又は10に記載の発現ベクター。
- プロモーター配列が、α−アミラーゼプロモーター配列、プロテアーゼプロモーター配列、サブチリシンプロモーター配列、グルタミン酸特異的プロテアーゼプロモーター配列及びレバンスクラーゼプロモーター配列からなる群から選択される、請求項9〜11のいずれかに記載の発現ベクター。
- プロモーター配列がα−アミラーゼプロモーター配列である、請求項9〜12のいずれかに記載の発現ベクター。
- 請求項1〜7のいずれかに記載の方法により得られる脂質アシルトランスフェラーゼ。
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