ES2345973T3 - Lipasa/aciltransferasa a partir de candida parapsilosis. - Google Patents

Abstract

Polipéptidos con actividad de lipasa/aciltransferasa, con una secuencia de aminoácidos, que tiene una identidad de, al menos, el 80% con respecto a la secuencia de aminoácidos indicada en la SEQ ID No. 2.

Description

Lipasa/aciltransferasa a partir de Candida parapsilosis.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a polipéptidos con actividad de lipasa/aciltransferasa, a secuencias de aminoácidos de polipéptidos, que muestran esta actividad, a ácidos nucleicos (genes), que codifican estos polipéptidos, a vectores, que contienen aquellos ácidos nucleicos, que codifican estos polipéptidos, a microorganismos transformados, que contienen estos ácidos nucleicos, a procedimientos para llevar a cabo la obtención de estos polipéptidos así como al empleo de ácidos nucleicos para encontrar nuevas lipasas/aciltransferasas y al empleo de estas lipasas/aciltransferasas como catalizadores en procedimientos químicos y bioquímicos.

Estado de la técnica

Con ocasión de la esterificación, según los métodos usuales de la síntesis química, puede producirse, por un lado, la formación de mezclas constituidas por productos monosubstituidos y polisubstituidos, como consecuencia de la presencia de varios grupos hidroxilo libres en el componente alcohólico o en un éster parcial del mismo de tal manera, que se requiere la introducción y la eliminación de grupos protectores cuando quiere llevarse a cabo la síntesis específica de un compuesto determinado.

Con ayuda del empleo de derivados activados de ácidos carboxílicos se forman productos acompañantes y, con frecuencia, también productos secundarios no deseados, que dificultan la elaboración, reducen los rendimientos en producto deseado y constituyen una carga para el medio ambiente. Estos inconvenientes pueden evitarse o, al menos, pueden reducirse si se lleva a cabo la obtención por vía enzimática (por ejemplo de conformidad con el procedimiento que ha sido descrito en la solicitud alemana DE 197 53 789.8).

Los enzimas son empleados, cada vez en mayor medida, en las síntesis químicas y bioquímicas, a título de catalizadores. De este modo, son empleadas ya las hidrolasas en procedimientos a escala industrial, especialmente las lipasas (EC 3.1.1.3) en muchos casos, como consecuencia de que las condiciones de la reacción son frecuentemente suaves, para llevar a cabo la disociación de grasas.

Los procedimientos enzimáticos adecuados para llevar a cabo la esterificación o la transesterificación están descritos, por ejemplo, en la publicación de los autores K. Drauz y H. Waldmann, Enzyme Catalysis in Organic Synthesis, VCH-Verlag, Weinheim 1975.

Se sabe que la transesterificación es catalizada en medios anhidros por medio de lipasas. Cuando en el sistema de reacción de ésteres, alcohol y lipasas esté presente también el agua, se produce normalmente una disociación de los ácidos grasos enlazados para dar ácidos grasos libres. Puesto que diversas lipasas catalizan también la formación de ésteres a partir de ácidos grasos libres y de alcoholes, se lleva a cabo como efecto final una reacción de transesterificación con un producto intermedio ácido. Desde luego, para muchos procesos industriales constituye un gran inconveniente la formación de ácidos libres en el sistema. El contenido en agua impide parcialmente una reacción industrial y comercialmente aceptable (formación de un equilibrio termodinámico desfavorable). Para conseguir rendimientos satisfactorios tienen que ser empleadas costosas instalaciones industriales (eliminación del agua por ejemplo por medio de una destilación azeotrópica, procedimientos de separación por medio de membranas, destilación en
vacío).

En la literatura ha sido descrito ya un polipéptido, que es único en su género hasta el presente, que presenta actividad de lipasa/aciltransferasa. Este polipéptido fue aislado a partir del microorganismo Candida parapsilosis CBS 604. Sin embargo, hasta el presente sólo se ha llevado a cabo la evaluación, exclusivamente, de la capacidad de reacción de este polipéptido. Es posible con el polipéptido procedente del microorganismo Candida parapsilosis, que presenta tanto propiedades de lipasa así como también propiedades de aciltransferasa, mantener en un nivel muy bajo los productos intermedios de un ácido (graso) libre incluso en presencia de agua (con una actividad > 0,8). Al mismo tiempo puede mantenerse controlado el coste industrial. (Véase la publicación de los autores L. Vaysse, E. Dubreucq, J.-L. Pirat, P. Galzy; J. Biotech. 53 (1997) 41-46).

El inconveniente de las reacciones catalizadas por vía enzimática reside frecuentemente en la disponibilidad y en la estabilidad de los polipéptidos.

Descripción de la invención

La tarea de la presente solicitud de patente consistía en caracterizar y en proporcionar aquellos polipéptidos, que posibiliten una transferencia de grupos acilo con elevados rendimientos incluso en un medio acuoso y que, por lo tanto, venzan los inconvenientes tradicionales que se presentan en el caso de una esterificación catalizada por medio de lipasas.

Por lo tanto, la tarea de la presente solicitud de patente consistía en aislar estos polipéptidos, en descifrar la secuencia de aminoácidos y la secuencia de nucleótidos, que codifica esta secuencia de aminoácidos, puesto que éstas son imprescindibles tanto para la obtención por bioingeniería así como también para el desarrollo ulterior del polipéptido.

Otra tarea parcial consistía en posibilitar la producción por bioingeniería de las lipasas/aciltransferasas encontradas y de este modo proporcionar rendimientos elevados y conseguir entonces la posibilidad de encontrar organismos alternativos por medio de una selección de las homologías de secuencia. Por lo tanto, estaba incluido en esta tarea el hecho de proporcionar células huésped transformadas, que fuesen capaces de producir este polipéptido.

En el sentido de la presente solicitud, se entiende por polipéptido aquel polímero compuesto por aminoácidos naturales, estructurado de forma ampliamente lineal, que adquiere, en la mayoría de los casos, una estructura tridimensional para ejercer su función. En la presente solicitud están denominados los 19 L-aminoácidos proteinógenos, que se encuentran en la naturaleza, con el código internacional usual formado por 1 y 3 letras. Otra denominación también es la de proteína, debiéndose dar una limitación del número de unidades monómeras en el polipéptido de 50 como mínimo.

En el sentido de la invención se entiende por "actividad de lipasa/aciltransferasa" la actividad de un polipéptido o de un enzima, que reúne las propiedades de las lipasas con las propiedades de las aciltransferasas. Las lipasas (EC 3.1.1.3) pertenecen al grupo de las hidrolasas (especial de las esterasas), que disocian de forma específica a las grasas (triglicéridos) en glicerina y en ácidos grasos; este proceso, que se denomina lipólisis, se produce en la interfase comprendida entre la grasa y el agua. Una propiedad importante, que conduce a la inclusión en el grupo de las hidrolasas, consiste en la actividad tensioactiva de las lipasas. Juega un papel en la catálisis una triada catalítica constituida por la serina, la histidina y el ácido asparagínico (o ácido glutamínico). Las aciltransferasas (EC 2.3) se denominan también transacilasas y pertenecen al grupo de las transferasas. Éstas transfieren de una manera muy general grupos acilo o, de manera especial, grupos acetilo desde una molécula donante hasta una molécula aceptora y, por lo tanto, son especialmente importantes para la formación y para la degradación de grasas. Se ha observado por medio de estudios realizados con las lipasas/aciltransferasas de conformidad con la invención, que este polipéptido es tensioactivo y que cataliza aquellas reacciones, que son características de la lipasas. Así mismo se ha encontrado que este polipéptido es capaz de catalizar transesterificaciones con un contenido en agua en la mezcla de la reacción, que corresponde a una actividad en agua mayor que 0,8. Con este contenido en agua, una lipasa tradicional catalizaría únicamente la hidrólisis del éster. Por lo tanto, se trata de un polipéptido que presenta rasgos caracterizantes tanto de las lipasas así como, también, de las aciltransferasas. El polipéptido de origen natural, de conformidad con la invención, está constituido por una lipasa, como consecuencia de homologías de secuencia con respecto a los enzimas conocidos hasta ahora tales como, por ejemplo, las lipasas procedentes de Candida albicans y están constituidos por una aciltransferasa como consecuencia de su actividad enzimática.

Como donantes preferentes en el sentido de la invención para las reacciones catalíticas con la lipasa/aciltransferasa, de conformidad con la invención, son empleados todos los posibles ésteres, grasas, triglicéridos, 1,3-diglicéridos, 1,2-diglicéridos y 1-monoglicéridos. Como aceptores preferentes en el sentido de la invención para reacciones catalíticas con la lipasa/aciltransferasa, de conformidad con la invención, son empleados alcoholes primarios y secundarios con uno hasta cinco átomos de carbono, de manera especial el etanol, el propanol, el butanol, el 1,2-propanodiol, el 1,3-propanodiol, el 2-metil-1-propanol, el 2-metil-1-butanol, el 3-metil-1-butanol y la hidroxilamina.

La expresión de "identidad", que es empleada en este caso con relación a la secuencia de aminoácidos, designa una homología con respecto a la secuencia de aminoácidos dada que conduce a que el polipéptido con una identidad dada tiene la misma actividad biológica que el primer polipéptido. La identidad de la secuencia de nucleótidos se refiere a una primera secuencia de nucleótidos homóloga del gen. Homólogo significa con respecto a la secuencia de nucleótidos, que el gen tiene que ser alélico. Así mismo homólogo significa que el gen procede de otra especie, pero que el polipéptido codificado por este gen tiene la misma actividad biológica que el polipéptido codificado por la primera secuencia de nucleótidos.

El objeto de la invención está constituido por polipéptidos con actividad de lipasa/aciltransferasa con una secuencia de aminoácidos, que tiene una identidad del 80% como mínimo, de manera preferente del 98% como mínimo, de manera especialmente preferente del 99,8% y, de manera especial, del 100% con respecto a la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO. 2. Una identidad con respecto a la secuencia de aminoácidos, que está indicada en la SEQ ID NO. 2 de, al menos, el 80%, preferentemente del 96% es especialmente válida para la región parcial, que corresponde a los aminoácidos en las posiciones 190 hasta 390. Un polipéptido, que tiene una identidad del 100% con respecto a la secuencia de aminoácidos, que está indicada en SEQ ID NO. 2, contiene 465 aminoácidos. Es especialmente preferente una identidad del 96% para las regiones parciales en las posiciones 190-200, 220 hasta 290 y 330 hasta 385, de manera especial en las posiciones 196, 240 y 381.

La secuencia de aminoácidos del enzima, de conformidad con la invención, está indicada en el protocolo de secuencias bajo la denominación SEQ ID NO. 2. La secuencia de nucleótidos de este enzima está indicada en el protocolo de secuencias bajo la denominación SEQ ID NO. 1. Por lo tanto, está disponible para desarrollos ulteriores por medio de métodos de la biología molecular en sí conocidos.

De la misma manera, los polipéptidos comparables con actividad de lipasa/aciltransferasa representan formas preferentes de realización de la presente invención y son reivindicadas en tanto en cuanto presenten secuencias de aminoácidos y/o secuencias de ácidos nucleicos, que se encuentren dentro del intervalo de similitud con respecto a las secuencias indicadas en la SEQ ID NO. 1 y/o en la SEQ ID NO. 2. Este intervalo de similitud abarca todos aquellos polipéptidos, cuya secuencia de aminoácidos sea idéntica al menos en un 80%, en un 96%, en un 96,5%, en un 97%, en un 97,5%, en un 98%, en un 98,5%, en un 99%, en un 99,5%, en un 99,8% o en un 100% con respecto a la secuencia de aminoácidos que está indicada en la SEQ ID NO. 2. Esto es especialmente válido para la región parcial de la proteína que corresponde a los aminoácidos 190 hasta 390.

Un polipéptido, que tiene una identidad al menos del 80% con respecto a la secuencia de aminoácidos, que está indicada en la SEQ ID NO. 2, tiene un peso molecular comprendido entre 49 y 55 kD tras la desglicosilación, de manera especial de 54 kD. El óptimo del pH para la reacción catalítica de la transesterificación, la hidrólisis o la esterificación, que se determinó a 28ºC, se encuentra comprendido entre 3 y 8,5, de manera preferente entre 4 y 8, de manera especial entre 6 y 7,5.

Un intervalo óptimo de temperaturas en la catálisis de la hidrólisis, determinado en el óptimo del pH, se encuentra comprendido entre 30 y 50ºC, de manera preferente entre 35 y 40ºC. Un intervalo óptimo de temperaturas para la catálisis de la transesterificación y de la esterificación, determinada en el óptimo del pH, se encuentra comprendido entre 20 y 50ºC, de manera preferente entre 20 y 30ºC.

A los polipéptidos, de conformidad con la invención, pertenecen también aquellos enzimas, que presentan una similitud suficiente con los mismos o que pueden derivarse con métodos en sí conocidos.

En una forma especial de realización de la invención, se presentan glicosilados los polipéptidos con actividad de lipasa/aciltransferasa, con una secuencia de aminoácidos, que tiene una identidad de, al menos, el 80%, de manera preferente de, al menos, el 98%, de manera especialmente preferente del 99,8% y, de manera especial, del 100% con respecto a la secuencia de aminoácidos, que está indicada en la SEQ ID NO. 2. Las posiciones sobre las cuales se presenta glicosilado el polipéptido y el grado de glicosilación dependen del organismo, que produzca este polipéptido. Es preferente un grado de glicosilación comprendido entre 1 y 2 restos sacáricos por molécula de polipéptido.

En otra forma de realización de la invención, los polipéptidos están enlazados con otro polipéptido. Un péptido de este tipo puede estar constituido por un marcador, que pueda conducir, por ejemplo, a que el polipéptido deseado pueda ser purificado de manera más efectiva por medio de una cromatografía, de manera especial por medio de una cromatografía de afinidad. De conformidad con la invención, el otro polipéptido está constituido por el marcador his-tag. El marcador his-tag está constituido por un péptido que está constituido a partir de seis unidades monómeras de histidina.

Una forma especial de realización de la invención corresponde a los polipéptidos con actividad de lipasa/aciltrans-
ferasa con una secuencia de aminoácidos, que tiene una identidad de, al menos, el 80%, de manera preferente de, al menos, el 98%, de manera especialmente preferente del 99,8% y, de manera especial, del 100% con respecto a la secuencia de aminoácidos que está indicada en la SEQ ID NO. 4.

Otra forma preferente de realización de la invención corresponde a fragmentos de polipéptido o a polipéptidos que pueden ser obtenidos por medio de mutación por deleción, con una actividad de lipasa/aciltransferasa de conformidad con el polipéptido que ha sido descrito precedentemente.

Se entenderá por fragmentos todas aquellas proteínas o todos aquellos péptidos, que sean menores que las proteínas naturales, que sean menores que aquellas proteínas que corresponden a las secuencias SEQ ID NO. 1 o SEQ ID NO. 2 o SEQ ID NO. 3 o SEQ ID NO. 4., pero con las que son homólogas en las correspondientes secuencias parciales, o aquellas que corresponden a genes completamente traducidos y que, por ejemplo, también pueden ser obtenidos por síntesis. Debido a sus secuencias de aminoácidos pueden ser asociados a las correspondientes proteínas completas. Estos fragmentos pueden adquirir, por ejemplo, las mismas estructuras o las mismas actividades proteolíticas o pueden ejercer actividades parciales tales como, por ejemplo, la formación de complejos de un substrato. Los fragmentos y los derivados de deleción de las proteínas de partida son en principio equivalentes; mientras que los fragmentos representan trozos más pequeños, en el caso de los mutantes por deleción están ausentes sólo pequeñas regiones y, por lo tanto, sólo funciones parciales individuales.

Los fragmentos pueden estar constituidos, por ejemplo, por dominios individuales o por trozos, que no coinciden con los dominios. Tales fragmentos pueden ser preparados de una manera económica, pueden no tener ya determinadas características, eventualmente inconvenientes, de la molécula de partida, tal como posiblemente un mecanismo de regulación reductor de la actividad, o pueden desarrollar un perfil de actividad favorable. Los fragmentos proteicos pueden ser preparados no solamente por vía biosintética, sino también, por ejemplo, por vía química. La síntesis química puede ser ventajosa, por ejemplo, cuando a continuación de la síntesis deban llevarse a cabo modificaciones químicas.

De la misma manera, deben asociarse a los fragmentos los polipéptidos que pueden ser obtenidos por medio de una mutación por deleción, como consecuencia de su igualdad en principio. Tales péptidos pueden coincidir ampliamente desde el punto de vista bioquímico con las moléculas de partida o precisamente ya no pueden presentar funciones individuales. Esto se pone de manifiesto, por ejemplo, en el caso de la deleción de regiones inhibidoras. Como resultado, con las deleciones pueden producirse tanto una especialización así como también una ampliación del campo de aplicación de la proteína. En tanto en cuanto sea mantenida, modificada, especificada o incluso conseguida por primera vez una actividad de lipasa/aciltransferasa en el sentido más amplio de la palabra, las variantes de deleción así como los fragmentos corresponden a proteínas de conformidad con la invención; la única condición previa adicional a este respecto consiste en que se encuentran dentro del intervalo de similitud indicado con respecto a las secuencias SEQ ID NO. 1 y SEQ ID NO. 2 y SEQ ID NO. 3 y SEQ ID NO. 4 a través de la secuencia parcial homóloga todavía presente.

La mutagénesis por inversión, es decir una inversión parcial de la secuencia puede ser considerada como una forma especial de deleción. Lo mismo es válido para un nuevo agrupamiento de diversas partes de la molécula, que se diferencie de la serie original de aminoácidos. Ésta puede ser considerada como variante por deleción de la proteína original.

Otra forma de realización de la invención se refiere a derivados de un polipéptido con actividad de lipasa/aciltrans-
ferasa de conformidad con uno de los polipéptidos que han sido descritos precedentemente.

En el sentido de la presente solicitud se entiende por derivados a aquellos polipéptidos, cuya cadena pura de aminoácidos ha sido químicamente modificada. Tales derivatizaciones pueden llevarse a cabo, por ejemplo, por vía biológica en conexión con la biosíntesis de la proteína por medio del organismo huésped. Con esta finalidad pueden emplearse métodos de la biología molecular. Sin embargo también pueden llevarse a cabo por vía química, por ejemplo por medio de la transformación química de una cadena lateral de un aminoácido o por medio de un enlace covalente de otro compuesto sobre la proteína. En el caso de un compuesto de este tipo puede tratarse, por ejemplo, de otras proteínas, que son enlazadas por ejemplo a través de enlaces químicos bifuncionales sobre polipéptidos de conformidad con la invención. De la misma manera, debe entenderse por derivatización el enlace covalente sobre otro soporte macromolecular. Tales modificaciones pueden influenciar, por ejemplo, la especificidad con respecto al substrato o la fuerza de enlace sobre el substrato o pueden provocar un bloqueo pasajero de la actividad enzimática, cuando la substancia acoplada esté constituida por un inhibidor. Esto puede ser conveniente, por ejemplo, para el período de tiempo correspondiente al almacenamiento. Por lo tanto, otra forma de realización corresponde a aquellos derivados, que han sido obtenidos por medio del enlace covalente sobre un soporte macromolecular, tal como, por ejemplo, el polietilenglicol o un polisacárido.

En el sentido de la presente invención, se reúnen bajo el concepto de polipéptido todos los polipéptidos, enzimas, proteínas, fragmentos y derivados, en tanto en cuanto no requieran ser citados como tales de manera explícita.

La actividad enzimática puede ser modificada de forma cualitativa o de forma cuantitativa por medio de otras regiones del polipéptido, que no participen en la reacción propiamente dicha. Esto se refiere, por ejemplo, a la estabilidad enzimática, a la actividad, a las condiciones de la reacción o a la especificidad con respecto al substrato. Esto se debe a que, por un lado, no se conocen exactamente que restos de aminoácidos del polipéptido, de conformidad con la invención, catalizan realmente la hidrólisis, la transesterificación y la esterificación, y a que, por otro lado, no puede excluirse en principio de forma definitiva la participación en la catálisis de determinadas funciones individuales. A las funciones auxiliares o a las actividades parciales pertenecen, por ejemplo, el enlace de un substrato, un producto intermedio o un producto final, la activación o la inhibición o la inducción de un efecto regulador sobre la actividad hidrolítica. En este caso puede tratarse por ejemplo también de la formación de un elemento estructural que se encuentre lejos del centro activo, o se trata de un péptido señal, cuya función se refiere a la segregación de la proteína formada a partir de la célula y/o a su plegamiento correcto y sin el cual no se forma in vivo, por regla general, ningún enzima capaz de funcionar. Desde luego debe catalizarse en conjunto una hidrólisis, una transesterificación y una esterificación.

Los polipéptidos, de conformidad con la invención, que proceden de fuentes naturales, son formas preferentes de realización de la presente invención, de manera especial cuando procedan de microorganismos tales como hongos o bacterias monocelulares. Esto se debe a que estos polipéptidos pueden ser manipulados en la mayoría de las ocasiones de una manera más sencilla que los organismos policelulares o que los cultivos celulares derivados de los metazoos. Éstos representan opciones convenientes para formas de realización especiales.

Son especialmente preferentes, de conformidad con la invención, los polipéptidos o los derivados procedentes de hongos eucariotas, especialmente aquellos que puedan desprender directamente en el medio circundante las proteínas secretadas.

Son muy especialmente preferentes de conformidad con la invención los polipéptidos o los derivados que pueden ser obtenidos a partir de microorganismos, que se eligen entre el grupo formado por Candida parapsilosis y, de manera preferente, formado por Candida parapsilosis CBS 604, Candida antarctica (Trychosporon oryzae, Pseudozyma antarctica) Candida glabrata, Candida albicans, Candida maltosa, Candida tropicalis, Candida viswanathii, Issatchenkia orientalis (Candida krusei), Kluyveromyces marxianus (C. kefyr, C. pseudotropicalis), Pichia guilliermondii (Candida guilliermondii), Geotrichum candidum, Fusarium solani y Aeromonas aerophila.

Entre los polipéptidos o derivados, de conformidad con la invención, que proceden de la especie Candida son preferentes, a su vez, aquellos que proceden de Candida parapsilosis, entre los cuales especialmente los que proceden de Candida parapsilosis CBS 604, puesto que han sido obtenidos originalmente a partir del mismo la forma de realización del enzima de conformidad con la invención, cuya secuencias correspondientes están dadas en el protocolo de secuencias.

Son preferentes, por motivos de producción industrial, respectivamente, aquellas cepas que segreguen al medio circundante el polipéptido formado.

Otro objeto de la invención está constituido por ácidos nucleicos, que codifican un polipéptido con actividad de lipasa/aciltransferasa, cuya secuencia de nucleótidos es idéntica en un 100% con respecto a la secuencia de nucleótidos que está indicada en la SEQ ID NO. 1, especialmente a través de la región parcial, que corresponde a los aminoácidos 190 hasta 390 de conformidad con la SEQ ID NO. 2. Por otra parte, se reivindican ácidos nucleicos, que codifican una secuencia de aminoácidos, que tiene una identidad de, al menos, el 80%, de manera preferente del 99,8% y, de manera especial, del 100% con respecto a la secuencia de aminoácidos que está indicada en la SEQ ID NO. 2, representando la secuencia de aminoácidos un polipéptido con actividad de lipasa/aciltransferasa. Son preferentes los ácidos nucleicos, que codifican una secuencia de aminoácidos, que es idéntica al menos en un 96% en las posiciones 190 hasta 390, con respecto a la secuencia de aminoácidos que está indicada en la SEQ ID NO. 2, representando la secuencia de aminoácidos un polipéptido con actividad de lipasa/aciltransferasa. Son especialmente preferentes los ácidos nucleicos, que codifican uno de los polipéptidos o derivados que han sido descritos precedentemente. El intervalo de similitud abarca también a todos los polipéptidos, cuya secuencia de nucleótidos sea idéntica al menos en un 85%, en un 87,5%, en un 90%, en un 92,5%, en un 95%, en un 96%, en un 97%, en un 98%, en un 99% o en un 100% con respecto a la secuencia de nucleótidos que ha sido indicada en la SEQ ID NO. 1.

Otro objeto de la invención corresponde a ácidos nucleicos que codifican un polipéptido con actividad de lipasa/aciltransferasa, cuya secuencia de nucleótidos es idéntica con la secuencia de nucleótidos que está indicada en la SEQ ID NO. 3.

Quedan abarcados en el ámbito de protección los ácidos nucleicos que codifican una secuencia de aminoácidos, que tiene una identidad de, al menos, un 80% con respecto a la secuencia de aminoácidos que está indicada en la SEQ ID NO. 4, representando la secuencia de aminoácidos un polipéptido con actividad de lipasa/aciltransferasa. El intervalo de similitud abarca así mismo a todos los polipéptidos, cuya secuencia de nucleótidos sea idéntica al menos en un 85%, en un 87,5%, en un 90%, en un 92,5%, en un 95%, en un 96%, en un 97%, en un 98%, en un 99% o en un 100% con respecto a la secuencia de nucleótidos que está indicada en la SEQ ID NO. 3.

Se entiende por ácidos nucleicos, en el sentido de la presente solicitud, aquellas moléculas que sirven como portadoras de información, que están constituidas de forma natural a partir de nucleótidos, que codifican series lineales de aminoácidos en proteínas o en enzimas. Los ácidos nucleicos pueden presentarse en forma de hebra individual, en forma de una hebra individual complementaria de esta hebra individual o en forma de doble hebra. El ácido nucleico ADN es preferente para los trabajos en biología molecular como portador de información duradero de forma natural. Por el contrario, para la realización de la invención en un medio natural, tal como por ejemplo en una célula de expresión, se forma un ARN, con lo cual las moléculas de ARN esenciales para la invención representan así mismo formas de realización de la presente invención.

En el ADN deben tomarse en consideración las secuencias de ambas hebras complementarias respectivamente en todas las posibles pautas de lectura. Así mismo debe tenerse en consideración que diversos tripletes de codón pueden codificar los mismos aminoácidos de tal manera, que puede derivarse una determinada serie de aminoácidos de varias secuencias de nucleótidos diferentes y que presenten posiblemente sólo una ligera identidad (degeneración del código genético). Así mismo diversos organismos presentan diferencias en cuanto a la utilización de este codón. Por estos motivos deben ser incorporados tanto las secuencias de aminoácidos así como también las secuencias de nucleótidos a la hora de tomar en consideración el ámbito de protección y las secuencias de nucleótidos indicadas deben ser consideradas respectivamente sólo como una codificación tomada como ejemplo para una determinada serie de aminoácidos.

La unidad de información, que corresponde a una proteína, se denomina también como gen en el sentido de la presente solicitud.

Un técnico en la materia tiene la posibilidad de preparar los ácidos nucleicos correspondientes hasta llegar a los genes completos por medio de los métodos conocidos actualmente en general, tales como, por ejemplo, la síntesis química o la reacción en cadena de polimerasa (RCP) en combinación con métodos estándar de la biología molecular y/o de la química de proteínas, por medio de las secuencias conocidas de ADN y/o de aminoácidos. Tales métodos son conocidos, por ejemplo, por la publicación "Lexikon der Biochemie", Spektrum Akademischer Verlag, Berlin, 1999, tomo 1, páginas 267-271 y tomo 2, páginas 227-229.

Se denominan mutaciones a las variaciones de la secuencia de nucleótidos, como las que pueden ser producidas, por ejemplo, por medio de métodos de la biología molecular, en sí conocidos. De conformidad con el tipo de la modificación se conocen, por ejemplo, mutaciones por deleción, por inserción o por substitución o aquellas en las que son fusionados entre sí (shuffling) diversos genes o partes de genes; éstas son mutaciones genéticas. Los organismos correspondientes se denominan mutantes. Las proteínas, que se derivan de los ácidos nucleicos mutados, se denominan variantes. De esta forma, las mutaciones por deleción, por inserción, por substitución o las fusiones conducen, por ejemplo, a genes mutados por deleción, por inserción, por substitución o a genes de fusión y, en el plano de las proteínas, conducen a las correspondientes variantes por deleción, por inserción o por substitución, y respectivamente a las proteínas de fusión.

Otra solución de la tarea de conformidad con la invención representa los organismos, que forman una proteína o un derivado de conformidad con la invención de forma natural o que contienen ácidos nucleicos, que codifican un polipéptido o un derivado de conformidad con la invención. Esto se debe a que su descubrimiento posibilita la implementación de la idea inventiva. Tales organismos son técnicas conocidas en general en la aplicación, por ejemplo por medio del aislamiento de cepas a partir de un habitat natural o por medio de la selección de genotecas. La secuencia de nucleótidos, que está indicada en la SEQ ID NO. 1, puede ser empleada en este caso, por ejemplo, en forma de sonda para llevar a cabo la selección o puede ser empleada como modelo para la construcción de cebadores correspondientes para la RCP. De manera análoga, pueden ser empleados péptidos de cadena corta o péptidos completos con secuencias de aminoácidos según la SEQ ID NO. 2, para llevar a cabo la formación de antisueros correspondientes, con cuya ayuda pueden ser identificados organismos correspondientes, o bien las proteínas liberadas por los mismos.

De conformidad con las realizaciones dadas precedentemente, los microorganismos son, de manera preferente los hongos de levadura, entre los cuales aquellos del género Candida, de manera especial Candida parapsilosis y, de forma muy especialmente preferente se trata de Candida parapsilosis CBS 604, puesto que estos microorganismos se han impuesto en los procesos industriales ante todo debido a la aptitud a ser cultivados y como organismos de producción con un rendimiento de producción especialmente elevado.

Son preferentes, por motivos de producción industrial, respectivamente, aquellas cepas que liberen en el medio que las circunda al polipéptido formado.

Es posible que los productores de origen natural ciertamente puedan preparar un enzima de conformidad con la invención, pero llevan a cabo su expresión y/o lo liberan en el medio circundante sólo en pequeña proporción bajo las condiciones determinadas en primer lugar. Por lo tanto, quedan abarcados dentro del ámbito de protección de la presente invención en tanto en cuanto se de la posibilidad de determinar por vía experimental condiciones medioambientales adecuadas o factores de baja molecularidad o de otro tipo, bajo cuya acción pueden ser estimulados para llevar a cabo una producción de la proteína de conformidad con la invención, que permita vislumbrar un aprovechamiento conveniente desde el punto de vista económico. Un mecanismo de regulación de este tipo puede ser empleado específicamente para la producción biotecnológica, por ejemplo para llevar a cabo la regulación de los promotores responsables.

De conformidad con la obtención, con la elaboración o con la preparación de una proteína, ésta puede ser asociada a otros productos diferentes, especialmente cuando haya sido obtenida a partir de productores de naturales de esta proteína. Por lo tanto puede ser combinada específicamente con otros productos determinados, pero así mismo independientemente de ello, por ejemplo para llevar a cabo un aumento de su estabilidad al almacenamiento. Por lo tanto, bajo el concepto de proteína, de conformidad con la invención, se entiende, además, todas las preparaciones de la proteína propiamente dicha, que es esencial para la invención. Esto es igualmente independiente de que en una determinada preparación esté desarrollada o no realmente esta actividad enzimática. Esto se debe a que puede ser deseable que no tenga ninguna actividad o que tenga solamente una baja actividad durante el almacenamiento y que la desarrolle solamente en el instante en el que se lleve a cabo el empleo de su función. Esto puede depender, por ejemplo, del estado de plegamiento de la proteína o puede resultar del enlace reversible de uno o de varios productos acompañantes procedentes de la preparación o de un mecanismo de control de otro tipo.

Los ácidos nucleicos forman el punto de partida para llevar a cabo las verificaciones y los desarrollos ulteriores desde el punto de vista de la biología molecular. Tales métodos están descritos, por ejemplo, en el manual de los autores Fritsch, Sambrook y Maniatis "Molecular cloning: a laboratory manual", Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, 1989. Así mismo, todos los métodos englobados en el estado de la técnica bajo el concepto de ingeniería de proteínas (Protein Engineering), de ingeniería genética y bioquímicos de proteínas están basados en el gen, especialmente en el gen clonado. Con tales métodos pueden ser optimizados todavía más los polipéptidos de conformidad con la invención con relación a diversas aplicaciones, por ejemplo por medio de la mutagénesis puntual o por medio de una fusión con secuencias procedentes de otros genes.

En un objeto propio de la invención, quedan incluidos los vectores, que contengan una de las regiones de ácidos nucleicos, que han sido descritas, que codifican un polipéptido de conformidad con la invención con actividad de lipasa/aciltransferasa.

Esto se debe a que, con objeto de tratar los ácidos nucleicos, se clona de manera conveniente el ADN en un vector. Los vectores son moléculas de ADN, que son adecuadas como moléculas de transporte (vehículo) para introducir (transformación) ADN foráneo en la célula huésped y eventualmente pueden ser replicados de manera autónoma en la misma. Los vectores que son empleados de manera frecuente están constituidos por plásmidos, es decir ADN bacteriano extracromosómico, en forma de anillo, de doble hebra, que pueden ser introducidos en otros microorganismos con ayuda de métodos adecuados y que pueden reproducirse en los mismos.

A los vectores pertenecen, por ejemplo, aquellos que se derivan de plásmidos bacterianos, de virus o de bacteriófagos, o los vectores o los plásmidos preponderantemente sintéticos con elementos de orígenes diversos. Los vectores son capaces de estabilizarse en las correspondientes células huésped a través de varias generaciones en forma de unidades estables con los otros elementos genéticos presentes de forma respectiva. En este caso carece de importancia, en el sentido de la invención, el que se establezcan en forma de unidades propias extracromosómicas o que se integren en un cromosoma. El sistema que es elegido, entre un gran número de sistemas, conocidos por el estado de la técnica, depende de cada caso particular. Pueden ser determinantes, por ejemplo, el número de copias que puede ser alcanzado, de los sistemas de selección que se encuentren disponibles, entre ellos ante todo las resistencias a los antibióticos, o la posibilidad de efectuar el cultivo de las células huésped, capaces de alojar a los vectores.

Los vectores forman puntos de partida adecuados para verificaciones de la biología molecular y bioquímicas del gen correspondiente o de la proteína correspondiente y para los desarrollos ulteriores de conformidad con la invención y, por último, para la amplificación y para la producción de las proteínas de conformidad con la invención. Por lo tanto, los vectores representan formas de realización de la presente invención, en tanto en cuanto las secuencias de las regiones de ácidos nucleicos, que están contenidas de conformidad con la invención, se encuentren dentro del intervalo de homología, que ha sido indicado más arriba con mayor detalle.

Las formas de realización preferentes de la presente invención son vectores de clonación. Estos vectores de clonación son adecuados para llevar a cabo la caracterización del gen correspondiente, además de para el almacenamiento, la amplificación biológica o la selección del gen interesante, por ejemplo por medio de la preparación de una carta de restricción o por medio de la secuenciación. Por lo tanto, los vectores de clonación son también formas preferentes de realización de la presente invención puesto que representan una forma transportable y almacenable del ADN reivindicado. Estos vectores también son puntos de partida preferentes para las técnicas de la biología molecular, que no dependen de las células, tal como por ejemplo la reacción en cadena de polimerasa.

Los vectores de expresión tienen secuencias parciales, que son capaces de replicarse en los organismos huésped optimizados para la producción de proteínas y de hacer que se verifique en los mismos la expresión del gen contenido. Las formas de realización preferentes son vectores de expresión, que portan a su vez los elementos genéticos, que son necesarios para llevar a cabo la expresión. La expresión es influenciada, por ejemplo, por promotores, que regulan la transcripción del gen. De este modo, la expresión puede llevarse a cabo por medio del promotor natural, que está localizado originalmente por delante de este gen, así como también puede llevarse a cabo después de una fusión, realizada por medio de la ingeniería genética, tanto por medio de un promotor de la célula huésped, preparado sobre el vector de expresión, así como también por medio de un promotor de otro organismo, modificado o completamente diferente.

Las formas de realización preferentes son aquellos vectores de expresión, que pueden ser regulados a través de modificaciones de las condiciones de cultivo o por medio del aporte de determinados compuestos, tales como, por ejemplo, la densidad celular o factores especiales. Los vectores de expresión posibilitan que la proteína correspondiente sea producida de forma heteróloga, es decir en otro organismo diferente de aquel a partir del cual puede ser obtenida de manera natural. Así mismo se encuentra dentro del ámbito de protección de la presente invención una obtención de proteína homóloga a partir de un organismo huésped que lleve a cabo la expresión de forma natural del gen por medio de un vector adecuado. Esta obtención puede presentar la ventaja de que pueden llevarse a cabo sobre la proteína formada reacciones de modificación naturales, que están relacionadas con la traducción, del mismo modo que las que se producirían también de forma natural.

Para llevar a cabo la obtención de los polipéptidos, de conformidad con la invención, son cultivados microorganismos, que han sido transformados con un vector de expresión, que contiene el gen estructural que codifica al enzima correspondiente. En este caso, los vectores de expresión se obtuvieron por medio de otros procedimientos, que están descritos más adelante. Los microorganismos especialmente preferentes, que son transformados con el vector de expresión, son Saccharomyces cerevisiae y Pichi pastoris. Los vectores preferentes son aquellos plásmidos cuyas cartas de restricción están representadas en las figuras 1 a 3.

A los vectores, que son empleados en el ámbito de la invención, pertenecen aquellos que se forman por medio de restricción con endonucleasas de restricción adecuadas, preferentemente con BamHI o con SnaBI y, a continuación, recombinación con las mitades correspondientes N-terminales y respectivamente C-terminales del gen estructural del enzima. Las endonucleasas de restricción son enzimas, que descomponen en fragmentos al ADN de doble hebra, específico del substrato, debido a que disocian los enlaces de diéster de fosfato entre los constituyentes nucleótidos individuales del ADN. Todas las endonucleasas de restricción son capaces de reconocer determinadas secuencias de bases del ADN, que marcan puntos específicos de actuación (puntos de restricción) para la actividad de las correspondientes endonucleasas de restricción. Con ocasión del troceado (restricción) del ADN de doble hebra se forman en algunas endonucleasas de restricción los denominados "extremos sobresalientes" específicos, que pueden unirse de nuevo (ligarse) bajo determinadas condiciones de renaturalización entre sí o con extremos sobresalientes correspondientes (complementarios) de fragmentos de ADN obtenidos por otra vía (recombinación).

De la misma manera, las formas de realización de la presente invención pueden ser sistemas de expresión exentos de células, en los cuales se lleva a cabo in vitro la biosíntesis de proteínas. Tales sistemas de expresión están igualmente establecidos en el estado de la técnica.

Otra forma de realización de este objeto de la invención representa células, que contienen uno de los vectores que han sido definidos precedentemente, de manera especial un vector de clonación o un vector de expresión. Esto se debe especialmente a que en el transcurso de los trabajos de biología molecular, como los que son necesarios, por ejemplo, para la mutagénesis, para la secuenciación o para el almacenamiento de los vectores, se lleva a cabo su transformación en células correspondientes. Con esta finalidad pueden ser adecuadas, por ejemplo, las bacterias gram-positivas, de manera especial sin embargo también las bacterias gram-negativas, en función del método.

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Otra forma de realización está constituida por células huésped, que llevan a cabo la expresión de un polipéptido o de un derivado del primer objeto de la invención o que pueden ser estimuladas para llevar a cabo su expresión, de manera preferente bajo el empleo de uno de los vectores de expresión que han sido definidos precedentemente.

Esto se debe a que la síntesis in-vivo preferente de un polipéptido de conformidad con la invención requiere la transferencia del gen correspondiente a una célula huésped. Como células huésped son adecuadas, en principio, todos los organismos, es decir los procariotas, los eucariotas o los cianofitos. Son preferentes aquellas células huésped, que puedan ser perfectamente manipuladas desde el punto de vista genético, lo cual corresponde por ejemplo a la transformación con el vector de expresión y su establecimiento estable, por ejemplo hongos o bacterias monocelulares. Por otra parte, las células huésped preferentes se caracterizan por una buena posibilidad de manipulación microbiológica y biotecnológica. Esto se refiere por ejemplo a la fácil posibilidad de cultivo, a las elevadas tasas de crecimiento, a las bajas exigencias en cuanto a los medios de fermentación y a las buenas tasas de producción y de secreción para proteínas foráneas. Los sistemas de expresión óptimos tienen que determinarse frecuentemente de forma experimental para cada caso particular a partir de un gran número de diversos sistemas, disponibles de conformidad con el estado de la técnica. Cada proteína de conformidad con la invención puede ser obtenida de esta forma a partir de una pluralidad de organismos huésped.

Representan formas preferentes de realización aquellas células huésped, que pueden ser reguladas en cuanto a su actividad como consecuencia de elementos reguladores genéticos, que están disponibles por ejemplo sobre el vector de expresión así como también que pueden estar presentes en estas células desde un principio. De forma ejemplificativa, estas células huésped pueden ser estimuladas para llevar a cabo la expresión por medio del aporte controlado de compuestos químicos tal como, por ejemplo, el metanol, que sirvan como activadores, por medio de la modificación de las condiciones de cultivo o por medio de la consecución de una densidad celular determinada. Esto posibilita una producción muy económica de las proteínas interesantes.

Una variante de este principio de ensayo está representada por sistemas de expresión, en los cuales genes adicionales influyen sobre la producción de proteínas de conformidad con la invención, por ejemplo aquellos genes que se ponen a disposición sobre otros vectores. En este caso puede tratarse de productos génicos modificados o puede tratarse de aquellos, que tengan que ser purificados conjuntamente con la proteína de conformidad con la invención, por ejemplo para influenciar su función. En este caso puede tratarse, por ejemplo, de otras proteínas o enzimas, de inhibidores o de aquellos elementos, que influyan la interacción con diversos substratos.

Las células huésped preferentes son las células procariotas o las células bacterianas. Las bacterias se caracterizan frente a los eucariotas, por regla general, por tiempos de generación más cortos y por menores exigencias en cuanto a las condiciones de cultivo. De este modo pueden establecerse procedimientos económicos para llevar a cabo la obtención de las proteínas de conformidad con la invención.

Son especialmente preferentes las células huésped, de manera especial las bacterias, que secretan en el medio circundante a la proteína o al derivado, que se han formado, de tal manera, que pueden ser purificadas directamente las proteínas expresadas de conformidad con la invención.

Es preferente la expresión heteróloga. Las bacterias gram positivas, tales como, por ejemplo, los actinomicetos o los bacilos, no tienen membrana externa de tal manera, que liberen a las proteínas secretadas directamente en el medio circundante. A las bacterias preferentes para llevar a cabo la expresión heteróloga pertenecen, por lo tanto, aquellas del género Bacillus, especialmente aquellas de las especies que están enumeradas más adelante.

De igual forma, las bacterias gram-negativas pueden ser utilizadas para llevar a cabo la expresión heteróloga. En el caso de estas bacterias se secreta una pluralidad de proteínas en la cavidad periplasmática, es decir en el compartimento situado entre las dos membranas, que rodean a las células. Esto puede ser ventajoso para aplicaciones especiales. A estas bacterias gram-negativas pertenecen, por ejemplo, aquellas de los géneros Klebsiella o Escherichia, de manera preferente de las especies que están enumeradas también más adelante.

De la misma manera, las células eucariotas pueden ser adecuadas para llevar a cabo la producción de los polipéptidos de conformidad con la invención. Ejemplos a este respecto son las levaduras tales como Saccharomyces o Kluyveromyces. Esto puede ser especialmente ventajoso, por ejemplo, cuando las proteínas deban sufrir modificaciones específicas en relación con su síntesis, que posibiliten tales sistemas. A estas modificaciones pertenecen, por ejemplo, el enlace de compuestos de bajo peso molecular tales como anclajes de la membrana u oligosacáridos.

Para llevar a cabo la producción de los polipéptidos, de conformidad con la invención, a partir de células huésped transformadas son especialmente preferentes los microorganismos, que son elegidos entre el grupo formado por Candida parapsilosis, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris, Pichia boidinii, Pichia stipitis, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces lactis, Schwanniomyces castellii, Yarrowia lipolytica, Escherishia coli, Bacillus subtilis, Bacillus amylolichefaciens, Bacillus stearothermophilus, Bacillus licheniformis, Lactococcus lactis, Streptococcus lactis, Lactobacillus bulgaricus, Aspergillus orizae, Aspergillus niger, Trichoderma reesei, Mucor sp y Rhizopus sp.

Las células huésped transformadas o denominadas también transformantes, se cultivan a continuación en una forma en sí conocida, de manera preferente tal como se describe en los ejemplos, y se aíslan los polipéptidos de conformidad con la invención, que se han formado.

Con objeto de llevar a cabo la obtención de los polipéptidos, de conformidad con la invención, pueden ser combinados en procedimientos todos los elementos, que ya han sido citados precedentemente. Por lo tanto, estos procedimientos representan otro objeto de la invención. En este caso, puede imaginarse una pluralidad de posibilidades de combinación de las etapas del procedimiento para cada proteína, de conformidad con la invención. Todas ellas llevan a cabo la implementación de la idea en la que está basada la presente invención, concretamente tomándose como representativa la obtención cuantitativa, con ayuda de la información genética correspondiente, de un tipo de proteína, que está definido por la actividad de lipasa/aciltransferasa y, al mismo tiempo, por la elevada homología con respecto a las secuencias, que están indicadas en los protocolos de secuencias. El procedimiento óptimo debe ser determinado, por vía experimental, para cada caso individual concreto.

En este caso de procede, en principio, de la siguiente manera: se ligan de manera adecuada los ácidos nucleicos de conformidad con la invención, es decir aquellos que se presentan dentro del intervalo de similitud, que ha sido definido precedentemente, con respecto a la secuencia de SEQ ID NO. 1 o de SEQ ID NO. 3, en forma del ADN de un vector de expresión adecuado. Este vector de expresión se transforma en la célula huésped, por ejemplo en células de una cepa bacteriana, que pueda ser cultivada fácilmente, que secrete en el medio nutriente circundante las proteínas, cuyos genes se encuentran bajo el control de elementos genéticos correspondientes; pueden proporcionarse, por ejemplo, por medio del vector de expresión, elementos reguladores para esta finalidad. A partir del medio circundante puede ser purificada la proteína de conformidad con la invención por medio de varias etapas de purificación, tales como, por ejemplo, precipitaciones o cromatografías. Un técnico en la materia es capaz de extrapolar a una escala de producción industrial un sistema, que haya sido optimizado experimentalmente a escala de laboratorio.

Otro objeto de la invención consiste en el empleo de microorganismos naturales y/o recombinantes, como los que han sido descritos precedentemente, que contienen un ácido nucleico para llevar a cabo la obtención de un polipéptido de conformidad con la invención, descrito precedentemente.

Otra aplicación, de conformidad con la invención, de los ácidos nucleicos y/o de la secuencia de aminoácidos, que han sido descritos precedentemente, que tienen una identidad de, al menos, un 49%, de manera preferente de un 80%, de manera preferente de, al menos, un 98%, de manera especialmente preferente de un 99,8% y, de manera especial, de un 100% con respecto a la secuencia de aminoácidos que está indicada en la SEQ ID NO. 2 y/o con respecto a la secuencia de aminoácidos que está indicada en la SEQ ID NO. 4, consiste en el descubrimiento de nuevas aciltransferasas.

Este descubrimiento de nuevos enzimas se denomina también selección. De manera especial se seleccionan genotecas de determinados organismos de conformidad con los métodos generales tales como, por ejemplo, los que están descritos en la publicación de los autores Fritsch, Sambrook y Maniatis "Molecular cloning: a laboratory manual", Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, 1989.

Por medio de una comparación con los enzimas conocidos, que están depositados por ejemplo en bancos de datos accesibles al público, pueden seguirse partes moleculares características a partir de la secuencia de aminoácidos o de la secuencia de nucleótidos tales como, por ejemplo, elementos estructurales o la actividad enzimática de un enzima considerado. Una comparación de este tipo se lleva a cabo por medio de la adscripción recíproca de series similares en las secuencias de nucleótidos o en las secuencias de aminoácidos de las proteínas consideradas. Esto se denomina homologación. Una adscripción tabulada de las posiciones correspondientes se denomina alineamiento. En el análisis de las secuencias de nucleótidos deben tenerse en consideración a su vez ambas hebras complementarias respectivamente del conjunto de las tres pautas de lectura posibles; de la misma manera debe tomarse en consideración la degeneración del código genético y el uso de codones. Entre tanto se han establecido alineaciones por medio de programas de ordenador, tal como por ejemplo por medio de los algoritmos FASTA o BLAST; esta forma de proceder está descrita por ejemplo por los autores D. J. Lipman y W. R. Pearson (1985) in Science, tomo 227, páginas 1435-1441. Se denomina secuencia de consenso a una recopilación de todas las posiciones coincidentes en las secuencias que han sido comparadas.

De igual modo, una comparación de este tipo permite una predicción sobre la similitud o la homología de las secuencias comparadas entre sí. Esta similitud se representa en porcentaje de identidad, es decir en la proporción de los nucleótidos o de los restos de aminoácidos, que son idénticos en las mismas posiciones. Otro concepto de homología adoptado incluye los intercambios conservados de aminoácidos en este valor con uno. Entonces se habla de porcentaje de similitud. Tales predicciones pueden llevarse a cabo a través de todas las proteínas o genes o únicamente a través de regiones individuales.

Las regiones homólogas de diversas proteínas son, en la mayoría de los casos, aquellas con elementos estructurales y/o funciones idénticas, que pueden reconocerse por medio de las coincidencias en la secuencia primaria de aminoácidos. La homología llega hasta la identidad total en las regiones más pequeñas, que se denominan cajas, que únicamente comprenden un número reducido de aminoácidos y que, en la mayoría de los casos ejercen funciones esenciales para la actividad total. Debe entenderse por funciones de las regiones homólogas, las funciones parciales mínimas de la función ejercida por el conjunto de la proteína, tal como, por ejemplo, la formación de enlaces por medio de puentes de hidrógeno individuales, para formar complejos de un substrato o complejos de transición.

Como consecuencia de los alineamientos, los polipéptidos de conformidad con la invención pueden adquirir ampliamente las mismas estructuras secundarias y terciarias que en el caso de las proteínas empleadas para llevar a cabo la homologación. Cuyos elementos estructurales pueden ser consultados en bancos de datos accesibles al público tales como, por ejemplo, en el EMBL-European Bioinformatics Institute (EBI) en Cambridge, Gran Bretaña (http://www.ebi.ac.uk), Swiss-Prot o GenBank (National Center for Biotechnology Information NCBI, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA). En el caso en que se produzcan estructuras que se desvíen de las anteriores o en el caso en que se ponga de manifiesto que existen diversas variantes de plegamiento con propiedades variables, lo cual concierne por ejemplo a las condiciones óptimas de reacción o a la especificidad con respecto al substrato, todas éstas quedan cubiertas por el ámbito de protección de la presente invención. Esto se debe a que, por un lado, el plegamiento puede depender de las condiciones de obtención, por ejemplo cuando esté presente o ausente el péptido conductor. Por otro lado, puede ponerse de manifiesto que estas variantes son especialmente adecuadas respectivamente para diversas posibilidades de aplicación.

Otro objeto de la invención consiste en el empleo de los polipéptidos descritos a modo de catalizadores en las reacciones de transferencia de grupos acilo, especialmente en las reacciones elegidas entre el grupo formado por la alcoholisis de los ésteres, especialmente de los gliceroles o de los esteroles, la alcoholisis de los tioésteres, la tiolisis de los ésteres, la aminolisis de un éster con hidroxilaminas o con hidrazinas; la reacción de un éster con peróxidos de hidrógeno y la síntesis enantioselectiva de ésteres, de tioésteres o de lactonas por medio de una alcoholisis. Las reacciones especiales que son catalizadas por los polipéptidos de conformidad con la invención están descritas, por ejemplo, en las publicaciones: a) Fournand et al. J. Mol. Catalysis B, 1998, 5, 207-211; b) Briand et al. Eur. J. Biochem. 1995, 228, 169-175.

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Ejemplos

1. Ejemplo

Cultivo de la cepa y aislamiento del polipéptido

Se depositó la cepa Candida parapsilosis (Ashford) Langeron y Talice, CBS 604 en el Centraalbureau voor Schimmelcultures, Yeast devision, Delft Países Bajos.

El cultivo se llevó a cabo de la misma forma que ha sido descrita por los autores Briand et al. en la publicación Eur. J. Biochem., 1995, 228, 169-175. El cultivo principal se ajustó a pH 6,5 con tampón de fosfato 100 mM y se combinó con 5 g/l de glucosa como fuente de carbono.

Al final de la fase exponencial de crecimiento se centrifugó el caldo de cultivo (7.000 g durante 15 minutos) y se obtuvo la lipasa/aciltransferasa a partir del sobrenadante líquido. La purificación del polipéptido se llevó a cabo según los métodos descritos en la publicación de los autores Riaublanc A. et al. J. Am. Oil Chem. Soc. 1993, 70, 497-500.

2. Ejemplo

Etapas de trabajo de biología molecular

Todas las etapas de trabajo de biología molecular siguen métodos estándar, como los que están indicados, por ejemplo, en los manuales tales como el de los autores Fritsch, Sambrook y Maniatis "Molecular cloning: a laboratory manual", Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, 1989.

Se midió el contenido en lipasa/aciltransferasa en unidades (U), determinado como contenido en ácido oleico que se obtiene por minuto en el caso de la hidrólisis de trioleilglicerol bajo las condiciones descritas por los autores Briand et al. en la publicación Eur. J. Biochem. 1995; 228; 169-175. La concentración en proteína se determinó según el método de Bradford (1976; Anal, Biochem. 72; 248-254).

3. Ejemplo

Expresión de un gen que contiene el ácido nucleico según la SEC ID NO. 1 en Saccharomyces cerevisiae

Para llevar a cabo la expresión de la secuencia de ácidos nucleicos deseada se llevó a cabo en primer lugar una hidrólisis parcial con la endonucleasa de restricción BamHI ADN. Se construyeron cebadores por medio de la RCP degenerada, que contiene el ácido nucleico según la SEQ ID NO. 1. Se emplearon los siguientes pares de cebadores (el codón de iniciación y el codón de detención están subrayados; el lado de restricción BamHI está escrito en negrita):

1

Para llevar a cabo la amplificación por RCP se ejecutó el siguiente programa de tiempo/temperatura: desnaturalizado durante 5 minutos a 95ºC y a continuación 30 ciclos de 1 minuto a 95ºC, 1 minuto a 50ºC, 1 minutos a 72ºC y como última etapa 10 minutos a 72ºC.

Los fragmentos, procedentes de la RCP, se sometieron a digestión con la endonucleasa de restricción BamHI y, a continuación, se ligaron en el vector pVT100-U, escindido con la endonucleasa de restricción BamHI, para formar un plásmido. Se obtuvo el vector pVT100CpLIP2 de conformidad con la figura 1 (plásmido replicativo). Se verificó la ausencia de mutaciones por medio de la secuenciación de los insertos. Se llevó a cabo la transformación del ADN neocombinado en la cepa Saccharomyces cerevisiae W303-1a de conformidad con el método de la electroporación descrito por los autores Becker et al. en la publicación Methods in Enzymology, 1991, 194, 182-187. Los transformantes se seleccionaron sobre medio YNB sin uracilo (6,7 g/l de Yeast nitrogen base sin aminoácidos de la firma [Difco], 20 g/l de glucosa, 150 mg/l de leucina, 100 mg/l de adenina, 100 mg/l de histidina, 100 mg/l de triptofano) con una frecuencia de 1-2x10^{4} transformantes por \mug de ADN. Los transformantes se seleccionaron en un ensayo de placa con respecto a la actividad de la lipasa de conformidad con el método de Kouker descrito en: Kouker G. et al., Applied Environ. Microbiol. 1987, 59, 211-213.

El transformante seleccionado se cultivó en un matraz sometido a sacudidas a 28ºC en medio YPD. (YPD = 10 g/l de extracto de levadura [Difco], 20 g/l de peptona Bacto [Difco], 60 g/l de glucosa, 150 mg/l de leucina, 100 mg/l de adenina, 100 mg/l de histidina y 100 mg/l de triptofano). El caldo de cultivo se recolectó al cabo de una fermentación durante 36 horas y el sobrenadante de la solución de cultivo se separó del residuo por medio de una centrifugación. El sobrenadante contenía 2.500 U de lipasa/aciltransferasa recombinante por litro y una actividad específica de 0,7 U/mg. Después de la concentración por medio de una ultrafiltración y de una cromatografía hidrófuga sobre Phenylsepharose 6 Fast-Flow Gel pudo obtenerse de nuevo el 10% de la actividad, con una actividad específica de 80 U/mg.

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4. Ejemplo

Expresión de un gen que contiene la SEQ ID NO. 1 en Pichia pastoris

Se llevó a cabo la expresión de la lipasa/aciltransferasa como fusión para dar un péptido N-terminal, que codifica la señal de secreción del factor \alpha a partir de Saccharomyces cerevisiae. En primer lugar se amplificó por RCP el gen de manera correspondiente a la SEQ ID NO. 1 y, de este modo, se obtuvo un gen escindido del gen maduro. Se emplearon los siguientes cebadores: (el codón de detención está subrayado, el primer codón de fenilalanina del gen maduro está escrito en negrita)

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2

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Con objeto de llevar a cabo la amplificación por medio de la RCP se ejecutó el siguiente programa de tiempo/temperatura: desnaturalizado durante 2 minutos a 94ºC y a continuación 15 ciclos de 15 segundos a 94ºC, 30 segundos a 50ºC, 90 segundos a 72ºC más 5 segundos por ciclo para los períodos de extensión del ciclo 11 y como última etapa 7 minutos a 72ºC.

Después de la amplificación se llevó a cabo una fosforilación del fragmento obtenido con T4-polinucleótido-lipasa y se tamponó con T4-ADN-polimerasa. El fragmento se ligó a continuación con un plásmido pPIC9K sometido a digestión con SnaBI y se obtuvo el vector pPIC9KCpLIP2 (plásmido replicativo) (figura 2). Se verificó la ausencia de mutaciones por medio de la secuenciación de los insertos.

Se llevó a cabo la transformación de los esferoplastos de levadura con el estuche de expresión Pichia de la firma Invitrogen (Groningen Países Bajos). La frecuencia de transformación fue de 10^{3} transformaciones por \mug de
ADN.

Se cultivó en un fermentador un transformante seleccionado con un medio sintético descritos por los autores Boze et al. En la publicación: (Boze H. et al.; Process Biochem, 2001, 36, 907-913) al que se le agregaron 40 g de glicerol. Después de la fase de crecimiento (al cabo de 2.500 minutos de fermentación) según el procedimiento por tandas, se aportó metanol puro (5 g/l) en el procedimiento de alimentación por tandas con objeto de inducir la expresión del gen. Al cabo de 4 días de cultivo con una elevada densidad celular se separó del residuo el sobrenadante del caldo de cultivo por medio de una centrifugación. El sobrenadante obtenido contenía 102.000 U/l de lipasa/aciltransferasa recombinante con una actividad específica de 80 U/mg de proteína. Una concentración por medio de ultrafiltración con membranas 10.000 kD cut-off proporcionó una concentración en enzima de 830.000 U/l con una actividad específica de 150 U/mg.

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5. Ejemplo

Expresión de una lipasa/aciltransferasa modificada (His-tagged) en Saccharomyces cerevisiae

Para llevar a cabo la expresión de la deseada secuencia de ácidos nucleicos modificada de conformidad con la SEQ ID NO 3, que posibilita la fusión del péptido 6-His con el extremo C-terminal de la secuencia del polipéptido de conformidad con la SEQ ID NO 2, se llevó a cabo en primer lugar una hidrólisis parcial con la endonucleasa de restricción BamHI ADN. Se construyeron cebadores por medio de la RCP, que contienen los ácidos nucleicos de conformidad con la SEQ ID NO. 1. Fueron empleados los siguientes pares de cebadores, que posibilitan una extensión de la secuencia de ácidos nucleicos con 6 codones de histidina (el codón de iniciación y el codón de detención están subrayados; el lado de restricción BamHI está escrito en negrita, los codones His están descritos en cursiva):

3

Con objeto de llevar a cabo la amplificación por medio de la RCP se ejecutó el siguiente programa de tiempo/temperatura: desnaturalizado durante 5 minutos a 95ºC y a continuación 30 ciclos de 1 minuto a 95ºC, 1 minuto a 50ºC, 1 minuto a 72ºC y como última etapa 10 minutos a 72ºC.

Los fragmentos, procedentes de la RCP, se sometieron a digestión con la endonucleasa de restricción BamHI y, a continuación, se ligaron en el vector pVT100-U escindido con la endonucleasa de restricción BamHI. Se obtuvo el vector pVT100CpLIP2His según la figura 3 (plásmido integrativo). La transformación de Saccharomyces cerevisiae W303-1a y la expresión del gen se llevaron a cabo de conformidad con el ejemplo 3.

El transformante seleccionado se cultivó en matraces sometidos a sacudidas a 28ºC en medio YPD (YPD = 10 g/l de extracto de levadura [Difco], 20 g/l de peptona Bacto [Difco], 60 g/l de glucosa, 150 mg/l de leucina, 100 mg/l de adenina, 100 mg/l de histidina y 100 mg/l de triptofano). El caldo de cultivo se separó al cabo de una fermentación durante 36 horas y el sobrenadante de la solución de cultivo se separó del residuo por medio de una centrifugación. El sobrenadante contenía 3.100 U de lipasa/aciltransferasa his-tagged recombinante por litro y una actividad específica de 0,25 U/mg de proteína. Se aprovecharon las propiedades formadoras de quelatos con iones para llevar a cabo una purificación en una etapa. Con esta finalidad se empleó el gel de afinidad Ni-NitriloTriacetic-Acid Agarose de la firma Qiagen, en la forma descrita por el fabricante. Se obtuvo un 26% del enzima con una actividad específica de 150 U/mg de proteína.

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<110> Cognis Deutschland GmbH

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<120> Lipasa/aciltransferasa

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<130> C2425

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<140>

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<141>

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<160> 4

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<170> PatentIn Ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 1398

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<212> ADN

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<213> Candida parapsilosis

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)..(1398)

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<400> 1

4

5

6

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<210> 2

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<211> 465

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<212> PRT

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<213> Candida parapsilosis

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<400> 2

7

8

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<210> 3

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<211> 1416

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<212> ADN

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<213> Candida parapsilosis

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)..(1416)

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<400> 3

9

10

11

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<210> 4

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<211> 471

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<212> PRT

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<213> Candida parapsilosis

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<400> 4

12

13

Claims (36)

1. Polipéptidos con actividad de lipasa/aciltransferasa, con una secuencia de aminoácidos, que tiene una identidad de, al menos, el 80% con respecto a la secuencia de aminoácidos indicada en la SEQ ID No. 2.

2. Polipéptidos con actividad de lipasa/aciltransferasa, con una secuencia de aminoácidos, que es idéntica en las posiciones 190 hasta 390 al menos en un 80% con respecto a la secuencia de aminoácidos que está indicada en la SEQ ID No. 2.

3. Polipéptidos con actividad de lipasa/aciltransferasa, con una secuencia de aminoácidos, que es idéntica en las posiciones 190 hasta 390 al menos en un 96% con respecto a la secuencia de aminoácidos que está indicada en la SEQ ID No. 2.

4. Polipéptidos con actividad de lipasa/aciltransferasa, con una secuencia de aminoácidos, que es idéntica a la secuencia de aminoácidos que está indicada en la SEQ ID No. 2.

5. Polipéptidos según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizados porque se presentan en estado glicosilado.

6. Polipéptidos según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizados porque están enlazados con otro péptido.

7. Polipéptidos según la reivindicación 6, caracterizados porque el otro péptido está constituido por un marcador, preferentemente está constituido por his-tag.

8. Polipéptidos con una secuencia de aminoácidos, que tiene una identidad del 80% como mínimo con respecto a la secuencia de aminoácidos que está indicada en la SEQ ID No. 4.

9. Polipéptidos con una secuencia de aminoácidos, que es idéntica en un 100% con respecto a la secuencia de aminoácidos que está indicada en la SEQ ID No. 4.

10. Fragmento polipéptido o polipéptidos, que pueden ser obtenidos por medio de una mutación por deleción, con actividad de lipasa/aciltransferasa, según una de las reivindicaciones 1 a 9.

11. Polipéptidos con actividad de lipasa/aciltransferasa según las reivindicaciones 1 a 10, cuya cadena pura de aminoácidos ha sido químicamente modificada.

12. Polipéptidos según al menos una de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizados porque pueden ser obtenidos de forma natural a partir de un microorganismo.

13. Polipéptidos según la reivindicación 12, caracterizados porque el microorganismo está constituido por un hongo eucariota, de manera preferente está constituido por hongos de levadura.

14. Polipéptidos según la reivindicación 12, caracterizados porque pueden ser obtenidos a partir de microorganismos, elegidos entre el grupo que está formado por Candida parapsilosis, Candida antarctica (Trychosporon oryzae, Pseudozyma antarctica), Candida glabrata, Candida albicans, Candida maltosa, Candida tropicalis, Candida viswanathii, Issatchenkia orientalis (Candida krusei), Kluyveromyces marxianus (C. kefyr, C. pseudotropicalis), Pichia guilliemondii (Candida guilliermondii), Geotrichum candidum, Fusarium solani y Aeromonas aerophila.

15. Ácidos nucleicos, que codifican un polipéptido con actividad de lipasa/aciltransferasa, cuya secuencia de nucleótidos es idéntica en un 100% con respecto a la secuencia de nucleótidos que está indicada en la SEQ ID No. 1, especialmente a través de la región parcial, que corresponde a los aminoácidos 190 hasta 390 de conformidad con la SEQ ID No. 2.

16. Ácidos nucleicos, que codifican una secuencia de aminoácidos, que tiene una identidad de, al menos, un 80% con respecto a la secuencia de aminoácidos que está indicada en la SEQ ID No. 2, representando la secuencia de aminoácidos un polipéptido con actividad de lipasa/aciltransferasa.

17. Ácidos nucleicos, que codifican una secuencia de aminoácidos, que es idéntica en las posiciones 190 hasta 390 al menos en un 96% con respecto a la secuencia de aminoácidos que está indicada en la SEQ ID No. 2, representando la secuencia de aminoácidos un polipéptido con actividad de lipasa/aciltransferasa.

18. Ácidos nucleicos, que codifican uno de los polipéptidos o derivados que han sido indicados en las reivindicaciones 1 a 14.

19. Ácidos nucleicos, que codifican un polipéptido con actividad de lipasa/aciltransferasa, cuya secuencia de nucleótidos es idéntica a la secuencia de nucleótidos que está indicada en la SEQ ID No. 3.

20. Ácidos nucleicos, que codifican una secuencia de aminoácidos, que tiene una identidad de un 80% como mínimo con respecto a la secuencia de aminoácidos que está indicada en la SEQ ID No. 4, representando la secuencia de aminoácidos un polipéptido con actividad de lipasa/aciltransferasa.

21. Vector, que contiene uno de los ácidos nucleicos indicados en las reivindicaciones 15 a 20, que codifica uno de los polipéptidos o derivados que han sido indicados en las reivindicaciones 1 a 14.

22. Vector de clonación según la reivindicación 21.

23. Vector de expresión según la reivindicación 21.

24. Célula, que contiene un vector según una de las reivindicaciones 21 a 23.

25. Célula huésped transformada, que expresa uno de los polipéptidos o derivados que han sido indicados en las reivindicaciones 1 a 14 o que puede ser inducida para llevar a cabo su expresión, por medio del empleo de un vector de expresión según la reivindicación 23.

26. Célula huésped transformada según la reivindicación 25, que contiene un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos, que tiene una identidad del 100% con respecto a la secuencia de aminoácidos que está indicada en la SEQ ID No. 2.

27. Célula huésped transformada según la reivindicación 25 y/o 26, que contiene un ácido nucleico, que codifica una secuencia de aminoácidos, que tiene una identidad de un 80% como mínimo con respecto a la secuencia de aminoácidos que está indicada en la SEQ ID No. 2.

28. Célula huésped transformada según la reivindicación 25, que contiene un ácido nucleico, que codifica una secuencia de aminoácidos, que tiene una identidad del 100% con respecto a la secuencia de aminoácidos que está indicada en la SEQ ID No. 4.

29. Célula huésped transformada según la reivindicación 25 y/o 26, que contiene un ácido nucleico, que codifica una secuencia de aminoácidos, que tiene una identidad de un 80% como mínimo con respecto a la secuencia de aminoácidos que está indicada en la SEQ ID No. 4.

30. Células huésped transformadas según una de las reivindicaciones 25 a 29, caracterizadas porque las células huésped, que deben ser transformadas, están constituidas por células huésped procedentes de microorganismos.

31. Células huésped transformadas según una de las reivindicaciones 25 a 30, caracterizadas porque las células huésped, que deben ser transformadas, están constituidas por células huésped procedentes de microorganismos, que se eligen entre el grupo que está formado por Candida parapsilosis, Saccharamyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris, Pichia boidinii, Pichia stipitis, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces lactis, Schwanniomyces castellii, Yarrowia lipolytica, Escherishia coli, Bacillus subtilis, Bacillus amylolichefaciens, Bacillus stearothermophilus, Bacillus licheniformis, Lactococcus lactis, Streptococcus lactis, Lactobacillus bulgaricus, Aspergillus orizae, Aspergillus niger, Trichoderma reesei, Mucor sp. y Rhizopus sp.

32. Procedimiento para la obtención de un polipéptido según, al menos, una de las reivindicaciones 1 a 14, por medio del empleo de un ácido nucleico, que codifica una secuencia de aminoácidos, que tiene una identidad de un 80% como mínimo con respecto a la secuencia de aminoácidos que está indicada en la SEQ ID No. 2 y/o por medio del empleo de un vector según una de las reivindicaciones 21 a 23 y/o por medio del empleo de una célula huésped transformada según una de las reivindicaciones 25 a 31 o con empleo de una célula, que lo forma de manera natural.

33. Empleo de microorganismos naturales y/o recombinantes, que contienen un ácido nucleico para la obtención de un polipéptido según, al menos, una de las reivindicaciones 1 a 14.

34. Empleo de un ácido nucleico según las reivindicaciones 15 a 20 y/o empleo de secuencias de aminoácidos, que tienen una identidad de un 80% como mínimo con respecto a la secuencia de aminoácidos que está indicada en la SEQ ID No. 2, para llevar a cabo el descubrimiento de nuevas aciltransferasas.

35. Empleo de un ácido nucleico según las reivindicaciones 15 a 20 y/o empleo de secuencias de aminoácidos, que tienen una identidad de un 80% como mínimo con respecto a la secuencia de aminoácidos que está indicada en la SEQ ID No. 4, para llevar a cabo el descubrimiento de nuevas aciltransferasas.

36. Empleo de polipéptidos según la reivindicación 1 a 14 como catalizadores en las reacciones de transferencia de grupos acilo, de manera especial en las reacciones que están elegidas entre el grupo formado por la alcoholisis de los ésteres, la alcoholisis de los tioésteres, la tiolisis de los ésteres, la aminolisis de un éster con hidroxilaminas o con hidrazinas; la reacción de un éster con peróxidos de hidrógeno y la síntesis enantioselectiva de ésteres, de tioésteres, de lactonas por medio de una alcoholisis.