JP5100291B2 - Fluorescent nanoparticles and method for observing biological material using the same - Google Patents
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Description
本発明は、蛍光性ナノ粒子、及び、それを用いて生体物質を観察する方法に関する。 The present invention relates to fluorescent nanoparticles and a method for observing biological materials using the same.
結晶がナノサイズの径をもつシリコンナノ粒子は、可視領域において、結晶サイズ依存性の蛍光性／発光性を示すことが知られている。この蛍光発光は、従来の蛍光プローブである、有機蛍光色素や蛍光タンパク質等の標識剤と比較すると、光による分解を受けにくく、退色が非常に遅いという特徴をもつ。このような蛍光性シリコンナノ粒子は、電気化学的手法により製造できることが知られている（特許文献１）。 It is known that silicon nanoparticles having a nano-sized crystal have a crystal size-dependent fluorescence / luminescence property in the visible region. This fluorescent light emission is characterized by being less susceptible to light degradation and fading very slowly compared to conventional fluorescent probes such as organic fluorescent dyes and fluorescent proteins. It is known that such fluorescent silicon nanoparticles can be produced by an electrochemical technique (Patent Document 1).
しかしながら、従来の製造方法では、シリコンナノ粒子の収量は十分では無く、操作も複雑でり、また、保存期間も水溶液中に数日しか保存出来なかった。そこで、本発明の目的は、より簡便な方法で、高い蛍光強度と親水性をもち、水溶液中でも長期保存が可能な蛍光性シリコンナノ粒子を、高収率で製造することにある。製造された蛍光性シリコンナノ粒子を用いて、生体物質を観察する方法を提供する。 However, in the conventional manufacturing method, the yield of silicon nanoparticles is not sufficient, the operation is complicated, and the storage period can be stored in an aqueous solution for only a few days. Therefore, an object of the present invention is to produce fluorescent silicon nanoparticles with a high yield by a simpler method, having high fluorescence intensity and hydrophilicity and capable of being stored for a long time even in an aqueous solution. Provided is a method for observing a biological material using the produced fluorescent silicon nanoparticles.
上記課題を解決すべく、蛍光性シリコンナノ粒子の製造方法は、シリコン基体にフッ化水素酸溶液と硝酸との第１の混合溶液を作用させる工程と、前記第１の混合溶液を作用させたシリコン基体に、フッ化水素酸溶液と硝酸と水との第２の混合溶液を作用させる工程と、前記第２の混合溶液を作用させたシリコン基体を、さらにフッ化水素酸と水との第３の混合溶液の蒸気にさらす工程と、を含むことを特徴とする。
In order to solve the above problems, a manufacturing method of the fluorescent silicon nanoparticles, the step of reacting a first mixture solution of hydrofluoric acid solution and nitric acid to the silicon substrate, by the action of the first mixed solution A step of allowing a second mixed solution of hydrofluoric acid solution , nitric acid and water to act on the silicon substrate; and a silicon substrate on which the second mixed solution is acted, and further comprising hydrofluoric acid and water . Exposing to the vapor of the third mixed solution.
また、発明の蛍光性シリコンナノ粒子の製造方法は、シリコン基体にフッ化水素酸溶液と硝酸との第１の混合溶液を作用させる工程と、前記第１の混合溶液を作用させたシリコン基体に、フッ化水素酸溶液と硝酸と水との第２の混合溶液を作用させる工程と、前記第２の混合溶液を作用させたシリコン基体を、さらにフッ化水素酸溶液と水との第３の混合溶液に浸す工程と、を含むことを特徴とする。 The method for producing fluorescent silicon nanoparticles according to the invention includes a step of applying a first mixed solution of hydrofluoric acid solution and nitric acid to a silicon substrate, and a silicon substrate having the first mixed solution applied thereto. A step of applying a second mixed solution of hydrofluoric acid solution , nitric acid and water , a silicon substrate on which the second mixed solution is applied , and a third base of hydrofluoric acid solution and water. Dipping in a mixed solution.
１．ポーラスシリコンの製造
＜ステップ１＞ まず、シリコンウエハ等のシリコン基体１０を用意し、適度な大きさ（例えば、約５ｃｍ×５ｃｍ）にカットする。次に、図１に示すように、容器１５中の濃フッ化水素酸溶液（ＨＦ、ＨＦ含有量４６％）と、濃硝酸（ＨＮＯ３、ＨＮＯ３含有量７０％）の第1の混合溶液３０に、カットしたシリコン基体１０の一端１１を、１〜５ｍｍ程度浸ける。
1. Production of Porous Silicon <Step 1> First, a
ここで用いる混合溶液のＨＦとＨＮＯ３との混合比は、体積比において、ＨＦ：ＨＮＯ３＝２：１〜１：２の範囲である。混合溶液中のＨＮＯ３の割合が少なすぎると、十分にシリコン基体のエッチングが進行せず、多すぎると反応速度が速すぎ、均一なエッチングを行なうことができない。 The mixing ratio of HF and HNO 3 in the mixed solution used here is in the range of HF: HNO 3 = 2: 1 to 1: 2 in the volume ratio. If the ratio of HNO 3 in the mixed solution is too small, the etching of the silicon substrate does not proceed sufficiently, and if it is too large, the reaction rate is too fast and uniform etching cannot be performed.
また、この段階で、シリコン基体を完全に混合溶液に浸すと、エッチング速度が過度に速くなり、均一にポーラスシリコンが形成されない。よって、上記の如くシリコン基体の一部を混合溶液に浸すのが好ましい。 Further, if the silicon substrate is completely immersed in the mixed solution at this stage, the etching rate becomes excessively high and porous silicon is not uniformly formed. Therefore, it is preferable to immerse a part of the silicon substrate in the mixed solution as described above.
シリコン基体の一端を混合溶液に浸す時間は、０．５〜５秒の範囲である。浸す時間が短いと、エッチングが均一に進行せず、十分なポーラスシリコンが形成されない。一方、浸す時間が長すぎると、形成されたポーラスシリコンが溶出してしまう。この処理は、室温で行なうことができる。 The time for immersing one end of the silicon substrate in the mixed solution is in the range of 0.5 to 5 seconds. If the immersion time is short, the etching does not proceed uniformly and sufficient porous silicon is not formed. On the other hand, when the immersion time is too long, the formed porous silicon is eluted. This treatment can be performed at room temperature.
＜ステップ２＞ 次に、図２に示すように、上記ステップ１で処理したシリコン基体１０を、容器３５内のＨＦとＨＮＯ３と水との第２の混合溶液４０に浸す。ここで用いる混合溶液中のＨＦとＨＮＯ３との混合比は、体積比において、ＨＦ：ＨＮＯ３＝１：１〜１：５の範囲である。また、ＨＦと水との混合比は、体積比において、ＨＦ：Ｈ２Ｏ＝１：３〜１：５の範囲である。なお、この混合溶液の組成比を調整することによって、様々な蛍光波長を示すポーラスシリコンを製造することができる。
<Step 2> Next, as shown in FIG. 2, the
混合溶液に浸す時間は、目的とするポーラスシリコンや、用いる混合溶液の組成により適宜選択できるが、通常２〜１０分の範囲である。また、この処理は室温で行うことができる。 The time for dipping in the mixed solution can be appropriately selected depending on the intended porous silicon and the composition of the mixed solution to be used, but is usually in the range of 2 to 10 minutes. This treatment can be performed at room temperature.
なお、組成比を変えた複数の混合溶液を用いて、シリコン基体を混合溶液に浸す処理を、複数段階で行ってもよい。 In addition, you may perform the process which immerses a silicon base | substrate in a mixed solution using the several mixed solution from which composition ratio was changed in multiple steps.
＜ステップ３＞ その後、ステップ２の処理を経たシリコン基体１０を、水、又は、エタノール等の有機溶媒で洗浄し、乾燥させる。本方法によって生成したポーラスシリコンの蛍光スペクトルは、蛍光分光光度計を用いて測定することができる。なお、洗浄用の有機溶媒には、メタノール等の他のアルコール性溶媒を用いても良い。
２．シリコンナノ粒子の分離
＜ステップ１＞ 図３（ａ）に、上記の方法でエッチング処理を行なったシリコン基体１０を示す。上がシリコン基体１０の断面図であり、下が該シリコン基体１０の上面図である。シリコン基体１０の表面上には、ＨＮＯ３を使用した表面処理によって、シリコンナノ粒子１２と、アモルファスシリコン膜１３が形成されている。アモルファスシリコン膜１３は、後述の、超音波処理によるシリコンナノ粒子の分離の妨げになるため、まず、これを除去する。なお、ここでいうアモルファスシリコン膜１３とは、アモルファス状のものに限定されず、他の形状を有している場合もある。
<
2. Separation of Silicon Nanoparticles <Step 1> FIG. 3A shows a
以下、アモルファスシリコン膜１３の除去方法について説明する。上記の方法でエッチング処理を行ったシリコン基体１０を適度な大きさ（例えば、約１ｃｍ×１ｃｍ）にカットする。次に、図４に示すように、ホットスターラ２１で、ＨＦとＨ２Ｏの混合溶液（第三の混合溶液）５０を入れた容器４５を加温する。そして、ピンセット２０によって挟持したシリコン基体１０を、容器４５上でシリコン粒子の形成面を下にして、ＨＦ水溶液５０の蒸気にさらし、アモルファスシリコン膜１３の除去処理を行う。
Hereinafter, a method for removing the
ここで用いるＨＦ水溶液の濃度は５〜４６％の範囲である。ＨＦ濃度が薄すぎると、十分にアモルファスシリコン膜１３を除去することができない。濃すぎると、処理時間を最適とするのが困難になる。
The concentration of the HF aqueous solution used here is in the range of 5 to 46%. If the HF concentration is too low, the
なお、ＨＦ水溶液の温度は、３０〜７０℃の範囲である。水溶液温度が低すぎると、十分にアモルファスシリコン膜１３を除去することができず、高すぎると反応が進行しすぎるため、シリコンナノ粒子の回収量が低下する。
In addition, the temperature of HF aqueous solution is the range of 30-70 degreeC. If the temperature of the aqueous solution is too low, the
さらに、ＨＦ水溶液の蒸気で処理する時間は１〜２４０秒の範囲である。処理時間が短すぎると、十分にアモルファスシリコン膜１３を除去することができず、長すぎると反応が進行しすぎるため、シリコンナノ粒子の回収量が低下する。この処理は、室温で行うことができる。
Furthermore, the processing time with the steam of the HF aqueous solution is in the range of 1 to 240 seconds. If the treatment time is too short, the
なお、図５に示すように、ホットスターラ２１により加温した容器４５中のＨＦ水溶液５０に、カットしたシリコン基体１０を浸して処理を行ってもよい。
In addition, as shown in FIG. 5, you may process by immersing the cut silicon base |
ここで用いるＨＦ水溶液の濃度は、蒸気にさらす場合と同様の、５〜４６％の範囲である。ＨＦ濃度が薄すぎると、十分にアモルファスシリコン膜１３を除去することができず、高すぎると、処理が進行しすぎるため、シリコンナノ粒子の回収量が低下する。
The concentration of the HF aqueous solution used here is in the range of 5 to 46%, which is the same as in the case of exposure to steam. If the HF concentration is too low, the
ＨＦ水溶液の温度は、２０〜６０℃の範囲である。これについても、水溶液の温度が低すぎると、十分にアモルファスシリコン膜１３を除去することができず、水溶液温度が高すぎると処理が進行しすぎるために、シリコンナノ粒子の回収量が低下するからである。
The temperature of the aqueous HF solution is in the range of 20-60 ° C. Also in this case, if the temperature of the aqueous solution is too low, the
ＨＦ水溶液中による処理時間は、１〜１８０秒の範囲である。処理時間が短すぎると、十分にアモルファスシリコン膜１３を除去することができず、長すぎると処理が進行しすぎるため、シリコンナノ粒子の回収量が低下する。この処理は、室温で行うことができる。
The processing time in the HF aqueous solution is in the range of 1 to 180 seconds. If the treatment time is too short, the
図３（ｂ）に、アモルファスシリコン膜１３除去処理後の、シリコン基体１０を示す。上がシリコン基体１０の断面図であり、下が該シリコン基体１０の上面図である。以上の処理によって、シリコン基体１０の表面からアモルファスシリコン膜１３が除去され、後述の超音波処理によって、高収率でシリコンナノ粒子の回収を行うことができる。
FIG. 3B shows the
＜ステップ２＞ 上記ステップ１でアモルファスシリコン膜１３を除去したシリコン基体１０を、水、又は、エタノール等の有機溶媒でよく洗浄して乾燥させる。このとき、後述の超音波処理の際に用いる溶液６０に、洗浄液と同様のものを用いる場合には乾燥させる必要はない。なお、洗浄用の有機溶媒には、メタノール等の他のアルコール性溶媒を用いても良い。
<Step 2> The
＜ステップ３＞ まず、水、又は、エタノール等の有機溶媒よりなる溶液６０を満たしたガラス容器５５に、上記ステップ２で洗浄処理を行なったシリコン基体１０を浸し、ガラス容器５５を蓋２２により封止する。次に、ガラス容器５５を超音波洗浄機２３中に載置し、超音波処理を行う（図６参照）。この超音波処理によって、シリコン基体１０の表面上から、シリコンナノ粒子が分離される。さらに、シリコン基体１０をガラス容器５５から取り除き、シリコンナノ粒子の含まれる上澄のみを遠心分離機によって分取し、図７に示すような、シリコンナノ粒子懸濁７０を得ることができる。
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シリコン基体１０の超音波処理時間は０．５〜２０分の範囲である。処理時間が短すぎるとシリコンナノ粒子を十分に回収することができず、長すぎると均一な粒径や粒形の粒子を回収することができない。回収したシリコンナノ粒子懸濁液の吸収と蛍光スペクトルは、吸光分光光度計と蛍光分光光度計で測定することができる。この処理は室温で行うことができる。
The ultrasonic treatment time of the
また、この処理は一度に数枚のシリコン基体を容器に入れて行うことができる。一度に処理できるシリコン基体の枚数は、用いる容器によるため限定するものではない。 Further, this treatment can be performed by putting several silicon substrates in a container at a time. The number of silicon substrates that can be processed at one time is not limited because it depends on the container used.
また、異なる複数のシリコン基体を用い、繰り返しステップ３の操作を行うことで、高濃度のシリコンナノ粒子懸濁液を得ることができる。なお、カットされたシリコン基体１枚について、ステップ１〜３を数回繰り返すことで、シリコン基体表面上からすべてのシリコンナノ粒子を回収することができる。通常、３〜４回の繰り返すことで、シリコン基体上のシリコンナノ粒子を完全に分離、回収することが可能である。
３．アリル化合物によるシリコンナノ粒子の表面修飾
＜ステップ１＞ 上記の方法で得られたシリコンナノ粒子の表面修飾は、アリル化合物を作用させることにより行うことができる。これによって、シリコンナノ粒子表面上に、該アリル化合物が有する官能基を導入することができる。アリル化合物の有する官能基としては、アミノ基、チオール基、メチル基、エチル基等があるが、中でも、アミノ基、チオール基が好ましい。
Moreover, a high concentration silicon nanoparticle suspension can be obtained by performing the operation of
3. Surface Modification of Silicon Nanoparticles with Allyl Compound <Step 1> The surface modification of silicon nanoparticles obtained by the above method can be performed by allowing an allyl compound to act. Thereby, the functional group of the allyl compound can be introduced onto the surface of the silicon nanoparticle. Examples of the functional group possessed by the allyl compound include an amino group, a thiol group, a methyl group, and an ethyl group, and among them, an amino group and a thiol group are preferable.
まず、シリコンナノ粒子懸濁液中の溶媒をエバポレータ等で完全に留去して、アリルアミンやアリルメルカプタンをこれに加えて懸濁させ、アミノ化試薬とシリコンナノ粒子の懸濁液８０とする。次に、図８に示すように、ガラス容器５５中に、アリルアミンやアリルメルカプタン等のアミノ化試薬とシリコンナノ粒子の懸濁液８０を移し、白金触媒を加えて撹拌子２５とスターラ２４を用いて攪拌することで、表面修飾を行う。この処理は室温で行うことができる。
First, the solvent in the silicon nanoparticle suspension is completely distilled off with an evaporator or the like, and allylamine or allyl mercaptan is added and suspended therein to obtain a
反応溶液中の白金触媒の濃度は、アリル化合物の種類によるが、通常０．1〜１００ｍＭの範囲である。濃度が薄いとアリル化合物による修飾が十分に進まず、濃度が濃すぎると後述の後処理操作において、白金触媒を完全に取り除くことができない。白金触媒の種類は、その反応系によって、適宜選択される。 The concentration of the platinum catalyst in the reaction solution depends on the type of allyl compound, but is usually in the range of 0.1 to 100 mM. If the concentration is low, the modification with the allyl compound does not proceed sufficiently. If the concentration is too high, the platinum catalyst cannot be completely removed in the post-treatment operation described later. The kind of platinum catalyst is appropriately selected depending on the reaction system.
反応時間はアリル化合物の種類によるが、通常１〜３６時間の範囲である。反応時間が短いとアリル化合物による修飾が十分に進行せず、長すぎると非特異的に修飾が行われる。 The reaction time depends on the type of allyl compound, but is usually in the range of 1 to 36 hours. If the reaction time is short, the modification with the allyl compound does not proceed sufficiently, and if it is too long, the modification is performed non-specifically.
アリル化合物は、上記のものに限定されず、アリルアルコール、臭化アリル、塩化アリル、アリルイソチオシアネート、１−ブテン等から、適宜選択される。 The allyl compound is not limited to those described above, and is appropriately selected from allyl alcohol, allyl bromide, allyl chloride, allyl isothiocyanate, 1-butene, and the like.
＜ステップ２＞ 上記ステップ１により得られた反応溶液から、白金触媒と、未反応のアリル化合物とを除去する。反応溶液中の溶媒と共に、未反応のアリル化合物をエバポレータなどで完全に留去し、ヘキサン等の有機溶媒を加えて、超音波処理を行う。これにより、アリル化合物により表面修飾がなされたシリコンナノ粒子と白金触媒とが分離されるため、上澄のシリコンナノ粒子のみを回収することが可能である。 <Step 2> The platinum catalyst and the unreacted allyl compound are removed from the reaction solution obtained in Step 1 above. Along with the solvent in the reaction solution, the unreacted allyl compound is completely distilled off with an evaporator or the like, and an organic solvent such as hexane is added to perform ultrasonic treatment. Thereby, since the silicon nanoparticle surface-modified with the allyl compound and the platinum catalyst are separated, it is possible to recover only the supernatant silicon nanoparticle.
この操作を、２〜１０回程度繰り返して行うことで、完全にアリル化合物と白金触媒とを取り除くことができる。繰り返す回数は、アリル化合物の種類によるため限定するものではないが、繰り返す回数が多くなるにつれ、シリコンナノ粒子の回収量は減少する。回収したシリコンナノ粒子懸濁液の吸収と蛍光スペクトルは、吸光分光光度計と蛍光分光光度計で測定することが可能である。 By repeating this operation about 2 to 10 times, the allyl compound and the platinum catalyst can be completely removed. The number of repetitions is not limited because it depends on the type of allyl compound, but the amount of silicon nanoparticles recovered decreases as the number of repetitions increases. The absorption and fluorescence spectrum of the recovered silicon nanoparticle suspension can be measured with an absorption spectrophotometer and a fluorescence spectrophotometer.
有機溶媒はヘキサンに限定されず、シクロベンゼン、シクロヘキサン、ジクロロメタン、ヘプタン、オクタン、ノナン、デカン等を用いても良い。 The organic solvent is not limited to hexane, and cyclobenzene, cyclohexane, dichloromethane, heptane, octane, nonane, decane, or the like may be used.
＜ステップ３＞ 上記ステップ２を行った懸濁液中のヘキサンなどの有機溶媒を、水、又は、緩衝液等の水溶液に交換する。有機溶媒をエバポレータ等で完全に留去し、水、又は、緩衝液等の水溶液を加えて、超音波処理を行う。このシリコンナノ粒子の懸濁液の吸収と蛍光スペクトルは、吸光分光光度計と蛍光分光光度計で測定することができる。
４．シリコンナノ粒子の精製
高純度のアリル化合物で修飾されたシリコンナノ粒子が必要な場合は、例えば、ろ過処理等で回収したシリコンナノ粒子を、ゲルろ過高速クロマトフィー（ＨＰＬＣ）によって精製することができる。使用目的によるため限定するものではないが、通常はＰＢＳ（phosphate-buffered saline）等のリン酸緩衝液が使用される。
５．シリコンナノ粒子を用いた生体分子標識
アリル化合物で修飾したシリコンナノ粒子は、公知の方法によって生体分子を標識することができる。例えば、アリル化合物で修飾したシリコンナノ粒子の有する官能基と、生体分子の官能基とを、必要に応じて他の化合物の存在下、又は、架橋剤等の化合物を介して共有結合、又は、イオン結合させる。
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4). Purification of silicon nanoparticles When silicon nanoparticles modified with high-purity allyl compounds are required, for example, silicon nanoparticles recovered by filtration can be purified by gel filtration high-speed chromatography (HPLC). . Although it does not limit for the purpose of use, a phosphate buffer solution such as PBS (phosphate-buffered saline) is usually used.
5. Biomolecule labeling using silicon nanoparticles Silicon nanoparticles modified with an allyl compound can label biomolecules by a known method. For example, the functional group of the silicon nanoparticles modified with the allyl compound and the functional group of the biomolecule may be covalently bonded in the presence of another compound, if necessary, via a compound such as a crosslinking agent, or Ion bond.
より具体的には、例えば、粒子表面にアミノ基をもつシリコンナノ粒子を、カルボキシル基を持つ蛋白質やペプチドに、架橋試薬ＥＤＣ（1-ethyl-3-[3-dimethyl-aminopropyl]carbodiimide HCl）を用いて標識することが可能である。 More specifically, for example, a silicon nanoparticle having an amino group on the particle surface, a protein or peptide having a carboxyl group, and a crosslinking reagent EDC (1-ethyl-3- [3-dimethyl-aminopropyl] carbodiimide HCl). Can be used to label.
また、ＳＰＤＰ（N-succinimidyl 3-[2-pyridyldithio]propionate）や、２−イミノチオラン塩酸塩などを用いて導入した、チオール基とアミノ基を持つ蛋白質やペプチドに、ＥＭＣＳ（N-[ε-Maleimidocaproyloxy]Succinimide Ester）のような架橋剤でマレイミド基を導入し、そこへ粒子表面にアミノ基をもつシリコンナノ粒子を反応させて、標識しても良い。 In addition, EMCS (N- [ε-Maleimidocaproyloxy) was introduced into proteins and peptides having a thiol group and an amino group introduced using SPDP (N-succinimidyl 3- [2-pyridyldithio] propionate) or 2-iminothiolane hydrochloride. A maleimide group may be introduced with a cross-linking agent such as [Succinimide Ester], and silicon nanoparticles having amino groups on the particle surface may be reacted therewith for labeling.
以下に本発明を実施例により詳細に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to examples. However, the present invention is not limited to these examples.
＜実施例１＞ ポーラスシリコンの製造
シリコンウエハ（面方位（１００）、ｐ−ｔｙｐｅ、ホウ素ドープ、比抵抗０．１〜１００Ω・ｃｍ）を、縦３．５ｃｍ×横４．０ｃｍの大きさにカットした。図１に示したように、カットしたシリコンウエハの端を２〜３ｍｍ程度、ＨＦとＨＮＯ３の混合液（体積比１：１）に２秒間浸ける。次に、図２に示したように、シリコンウエハ全体をＨＦ、ＨＮＯ３、水の混合液（体積比２：７：８）に５分間浸ける。その後、水でよく洗い乾燥させる。
<Example 1> Manufacture of porous silicon A silicon wafer (plane orientation (100), p-type, boron dope, specific resistance 0.1 to 100 Ω · cm) is 3.5 cm long by 4.0 cm wide. Cut. As shown in FIG. 1, the edge of the cut silicon wafer is immersed in a mixed solution (volume ratio 1: 1) of HF and HNO 3 for about 2 to 3 mm for 2 seconds. Next, as shown in FIG. 2, the entire silicon wafer is immersed in a mixed solution of HF, HNO 3 , and water (volume ratio 2: 7: 8) for 5 minutes. Then wash well with water and dry.
上記処理により得られたシリコンウエハを、約１．０ｃｍ×１．０ｃｍにカットする。図４に示したように、カットしたシリコンウエハを、ホットスターラで約４０℃に温めた１５％ＨＦ水溶液の蒸気に４０秒間さらし、アモルファスシリコン膜を取り除く。その後、エタノールでよく洗って、シリコンウエハ表面についたエタノールを拭き取る。 The silicon wafer obtained by the above process is cut into about 1.0 cm × 1.0 cm. As shown in FIG. 4, the cut silicon wafer is exposed to vapor of a 15% HF aqueous solution heated to about 40 ° C. with a hot stirrer for 40 seconds to remove the amorphous silicon film. Thereafter, it is thoroughly washed with ethanol, and the ethanol adhering to the silicon wafer surface is wiped off.
上記処理を行ったシリコンウエハを、図６に示すように、エタノール２ｍｌの入ったガラス容器に入れ、蓋をして、超音波洗浄機で５分間超音波処理を行い、その後、シリコンウエハの基板を取り除く。また、同じエタノール中で１０枚のシリコンウエハを１枚ずつ同様に処理して得られた懸濁液を、遠心分離機（遠心回転数１５０００ｒｐｍ）で３０分間遠心し、シリコンナノ粒子の含まれる上澄みを分取する。 As shown in FIG. 6, the silicon wafer subjected to the above treatment is put in a glass container containing 2 ml of ethanol, covered, and subjected to ultrasonic treatment for 5 minutes with an ultrasonic cleaner, and then the silicon wafer substrate. Remove. In addition, a suspension obtained by similarly treating 10 silicon wafers one by one in the same ethanol is centrifuged for 30 minutes in a centrifuge (centrifugal rotation speed 15000 rpm), and a supernatant containing silicon nanoparticles is obtained. Sort out.
＜実施例２＞ アリルアミンで修飾した蛍光波長４３７ｎｍのシリコンナノ粒子の製造
実施例１で得られたシリコンナノ粒子懸濁液から、エバポレータを用いて完全にエタノールを留去する。そこへ、アリルアミン１ｍｌを加えて３０分間超音波処理を行い、アリルアミン中にシリコンナノ粒子を加えて懸濁させた。その後、５０ｍＭ白金触媒２０μｌを加えて、図８に示したように、スターラを用いて室温で３時間攪拌し、反応液を作成する。ここで使用した白金触媒は、Aldrich Chem.社製の、Cloroplatinic acid hydrate（H2PtCl6・aq）であり、densityは、2.43g/ml at 25℃である。
<Example 2> Production of silicon nanoparticles modified with allylamine and having a fluorescence wavelength of 437 nm Ethanol is completely distilled off from the silicon nanoparticle suspension obtained in Example 1 using an evaporator. Thereto, 1 ml of allylamine was added and subjected to ultrasonic treatment for 30 minutes, and silicon nanoparticles were added and suspended in allylamine. Thereafter, 20 μl of 50 mM platinum catalyst is added, and as shown in FIG. 8, the mixture is stirred for 3 hours at room temperature using a stirrer to prepare a reaction solution. The platinum catalyst used here is Cloroplatinic acid hydrate (H 2 PtCl 6 · aq) manufactured by Aldrich Chem., And its density is 2.43 g / ml at 25 ° C.
＜実施例３＞ アリルアミンで修飾したシリコンナノ粒子の分離
その後、エバポレータを用いて上記の反応液から、完全にアリルアミンを留去する。そこへ、ヘキサン２ｍｌを加えて、３０分間超音波処理を行い、アリルアミンで修飾したシリコンナノ粒子をヘキサンに加えて懸濁させ、上澄を分取する。この操作を３回繰り返し、完全にアリルアミンと白金触媒を取り除いた。その後、エバポレータを用いてヘキサンを完全に留去し、そこへ水１ｍｌを加えて超音波処理することで、水にアリルアミンで修飾したシリコンナノ粒子のみを再懸濁させる。図９に本方法によって生成したアリルアミンで修飾したシリコンナノ粒子の吸収スペクトル・蛍光スペクトルを、図１０に本方法によって生成したアリルアミンで修飾したシリコンナノ粒子のＦＴ−ＩＲスペクトルを示した。
<Example 3> Separation of silicon nanoparticles modified with allylamine Thereafter, allylamine is completely distilled off from the reaction solution using an evaporator. Thereto, 2 ml of hexane is added, and ultrasonic treatment is performed for 30 minutes. Silicon nanoparticles modified with allylamine are added to and suspended in hexane, and the supernatant is collected. This operation was repeated three times to completely remove allylamine and the platinum catalyst. Thereafter, hexane is completely distilled off using an evaporator, and 1 ml of water is added thereto and subjected to ultrasonic treatment, whereby only silicon nanoparticles modified with allylamine are resuspended in water. FIG. 9 shows the absorption spectrum / fluorescence spectrum of silicon nanoparticles modified with allylamine produced by this method, and FIG. 10 shows the FT-IR spectrum of silicon nanoparticles modified with allylamine produced by this method.
＜実施例４＞ アリルアミンで修飾したシリコンナノ粒子の精製
アリルアミンで修飾したシリコンナノ粒子懸濁液を０．２２μｍフィルターでろ過処理する。より高純度のものを得るため、回収したシリコンナノ粒子をＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）に付する。ここで使用したカラムは、ゲルろ過カラムＳｕｐｅｒｄｅｘ７５であり、溶媒は５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、流速は０．４ｍｌ／ｍｉｎで精製を行う。図１１に、ＨＰＬＣにより分離された、アリルアミンで修飾したシリコンナノ粒子のチャートを示す。
＜実施例５＞ アリルアミンで修飾したシリコンナノ粒子による１細胞の標識
マウス由来のマクロファージ系細胞株であるＰ３８８Ｄ１細胞を、５×１０５個／２ｍｌになるよう、1０％ ＦＢＳ（FETAL BOVINE SERUM）を含むＲＰＭＩ１６４０培地中で、３７℃、５%ＣＯ２で培養した。細胞は１２時間以上培養した後、アリルアミンで粒子表面を修飾したシリコンナノ粒子を加え、更に２時間培養し細胞にナノ粒子を貪食させた。
<Example 4> Purification of silicon nanoparticles modified with allylamine A silicon nanoparticle suspension modified with allylamine is filtered through a 0.22 µm filter. In order to obtain a higher purity, the collected silicon nanoparticles are subjected to HPLC (high performance liquid chromatography). The column used here is a gel filtration column Superdex 75, the solvent is 50 mM phosphate buffer (pH 7.0), and the flow rate is 0.4 ml / min. FIG. 11 shows a chart of silicon nanoparticles modified with allylamine separated by HPLC.
<Example 5> Labeling of one cell with silicon nanoparticles modified with allylamine P388D1 cells, which are mouse-derived macrophage cell lines, were treated with 10% FBS (FETAL BOVINE SERUM) at 5 × 10 5 cells / 2 ml. The cells were cultured in RPMI 1640 medium containing 37 ° C. and 5% CO 2 . After culturing the cells for 12 hours or more, silicon nanoparticles whose particle surface was modified with allylamine were added, and the cells were further cultured for 2 hours to phagocytose the nanoparticles.
ＰＢＳで３回洗浄し、非特異的に吸着したナノ粒子を取り除いて、細胞懸濁液とした。細胞懸濁液を遠心した後、２％ＦＢＳを含むＰＢＳに再懸濁させ、蛍光顕微鏡とフローサイトメータを用いて解析した。図１２に蛍光顕微鏡でＰ３８８Ｄ１細胞を観察した結果を、図１３にフローサイトメータによる解析結果を示す。 After washing 3 times with PBS, the non-specifically adsorbed nanoparticles were removed to obtain a cell suspension. The cell suspension was centrifuged, resuspended in PBS containing 2% FBS, and analyzed using a fluorescence microscope and a flow cytometer. FIG. 12 shows the results of observing P388D1 cells with a fluorescence microscope, and FIG. 13 shows the results of analysis using a flow cytometer.
蛍光顕微鏡による観察では、シリコンナノ粒子を貪食した標識細胞（＋）は、励起光４７０／４０ｎｍにおいて、５３５／５０ｎｍの蛍光発光が見られた。また、蛍光発光は、３日以上の長時間にわたって観察が可能であった。なお、視覚的に見ても、本願発明の蛍光性シリコンナノ粒子は、従来のものよりも１０倍以上強い発光強度が観察された。
In the observation with the fluorescence microscope, the labeled cells (+) phagocytosed with the silicon nanoparticles showed fluorescence emission of 535/50 nm with excitation light of 470/40 nm. Further, the fluorescence emission could be observed over a long period of 3 days or longer. In addition, visually, the fluorescent silicon nanoparticles of the present invention were observed to have a
フローサイトメータによる解析結果によっても、シリコンナノ粒子を貪食しない未標識細胞（−）と、貪食した標識細胞（＋）では、その蛍光強度に明らかな差が生じており、アリルアミンで修飾したシリコンナノ粒子で、すべての細胞を標識することができた。 According to the results of analysis by the flow cytometer, there is a clear difference in fluorescence intensity between unlabeled cells (−) that do not phagocytose silicon nanoparticles and labeled cells (+) that have phagocytosed. The particles were able to label all cells.
以上、実施例により本願発明を詳細に説明した。 As described above, the present invention has been described in detail by way of examples.
本願発明の蛍光性シリコンナノ粒子は、化学的手法によるエッチング、すなわち、ＨＦにおける表面処理と、超音波を使用した回収処理のみという、非常に簡便な操作によって製造可能なことから、収率良く、大量に製造することが可能である。また、表面をアリル化合物で修飾することによって、シリコンナノ粒子は親水性を示し、水溶液中での長期安定保存が可能になると共に、生体分子などにも結合させることができる。 Since the fluorescent silicon nanoparticles of the present invention can be produced by a very simple operation of etching by a chemical method, that is, only a surface treatment in HF and a recovery treatment using ultrasonic waves, the yield is high. It can be manufactured in large quantities. Moreover, by modifying the surface with an allyl compound, the silicon nanoparticles exhibit hydrophilicity, can be stably stored for a long time in an aqueous solution, and can also be bound to biomolecules.
なお、このようにして製造された量子サイズの蛍光性シリコンナノ粒子によれば、蛋白質などの生体分子において、他の分子とクロスリンクを引き起こさずに、生細胞内あるいは細胞表面における単一分子や、１細胞を標識することが可能であり、非常に微小なスケールでの観察が実現できる。また、その退色の遅さから、個体内での細胞の挙動についても、長時間にわたる観察が可能である。さらに、従来の量子ドットのような手法に比べても、生体にとって安全性が高く、分子の機能を解明し、これらの分子の機能異常が原因となるさまざまな病気の探求や、治療法の開発が大いに期待できる。 In addition, according to the thus produced quantum size fluorescent silicon nanoparticles, biomolecules such as proteins do not cause cross-linking with other molecules, and in the living cell or on the cell surface, 1 cell can be labeled, and observation on a very small scale can be realized. In addition, due to the slow discoloration, the behavior of cells within an individual can be observed over a long period of time. Furthermore, compared to conventional methods such as quantum dots, it is safer for the living body, elucidates the functions of molecules, searches for various diseases caused by abnormal functions of these molecules, and develops treatments. Can be greatly expected.
なお、上記実施形態および実験例は、本願発明の技術的思想の範囲内で様々な変形が可能である。 The above embodiment and experimental examples can be variously modified within the scope of the technical idea of the present invention.
例えば、上記の方法でポーラスシリコンを生成し、シリコン基体表面をアリル化合物で修飾する。その後、ＨＦ水溶液でアモルファスシリコン膜の除去処理行い、超音波処理によってシリコンナノ粒子を分離（回収）してもよい。こうすれば、より大量のアリルアミンで修飾したシリコンナノ粒子を生成することができる。 For example, porous silicon is produced by the above method, and the silicon substrate surface is modified with an allyl compound. Thereafter, the amorphous silicon film may be removed with an aqueous HF solution, and the silicon nanoparticles may be separated (collected) by ultrasonic treatment. In this way, silicon nanoparticles modified with a larger amount of allylamine can be produced.
なお、標識対象は、上記のものに限定されない。本発明の蛍光性シリコンナノ粒子の持つ疎水性と官能基を考慮すれば、核酸、蛋白質、ペプチド、脂質、糖鎖、ビタミン、アゴニスト・アンタゴニストを含む受容体リガンド等の生体分子、生理活性分子、及び、薬剤分子を標識、観察が可能であることは自明である。また、これらを用いることによって、個体、組織、器官、及び、細胞内小器官についても、標識と観察が可能となる。 The labeling target is not limited to the above. Considering the hydrophobicity and functional group of the fluorescent silicon nanoparticles of the present invention, biomolecules such as receptor ligands including nucleic acids, proteins, peptides, lipids, sugar chains, vitamins, agonists / antagonists, bioactive molecules, It is obvious that the drug molecule can be labeled and observed. Further, by using these, it is possible to label and observe individuals, tissues, organs, and intracellular organelles.
１０・・・シリコン基体、１１・・・シリコン基体の一端、１２・・・シリコンナノ粒子、１３・・・アモルファスシリコン膜、１５・・・容器、２０・・・ピンセット、２１・・・ホットスターラ、２２・・・蓋、２３・・・超音波洗浄機、２４・・・スターラ、２５・・・撹拌子、３０・・・ＨＦ＋ＨＮＯ３の混合溶液、３５・・・、４０・・・ＨＦ＋ＨＮＯ３＋水の混合溶液、４５・・・容器、５０・・・ＨＦ水溶液、５５・・・ガラス容器、６０・・・水、又は、エタノール等の有機溶媒、７０・・・シリコンナノ粒子懸濁液、８０・・・アミノ化試薬とシリコンナノ粒子の懸濁液
DESCRIPTION OF
Claims (9)
前記第１の混合溶液を作用させたシリコン基体に、フッ化水素酸溶液と硝酸と水との第２の混合溶液を作用させる工程と、
前記第２の混合溶液を作用させたシリコン基体を、さらにフッ化水素酸と水との第３の混合溶液の蒸気にさらす工程と
を含むことを特徴とする蛍光性シリコンナノ粒子の製造方法。 Allowing a first mixed solution of hydrofluoric acid solution and nitric acid to act on a silicon substrate;
Applying a second mixed solution of hydrofluoric acid solution, nitric acid and water to the silicon substrate on which the first mixed solution is allowed to act;
And a step of exposing the silicon substrate on which the second mixed solution has acted to a vapor of a third mixed solution of hydrofluoric acid and water.
前記第１の混合溶液を作用させたシリコン基体に、フッ化水素酸溶液と硝酸と水との第２の混合溶液を作用させる工程と、
前記第２の混合溶液を作用させたシリコン基体を、さらにフッ化水素酸溶液と水との第３の混合溶液に浸す工程と
を含むことを特徴とする蛍光性シリコンナノ粒子の製造方法。 Allowing a first mixed solution of hydrofluoric acid solution and nitric acid to act on a silicon substrate;
Applying a second mixed solution of hydrofluoric acid solution, nitric acid and water to the silicon substrate on which the first mixed solution is allowed to act;
A step of immersing the silicon substrate on which the second mixed solution is allowed to act in a third mixed solution of hydrofluoric acid solution and water.
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