JP2011185874A - Kit for analyzing biomolecules and method for analyzing biomolecules using the same - Google Patents
Kit for analyzing biomolecules and method for analyzing biomolecules using the same Download PDFInfo
- Publication number
- JP2011185874A JP2011185874A JP2010053685A JP2010053685A JP2011185874A JP 2011185874 A JP2011185874 A JP 2011185874A JP 2010053685 A JP2010053685 A JP 2010053685A JP 2010053685 A JP2010053685 A JP 2010053685A JP 2011185874 A JP2011185874 A JP 2011185874A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- nanoparticle
- protein
- lipid bilayer
- biorelevant
- biomolecule
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Abstract
Description
本発明は、生体分子分析用キット、これを用いた生体分子の分析方法に関する。 The present invention relates to a biomolecule analysis kit and a biomolecule analysis method using the kit.
基板上に生体分子を配したバイオチップは、医療・診断用チップ、環境センシング、ナノバイオオプティクス・エレクトロニクス等の幅広い分野での応用が期待されている。特に、バイオ・環境センシング素子や医薬品開発においては、基板上に特定多数の生体分子を所望の位置に配し、生体分子の種類や濃度、あるいは生体分子間の相互作用（活性検出、分子認識等）をハイスループットで調査、診断できるバイオチップは多大な市場価値をもたらすと期待されている。 Biochips in which biomolecules are arranged on a substrate are expected to be applied in a wide range of fields such as medical / diagnostic chips, environmental sensing, and nanobiooptics / electronics. In particular, in bio / environmental sensing elements and pharmaceutical development, a large number of specific biomolecules are placed on a substrate at desired positions, and the types and concentrations of biomolecules, or interactions between biomolecules (activity detection, molecular recognition, etc.) ) Is expected to bring tremendous market value.
また、これらの産業分野だけでなく、基礎研究分野においても、酵素、抗体をはじめとするタンパク質やＤＮＡ等の生体分子を、非破壊で安定して基板上に配置し、各生体分子の相互作用や情報伝達機構、あるいは構造変化等の時間的変動を追跡できるバイオチップの開発が求められている。 Furthermore, not only in these industrial fields but also in basic research fields, biomolecules such as enzymes and antibodies, such as proteins and DNA, are stably placed on the substrate in a non-destructive manner, and the interaction of each biomolecule. There is a need to develop biochips that can track temporal changes such as information transmission mechanisms and structural changes.
タンパク質等の生体分子を基板上に固定化する方法としては、ビオチン−ストレプトアビジン間の特異的な結合を利用する方法が広く用いられている（非特許文献１、２）。この方法では、一般的に、末端を修飾したビオチン分子を基板上に固定化し、該ビオチン分子に、ビオチンを特異的に認識するストレプトアビジンを結合させ、該ストレプトアビジンに、ビオチン化されたタンパク質を結合させる方法が用いられる。 As a method for immobilizing biomolecules such as proteins on a substrate, methods utilizing specific binding between biotin and streptavidin are widely used (Non-patent Documents 1 and 2). In this method, generally, a biotin molecule whose end is modified is immobilized on a substrate, streptavidin that specifically recognizes biotin is bound to the biotin molecule, and a biotinylated protein is bound to the streptavidin. A bonding method is used.
また、基板上にタンパク質を固定化する方法としては、ビオチン−ストレプトアビジン結合を利用する方法以外に、有機分子の自己組織化膜を用いる方法がある。有機分子の自己組織化膜を用いる方法としては、例えば、非特許文献３に記載の以下の方法が挙げられる。
まず、金基板上に、３−メルカプトプロピオン酸や１１−メルカプトウンデカン酸等の自己組織化膜を形成する。次いで、該自己組織化膜の上側に位置する末端のカルボキシル基に、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドを触媒として、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドをカップリングする。次いで、該自己組織化膜の最表面にあるスクシンイミド基と、タンパク質のアミノ酸末端（Ｎ末端）とを選択的に結合させ、タンパク質を基板上に固定化する。
Moreover, as a method for immobilizing a protein on a substrate, there is a method using a self-assembled film of an organic molecule in addition to a method using a biotin-streptavidin bond. Examples of a method using a self-assembled film of organic molecules include the following method described in Non-Patent Document 3.
First, a self-assembled film such as 3-mercaptopropionic acid or 11-mercaptoundecanoic acid is formed on a gold substrate. Subsequently, N-hydroxysuccinimide is coupled to the terminal carboxyl group located on the upper side of the self-assembled film using 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide as a catalyst. Next, the succinimide group on the outermost surface of the self-assembled film is selectively bonded to the amino acid terminal (N terminal) of the protein to immobilize the protein on the substrate.
しかしながら、非特許文献１〜２に記載の発明は、基板に結合するためのビオチン分子の末端修飾や、タンパク質の末端をビオチン化する修飾が必要であるため、その反応収率、時間的効率を考慮すると、バイオチップの大量生産には不向きである。
また、非特許文献３に記載の発明は、一般に末端がチオール化された化合物を用いる必要があるため、金表面のような特定の基板上にしかタンパク質を固定化することができない。加えて、最終的にタンパク質を結合するには、基板の前処理として、数種のスペーサー分子を結合させる必要があり、反応プロセスが多段階にわたるため工程が煩雑になると共に、反応が多段階になるほど、基板上にタンパク質を固定化する効率が低くなる。さらに、生体分子は本来流動性のある媒質中で活動しているのに対し、この方法はスペーサー分子により生体分子を基板上に強固に固定するため、生体分子の流動性が失われる。また、スペーサー分子と共有結合することで、生体分子自体の構造が変化する可能性があるため、固定化により生体分子本来の機能や活動が制限され、生理機能が損なわれるおそれがある。
However, the inventions described in Non-Patent Documents 1 and 2 require modification of the end of the biotin molecule for binding to the substrate and modification of biotinylating the end of the protein, so that the reaction yield and time efficiency are improved. Considering this, it is not suitable for mass production of biochips.
In addition, since the invention described in Non-Patent Document 3 generally requires the use of a compound having a thiol end, it is possible to immobilize a protein only on a specific substrate such as a gold surface. In addition, in order to finally bind the protein, it is necessary to bind several kinds of spacer molecules as a pretreatment of the substrate, and the reaction process is multistage, which makes the process complicated and the reaction multistage. The lower the efficiency of immobilizing proteins on the substrate. Furthermore, while biomolecules are originally active in a fluid medium, this method firmly fixes the biomolecules on the substrate by spacer molecules, so that the fluidity of the biomolecules is lost. In addition, since the structure of the biomolecule itself may change due to the covalent bond with the spacer molecule, immobilization may limit the original functions and activities of the biomolecule and may impair the physiological function.
従来の一般的なバイオチップは、上述のような方法で、基板上のある特定の位置に生体分子を固定化し、検査対象とする生体分子との相互作用を分光学的に判定・診断するものであった。通常、バイオ分野での分光測定には、生体分子を有機蛍光色素で標識化する方法が用いられている。
標識化に用いられる有機蛍光色素は光退色が激しく、バイオチップの長時間にわたる使用には不向きである。バイオチップを長時間安定して利用するためには、基板上に配置された生体分子自体の安定性と、判定・診断時の測定安定性の双方を兼ね備えたバイオチップの技術開発が求められている
Conventional general biochips use a method as described above to immobilize biomolecules at a specific position on a substrate and to spectroscopically determine and diagnose interactions with biomolecules to be examined. Met. Usually, a method of labeling a biomolecule with an organic fluorescent dye is used for spectroscopic measurement in the bio field.
Organic fluorescent dyes used for labeling are severely photobleached and are not suitable for long-term use of biochips. In order to use biochips stably for a long period of time, it is necessary to develop biochip technology that combines both the stability of the biomolecules placed on the substrate and the measurement stability during judgment and diagnosis. Have
以上のように、バイオセンサーやバイオチップ等への適用が検討されている従来の生体分子固定化基板は、生体分子の固定化手法が煩雑なために生産性が低く、固定化する基板が限定される上、固定化された生体分子の流動性及び安定性が低くなり、該生体分子の生理機能が失活するおそれがある。また、従来の生体分子固定化基板では、生体分子の流動性が低いため、基板上で生体分子を移動させ、所望の位置に輸送することはできない。
さらに、異なる種類及び／又は濃度の生体分子が配置されたバイオチップ上で、該生体分子の位置情報を把握しながら、生体分子に対する特定の化学物質の作用や生体分子間の相互作用等を、長時間にわたり検査・診断できるリアクターチップとしての機能は付与されていない。以上のことから、バイオチップの安定化、高性能化、ハイスループット化はまだ不十分であり、それらの制御のさらなる向上が望まれている。
As described above, conventional biomolecule-immobilized substrates that have been studied for application to biosensors and biochips have low productivity due to complicated biomolecule immobilization techniques, and the substrates to be immobilized are limited. In addition, the fluidity and stability of the immobilized biomolecules are lowered, and the physiological function of the biomolecules may be deactivated. Further, in the conventional biomolecule-immobilized substrate, since the fluidity of the biomolecule is low, the biomolecule cannot be moved on the substrate and transported to a desired position.
Furthermore, on the biochip on which biomolecules of different types and / or concentrations are arranged, while grasping the position information of the biomolecule, the action of a specific chemical substance on the biomolecule, the interaction between biomolecules, etc. No function is provided as a reactor chip that can be inspected and diagnosed for a long time. From the above, stabilization, high performance, and high throughput of biochips are still insufficient, and further improvement of their control is desired.
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、生体分子を生理活性が失活することなく、高い流動性及び安定性で生体分子を基板上の所望の位置に輸送でき、かつ輸送された生体分子の位置情報を長時間にわたり把握できる生体分子分析用キット、これを用いた生体分子の分析方法を目的とする。 The present invention has been made in view of the above circumstances, and the biomolecule can be transported to a desired position on the substrate with high fluidity and stability without deactivating the bioactivity of the biomolecule, and is transported. It is an object of the present invention to provide a biomolecule analysis kit that can grasp position information of biomolecules over a long period of time and a biomolecule analysis method using the kit.
本発明の生体分子分析用キットは、脂質二分子膜が自発展開する親水部が形成された輸送基板を備える分析装置と、前記脂質二分子膜に導入され、前記脂質二分子膜の自発展開により輸送されるナノ粒子−生体関連分子複合体とを備えた生体分子分析用キットであって、前記ナノ粒子−生体関連分子複合体は、表面に反応活性基を備えるナノ粒子と、該ナノ粒子の表面の反応活性基に結合した生体関連分子とを備えるナノ粒子複合体を含有することを特徴とする。
前記輸送基板は、親水部と疎水部とからなる流路パターンが形成され、前記脂質二分子膜は、前記親水部の表面を自発展開することが好ましく、前記ナノ粒子は、半導体ナノ粒子からなる量子ドット、又は金、銀、銅から選択される少なくとも１種からなる金属ナノ粒子であることが好ましく、前記生体関連分子は、リン脂質及びポリエーテル化リン脂質から選択される少なくとも１種であることが好ましく、前記生体関連分子は、ビオチン化ポリエーテル、マレイミド化ポリエーテル及びスクシンイミド化ポリエーテルから選択される少なくとも１種であってもよい。
前記ナノ粒子−生体関連分子複合体は、リン脂質からなる脂質二重層がカプセル状に形成され、前記ナノ粒子複合体が、前記脂質二重層の層内及び表面の双方又はいずれか一方に含有されてなることが好ましく、前記ナノ粒子−生体関連分子複合体は、前記のカプセル状に形成された脂質二重層で化学物質が内包されていることが好ましく、前記脂質二重層は、その表面にビオチン化ポリエーテル、マレイミド化ポリエーテル及びスクシンイミド化ポリエーテルから選択される少なくとも１種が結合していることが好ましく、前記ナノ粒子−生体関連分子複合体は、タンパク質を標識化していることが好ましく、前記タンパク質は、抗原、抗体、酵素、膜タンパク質、受容体型タンパク質、蛍光タンパク質、細胞骨格及びモータータンパク質から選択される少なくとも１種の機能性タンパク質であることがより好ましい。
The kit for biomolecule analysis of the present invention comprises an analyzer equipped with a transport substrate on which a hydrophilic part on which a lipid bilayer membrane spontaneously develops is formed, and is introduced into the lipid bilayer membrane, and by the spontaneous deployment of the lipid bilayer membrane A kit for analyzing a biomolecule comprising a transported nanoparticle-biorelevant molecule complex, wherein the nanoparticle-biorelevant molecule complex comprises a nanoparticle having a reactive group on its surface, It comprises a nanoparticle complex comprising a biologically relevant molecule bound to a reactive group on the surface.
The transport substrate is formed with a flow path pattern composed of a hydrophilic portion and a hydrophobic portion, and the lipid bilayer membrane preferably expands spontaneously on the surface of the hydrophilic portion, and the nanoparticles are composed of semiconductor nanoparticles. Preferably, it is a quantum dot or a metal nanoparticle consisting of at least one selected from gold, silver, and copper, and the biologically relevant molecule is at least one selected from phospholipids and polyetherized phospholipids Preferably, the bio-related molecule may be at least one selected from biotinylated polyether, maleimidated polyether and succinimide polyether.
In the nanoparticle-biorelevant molecule complex, a lipid bilayer composed of phospholipid is formed in a capsule shape, and the nanoparticle complex is contained in and / or on the surface of the lipid bilayer. It is preferable that the nanoparticle-biorelevant molecule complex has a chemical substance encapsulated in the lipid bilayer formed in the capsule shape, and the lipid bilayer has biotin on its surface. It is preferable that at least one selected from a conjugated polyether, a maleimide polyether and a succinimide polyether is bound, and the nanoparticle-biorelevant molecule complex preferably labels a protein, The proteins are antigens, antibodies, enzymes, membrane proteins, receptor proteins, fluorescent proteins, cytoskeletons and motor proteins And more preferably at least one of the functional protein to be al selected.
前記分析装置は、バイオリアクターチップであることが好ましく、前記バイオリアクターチップは、ナノギャップ電極を備えることがより好ましく、前記バイオリアクターチップは、ハイスループットスクリーニング検出用であり、種類及び／又は濃度の異なる複数の生体分子が、脂質二分子膜によって輸送され、前記輸送基板の任意の位置に配置されることが好ましい。 The analyzer is preferably a bioreactor chip, the bioreactor chip is more preferably equipped with a nanogap electrode, and the bioreactor chip is for high-throughput screening detection, and of type and / or concentration. It is preferable that a plurality of different biomolecules are transported by the lipid bilayer membrane and arranged at an arbitrary position on the transport substrate.
本発明の生体分子の分析方法は、前記の本発明の生体分子分析用キットを用いることを特徴とする。 The biomolecule analysis method of the present invention is characterized by using the biomolecule analysis kit of the present invention.
本発明によれば、生体分子を生理活性が失活することなく、高い流動性及び安定性で生体分子を基板上の所望の位置に輸送でき、かつ輸送された生体分子の位置情報を長時間にわたり把握できる。 According to the present invention, the biomolecule can be transported to a desired position on the substrate with high fluidity and stability without deactivating the bioactivity of the biomolecule, and the position information of the transported biomolecule can be obtained for a long time. Can be understood.
本発明の生体分子分析用キットは、親水部が形成された輸送基板を備える分析装置と、ナノ粒子−生体関連分子複合体とを備えるものである。以下に本発明について、実施形態を示して説明する。 The kit for biomolecule analysis of the present invention comprises an analyzer comprising a transport substrate on which a hydrophilic portion is formed, and a nanoparticle-biorelevant molecule complex. Hereinafter, the present invention will be described with reference to embodiments.
（第一の実施形態）
本発明の第一の実施形態にかかる生体分子分析用キットについて、以下に図面を参照して説明する。
本実施形態の生体分子分析用キットは、輸送基板からなる分析装置と、ナノ粒子−生体関連分子複合体とを備えるものである。
(First embodiment)
A biomolecule analysis kit according to a first embodiment of the present invention will be described below with reference to the drawings.
The kit for biomolecule analysis of this embodiment comprises an analyzer comprising a transport substrate and a nanoparticle-biorelevant molecule complex.
＜分析装置＞
図１に示すように、輸送基板１は、基板本体１０を備え、この基板本体１０の表面には、疎水部１２と親水部１３とが形成されている。
基板本体１０の表面の長手方向の両端には、試料が収容される略矩形の第一の試料収容部１４と第二の試料収容部１８とが形成されている。第一の試料収容部１４と第二の試料収容部１８との間には、第一の試料収容部１４と第二の試料収容部１８とを連絡する複数の流路１６が形成され、流路１６と、基板本体１０の長手方向に延びる疎水部１２とは、基板本体１０の短手方向に交互に形成されている。こうして、第一の試料収容部１４と、流路１６と、第二の試料収容部１８とで、第一の試料収容部１４に導入された脂質二分子膜を第二の試料収容部１８へ向けて自発展開させる親水部１３が構成されている。なお、本実施形態において、流路パターンは、第一の試料収容部１４と第二の試料収容部１８と、複数の流路１６及び複数の疎水部１２からなる縞状の案内部１９とで形成されたものである。
<Analyzer>
As shown in FIG. 1, the transport substrate 1 includes a substrate body 10, and a hydrophobic portion 12 and a hydrophilic portion 13 are formed on the surface of the substrate body 10.
At both ends in the longitudinal direction of the surface of the substrate body 10, a substantially rectangular first sample storage portion 14 and second sample storage portion 18 for storing a sample are formed. Between the first sample storage unit 14 and the second sample storage unit 18, a plurality of flow paths 16 that connect the first sample storage unit 14 and the second sample storage unit 18 are formed. The paths 16 and the hydrophobic portions 12 extending in the longitudinal direction of the substrate body 10 are alternately formed in the short direction of the substrate body 10. Thus, the lipid bimolecular membrane introduced into the first sample storage unit 14 is transferred to the second sample storage unit 18 by the first sample storage unit 14, the flow path 16, and the second sample storage unit 18. A hydrophilic portion 13 that spontaneously expands toward is configured. In the present embodiment, the flow path pattern includes a first sample storage section 14 and a second sample storage section 18, and a striped guide section 19 including a plurality of flow paths 16 and a plurality of hydrophobic sections 12. It is formed.
基板本体１０としては、安定に脂質二分子膜を形成する親水性の高い基板が好ましく、ガラス、石英、シリコン、サファイア、マイカ等からなる基板、疎水性の基板の表面に化学洗浄、分子修飾等の処理を施し、表面を親水化した基板等が挙げられる。かかる基板本体１０の表面が露出した部分が、親水部１３となる。 The substrate body 10 is preferably a highly hydrophilic substrate that stably forms a lipid bimolecular film, such as a substrate made of glass, quartz, silicon, sapphire, mica, etc., a chemical cleaning, molecular modification, etc. on the surface of a hydrophobic substrate. And a substrate having a hydrophilic surface. A portion where the surface of the substrate body 10 is exposed becomes a hydrophilic portion 13.
基板本体１０は、後述する測定方法において、膜厚４〜５ｎｍ程度の脂質二分子膜を容易に形成する観点から、ナノメートルスケールの平坦性を有するものが好ましい。
基板本体１０の厚さは、特に限定されないが、例えば、０．１〜２０ｍｍが好ましい。
The substrate main body 10 preferably has nanometer-scale flatness from the viewpoint of easily forming a lipid bimolecular film having a film thickness of about 4 to 5 nm in the measurement method described later.
Although the thickness of the board | substrate body 10 is not specifically limited, For example, 0.1-20 mm is preferable.
疎水部１２は、基板本体１０の表面上に形成されたものであり、例えば、金、チタン等の金属類、フォトレジスト等の樹脂で形成した膜等が挙げられる。
疎水部１２の幅は、特に限定されないが、輸送基板１の高密度化を図る観点から、１０ｎｍ〜１μｍが好ましい。また、疎水部１２の基板本体１０上の高さは、輸送基板１の高密度化を図る観点から、１０〜１００ｎｍが好ましい。
The hydrophobic portion 12 is formed on the surface of the substrate body 10 and includes, for example, a film formed of a metal such as gold or titanium, or a resin such as a photoresist.
The width of the hydrophobic portion 12 is not particularly limited, but is preferably 10 nm to 1 μm from the viewpoint of increasing the density of the transport substrate 1. The height of the hydrophobic portion 12 on the substrate body 10 is preferably 10 to 100 nm from the viewpoint of increasing the density of the transport substrate 1.
第一の試料収容部１４の寸法は、特に限定されないが、例えば０．５〜２ｍｍ四方とされる。第二の試料収容部１８の寸法は、第一の試料収容部１４の寸法と同じである。
流路１６の幅は、特に限定されないが、輸送基板１の高密度化を図る観点から、１０ｎｍ〜１μｍとされる。
Although the dimension of the 1st sample accommodating part 14 is not specifically limited, For example, it shall be 0.5-2 mm square. The dimensions of the second sample storage section 18 are the same as the dimensions of the first sample storage section 14.
The width of the flow path 16 is not particularly limited, but is 10 nm to 1 μm from the viewpoint of increasing the density of the transport substrate 1.
疎水部１２及び親水部１３からなる流路パターンの形成方法は、例えば、特開２００７−２４８２９０号公報に記載の公知のリソグラフィー技術で微細加工を施し、所望の凹凸パターンを描画する方法が挙げられる。この際、凹部を親水部１３とし、凸部を疎水部１２とすることができる。例えば、基板本体１０をシリコンとした場合、リソグラフィー技術としては、以下のものが挙げられる。シリコン基板に酸化膜を形成し、酸化膜上に膜厚１０ｎｍ〜１００μｍとなるようにフォトレジストを塗布し、その後、露光装置によって、レジスト薄膜の上に所定のパターンを転写する。さらに、現像液によって現像を行い、転写されたパターンに応じて所定箇所のレジスト薄膜を剥離する。このとき、レジスト薄膜が残された部分が疎水部１２となり、レジスト薄膜が剥離された部分では酸化膜が露出して親水部１３となる。 Examples of a method for forming a flow path pattern including the hydrophobic portion 12 and the hydrophilic portion 13 include a method of drawing a desired concavo-convex pattern by performing fine processing using a known lithography technique described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2007-248290. . At this time, the concave portion can be the hydrophilic portion 13 and the convex portion can be the hydrophobic portion 12. For example, when the substrate body 10 is made of silicon, examples of the lithography technique include the following. An oxide film is formed on a silicon substrate, a photoresist is applied on the oxide film so as to have a film thickness of 10 nm to 100 μm, and then a predetermined pattern is transferred onto the resist thin film by an exposure device. Further, development is performed with a developer, and the resist thin film at a predetermined location is peeled off according to the transferred pattern. At this time, the portion where the resist thin film is left becomes the hydrophobic portion 12, and the oxide film is exposed and becomes the hydrophilic portion 13 in the portion where the resist thin film is peeled off.
なお、現像後のシリコン基板に金属を蒸着し、その後レジスト薄膜を有機溶剤で剥離する通常のリフトオフプロセスを用いることにより、蒸着した金属を疎水部１２とすることができる。 The deposited metal can be made into the hydrophobic portion 12 by using a normal lift-off process in which a metal is vapor-deposited on the developed silicon substrate and then the resist thin film is peeled off with an organic solvent.
こうして得られる凹凸パターンの寸法は、通常のリソグラフィー技術によれば、疎水部１２及び流路１６の幅、流路１６の深さを１０ｎｍ〜１００μｍの範囲で幅広く制御できる。 The size of the concavo-convex pattern thus obtained can be widely controlled in the range of 10 nm to 100 μm in the width of the hydrophobic portion 12 and the flow path 16 and the depth of the flow path 16 according to a normal lithography technique.
＜ナノ粒子−生体関連分子複合体＞
本発明のナノ粒子−生体関連分子複合体は、ナノ粒子と、該ナノ粒子の表面に結合した生体関連分子とを備えるナノ粒子複合体を含有するものであり、ナノ粒子複合体の単体で構成されるもの（以下、単体型ということがある）、ナノ粒子の表面に生体関連分子としてビオチン化ポリエーテル、マレイミド化ポリエーテル及びスクシンイミド化ポリエーテルから選択される少なくとも１種の機能性ポリエーテルを備えるもの（以下、機能性単体型ということがある）、ナノ粒子複合体が、カプセル状に形成されたリン脂質の脂質二重層の層内及び表面の双方又はいずれか一方に含有されるもの（以下、ベシクル型ということがある）、機能性単体型又は機能性ベシクル型がタンパク質を標識化しているもの（タンパク質標識型）等が挙げられる。以下、本発明のナノ粒子−生体関連分子複合体について説明する。
<Nanoparticles-biologically related molecular complex>
The nanoparticle-biorelevant molecule complex of the present invention comprises a nanoparticle complex comprising a nanoparticle and a biorelevant molecule bonded to the surface of the nanoparticle, and is composed of a single nanoparticle complex. At least one functional polyether selected from biotinylated polyethers, maleimidated polyethers and succinimided polyethers as biologically relevant molecules on the surface of the nanoparticles. Provided (hereinafter sometimes referred to as a functional simple substance), a nanoparticle complex is contained in and / or on the surface of a lipid bilayer of a phospholipid formed in a capsule shape ( Hereinafter, it may be referred to as a vesicle type), a functional simple substance type or a functional vesicle type in which a protein is labeled (protein labeling type), etc. . Hereinafter, the nanoparticle-biorelevant molecule complex of the present invention will be described.
≪単体型≫
単体型は、ナノ粒子の表面に生体関連分子が結合されたものである。
本発明におけるナノ粒子は、半導体ナノ粒子を備える量子ドットや、金、銀、銅等の金属ナノ粒子から構成され、中でも、生体分子分析用に用いるための生体適合型のナノ粒子という観点から、量子ドット又は金ナノ粒子を用いることが好ましい。
ナノ粒子の形状は、特に限定されず、球状、ロッド状、キューブ状、ピラミッド状、金平糖状等、いかなる形状であっても構わない。
≪Single unit type≫
The simple substance type is one in which a bio-related molecule is bonded to the surface of a nanoparticle.
Nanoparticles in the present invention are composed of quantum dots including semiconductor nanoparticles, metal nanoparticles such as gold, silver, copper, among others, from the viewpoint of biocompatible nanoparticles for use in biomolecular analysis, It is preferable to use quantum dots or gold nanoparticles.
The shape of the nanoparticles is not particularly limited, and may be any shape such as a spherical shape, a rod shape, a cube shape, a pyramid shape, and a confetti shape.
本発明における量子ドットは、半導体ナノ粒子からなるコア部と、該コア部の表面のポリマーからなるシェル部とを備え、その表面に反応活性基を備えるものである。
半導体ナノ粒子は、半導体のナノメートルサイズの微粒子であり、量子閉じ込め効果を有する発光材料であり、金属元素と、非金属元素又は遷移金属元素を組み合わせたものが挙げられ、例えば、セレン化カドミウム（ＣｄＳｅ）、硫化カドミウム（ＣｄＳ）、テルル化カドミウム（ＣｄＴｅ）、硫化亜鉛（ＺｎＳ）等のＩＩＢ−ＶＩＢ族のもの、インジウムリン（ＩｎＰ）、ガリウムリン（ＧａＰ）等のＩＩＩＢ−ＶＢ族のもの等が挙げられる。
The quantum dot in the present invention includes a core portion made of semiconductor nanoparticles and a shell portion made of a polymer on the surface of the core portion, and has a reactive group on the surface thereof.
A semiconductor nanoparticle is a semiconductor nanometer-sized fine particle and is a light emitting material having a quantum confinement effect, and includes a combination of a metal element and a nonmetal element or a transition metal element. For example, cadmium selenide ( IIB-VIB group such as CdSe), cadmium sulfide (CdS), cadmium telluride (CdTe), zinc sulfide (ZnS), IIIB-VB group such as indium phosphide (InP), gallium phosphide (GaP), etc. Is mentioned.
量子ドットは、コア部の半導体ナノ粒子のサイズによって、発光波長が著しく変化する。通常、バイオイメージングでは、可視域の波長を利用するため、コア部のサイズは、可視域に発光を示す１〜２０ｎｍが好ましい。また、シェル部１４の厚みは特に限定されないが、１〜３０ｎｍが好ましい。 The quantum dot has a significantly changed emission wavelength depending on the size of the semiconductor nanoparticles in the core. In general, in bioimaging, since a wavelength in the visible region is used, the size of the core is preferably 1 to 20 nm showing light emission in the visible region. The thickness of the shell portion 14 is not particularly limited, but is preferably 1 to 30 nm.
シェル部を構成するポリマーとしては、後述する生体関連分子の反応活性基と結合する反応活性基を備えるものであればよく、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリアクリルアミド、ポリメタクリレート等の生体適合型ポリマーに、カルボキシル基やアミノ基を反応活性基として備えるポリマーが挙げられる。中でも、生体関連分子としてリン脂質を用いる場合には、カルボキシル基を反応活性基として備えるポリマーが好ましく、カルボキシル基を反応活性基として備えるＰＥＧがより好ましい。半導体ナノ粒子は、溶液中で凝集しやすく取り扱いが困難であると共に、人体への健康被害や環境に対する毒性が懸念されるものである。半導体ナノ粒子は、生体親和性の高いポリマーで構成されるシェル部を備えることで、無害化され、医療、バイオテクノロジー分野等で汎用的に用いることができる。
加えて、ナノ粒子は、シェル部の表面に、カルボキシル基等の反応活性基が導入されていることで、生体関連分子をナノ粒子表面に直接化学結合させた、単体型のナノ粒子−生体関連分子複合体を作製することができる。
The polymer constituting the shell portion may be any polymer having a reactive group that binds to a reactive group of a biological molecule described later, for example, biocompatible type such as polyethylene glycol (PEG), polyacrylamide, and polymethacrylate. Examples of the polymer include a polymer having a carboxyl group or an amino group as a reactive group. Especially, when using phospholipid as a biologically relevant molecule, a polymer having a carboxyl group as a reactive group is preferable, and PEG having a carboxyl group as a reactive group is more preferable. Semiconductor nanoparticles are likely to aggregate in a solution and are difficult to handle, and there are concerns about health damage to the human body and toxicity to the environment. The semiconductor nanoparticles are rendered harmless by having a shell portion made of a polymer with high biocompatibility, and can be used for general purposes in the medical and biotechnology fields.
In addition, nanoparticles are a single-type nanoparticle-biorelevant in which biologically active molecules are directly chemically bonded to the nanoparticle surface by introducing reactive groups such as carboxyl groups on the surface of the shell part. Molecular complexes can be made.
金ナノ粒子は、合成の簡便さから球状、ロッド状の形状のものを用いることが好ましい。金ナノ粒子は、アスペクト比に応じて吸収特性が変化し、高い波長選択性を発現する点から、ロッド状の金ナノ粒子を用いることがより好ましい。
金ナノロッドは、粒子のサイズ効果による発色特性が可視域で顕著に発現することから、金ナノロッドのアスペクト比が１〜５であることが好ましい。
また、金ナノロッドは、直径が１ｎｍ〜１００ｎｍ、長さが１ｎｍ〜１μｍのものが好ましい。
なお、金ナノ粒子は、その表面にポリマーを備えるものであってもよい。
The gold nanoparticles are preferably used in a spherical or rod-like shape for the convenience of synthesis. The gold nanoparticles are more preferably rod-shaped gold nanoparticles from the viewpoint that the absorption characteristics change according to the aspect ratio and high wavelength selectivity is expressed.
The gold nanorods preferably have an aspect ratio of 1 to 5 because the color development characteristics due to the size effect of the particles are remarkably exhibited in the visible region.
The gold nanorods preferably have a diameter of 1 nm to 100 nm and a length of 1 nm to 1 μm.
The gold nanoparticles may have a polymer on the surface.
生体関連分子は、生体中に存在する分子及びその誘導体である。このような生体関連分子をナノ粒子の表面に結合することで、輸送基板上に自発展開する脂質二分子膜により輸送される。生体関連分子としては、例えば、リン脂質、ポリエーテル化リン脂質、一本鎖もしくは二本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡ等の核酸、ポリペプチド、オリゴペプチド、糖等が挙げられ、中でも、リン脂質又はポリエーテル化リン脂質が好ましい。 Biologically relevant molecules are molecules present in the living body and derivatives thereof. By binding such bio-related molecules to the surface of the nanoparticles, they are transported by a lipid bilayer that spontaneously develops on the transport substrate. Examples of biologically relevant molecules include nucleic acids such as phospholipids, polyetherized phospholipids, single-stranded or double-stranded DNA or RNA, polypeptides, oligopeptides, sugars, etc. Among them, phospholipids or polyethers Phospholipids are preferred.
リン脂質は、その疎水部のアシル鎖長、アシル鎖内の二重結合の有無、さらにその二重結合の部位と数は特に限定されない。ただし、リン脂質の親水頭部は、ナノ粒子の表面にあるカルボキシル基等の活性反応基と化学結合が可能な、ホスファエタノールアミン（ＰＥ）を備える構造が好ましい。このようなリン脂質としては、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファエタノールアミン（ＤＳＰＥ）等が挙げられる。
ポリエーテル化リン脂質としては、ＰＥＧ化リン脂質、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）化リン脂質等が挙げられ、中でもＰＥＧ化リン脂質が好ましい。
In the phospholipid, the acyl chain length of the hydrophobic part, the presence or absence of a double bond in the acyl chain, and the site and number of the double bond are not particularly limited. However, the hydrophilic head of the phospholipid preferably has a structure including phosphaethanolamine (PE) capable of chemically bonding with an active reactive group such as a carboxyl group on the surface of the nanoparticle. Such phospholipids include 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphaethanolamine (DOPE), 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphaethanolamine (DPPE), 1 , 2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphaethanolamine (DSPE) and the like.
Examples of polyether phospholipids include PEGylated phospholipids and polypropylene glycol (PPG) phospholipids, among which PEGylated phospholipids are preferred.
このような単体型のナノ粒子−生体関連分子複合体としては、例えば、図２に示すナノ粒子−生体関連分子複合体５０、図３に示すナノ粒子−生体関連分子複合体６０が挙げられる。 Examples of such a simple nanoparticle-biorelevant molecule complex include a nanoparticle-biorelevant molecule complex 50 shown in FIG. 2 and a nanoparticle-biorelevant molecule complex 60 shown in FIG.
図２に示すように、ナノ粒子−生体関連分子複合体５０は、半導体ナノ粒子であるコア部５４とシェル部５６とからなるナノ粒子５２と、リン脂質５８とを備え、ナノ粒子５２の表面、即ちシェル部５６に存在する活性官能基にリン脂質５８が結合したものである。
また、図３に示すように、ナノ粒子−生体関連分子複合体６０は、ナノ粒子５２とＰＥＧ化リン脂質６１とを備え、ナノ粒子５２の表面に存在する活性官能基にＰＥＧ化リン脂質６１が結合したものである。ＰＥＧ化リン脂質６１は、ＰＥＧ部６２とリン脂質部６４とからなり、ナノ粒子−生体関連分子複合体６０は、ＰＥＧ部６２の末端がシェル部５６と結合されたものである。
As shown in FIG. 2, the nanoparticle-biorelevant molecule complex 50 includes a nanoparticle 52 including a core portion 54 and a shell portion 56 that are semiconductor nanoparticles, and a phospholipid 58, and the surface of the nanoparticle 52. That is, a phospholipid 58 is bonded to an active functional group present in the shell portion 56.
In addition, as shown in FIG. 3, the nanoparticle-biorelevant molecule complex 60 includes a nanoparticle 52 and a PEGylated phospholipid 61, and PEGylated phospholipid 61 is added to an active functional group present on the surface of the nanoparticle 52. Are combined. The PEGylated phospholipid 61 is composed of a PEG portion 62 and a phospholipid portion 64, and the nanoparticle-biorelevant molecule complex 60 is obtained by binding the end of the PEG portion 62 to the shell portion 56.
単体型のナノ粒子−生体関連分子複合体の製造方法は、ナノ粒子の表面、即ちシェル部の反応活性基に、生体関連分子の反応活性基を結合するものであり、公知の脱水縮合反応による結合方法が挙げられる。例えば、ナノ粒子を量子ドットとし、生体関連分子を、ホスファエタノールアミンを含有するリン脂質又はアミノ化ポリエチレングリコールリン脂質とする場合、量子ドットと生体関連分子とを１−エチル−３（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）触媒下で脱水縮合する製造方法が挙げられる。 The production method of the single-piece nanoparticle-biorelevant molecule complex is to bind the reactive group of the biorelevant molecule to the surface of the nanoparticle, i.e., the reactive group of the shell part, by a known dehydration condensation reaction. A bonding method is mentioned. For example, when the nanoparticle is a quantum dot and the bio-related molecule is a phospholipid or aminated polyethylene glycol phospholipid containing phosphaethanolamine, the quantum dot and the bio-related molecule are 1-ethyl-3 (3- Examples thereof include a production method in which dehydration condensation is performed in the presence of (dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) catalyst.
金ナノ粒子の表面に、リン脂質を結合する方法としては、例えば、特開２００８−００７８１５号公報、Ｈ．Ｎａｋａｓｈｉｍａら、「ラングミュア（Ｌａｎｇｍｕｉｒ）」、第２４巻、２００８年、第５６５４−５６５８頁に記載の公知の方法を用いることができる。 As a method for binding phospholipid to the surface of the gold nanoparticle, for example, JP-A-2008-007815, H.P. Known methods described in Nakashima et al., “Langmuir”, Vol. 24, 2008, pp. 5654-5658 can be used.
≪機能性単体型≫
機能性単体型は、ナノ粒子の表面に生体関連分子として、機能性ポリエーテルが結合されたものである。
機能性単体型におけるナノ粒子は、単体型におけるナノ粒子と同じである。
≪Functional unit type≫
The functional simple substance is a substance in which a functional polyether is bound to the surface of a nanoparticle as a bio-related molecule.
The nanoparticles in the functional single type are the same as the nanoparticles in the single type.
機能性ポリエーテルは、ビオチン化ポリエーテル、マレイミド化ポリエーテル及びスクシンイミド化ポリエーテルから選択される少なくとも１種である。機能性単体型のナノ粒子−生体関連分子複合体は、ナノ粒子の表面に、機能性ポリエーテルが結合していることで、任意のタンパク質と特異的に結合し、タンパク質を標識化することができる。例えば、ビオチン化ポリエーテルはストレプトアビジンと結合し、マレイミド化ポリエーテル、スクシンイミド化ポリエーテルは、抗原、抗体、酵素、膜タンパク質、受容体型タンパク質、蛍光タンパク質、細胞骨格、モータータンパク質等のタンパク質の末端アミノ基と結合して、容易にタンパク質を標識化できる。 The functional polyether is at least one selected from biotinylated polyethers, maleimidated polyethers, and succinimidated polyethers. Functional single-particulate nanoparticle-biorelevant molecular complexes can bind specifically to any protein and label the protein by binding the functional polyether to the surface of the nanoparticle. it can. For example, biotinylated polyether binds to streptavidin, and maleimidated polyether and succinimided polyether are the ends of proteins such as antigens, antibodies, enzymes, membrane proteins, receptor proteins, fluorescent proteins, cytoskeletons, motor proteins, etc. A protein can be easily labeled by binding to an amino group.
機能性ポリエーテルを構成するポリエーテルは、シェル部の材質等を勘案して決定でき、例えば、ＰＥＧ、ＰＰＧ等が挙げられ、中でもＰＥＧが好ましい。
ポリエーテルをＰＥＧとする場合、ＰＥＧの鎖長は特に限定されないが、質量平均分子量５００〜１００００のものが好ましい。
The polyether constituting the functional polyether can be determined in consideration of the material of the shell portion and the like, and examples thereof include PEG, PPG, etc. Among them, PEG is preferable.
When the polyether is PEG, the chain length of PEG is not particularly limited, but those having a mass average molecular weight of 500 to 10,000 are preferred.
このような機能性ポリエーテルをナノ粒子の表面に付与するには、例えば、ビオチン−ポリエチレングリコール（２０００）アミン（Ｂｉｏｔｉｎ−ＰＥＧ２０００−Ａｍｉｎｅ）等のビオチン化ＰＥＧアミン、マレイミド−ポリエチレングリコール（２０００）アミン（Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ−ＰＥＧ２０００−Ａｍｉｎｅ）等のマレイミド化ＰＥＧアミン、スクシンイミド−ポリエチレングリコール（２０００）アミン（Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ−ＰＥＧ２０００−Ａｍｉｎｅ）等のスクシンイミド化ＰＥＧアミン等を用いればよい。 In order to impart such a functional polyether to the surface of the nanoparticle, for example, biotinylated PEG amine such as biotin-polyethylene glycol (2000) amine (Biotin-PEG2000-Amine), maleimide-polyethylene glycol (2000) amine A maleimidated PEG amine such as (Maleimide-PEG2000-Amine), a succinimide-PEGamine such as succinimide-polyethylene glycol (2000) amine, or the like may be used.
このような機能性単体型のナノ粒子−生体関連分子複合体としては、例えば、図４に示すナノ粒子−生体関連分子複合体７０、図５に示すナノ粒子−生体関連分子複合体８０が挙げられる。 Examples of such a functional unit-type nanoparticle-biorelevant molecule complex include a nanoparticle-biorelevant molecule complex 70 shown in FIG. 4 and a nanoparticle-biorelevant molecule complex 80 shown in FIG. It is done.
図４に示すように、ナノ粒子−生体関連分子複合体７０は、ナノ粒子５２とビオチン化ＰＥＧ７１とを備えるものである。ナノ粒子−生体関連分子複合体７０は、シェル部５６の表面にＰＥＧ７２が結合され、ＰＥＧ７２の末端にビオチン７４が備えられていることで、その最外部にビオチン７４が位置するものとされている。
また、図５に示すように、ナノ粒子−生体関連分子複合体８０は、ナノ粒子５２とマレイミド化ＰＥＧ又はスクシンイミド化ＰＥＧからなるタンパク質結合型ＰＥＧ８１とを備えるものである。ナノ粒子−生体関連分子複合体８０は、シェル部５６の表面にＰＥＧ７２が結合され、ＰＥＧ７２の末端にマレイミド又はスクシンイミドから選択される結合部８４が備えられていることで、その最外部にマレイミド又はスクシンイミドが位置するものとされている。
As shown in FIG. 4, the nanoparticle-biorelevant molecule complex 70 includes nanoparticles 52 and biotinylated PEG 71. In the nanoparticle-biorelevant molecule complex 70, PEG 72 is bonded to the surface of the shell portion 56, and biotin 74 is provided at the end of the PEG 72, so that biotin 74 is located at the outermost part. .
As shown in FIG. 5, the nanoparticle-biorelevant molecule complex 80 includes nanoparticles 52 and a protein-binding PEG 81 made of maleimide PEG or succinimide PEG. In the nanoparticle-biorelevant molecule complex 80, PEG 72 is bonded to the surface of the shell portion 56, and a bonding portion 84 selected from maleimide or succinimide is provided at the end of the PEG 72, so that maleimide or Succinimide is located.
機能性単体型のナノ粒子−生体関連分子複合体の製造方法は、「≪単体型≫」のナノ粒子と同様のものが挙げられる。
また、金ナノ粒子の表面に機能性ポリエーテルを導入する方法としては、例えば、末端にカルボキシル基を有するアルキルチオールで金ナノ粒子の表面を修飾し、該金ナノ粒子と、末端アミノ基を有するビオチン化ＰＥＧとを１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）触媒下で脱水縮合する製造方法が挙げられる。
Examples of the method for producing the functional simple substance-type nanoparticle-biorelevant molecule complex include the same method as that of the nano-particle of “<< single form >>”.
Moreover, as a method for introducing a functional polyether into the surface of the gold nanoparticle, for example, the surface of the gold nanoparticle is modified with an alkylthiol having a carboxyl group at the terminal, and the gold nanoparticle and the terminal amino group are included. Examples thereof include a production method in which biotinylated PEG is subjected to dehydration condensation in the presence of 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC) catalyst.
≪ベシクル型≫
ベシクル型は、リン脂質の脂質二重層（リン脂質二重層）がカプセル状に形成されたベシクルとナノ粒子複合体とを備え、ナノ粒子複合体がリン脂質二重層の層内及び表面の双方又はいずれか一方に含有されてなるものである。加えて、ベシクル内に形成される内孔には、液体が保持されている。
≪Vesicle type≫
The vesicle type comprises a vesicle in which a lipid bilayer of phospholipid (phospholipid bilayer) is formed in a capsule shape and a nanoparticle complex, and the nanoparticle complex is both inside and on the surface of the phospholipid bilayer or on the surface. It is contained in either one. In addition, liquid is held in the inner hole formed in the vesicle.
ベシクルを構成するリン脂質は、その疎水部のアシル鎖長、アシル鎖内の二重結合の有無、さらにその二重結合の部位と数は特に限定されない。ベシクルを構成するリン脂質としては、例えば、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルイノシトールホスフェイト（ＰＩＰ）、ホスファチジン酸（ＰＡ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、スフィンゴ脂質等が挙げられる。これらリン脂質は、１種類のみを使用してもよく、２種類以上を併用してもよい。 The phospholipid constituting the vesicle is not particularly limited in the acyl chain length of the hydrophobic part, the presence or absence of a double bond in the acyl chain, and the site and number of the double bond. Examples of the phospholipid constituting the vesicle include phosphatidylcholine (PC), phosphatidylethanolamine (PE), phosphatidylserine (PS), phosphatidylinositol (PI), phosphatidylinositol phosphate (PIP), phosphatidic acid (PA), phosphatidyl. Examples thereof include glycerol (PG) and sphingolipid. These phospholipids may be used alone or in combination of two or more.
ベシクルは、そのサイズにより、外径５０ｎｍ未満のスモールベシクルと、外径５０ｎｍ以上のラージベシクルとに分類され、特に、外径１０μｍ超のベシクルは、巨大ベシクルと呼ばれている。ベシクルの外径（ベシクルサイズ）は、合成方法やサイズ分離精製によって制御することができる。本発明に用いるベシクルは、その大きさが特に限定されないが、巨大ベシクルであることが好ましい。一般に、小さなベシクルサイズでは、ベシクルの膜厚が４〜５ｎｍであり、仮にベシクルサイズが５０〜１００ｎｍであると、球状構造の曲率が高くなるため、膜面に欠陥が生じやすく、構造が不安定である。このため本発明においては、ベシクルの取り扱い操作の簡便性、ベシクル構造の安定性、ベシクル内に形成された内孔内への化学物質の取り込みの制御性、という観点から巨大ベシクルを用いることがより好ましい。巨大ベシクルとすることで、化学物質を幅広い濃度で内孔に内包できる。 Vesicles are classified into small vesicles having an outer diameter of less than 50 nm and large vesicles having an outer diameter of 50 nm or more depending on the size thereof. In particular, vesicles having an outer diameter of more than 10 μm are called giant vesicles. The outer diameter (vesicle size) of the vesicle can be controlled by a synthesis method or size separation purification. The size of the vesicle used in the present invention is not particularly limited, but is preferably a giant vesicle. In general, when the vesicle size is small, the film thickness of the vesicle is 4 to 5 nm. If the vesicle size is 50 to 100 nm, the curvature of the spherical structure increases, so that the film surface is likely to be defective and the structure is unstable. It is. For this reason, in the present invention, it is more preferable to use a huge vesicle from the viewpoints of easy handling operation of the vesicle, stability of the vesicle structure, and controllability of chemical substance uptake into the inner hole formed in the vesicle. preferable. By using huge vesicles, chemical substances can be contained in the inner pores in a wide range of concentrations.
内孔内の液体の種類は、特に限定されず、ベシクル型のナノ粒子−生体関連分子複合体の製造過程で用いられる溶媒等が挙げられる。内孔内に液体が保持されていることで、ナノ粒子−生体関連分子複合体の形態が維持される。 The type of the liquid in the inner hole is not particularly limited, and examples thereof include a solvent used in the production process of the vesicle-type nanoparticle-biorelevant molecule complex. Since the liquid is held in the inner hole, the form of the nanoparticle-biorelevant molecule complex is maintained.
内孔内には、化学物質が内包されていてもよい（以下、化学物質がベシクルに内包されたナノ粒子−生体関連分子複合体を特に化学物質内包型ということがある）。
化学物質は、対象とする生体物質と、化学結合の形成、吸着等の何らかの相互作用を生じる特異結合物質が存在するもの、即ち、例えば、ある種のタンパク質を特異的に認識したり、タンパク質を活性化したりする生理活性物質等が挙げられ、具体的には、各種アミノ酸、ＡＴＰ、イオン、糖類、タンパク質、ペプチド、低分子有機化合物等が挙げられる。
A chemical substance may be encapsulated in the inner hole (hereinafter, a nanoparticle-biorelevant molecular complex in which a chemical substance is encapsulated in a vesicle may be particularly referred to as a chemical substance-encapsulated type).
A chemical substance is a substance in which a specific binding substance that causes some kind of interaction such as formation of a chemical bond or adsorption with a target biological substance exists, that is, for example, specifically recognizes a certain type of protein or Examples thereof include physiologically active substances that are activated, and specific examples include various amino acids, ATP, ions, sugars, proteins, peptides, low molecular organic compounds, and the like.
ベシクル型のナノ粒子−生体関連分子複合体は、さらにその表面に機能性ポリエーテルを結合させ、機能性ポリエーテルを備えていてもよい（以下、表面に機能性ポリエーテルを備えるベシクル型のナノ粒子−生体関連分子複合体を特に機能性ベシクル型ということがある）。
機能性ベシクル型のナノ粒子−生体関連分子複合体に用いられる機能性ポリエーテルは、例えば、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファエタノールアミン−Ｎ−［ビオチニル（ポリエチレングリコール）−２０００］（アンモニウム塩）（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−Ｂｉｏｔｉｎ）等のビオチン−ＰＥＧ化リン脂質、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファエタノールアミン−Ｎ−［マレイミド（ポリエチレングリコール）−２０００］（アンモニウム塩）（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ）等のマレイミド−ＰＥＧ化リン脂質、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファエタノールアミン−Ｎ−［スクシンイミド（ポリエチレングリコール）−２０００］（アンモニウム塩）（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）等のスクシンイミド−ＰＥＧ化リン脂質が好適なものとして挙げられる。
ベシクルは、柔軟で、流体のような特性をもつため、長時間放置するとベシクル同士の融合が生じる可能性がある。この問題を克服するため、ベシクル表面へ機能性ポリエーテルを導入し、ベシクル融合を防止することが好ましい。機能性ポリエーテルを備えることで、ベシクル表面にあるポリエーテルの排除体積効果（立体障害）により、溶液中でベシクルを単体に保ち、ベシクル構造を長時間安定化させることができる。
加えて、機能性ベシクル型のナノ粒子−生体関連分子複合体は、機能性ポリエーテルが結合していることで、任意のタンパク質と特異的に結合し、タンパク質を標識化することができる。
The vesicle-type nanoparticle-biorelevant molecule complex may be further provided with a functional polyether on the surface thereof (hereinafter referred to as a vesicle-type nanoparticle having a functional polyether on the surface). The particle-biorelevant molecular complex is sometimes called a functional vesicle type in particular).
The functional polyether used for the functional vesicle type nanoparticle-biorelevant molecule complex is, for example, 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphaethanolamine-N- [biotinyl (polyethylene glycol) -2000] (ammonium salt) (DSPE-PEG2000-Biotin) and other biotin-PEGylated phospholipids, 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphaethanolamine-N- [maleimide (polyethylene glycol)- 2000] (Ammonium salt) (DSPE-PEG2000-Maleimide) and other maleimide-PEGylated phospholipids, 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphaethanolamine-N- [succinimide (polyethylene glycol) -2000 ] (Ammoni Unsalted) (DSPE-PEG2000-Succinimide) succinimide -PEG phospholipids such as are mentioned as suitable.
Since vesicles are flexible and have fluid-like characteristics, vesicles may be fused when left for a long time. In order to overcome this problem, it is preferable to introduce a functional polyether to the vesicle surface to prevent vesicle fusion. By including the functional polyether, the vesicle structure can be stabilized for a long time by keeping the vesicle alone in the solution by the excluded volume effect (steric hindrance) of the polyether on the vesicle surface.
In addition, the functional vesicle-type nanoparticle-biorelevant molecule complex can specifically bind to an arbitrary protein and label the protein by binding a functional polyether.
図６（ａ）は、機能性ベシクル型かつ化学物質内包型のナノ粒子−生体関連分子複合体の一例を示す断面図であり、図６（ｂ）は、（ａ）における領域Ｘの拡大図である。
図６（ａ）に示すように、ナノ粒子−生体関連分子複合体９０は、ナノ粒子複合体９４と、内孔９６を有するカプセル状のベシクル９２と、ビオチン−ＰＥＧ化リン脂質９１とを備え、内孔９６には、液体と共に化学物質９８が内包されているものである。図６（ｂ）に示すように、ベシクル９２は、リン脂質９３の二分子層であるリン脂質二重層からなり、リン脂質二重層の層内又は表面には、ナノ粒子複合体９４が含有されている。ナノ粒子−生体関連分子複合体９０は、ベシクル９２にＰＥＧリン脂質９５が結合し、ＰＥＧリン脂質９５の末端にビオチン７４が備えられることで、その最外部にビオチン７４が位置するものとされている。
6A is a cross-sectional view showing an example of a functional vesicle-type and chemical substance-encapsulated nanoparticle-biorelevant molecule complex, and FIG. 6B is an enlarged view of a region X in FIG. It is.
As shown in FIG. 6A, the nanoparticle-biorelevant molecule complex 90 includes a nanoparticle complex 94, a capsule-like vesicle 92 having an inner hole 96, and a biotin-PEGylated phospholipid 91. The inner hole 96 contains a chemical substance 98 together with a liquid. As shown in FIG. 6B, the vesicle 92 is composed of a phospholipid bilayer that is a bilayer of phospholipid 93, and the nanoparticle complex 94 is contained in or on the surface of the phospholipid bilayer. ing. In the nanoparticle-biorelevant molecule complex 90, PEG phospholipid 95 is bound to vesicle 92, and biotin 74 is provided at the end of PEG phospholipid 95, so that biotin 74 is located at the outermost part. Yes.
ナノ粒子複合体９４は、ナノ粒子の表面に生体関連分子が結合してなるものであり、単体型のナノ粒子−生体関連分子複合体、即ち、図２に示すナノ粒子−生体関連分子複合体５０と同じものである。 The nanoparticle complex 94 is formed by binding a biological molecule to the surface of the nanoparticle, and is a single-type nanoparticle-biological molecule complex, that is, the nanoparticle-biological molecule complex shown in FIG. The same as 50.
図７に示すように、ナノ粒子−生体関連分子複合体１００は、ナノ粒子複合体９４と、内孔９６を有するカプセル状のベシクル９２と、マレイミド−ＰＥＧ化リン脂質又はスクシンイミド−ＰＥＧ化リン脂質からなるタンパク質結合型ＰＥＧ化リン脂質１０１とを備え、内孔９６には、液体と共に化学物質９８が内包されているものである。加えて、ナノ粒子複合体９４は、ベシクルを構成するリン脂質二重層の層内及び表面に含有されている。
ナノ粒子−生体関連分子複合体１００は、ベシクル９２の表面にＰＥＧリン脂質９５が結合し、ＰＥＧリン脂質９５の末端に結合部８４が備えられることで、その最外部にマレイミド又はスクシンイミドが位置するものとされている。
As shown in FIG. 7, the nanoparticle-biorelevant molecular complex 100 includes a nanoparticle complex 94, a capsule-like vesicle 92 having an inner hole 96, and maleimide-PEGylated phospholipid or succinimide-PEGylated phospholipid. A protein-bound PEGylated phospholipid 101 comprising: a chemical substance 98 is contained in the inner hole 96 together with a liquid. In addition, the nanoparticle composite 94 is contained in and on the surface of the phospholipid bilayer constituting the vesicle.
In the nanoparticle-biorelevant molecule complex 100, the PEG phospholipid 95 is bonded to the surface of the vesicle 92, and the bonding portion 84 is provided at the end of the PEG phospholipid 95, so that maleimide or succinimide is located at the outermost part. It is supposed to be.
さらに、機能性ベシクル型のナノ粒子−生体関連分子複合体は、タンパク質を標識化していてもよい。標識化されるタンパク質としては、ストレプトアビジン、抗原、抗体、酵素、膜タンパク質、受容体型タンパク質、蛍光タンパク質、細胞骨格、モータータンパク質等が挙げられる。 Furthermore, the functional vesicle-type nanoparticle-biorelevant molecule complex may be labeled with a protein. Examples of the protein to be labeled include streptavidin, antigen, antibody, enzyme, membrane protein, receptor protein, fluorescent protein, cytoskeleton, motor protein and the like.
本発明のベシクル型のナノ粒子−生体関連分子複合体の製造方法は、ポリマーからなるシェル部を有するナノ粒子の表面に、生体関連分子を結合してナノ粒子複合体、即ち単体型のナノ粒子−生体関連分子複合体を得る第一の工程と、得られた複合体とリン脂質とを分散媒に分散した後、分散媒を除去してリン脂質を薄膜化し、次いで水溶液中で前記リン脂質をカプセル化する第二の工程とを有するものである。 The method for producing a vesicle-type nanoparticle-biorelevant molecule complex according to the present invention comprises a nanoparticle complex, that is, a single-type nanoparticle obtained by binding a biorelevant molecule to the surface of a nanoparticle having a shell portion made of a polymer. -A first step of obtaining a biologically relevant molecular complex, and after dispersing the obtained complex and phospholipid in a dispersion medium, the dispersion medium is removed to form a thin phospholipid, and then the phospholipid in an aqueous solution. And a second step of encapsulating.
第一の工程は、前述の「≪単体型≫」のナノ粒子−生体関連分子複合体の製造方法と同じである。 The first step is the same as the above-described method for producing the “<< unitary type” nanoparticle-biorelevant molecule complex.
第二の工程は、第一の工程で得られたナノ粒子複合体と、ベシクルを構成するリン脂質（ベシクル用リン脂質）とを分散媒に分散し（分散操作）、次いで、分散媒を除去・乾燥した後、水や緩衝液中でベシクル用リン脂質をカプセル状に形成し（カプセル化操作）ベシクルとする工程である。 In the second step, the nanoparticle composite obtained in the first step and the phospholipid (phospholipid for vesicle) constituting the vesicle are dispersed in a dispersion medium (dispersion operation), and then the dispersion medium is removed. -After drying, a vesicle phospholipid is formed in a capsule shape in water or a buffer solution (encapsulation operation) to form a vesicle.
［分散操作］
分散操作は、分散媒にナノ粒子複合体及びベシクル用リン脂質を分散するものである。
分散媒は、クロロホルム等の有機溶剤が挙げられる。
分散液中の、ナノ粒子複合体の濃度は、特に限定されないが、例えば、０．００１〜１ｇ／Ｌが好ましい。
また、分散液中のリン脂質濃度は、特に限定されないが、例えば、０．１〜１０ｇ／Ｌが好ましい。
[Distributed operation]
In the dispersing operation, the nanoparticle composite and the phospholipid for vesicle are dispersed in a dispersion medium.
Examples of the dispersion medium include organic solvents such as chloroform.
Although the density | concentration of the nanoparticle composite in a dispersion liquid is not specifically limited, For example, 0.001-1 g / L is preferable.
Moreover, the phospholipid concentration in the dispersion is not particularly limited, but is preferably 0.1 to 10 g / L, for example.
分散液には、必要に応じて、ビオチン−ＰＥＧ化リン脂質、マレイミド−ＰＥＧ化リン脂質又はスクシンイミド−ＰＥＧ化リン脂質等の機能性ポリエーテルを添加することができる。分散液に機能性ポリエーテルを添加することで、ベシクルの表面に機能性ポリエーテルを導入できる。分散液中の機能性ポリエーテルの含有量は、ベシクル用リン脂質に対し０．１〜１質量％が好ましい。 If necessary, a functional polyether such as biotin-PEGylated phospholipid, maleimide-PEGylated phospholipid, or succinimide-PEGylated phospholipid can be added to the dispersion. By adding a functional polyether to the dispersion, the functional polyether can be introduced on the surface of the vesicle. The content of the functional polyether in the dispersion is preferably 0.1 to 1% by mass with respect to the phospholipid for vesicles.
［カプセル化操作］
カプセル化操作は、分散媒である有機溶剤を除去・乾燥して、ベシクル用リン脂質からなるリン脂質薄膜を形成し、このリン脂質薄膜を水や緩衝液中でカプセル状に形成させベシクルを作製するものである。ベシクルの作製の手法としては、静置水和法やエレクトロスウェリング法（電界形成法）等が挙げられ、中でも巨大ベシクルが作製しやすく、また反応時間や反応プロセスの簡易性から、電界形成法を採用することが好ましい。電界形成法は、例えば、Ｐ．Ｇｉｒａｒｄら、「バイオフィジカルジャーナル（Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ）」、第８７巻、２００４年、第４１９−４２９頁に記載の公知の電解形成法が挙げられる。電界形成法は、酸化インジウムスズ（ＩＴＯ）等の電極上に分散液を塗布し、分散媒を除去・乾燥してリン脂質を薄膜化した後、この薄膜にベシクル化水溶液を添加し、交流電場をかけて水溶液中に巨大ベシクルを膨潤させる手法である。
分散媒の除去方法は、特に限定されず、例えば、減圧乾燥等が挙げられる。
ベシクル化水溶液としては、水又はリン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液等の緩衝液が用いられる。サイズのそろったベシクルを得るためには、ＩＴＯ基板上に厚さ１０ｎｍ〜１００μｍの均一なリン脂質の薄膜を形成することが好ましい。また、印加する交流電場は、周波数が１０Ｈｚ程度、振幅が１００ｍＶ〜２Ｖ程度の条件が好ましい。より低い振幅では、ベシクルの収量が低く、より高い振幅では、ベシクルの構造破壊や水の電気分解が生じ、ベシクルが製造できない可能性がある。
[Encapsulation operation]
In the encapsulation operation, the organic solvent, which is the dispersion medium, is removed and dried to form a phospholipid thin film composed of phospholipids for vesicles, and this phospholipid thin film is formed into a capsule in water or a buffer to produce a vesicle. To do. Examples of methods for producing vesicles include static hydration method and electro-swelling method (electric field forming method). Among them, large vesicles are easy to produce, and because of the reaction time and the simplicity of the reaction process, the electric field forming method. Is preferably adopted. The electric field forming method is, for example, P.I. Examples include known electrolysis methods described in Girard et al., “Biophysical Journal”, Vol. 87, 2004, pp. 419-429. In the electric field forming method, a dispersion liquid is applied on an electrode such as indium tin oxide (ITO), the dispersion medium is removed and dried to form a phospholipid film, and then a vesicle aqueous solution is added to the thin film to generate an alternating electric field. This is a technique for swelling giant vesicles in an aqueous solution by applying.
The method for removing the dispersion medium is not particularly limited, and examples thereof include drying under reduced pressure.
As the aqueous vesicle solution, water or a buffer solution such as a phosphate buffer solution or a borate buffer solution is used. In order to obtain vesicles of uniform size, it is preferable to form a uniform phospholipid thin film having a thickness of 10 nm to 100 μm on the ITO substrate. Moreover, the AC electric field to be applied is preferably under the conditions of a frequency of about 10 Hz and an amplitude of about 100 mV to 2 V. At lower amplitudes, the yield of vesicles is low, and at higher amplitudes, vesicles may break down or electrolyze water, and vesicles may not be manufactured.
このカプセル化操作は、ベシクル化水溶液中でリン脂質からなるベシクルを形成する操作である。ベシクル化水溶液には、必要に応じて化学物質を添加することができる。ベシクル化水溶液に化学物質を添加することで、化学物質内包型のナノ粒子−生体関連分子複合体を製造できる。
以上の工程により、ベシクル型のナノ粒子−生体関連分子複合体が分散したベシクル分散液を得られる。
This encapsulation operation is an operation for forming a vesicle composed of a phospholipid in a vesicular aqueous solution. A chemical substance can be added to the aqueous vesicle solution as necessary. By adding a chemical substance to the aqueous vesicle solution, a chemical substance-encapsulated nanoparticle-biorelevant molecule complex can be produced.
Through the above steps, a vesicle dispersion in which vesicle-type nanoparticle-biorelevant molecule complexes are dispersed can be obtained.
≪タンパク質標識型≫
タンパク質標識型は、機能性単体型又は機能性ベシクル型のナノ粒子−生体関連分子複合体がタンパク質を標識化したものである。標識化されるタンパク質としては、ストレプトアビジン、抗原、抗体、酵素、膜タンパク質、受容体型タンパク質、蛍光タンパク質、細胞骨格、モータータンパク質等が挙げられる。
標識化の方法は、機能性ポリエーテルの末端のビオチン、マレイミド又はスクシンイミドと、任意のタンパク質との特異的な結合により行うことができる。
≪Protein labeling type≫
The protein labeling type is a protein labeled with a functional simple substance type or functional vesicle type nanoparticle-biorelevant molecule complex. Examples of the protein to be labeled include streptavidin, antigen, antibody, enzyme, membrane protein, receptor protein, fluorescent protein, cytoskeleton, motor protein and the like.
The labeling method can be performed by specific binding of biotin, maleimide or succinimide at the end of the functional polyether and any protein.
＜分析方法＞
次に、本発明の生体分析用キット１を用いた分析方法について、図１を用いて説明する。図１中、符号Ｓ１は、脂質分子を含む混合物を示し、符号Ｓ２は、脂質二分子膜を示す。
<Analysis method>
Next, an analysis method using the bioanalytical kit 1 of the present invention will be described with reference to FIG. In FIG. 1, symbol S1 indicates a mixture containing lipid molecules, and symbol S2 indicates a lipid bilayer membrane.
まず、第一の試料収容部１４に混合物Ｓ１を配置した後、親水部１３が覆われるように基板本体１０に緩衝液を添加する。
混合物Ｓ１は、脂質分子を含むものである。脂質分子においては、各脂質の疎水部のアシル鎖長、アシル鎖内の二重結合の有無、さらにその二重結合の部位と数は特に限定されない。脂質分子としては、例えば、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファチジルイノシトールホスフェイト（ＰＩＰ）、ホスファチジン酸（ＰＡ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、スフィンゴ脂質等が挙げられる。中でも、例えば、卵黄由来フォスファチジルコリン（Ｌ−α−ＰＣ）やＤＯＰＥ等、室温付近（１０〜３０℃）で流動性の高い脂質分子が好ましい。このような室温で流動性の高い脂質分子のみからなる脂質二分子膜は、自発展開現象を発現する。これらの脂質分子は、１種類のみを使用してもよく、２種類以上を併用してもよい。
ここで、自発展開とは、基板本体１０の表面上を、脂質二分子膜が自己組織化によって成長しつつ広がっていくことをいう。自発展開は、通常、緩衝液中で生じる。
First, after arranging the mixture S1 in the first sample storage part 14, a buffer solution is added to the substrate body 10 so that the hydrophilic part 13 is covered.
The mixture S1 contains lipid molecules. In the lipid molecule, the acyl chain length of the hydrophobic part of each lipid, the presence or absence of a double bond in the acyl chain, and the site and number of the double bond are not particularly limited. Examples of lipid molecules include phosphatidylcholine (PC), phosphatidylethanolamine (PE), phosphatidylserine (PS), phosphatidylinositol (PI), phosphatidylinositol phosphate (PIP), phosphatidic acid (PA), phosphatidylglycerol (PG) And sphingolipids. Among these, lipid molecules having high fluidity near room temperature (10 to 30 ° C.) such as egg yolk-derived phosphatidylcholine (L-α-PC) and DOPE are preferable. Such a lipid bilayer composed only of lipid molecules having high fluidity at room temperature exhibits a spontaneous expansion phenomenon. These lipid molecules may be used alone or in combination of two or more.
Here, spontaneous development means that the lipid bilayer grows on the surface of the substrate body 10 while growing by self-assembly. Spontaneous development usually occurs in buffer.
加えて、混合物Ｓ１には、分析対象とするタンパク質が含まれていてもよい。
さらに、混合物Ｓ１には、本発明のナノ粒子−生体関連分子複合体が含まれてもよい。混合物Ｓ１に含まれるナノ粒子−生体関連分子複合体としては、上述した単体型、機能性単体型、ベシクル型又はタンパク質標識型のいずれであってもよく、ベシクル型のナノ粒子−生体関連分子複合体を用いる場合には、化学物質含有型、機能性ベシクル型又はこれらを組み合わせたものであってもよい。
In addition, the mixture S1 may contain a protein to be analyzed.
Furthermore, the mixture S1 may contain the nanoparticle-biorelevant molecule complex of the present invention. The nanoparticle-biorelevant molecule complex contained in the mixture S1 may be any of the above-described simple substance type, functional simple substance type, vesicle type, or protein labeling type, and the vesicle type nanoparticle-biorelevant molecule complex. When using a body, it may be a chemical substance-containing type, a functional vesicle type, or a combination thereof.
親水部１３に添加する緩衝液は、脂質二分子膜を構成する脂質分子や、分析対象とするタンパク質の種類に応じて決定でき、例えば、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液等が挙げられる。 The buffer solution added to the hydrophilic part 13 can be determined according to the lipid molecule constituting the lipid bilayer membrane and the type of protein to be analyzed, and examples thereof include a phosphate buffer solution and a borate buffer solution.
親水部１３に緩衝液を添加すると、脂質分子は、混合物Ｓ１の裾野から親水部１３上を自発展開して脂質二分子膜Ｓ２となる。脂質二分子膜Ｓ２は、（人工）脂質二分子膜であり、両親媒性分子であるリン脂質等の脂質分子が二層構造を形成した脂質二分子の単一膜であり、生体膜の最も基本的な構造である。この脂質二分子膜Ｓ２は、疎水部１２上には広がらないため、矢印Ｆのように第一の試料収容部１４から流路１６を経て、第二の試料収容部１８へ向かって親水部１３上で展開する。 When a buffer solution is added to the hydrophilic portion 13, the lipid molecules spontaneously develop on the hydrophilic portion 13 from the bottom of the mixture S1 to become a lipid bilayer membrane S2. The lipid bilayer membrane S2 is an (artificial) lipid bilayer membrane, and is a single membrane of lipid bimolecules in which lipid molecules such as phospholipids, which are amphipathic molecules, form a bilayer structure. Basic structure. Since the lipid bilayer membrane S2 does not spread on the hydrophobic portion 12, the hydrophilic portion 13 passes from the first sample storage portion 14 through the flow path 16 to the second sample storage portion 18 as indicated by an arrow F. Expand above.
混合物Ｓ１にタンパク質が含まれている場合、脂質二分子膜Ｓ２の自発展開に従い、タンパク質が第一の試料収容部１４から第二の試料収容部１８に輸送される。この際、機能性単体型又は機能性ベシクル型のナノ粒子−生体関連分子複合体を脂質二分子膜Ｓ２に導入することで、タンパク質を標識化したナノ粒子−生体関連分子複合体が第二の試料収容部１８に輸送される。 When the mixture S1 contains a protein, the protein is transported from the first sample container 14 to the second sample container 18 in accordance with the spontaneous development of the lipid bilayer membrane S2. At this time, the functionalized single-type or functional vesicle-type nanoparticle-biorelevant molecule complex is introduced into the lipid bilayer membrane S2, so that the protein-labeled nanoparticle-biorelevant molecule complex becomes the second molecule. It is transported to the sample storage unit 18.
あるいは、混合物Ｓ１に本発明のナノ粒子−生体関連分子複合体が含まれている場合、ナノ粒子−生体関連分子複合体は、脂質二分子膜Ｓ２の表面に導入され、脂質二分子膜Ｓ２の自発展開に従い、第一の試料収容部１４から第二の試料収容部１８に輸送される。
以下に、脂質二分子膜Ｓ２の自発展開に伴いナノ粒子−生体関連分子複合体が輸送される形態について、図８〜１５を用いて説明する。図８〜１５は、図１の輸送基板１の案内部１９の拡大図であり、脂質二分子膜Ｓ２が矢印Ｆの方向に自発展開する様子を示したものである。
Alternatively, when the mixture S1 contains the nanoparticle-biorelevant molecule complex of the present invention, the nanoparticle-biorelevant molecule complex is introduced on the surface of the lipid bilayer membrane S2, and the lipid bilayer membrane S2 In accordance with the spontaneous deployment, the sample is transported from the first sample container 14 to the second sample container 18.
Below, the form in which a nanoparticle-biorelevant molecule complex is transported with the spontaneous development of the lipid bilayer membrane S2 will be described with reference to FIGS. 8 to 15 are enlarged views of the guide portion 19 of the transport substrate 1 in FIG. 1 and show a state in which the lipid bilayer membrane S2 spontaneously expands in the direction of the arrow F.
例えば、混合物に単体型のナノ粒子−生体関連分子複合体が含まれる例を図８〜９に示す。
図８に示すように、単体型である図２のナノ粒子−生体関連分子複合体５０が混合物に含まれると、ナノ粒子−生体関連分子複合体５０は、その表面の生体関連分子であるリン脂質と脂質二分子膜Ｓ２との親和力により脂質二分子膜Ｓ２に導入され、脂質二分子膜Ｓ２の自発展開に伴って矢印Ｆの方向に輸送される。
For example, FIGS. 8 to 9 show examples in which a single-type nanoparticle-biorelevant molecule complex is included in the mixture.
As shown in FIG. 8, when the nanoparticle-biorelevant molecule complex 50 of FIG. 2 that is a single type is included in the mixture, the nanoparticle-biorelevant molecule complex 50 is phosphorous that is a biorelevant molecule on the surface thereof. It is introduced into the lipid bilayer membrane S2 by the affinity between the lipid and the lipid bilayer membrane S2, and is transported in the direction of arrow F along with the spontaneous development of the lipid bilayer membrane S2.
あるいは、図９に示すように、混合物に単体型である図３のナノ粒子−生体関連分子複合体６０が含まれると、ナノ粒子−生体関連分子複合体６０は、ＰＥＧ化リン脂質６１と脂質二分子膜Ｓ２との親和力により脂質二分子膜Ｓ２に導入され、脂質二分子膜Ｓ２の自発展開に伴って矢印Ｆの方向に輸送される。 Alternatively, as shown in FIG. 9, when the mixture includes the nanoparticle-biorelevant molecule complex 60 of FIG. 3 that is a single type, the nanoparticle-biorelevant molecule complex 60 is composed of PEGylated phospholipid 61 and lipid. It is introduced into the lipid bilayer membrane S2 due to its affinity with the bilayer membrane S2, and is transported in the direction of arrow F along with the spontaneous development of the lipid bilayer membrane S2.
また、例えば、機能性単体型のナノ粒子−生体関連分子複合体で標識化されたタンパク質が脂質二分子膜で輸送される例を図１０〜１１に示す。
図１０に示すように、機能性単体型である図４のナノ粒子−生体関連分子複合体７０は、ビオチン化ＰＥＧ７１の末端のビオチン７４と、タンパク質であるストレプトアビジン１１０との特異的な結合により、ストレプトアビジン１１０を標識化している。そして、標識化されたストレプトアビジン１１０が脂質二分子膜Ｓ２に導入されることで、ナノ粒子−生体関連分子複合体７０とストレプトアビジン１１０とは、結合した状態で、脂質二分子膜Ｓ２の自発展開に伴い、矢印Ｆの方向に輸送される。かかる形態においては、ストレプトアビジン１１０をナノ粒子−生体関連分子複合体７０で標識化した後に混合物へ添加してもよいし、ストレプトアビジン１１０とナノ粒子−生体関連分子複合体７０とをそれぞれ混合物に添加してもよい。あるいは、脂質二分子膜Ｓ２の自発展開に伴って輸送されるストレプトアビジン１１０に対し、ナノ粒子−生体関連分子複合体７０を添加して標識化してもよい。
Further, for example, FIGS. 10 to 11 show examples in which a protein labeled with a functional simple-type nanoparticle-biorelevant molecule complex is transported by a lipid bilayer membrane.
As shown in FIG. 10, the nanoparticle-biorelevant molecule complex 70 of FIG. 4 that is a functional simple substance is formed by specific binding between biotin 74 at the end of biotinylated PEG 71 and streptavidin 110 that is a protein. Streptavidin 110 is labeled. Then, the labeled streptavidin 110 is introduced into the lipid bilayer membrane S2, so that the nanoparticle-biorelevant molecular complex 70 and the streptavidin 110 are bound to each other, and the lipid bilayer membrane S2 is spontaneously bound. Along with the development, it is transported in the direction of arrow F. In such a form, streptavidin 110 may be labeled with the nanoparticle-biorelevant molecular complex 70 and then added to the mixture, or streptavidin 110 and nanoparticle-biorelevant molecular complex 70 may be added to the mixture, respectively. It may be added. Alternatively, the nanoparticle-biorelevant molecule complex 70 may be added to the streptavidin 110 transported along with the spontaneous development of the lipid bilayer membrane S2 for labeling.
あるいは、図１１に示すように、機能性単体型である図５のナノ粒子−生体関連分子複合体８０は、タンパク質結合型ＰＥＧ８１の末端の結合部８４とタンパク質１２０との特異的な結合により、タンパク質１２０を標識化している。そして、標識化されたタンパク質１２０が脂質二分子膜Ｓ２に導入されることで、ナノ粒子−生体関連分子複合体８０とタンパク質１２０とは、結合した状態で、脂質二分子膜Ｓ２の自発展開に伴い、矢印Ｆの方向に輸送される。かかる形態においては、タンパク質１２０をナノ粒子−生体関連分子複合体８０で標識化した後に混合物へ添加してもよいし、タンパク質１２０とナノ粒子−生体関連分子複合体８０とをそれぞれ混合物に添加してもよい。あるいは、脂質二分子膜Ｓ２の自発展開に伴って輸送されるタンパク質１２０に対し、ナノ粒子−生体関連分子複合体８０を添加して標識化してもよい。 Alternatively, as shown in FIG. 11, the nanoparticle-biorelevant molecule complex 80 of FIG. 5 that is a functional simple substance is formed by specific binding between the binding portion 84 at the end of the protein-binding PEG 81 and the protein 120. Protein 120 is labeled. Then, by introducing the labeled protein 120 into the lipid bilayer membrane S2, the nanoparticle-biologically related molecule complex 80 and the protein 120 are bound to each other to spontaneously expand the lipid bilayer membrane S2. Accordingly, it is transported in the direction of arrow F. In such a form, the protein 120 may be labeled with the nanoparticle-biorelevant molecule complex 80 and then added to the mixture, or the protein 120 and the nanoparticle-biorelevant molecule complex 80 may be added to the mixture, respectively. May be. Alternatively, the protein 120 transported along with the spontaneous development of the lipid bilayer membrane S2 may be labeled by adding the nanoparticle-biorelevant molecule complex 80.
また、例えば、機能性ベシクル型のナノ粒子−生体関連分子複合体で標識化されたタンパク質が脂質二分子膜で輸送される例を図１２〜１３を用いて説明する。
図１２に示すように、機能性単体型である図６のナノ粒子−生体関連分子複合体９０は、ビオチン−ＰＥＧ化リン脂質９１の末端のビオチン７４と、タンパク質であるストレプトアビジン１１０との特異的な結合により、ストレプトアビジン１１０を標識化している。そして、標識化されたストレプトアビジン１１０が脂質二分子膜Ｓ２に導入されることで、ナノ粒子−生体関連分子複合体９０とストレプトアビジン１１０とは、結合した状態で、脂質二分子膜Ｓ２の自発展開に伴い、矢印Ｆの方向に輸送される。かかる形態においては、ストレプトアビジン１１０をナノ粒子−生体関連分子複合体９０で標識化した後に混合物へ添加してもよいし、ストレプトアビジン１１０とナノ粒子−生体関連分子複合体９０とをそれぞれ混合物に添加してもよい。あるいは、脂質二分子膜Ｓ２の自発展開に伴って輸送されるストレプトアビジン１１０に対し、ナノ粒子−生体関連分子複合体９０を添加して標識化してもよい。
Further, for example, an example in which a protein labeled with a functional vesicle-type nanoparticle-biorelevant molecule complex is transported through a lipid bilayer will be described with reference to FIGS.
As shown in FIG. 12, the nanoparticle-biorelevant molecule complex 90 of FIG. 6 which is a functional simple substance is specific to biotin 74 at the end of biotin-PEGylated phospholipid 91 and streptavidin 110 which is a protein. Streptavidin 110 is labeled by conjugation. Then, the labeled streptavidin 110 is introduced into the lipid bilayer membrane S2, so that the nanoparticle-biorelevant molecule complex 90 and the streptavidin 110 are bound to each other and spontaneously generated in the lipid bilayer membrane S2. Along with the development, it is transported in the direction of arrow F. In such a form, streptavidin 110 may be labeled with nanoparticle-biorelevant molecule complex 90 and then added to the mixture, or streptavidin 110 and nanoparticle-biorelevant molecule complex 90 may be added to the mixture, respectively. It may be added. Alternatively, the nanoparticle-biorelevant molecule complex 90 may be added to the streptavidin 110 transported along with the spontaneous development of the lipid bilayer membrane S2 for labeling.
あるいは、図１３に示すように、機能性ベシクル型である図７のナノ粒子−生体関連分子複合体１００は、タンパク質結合型ＰＥＧ化リン脂質１０１の末端の結合部８４とタンパク質１２０との特異的な結合により、タンパク質１２０を標識化している。そして、標識化されたタンパク質１２０が脂質二分子膜Ｓ２に導入されることで、ナノ粒子−生体関連分子複合体１００とタンパク質１２０とは、結合した状態で、脂質二分子膜Ｓ２の自発展開に伴い、矢印Ｆの方向に輸送される。かかる形態においては、タンパク質１２０をナノ粒子−生体関連分子複合体１００で標識化した後に混合物へ添加してもよいし、タンパク質１２０とナノ粒子−生体関連分子複合体１００とをそれぞれ混合物に添加してもよい。あるいは、脂質二分子膜Ｓ２の自発展開に伴って輸送されるタンパク質１２０に対し、ナノ粒子−生体関連分子複合体１００を添加して標識化してもよい。 Alternatively, as shown in FIG. 13, the nanoparticle-biorelevant molecule complex 100 of FIG. 7 that is a functional vesicle type is specific to the protein 120 and the binding portion 84 at the end of the protein-bound PEGylated phospholipid 101. Protein 120 is labeled by simple binding. Then, the labeled protein 120 is introduced into the lipid bilayer membrane S2, so that the nanoparticle-biologically related molecule complex 100 and the protein 120 are bonded to each other to spontaneously expand the lipid bilayer membrane S2. Accordingly, it is transported in the direction of arrow F. In such a form, the protein 120 may be labeled with the nanoparticle-biorelevant molecule complex 100 and then added to the mixture, or the protein 120 and the nanoparticle-biorelevant molecule complex 100 may be added to the mixture, respectively. May be. Alternatively, the nanoparticle-biorelevant molecule complex 100 may be added and labeled to the protein 120 that is transported with the spontaneous development of the lipid bilayer membrane S2.
また、例えば、複数の流路上にそれぞれ異なるタンパク質を配置し、機能性ベシクル型のナノ粒子−生体関連分子複合体で標識化されたタンパク質が脂質二分子膜で輸送される例を図１４〜１５に示す。
図１４においては、混合物が、ナノ粒子−生体関連分子複合体９０でストレプトアビジン１１０を標識化したものを含む例を示す。図１４に示すように、案内部１９は２つの流路１６を備え、一方の流路１６にはタンパク質１３０が配置され、他方の流路１６にはタンパク質１３２が配置されている。脂質二分子膜Ｓ２の自発展開に伴い、ナノ粒子−生体関連分子複合体９０で標識化されたストレプトアビジン１１０が矢印Ｆの方向に輸送されて、タンパク質１３０又はタンパク質１３２が配置された位置に到達する。この時、流路１６に塩化ナトリウムや塩化カルシウム等の塩類を含む水溶液を添加すると、ベシクル９２が崩壊し、亀裂１９０が形成され、この亀裂１９０から内包されていた化学物質９８が放出される。化学物質９８が放出されると、タンパク質１３０又は１３２はその種類に応じた生体反応を示す。この生体反応の有無を観察することで、化学物質９８又はタンパク質１３０もしくは１３２の生理活性機能を分析できる。この例では、タンパク質１３０は生体反応を示し、タンパク質１３２は生体反応を示していない。
Further, for example, different proteins are arranged on a plurality of channels, and proteins labeled with functional vesicle-type nanoparticles-biorelevant molecule complexes are transported by lipid bilayers as shown in FIGS. Shown in
FIG. 14 shows an example in which the mixture includes a product in which streptavidin 110 is labeled with a nanoparticle-biorelevant molecule complex 90. As shown in FIG. 14, the guide unit 19 includes two flow paths 16, a protein 130 is disposed in one flow path 16, and a protein 132 is disposed in the other flow path 16. Along with the spontaneous development of the lipid bilayer membrane S2, the streptavidin 110 labeled with the nanoparticle-biorelevant molecule complex 90 is transported in the direction of arrow F and reaches the position where the protein 130 or protein 132 is disposed. To do. At this time, when an aqueous solution containing a salt such as sodium chloride or calcium chloride is added to the flow path 16, the vesicle 92 is collapsed to form a crack 190, and the chemical substance 98 contained therein is released. When the chemical substance 98 is released, the protein 130 or 132 exhibits a biological reaction according to its type. By observing the presence or absence of this biological reaction, the physiologically active function of the chemical substance 98 or the protein 130 or 132 can be analyzed. In this example, protein 130 exhibits a biological reaction and protein 132 does not exhibit a biological reaction.
図１５においては、混合物が、ナノ粒子−生体関連分子複合体１００でタンパク質１２０を標識化したものを含む例を示す。図１５に示すように、案内部１９は２つの流路１６を備え、一方の流路１６にはタンパク質１４０が配置され、他方の流路１６にはタンパク質１４２が配置されている。脂質二分子膜Ｓ２の自発展開に伴い、ナノ粒子−生体関連分子複合体１００で標識化されたタンパク質１２０が矢印Ｆの方向に輸送されて、タンパク質１４０又はタンパク質１４２が配置された位置に到達する。この時、流路１６に上記のような塩類を含む水溶液を添加すると、ベシクル９２が崩壊し、亀裂１９０が形成され、この亀裂１９０から内包されていた化学物質９８が放出される。化学物質９８が放出されると、タンパク質１４０又は１４２は、その種類に応じて、輸送されてきたタンパク質１２０との間で生体分子間相互作用を示す。この生体反応の有無を観察することで、化学物質９８に対するタンパク質１４０又は１４２の生体反応を分析できる。この例では、タンパク質１４０はタンパク質１２０との間に生体分子間相互作用を示し、タンパク質１４２はタンパク質１４２との間に生体分子間相互作用を示していない。 FIG. 15 shows an example in which the mixture includes the protein 120 labeled with the nanoparticle-biorelevant molecule complex 100. As shown in FIG. 15, the guide unit 19 includes two flow paths 16, a protein 140 is disposed in one flow path 16, and a protein 142 is disposed in the other flow path 16. Along with the spontaneous development of the lipid bilayer membrane S2, the protein 120 labeled with the nanoparticle-biorelevant molecule complex 100 is transported in the direction of arrow F and reaches the position where the protein 140 or protein 142 is disposed. . At this time, when an aqueous solution containing salts as described above is added to the flow path 16, the vesicle 92 is collapsed, a crack 190 is formed, and the contained chemical substance 98 is released from the crack 190. When the chemical substance 98 is released, the protein 140 or 142 exhibits a biomolecular interaction with the transported protein 120 depending on the type. By observing the presence or absence of this biological reaction, the biological reaction of the protein 140 or 142 with respect to the chemical substance 98 can be analyzed. In this example, the protein 140 exhibits a biomolecular interaction with the protein 120, and the protein 142 does not exhibit a biomolecular interaction with the protein 142.
上述の通り、本発明の生体分子分析用キットは、輸送基板の輸送媒体に脂質二分子膜を使用するため、輸送するナノ粒子−生体関連分子複合体、ならびにタンパク質を標識化したナノ粒子−生体関連分子複合体の流動性が高く、安定である。そのため生体分子の生理機能の失活を抑制できる。 As described above, since the biomolecule analysis kit of the present invention uses a lipid bilayer membrane as a transport medium of a transport substrate, the transported nanoparticle-biorelevant molecular complex, and the protein-labeled nanoparticle-biological body The related molecular complex is highly fluid and stable. Therefore, the deactivation of the physiological function of a biomolecule can be suppressed.
本発明の生体分子分析用キットは、指標物質であるナノ粒子−生体関連分子複合体が表面に生体関連分子を備えるナノ粒子を含有するため、高い生体適合性を有すると共に、量子ドット又は金属ナノ粒子特有の優れた光学特性が発揮される。このため、輸送された生体分子の位置情報を把握することができる。
加えて、本発明の生体分子分析用キットは、輸送基板に親水部と疎水部とからなる流路パターンの形成により脂質二分子膜の自発展開を制御し（特開２００７−２４８２９０号公報）、生体分子を輸送基板上の所望の位置に輸送できる。
The kit for biomolecule analysis of the present invention has high biocompatibility because the nanoparticle-biorelevant molecule complex that is an indicator substance contains a nanoparticle having a biorelevant molecule on its surface. Excellent optical properties unique to the particles are exhibited. For this reason, position information of the transported biomolecule can be grasped.
In addition, the biomolecule analysis kit of the present invention controls the spontaneous development of the lipid bilayer membrane by forming a flow path pattern comprising a hydrophilic portion and a hydrophobic portion on the transport substrate (Japanese Patent Laid-Open No. 2007-248290), The biomolecule can be transported to a desired position on the transport substrate.
本発明の生体分子分析用キットは、ナノ粒子を量子ドット又は金属ナノ粒子とすることで、より高い光学特性を発揮できる。
加えて、生体関連分子をリン脂質又はポリエーテル化リン脂質とすることで、ナノ粒子−生体関連分子複合体の脂質二分子膜への導入をより容易にできる。
The biomolecule analysis kit of the present invention can exhibit higher optical properties by using nanoparticles as quantum dots or metal nanoparticles.
In addition, introduction of the nanoparticle-biorelevant molecule complex into the lipid bilayer can be facilitated by making the biorelevant molecule a phospholipid or a polyether phospholipid.
本発明の生体分子分析用キットは、生体関連分子をビオチン化ポリエーテル、マレイミド化ポリエーテル及びスクシンイミド化ポリエーテルとすることで、ナノ粒子−生体関連分子複合体のタンパク質への指標化を図れる。 The biomolecule analysis kit of the present invention can be used to index the nanoparticle-biorelevant molecule complex to a protein by using biotinylated polyether, maleimidized polyether, and succinimide polyether as biorelated molecules.
従来、生理活性を検査するバイオチップ等では、添加する化学物質の大部分が溶液中に拡散し、生体分子に対する化学物質の作用が低効率となる問題があった。本発明の化学物質内包型のナノ粒子−生体関連分子複合体は、１ｍｍｏｌ／Ｌ〜１００ｍｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム等の水溶液等を添加することにより、容易にベシクルが破壊されるものである。このナノ粒子−生体関連分子複合体によれば、塩類を含む水溶液を添加することで、内包する化学物質を生体分子に対して近距離で放出し、化学物質を高効率で作用させることができる。また、ベシクルがナノ粒子で標識されているため、生体組織内でターゲットとする生体分子の位置情報を容易に把握することができる。
加えて、ナノ粒子−生体関連分子複合体を機能性ベシクル型とすることで、タンパク質への標識化を図れる。
さらに、機能性単体型又は機能性ベシクル型のナノ粒子−生体関連分子複合体がタンパク質を指標化することで、各種生体分子間相互作用を分析できる。
Conventionally, biochips and the like for testing physiological activity have a problem that most of chemical substances to be added diffuse into the solution, and the action of the chemical substances on biomolecules becomes low efficiency. In the chemical substance-encapsulated nanoparticle-biorelevant molecular complex of the present invention, vesicles are easily destroyed by adding 1 mmol / L to 100 mmol / L of an aqueous solution of sodium chloride, calcium chloride, magnesium chloride or the like. Is. According to this nanoparticle-biorelevant molecule complex, by adding an aqueous solution containing salts, it is possible to release the encapsulated chemical substance at a short distance from the biomolecule and to make the chemical substance act with high efficiency. . Further, since the vesicle is labeled with the nanoparticles, the position information of the target biomolecule in the living tissue can be easily grasped.
In addition, protein can be labeled by making the nanoparticle-biorelevant molecule complex into a functional vesicle type.
Furthermore, the interaction between various biomolecules can be analyzed by using a functional simple substance type or functional vesicle type nanoparticle-biorelevant molecule complex as a protein index.
（第二の実施形態）
本発明の第二の実施形態にかかる生体分子分析用キットについて、以下に図面を参照して説明する。
本実施形態の生体分子分析用キットは、分析装置をバイオリアクターチップとしたものであり、このバイオリアクターチップは、親水部及び疎水部からなる流路パターンを有する輸送基板を利用した、流路型の素子構造を有するものである。
(Second embodiment)
A biomolecule analysis kit according to a second embodiment of the present invention will be described below with reference to the drawings.
The biomolecule analysis kit of the present embodiment uses a bioreactor chip as an analysis device, and this bioreactor chip uses a transport substrate having a flow path pattern composed of a hydrophilic part and a hydrophobic part. The device structure is as follows.
＜バイオリアクターチップ＞
図１６に示すように、バイオリアクターチップ２００は、基板本体２０２上に、第一の輸送部２１０と、第二の輸送部２２０と、第三の輸送部２３０とが形成されたものである。基板本体２０２の材質は、第一の実施形態における基板本体１０と同様である。
第一の輸送部２１０は、試料配置部２１１と、反応用試薬配置部２１２と、検出部２１３と、検出用試薬配置部２１４と、試料配置部２１１と検出部２１３とを連絡する流路２１６と、検出部２１３と検出用試薬配置部２１４とを連絡する流路２１８と、流路２１６と反応用試薬配置部２１２とを連絡する流路２１７とで構成されている。基板本体２０２の第一の輸送部２１０の位置には、流路２１６上、かつ流路２１６と検出部２１３との連結部近傍にナノギャップ電極２１９が設けられている。ナノギャップ電極２１９が設けられていることで、ナノギャップ電極２１９に電圧を印加して、ナノ粒子−生体関連分子複合体及びナノ粒子−生体関連分子複合体に標識化された生体分子の輸送特性（速さ、出発・停止の輸送スイッチング）を制御できる。即ち、ナノギャップ電極２１９を備えることにより、第一の輸送部２１０における分子輸送のゲーティング機能をバイオリアクターチップ２００に付与できる。
<Bioreactor chip>
As shown in FIG. 16, the bioreactor chip 200 is obtained by forming a first transport unit 210, a second transport unit 220, and a third transport unit 230 on a substrate body 202. The material of the substrate body 202 is the same as that of the substrate body 10 in the first embodiment.
The first transport unit 210 includes a channel 216 that communicates the sample placement unit 211, the reaction reagent placement unit 212, the detection unit 213, the detection reagent placement unit 214, and the sample placement unit 211 and the detection unit 213. And a flow channel 218 that communicates the detection unit 213 and the detection reagent arrangement unit 214, and a flow channel 217 that communicates the flow channel 216 and the reaction reagent arrangement unit 212. A nanogap electrode 219 is provided on the flow path 216 and in the vicinity of the connecting portion between the flow path 216 and the detection section 213 at the position of the first transport section 210 of the substrate body 202. Since the nanogap electrode 219 is provided, a voltage is applied to the nanogap electrode 219 to transport the biomolecules labeled with the nanoparticle-biorelevant molecule complex and the nanoparticle-biorelevant molecule complex. (Speed, start / stop transport switching) can be controlled. That is, by providing the nanogap electrode 219, the bioreactor chip 200 can be provided with a gating function for molecular transport in the first transport unit 210.
第一の輸送部２１０は、親水部であり、第一の輸送部２１０が形成されていない部分、即ち基板本体２０２の表面は疎水部とされている。
流路２１６、２１７、２１８の幅は、特に限定されないが、１〜１００μｍが好ましい。
The first transport portion 210 is a hydrophilic portion, and the portion where the first transport portion 210 is not formed, that is, the surface of the substrate body 202 is a hydrophobic portion.
Although the width | variety of the flow paths 216, 217, 218 is not specifically limited, 1-100 micrometers is preferable.
ナノギャップ電極２１９は、特許３７３７９９５号公報、Ｙ．Ｋａｓｈｉｍｕｒａら、「シィン・ソリッド・フィルムズ（Ｔｈｉｎ Ｓｏｌｉｄ Ｆｉｌｍｓ）」、第４３８−４３９巻、２００３年、第３１７−３２１頁に記載の公知の方法により製造できる。 The nanogap electrode 219 is disclosed in Japanese Patent No. 3737995, Y.C. Kashimura et al., “Thin Solid Films”, 438-439, 2003, pp. 317-321.
第二の輸送部２２０は、試料配置部２２１と、反応用試薬配置部２２２と、検出部２２３と、検出用試薬配置部２２４と、試料配置部２２１と検出部２２３とを連絡する流路２２６と、検出部２２３と検出用試薬配置部２２４とを連絡する流路２２８と、流路２２６と反応用試薬配置部２２２とを連絡する流路２２７とで構成されている。第二の輸送部２２０には、流路２２６上、かつ流路２２６と検出部２２３との連結部近傍にナノギャップ電極２２９が設けられている。 The second transport unit 220 includes a sample placement unit 221, a reaction reagent placement unit 222, a detection unit 223, a detection reagent placement unit 224, and a flow path 226 that communicates the sample placement unit 221 and the detection unit 223. And a flow channel 228 that communicates the detection unit 223 and the detection reagent arrangement unit 224, and a flow channel 227 that communicates the flow channel 226 and the reaction reagent arrangement unit 222. In the second transport unit 220, a nanogap electrode 229 is provided on the flow channel 226 and in the vicinity of the connection portion between the flow channel 226 and the detection unit 223.
第二の輸送部２２０は、親水部であり、第一の輸送部２１０と同様である。
ナノギャップ電極２２９は、ナノギャップ２１９と同様である。
The second transport part 220 is a hydrophilic part and is the same as the first transport part 210.
The nanogap electrode 229 is the same as the nanogap 219.
第三の輸送部２３０は、試料配置部２３１と、反応用試薬配置部２３２と、検出部２３３と、検出用試薬配置部２３４と、試料配置部２３１と検出部２３３とを連絡する流路２３６と、検出部２３３と検出用試薬配置部２３４とを連絡する流路２３８と、流路２３６と反応用試薬配置部２３２とを連絡する流路２３７とで構成されている。第三の輸送部２３０には、流路２３６上、かつ流路２３６と検出部２３３との連結部近傍にナノギャップ電極２３９が設けられている。 The third transport unit 230 includes a channel 236 that communicates the sample placement unit 231, the reaction reagent placement unit 232, the detection unit 233, the detection reagent placement unit 234, and the sample placement unit 231 and the detection unit 233. And a flow channel 238 that communicates the detection unit 233 and the detection reagent arrangement unit 234, and a flow channel 237 that communicates the flow channel 236 and the reaction reagent arrangement unit 232. In the third transport unit 230, a nanogap electrode 239 is provided on the flow channel 236 and in the vicinity of the connection portion between the flow channel 236 and the detection unit 233.
第三の輸送部２３０は、親水部であり、第一の輸送部２１０と同様である。
ナノギャップ電極２３９は、ナノギャップ２１９と同様である。
The third transport part 230 is a hydrophilic part and is the same as the first transport part 210.
The nanogap electrode 239 is similar to the nanogap 219.
＜ナノ粒子−生体関連分子複合体＞
本実施形態に用いられるナノ粒子−生体関連分子複合体は、第一の実施形態に用いられるナノ粒子−生体関連分子複合体と同じである。
<Nanoparticles-biologically related molecular complex>
The nanoparticle-biorelevant molecule complex used in the present embodiment is the same as the nanoparticle-biorelevant molecule complex used in the first embodiment.
＜分析方法＞
次に、バイオリアクターチップ２００を用いた生体分子の分析方法について、ナノ粒子−生体関連分子複合体として化学物質内包型を用いた場合を例にして説明する。
<Analysis method>
Next, a method for analyzing biomolecules using the bioreactor chip 200 will be described taking as an example a case where a chemical substance-encapsulating type is used as the nanoparticle-biorelevant molecule complex.
検出部２１３、２２３、２３３に、それぞれ異なる種類及び／又は濃度の標的生体分子を配置する。
試料配置部２１１、２２１、２３１に脂質二分子膜を形成し、それぞれの脂質二分子膜上に、ナノ粒子−生体関連分子複合体で標識化した異なる種類及び／又は濃度の検体試料を配置する。
第一の輸送部２１０において、各試料は、脂質二分子膜の自発展開により輸送され、試料配置部２１１から流路２１６に流入する。この際、反応用試薬配置部２１２にナノ粒子−生体関連分子複合体を配置し、流路２１６を輸送途中の検体試料に対して、ナノ粒子−生体関連分子複合体を標識化してもよい。反応用試薬配置部２１２には、任意の反応用試薬を配してもよい。これらの検体試料は輸送されて、標的生体分子が配置される検出部２１３に流入する。
Different types and / or concentrations of target biomolecules are arranged in the detection units 213, 223, and 233, respectively.
Lipid bilayers are formed in the sample arrangement sections 211, 221, and 231, and different types and / or concentrations of sample samples labeled with the nanoparticle-biorelevant molecule complex are arranged on the respective lipid bilayers. .
In the first transport unit 210, each sample is transported by the spontaneous development of the lipid bilayer membrane, and flows into the channel 216 from the sample placement unit 211. At this time, the nanoparticle-biorelevant molecule complex may be disposed in the reagent arrangement part 212 for reaction, and the nanoparticle-biorelevant molecule complex may be labeled on the sample sample being transported through the channel 216. Any reaction reagent may be arranged in the reaction reagent arrangement unit 212. These specimen samples are transported and flow into the detection unit 213 where the target biomolecule is arranged.
検出部２１３では、例えば、試料中にナノ粒子−生体関連分子複合体に標識化された生体分子と相互作用する標的分子がある場合、該標的分子が検出部２１３において、該生体分子と相互作用する。さらに、検出用試薬配置部２１４から流路２１８を経由して導入した塩類を含む水溶液等の試薬により、ナノ粒子−生体関連分子複合体のベシクルに内包された化学物質が放出される。オプティカルプローブ２５０により、検出部２１３の分光測定を行うことで、生体分子と標的分子とが特異的に結合し、さらに、化学物質の作用により生体反応を起こした検出部２１３においてのみ、分光信号の変化が観測される。
こうして、試料中に含まれる標的分子を、分子選択的に、同定、定量、生体反応診断を行える。
In the detection unit 213, for example, when there is a target molecule that interacts with a biomolecule labeled in the nanoparticle-biorelevant molecule complex in the sample, the target molecule interacts with the biomolecule in the detection unit 213. To do. Furthermore, the chemical substance contained in the vesicle of the nanoparticle-biorelevant molecule complex is released by a reagent such as an aqueous solution containing salts introduced from the detection reagent arrangement unit 214 via the flow path 218. By performing spectroscopic measurement of the detection unit 213 with the optical probe 250, the biomolecule and the target molecule are specifically bound to each other, and furthermore, only in the detection unit 213 that has caused a biological reaction due to the action of a chemical substance, Changes are observed.
In this way, target molecules contained in the sample can be identified, quantified, and biological reaction diagnosed in a molecular selective manner.
第二の輸送部２２０、第三の輸送部２３０においても、第一の輸送部２１０と同様にして、試料中に含まれる標的分子を分子選択的に、同定、定量、生体反応診断できる。 Similarly to the first transport unit 210, the second transport unit 220 and the third transport unit 230 can identify, quantify, and diagnose a biological reaction of target molecules contained in a sample in a molecular selective manner.
上述の通り、バイオリアクターチップを用いた本発明の生体分子分析用キットによれば、各生体分子は脂質二分子膜の環境下に存在するため、生体分子の流動性及び安定性が高く、生理機能が長時間にわたり保持される。加えて、標的生体分子が配置された検出部に短時間、かつ高収率でナノ粒子−生体関連分子複合体及びナノ粒子−生体関連分子複合体に標識化された生体分子を輸送することができる。さらに、ナノ粒子−生体関連分子複合体に内包される化学物質を、高効率で標的分子に作用させることが可能となる。 As described above, according to the biomolecule analysis kit of the present invention using a bioreactor chip, each biomolecule exists in the environment of a lipid bilayer membrane, so that the fluidity and stability of the biomolecule are high, and the physiological Function is retained for a long time. In addition, the biomolecules labeled on the nanoparticle-biorelevant molecule complex and the nanoparticle-biorelevant molecule complex can be transported to the detection unit where the target biomolecule is disposed in a short time and in a high yield. it can. Furthermore, it becomes possible to make the chemical substance included in the nanoparticle-biorelevant molecule complex act on the target molecule with high efficiency.
バイオリアクターチップを用いた本発明の生体分子分析用キットによれば、ナノギャップ電極配置によるゲーティング機能の付与により、ナノ粒子−生体関連分子複合体及びナノ粒子−生体関連分子複合体に標識化された生体分子の輸送特性の制御が可能となる。加えて、量子ドット等の光安定性が高いナノ粒子を用いるため、生体分子輸送や生体分子間反応の長時間の観測が可能となる。さらに、バイオリアクターチップ上の反応点を高密度に集積させることが可能なため、バイオリアクターチップのスループットの向上、高感度化、小型化、生体分子の輸送に伴う逐次的な生体分子反応計測等の付加価値が得られる。 According to the biomolecule analysis kit of the present invention using a bioreactor chip, the nanoparticle-biorelevant molecular complex and the nanoparticle-biorelevant molecular complex are labeled by providing a gating function by arranging the nanogap electrode. Control of the transport properties of the biomolecules made is possible. In addition, since nanoparticles with high photostability such as quantum dots are used, it is possible to observe biomolecule transport and reactions between biomolecules for a long time. In addition, since the reaction points on the bioreactor chip can be integrated at high density, the throughput of the bioreactor chip is improved, the sensitivity is increased, the size is reduced, and the sequential biomolecule reaction measurement associated with the transport of biomolecules, etc. Value added.
（その他の実施形態）
本発明の生体分子分析用キットは、上述の実施形態に限定されない。第一の実施形態では、案内部１９が流路１６及び疎水部１２からなる縞状の流路パターンとされているが、流路パターンはこれに限定されず、例えば、流路が渦巻き状のものとされていてもよい。
(Other embodiments)
The biomolecule analysis kit of the present invention is not limited to the above-described embodiment. In the first embodiment, the guide portion 19 is a striped flow path pattern including the flow path 16 and the hydrophobic section 12, but the flow path pattern is not limited to this, and for example, the flow path is a spiral shape. It may be assumed.
第二の実施形態では、基板本体２０２に３つの輸送部が形成されているが、本発明はこれに限定されず、輸送部の数は２つ以下であってもよいし、４つ以上であってもよい。 In the second embodiment, three transport portions are formed in the substrate body 202, but the present invention is not limited to this, and the number of transport portions may be two or less, or four or more. There may be.
本発明について実施例を挙げて具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。 The present invention will be specifically described with reference to examples, but the present invention is not limited to the examples.
（合成例１）
カルボキシル基修飾量子ドット５２５（量子ドット５２５（発光波長５２５ｎｍ）、Ｑｄｏｔ▲Ｒ▼ＩＴＫＴＭ Ｃａｒｂｏｘｙｌ Ｑｕａｎｔｕｍ Ｄｏｔｓ，Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）８μｍｏｌを含む水溶液、ならびにＤＯＰＥを２．５ｍｇ／ｍＬ含むクロロホルム分散液、ならびに１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を２０ｍｇ／ｍＬ含む水溶液、ならびにホウ酸バッファー溶液（１０ｍｍｏｌ Ｈ３ＢＯ３、ｐＨ７．４）をそれぞれ調製した。反応容器のガラス瓶内に、クロロホルム１．１ｍＬを加え、続いてＤＯＰＥクロロホルム分散液２８６μＬ（９６０ｎｍｏｌ）を添加した。撹拌子で緩やかに撹拌しながら、ホウ酸バッファー溶液７００μＬ、量子ドット５２５水溶液１００μＬ（０．８ｎｍｏｌ）、ＥＤＣ水溶液２７６μＬ（２８．８μｍｏｌ）を添加し、反応溶液を均一系にするためにメタノール２．５ｍＬを滴下した。この反応溶液を室温で終夜撹拌すると、ガラス容器壁面に沈着する黄色の生成物を得た。反応溶液を完全に除去した後、クロロホルムを添加すると、生成物はクロロホルムに均一に分散した。このクロロホルム分散液に純水を加え、遠心分離（１０，０００回転／分、１０分、１０℃）、上澄み水相除去の操作を繰り返し行い、生成物が溶解するクロロホルム相のみを抽出することで、未反応の量子ドット５２５及び過剰なＥＤＣを除去した。その後、クロロホルムを完全に除去し、図２のナノ粒子−生体関連分子複合体５０に相当するナノ粒子−生体関連分子複合体Ａを得た。ナノ粒子−生体関連分子複合体Ａは、ナノ粒子の表面が、リン脂質分子で化学修飾されているため、クロロホルムに再分散可能であった。
(Synthesis Example 1)
Carboxyl group-modified quantum dot 525 (quantum dot 525 (emission wavelength 525 nm), Qdot <R> ITK ™ Carboxyl Quantum Dots, Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, USA) containing 8 μmol of water, and 2.5 mg / mL of DOPE A chloroform dispersion, an aqueous solution containing 20 mg / mL of 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC), and a boric acid buffer solution (10 mmol H 3 BO 3 , pH 7.4) were prepared, respectively. did. Into a glass bottle of the reaction vessel, 1.1 mL of chloroform was added, followed by 286 μL (960 nmol) of DOPE chloroform dispersion. While gently stirring with a stir bar, 700 μL of borate buffer solution, 100 μL (0.8 nmol) of quantum dot 525 aqueous solution, and 276 μL (28.8 μmol) of EDC aqueous solution were added, and methanol was added in order to make the reaction solution homogeneous. 5 mL was added dropwise. When this reaction solution was stirred at room temperature overnight, a yellow product deposited on the wall surface of the glass container was obtained. When the reaction solution was completely removed and chloroform was added, the product was uniformly dispersed in chloroform. By adding pure water to this chloroform dispersion, repeating centrifugation (10,000 rpm / min, 10 min, 10 ° C.) and removing the supernatant aqueous phase, only the chloroform phase in which the product is dissolved is extracted. Unreacted quantum dots 525 and excess EDC were removed. Thereafter, chloroform was completely removed to obtain a nanoparticle-biorelevant molecule complex A corresponding to the nanoparticle-biorelevant molecule complex 50 of FIG. The nanoparticle-biorelevant molecule complex A was redispersible in chloroform because the surface of the nanoparticle was chemically modified with phospholipid molecules.
（合成例２）
卵黄由来フォスファチジルコリン（Ｌ−α−ＰＣ）０．２ｍｇ、実施例１で得られたナノ粒子−生体関連分子複合体Ａ１０．５μｇ（５質量％）、及びＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−Ｂｉｏｔｉｎ０．６μｇ（０．３質量％）を含む複合体−クロロホルム分散液２００μＬを調製した。続いて、ＩＴＯ基板（ＳｉＯ２上に膜厚１００ｎｍのＩＴＯが薄膜化された基板、サイズ４０×４０ｎｍ、５０〜１００Ω・ｃｍ）上に、Ｌ−α−ＰＣと複合体−クロロホルム分散液を均一に塗布した。この基板を、室温で２時間、減圧乾燥して、クロロホルム分散液を完全に除去することで、均一なリン脂質薄膜をＩＴＯ基板上に形成した。このリン脂質薄膜上に、窓部を有するシリコーンゴム（外寸３０×３０ｍｍ、厚さ１ｍｍのシリコーンゴムを２０×２０ｍｍのサイズでくり貫いた窓部を有する）を密着して配置し、窓部に２００ｍｍｏｌのスクロース水溶液４００μＬを滴下した。さらに、その上部にＩＴＯ基板を配置し、シリコーンゴム窓部にある溶液をＩＴＯ基板で挟み込んで密閉した。続いて、ＩＴＯ基板にクリップ電極を接合し、６０℃のホットプレート上で、交流電場（正弦波、１Ｖ、１０Ｈｚ）を２時間印加することで、電解形成法により、図６のナノ粒子−生体関連分子複合体９０に相当するナノ粒子−生体関連分子複合体がスクロース水溶液に分散したベシクル−スクロース分散液を得た。このベシクルの内孔には、化学物質としてスクロース水溶液を含む。
(Synthesis Example 2)
Egg yolk-derived phosphatidylcholine (L-α-PC) 0.2 mg, nanoparticle-biorelevant molecule complex A 10.5 μg (5 mass%) obtained in Example 1, and DSPE-PEG2000-Biotin 0.6 μg ( 200 μL of a complex-chloroform dispersion containing 0.3% by mass) was prepared. Subsequently, L-α-PC and the complex-chloroform dispersion are uniformly applied on the ITO substrate (substrate obtained by thinning ITO with a thickness of 100 nm on SiO 2 , size 40 × 40 nm, 50 to 100 Ω · cm). It was applied to. The substrate was dried under reduced pressure at room temperature for 2 hours to completely remove the chloroform dispersion, thereby forming a uniform phospholipid thin film on the ITO substrate. On this phospholipid thin film, a silicone rubber having a window portion (having a window portion in which a silicone rubber having an outer dimension of 30 × 30 mm and a thickness of 1 mm is cut through in a size of 20 × 20 mm) is disposed in close contact with the window portion. To the flask, 400 μL of 200 mmol aqueous sucrose solution was added dropwise. Further, an ITO substrate was placed on the top, and the solution in the silicone rubber window was sandwiched between the ITO substrates and sealed. Subsequently, a clip electrode is joined to the ITO substrate, and an alternating electric field (sine wave, 1 V, 10 Hz) is applied on a hot plate at 60 ° C. for 2 hours, whereby the nanoparticle-biological body of FIG. A vesicle-sucrose dispersion in which the nanoparticle-biorelevant molecule complex corresponding to the related molecule complex 90 was dispersed in an aqueous sucrose solution was obtained. The inner hole of this vesicle contains a sucrose aqueous solution as a chemical substance.
＜共焦点レーザー蛍光顕微鏡測定＞
シリコーンコートされた撥水性のスライドガラス表面に、２００ｍｍｏｌのグルコース溶液を３００μＬ滴下し、液滴を形成させた。その液滴中に、合成例２で得られたベシクル−スクロース分散液１０μＬを添加した。ベシクル内部にあるスクロース水溶液と、ベシクル外液のグルコース溶液の比重の差を利用し、ベシクルをスライドガラス表面近傍に沈降させるため、５分間静置した。その後、この試料を共焦点レーザー蛍光顕微鏡（励起：４８８ｎｍアルゴンレーザー、観測：５０５〜５２５ｎｍ領域観測用の蛍光フィルター、４０倍対物レンズ）を用いて観察した。その結果を図１７に示す。
<Confocal laser fluorescence microscope measurement>
300 μL of a 200 mmol glucose solution was dropped on the surface of a silicone-coated water-repellent glass slide to form droplets. 10 μL of the vesicle-sucrose dispersion obtained in Synthesis Example 2 was added to the droplet. Using the difference in specific gravity between the aqueous sucrose solution inside the vesicle and the glucose solution outside the vesicle, the vesicle was allowed to stand for 5 minutes in order to settle near the slide glass surface. Then, this sample was observed using a confocal laser fluorescence microscope (excitation: 488 nm argon laser, observation: fluorescent filter for 505 to 525 nm region observation, 40 × objective lens). The result is shown in FIG.
図１７に示すように、共焦点レーザー蛍光顕微鏡写真から、リング状の蛍光像が多数観測された。このリング形状は、ベシクルの断面を反映した像である。リング状に蛍光成分が観測される結果は、ベシクル構造のリン脂質二重層内、又はベシクル表面に量子ドットを含有するナノ粒子−生体関連分子複合体Ａが導入されていることを示唆する。ベシクルの内孔には蛍光成分が観測されず、ナノ粒子−生体関連分子複合体Ａはベシクル内液中にはほぼ含まれていないことが推量される。 As shown in FIG. 17, many ring-shaped fluorescence images were observed from the confocal laser fluorescence micrograph. This ring shape is an image reflecting the cross section of the vesicle. The result of the fluorescence component being observed in a ring shape suggests that the nanoparticle-biorelevant molecule complex A containing quantum dots is introduced in the phospholipid bilayer having a vesicle structure or on the vesicle surface. A fluorescent component is not observed in the inner pore of the vesicle, and it is assumed that the nanoparticle-biorelevant molecule complex A is not substantially contained in the vesicle internal fluid.
（実施例１）
＜輸送用試料の調製＞
卵黄由来フォスファチジルコリン（Ｌ−α−ＰＣ）が０．２ｍｇ溶解するクロロホルム溶液０．５ｍＬに、実施例１で作製したナノ粒子−生体関連分子複合体Ａを５質量％、脂質膜の自発展開を観測するための指示薬として、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ ＤＨＰＥ （Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ １，２−ｄｉｈｅｘａｄｅｃａｎｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ，ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ｓａｌｔ）を１ｍｏｌ％となるように混合した。その後、アルゴンガスを吹き付けて、クロロホルムを蒸発させ、該混合試料からなる脂質膜をガラス瓶の内壁に形成した。これを真空下で２時間乾燥させ、残存する溶液を完全に除去し、輸送用試料を得た。
Example 1
<Preparation of transportation sample>
5% by mass of the nanoparticle-biorelevant molecule complex A prepared in Example 1 in 0.5 mL of a chloroform solution in which 0.2 mg of egg yolk-derived phosphatidylcholine (L-α-PC) is dissolved, and spontaneous formation of a lipid membrane As an indicator for observing the development, Texas Red DHPE (Texas Red 1,2-dihexadecanyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, triethylammonium salt) was mixed to 1 mol%. Thereafter, argon gas was blown to evaporate chloroform, and a lipid film made of the mixed sample was formed on the inner wall of the glass bottle. This was dried under vacuum for 2 hours, and the remaining solution was completely removed to obtain a transport sample.
＜輸送基板の製造＞
ガラス基板（ガラスウエハ）上に、プライマーとしてヘキサメチルジシロキサンを滴下し、５００回転／分で、３０秒間、引き続き２０００回転／分で３０秒間のスピンコートを行った。次いで、フォトレジスト（ＴＳＭＲ−Ｖ９０、東京応化工業株式会社製）を滴下し、５００回転／分で３０秒間、引き続き２０００回転／分で３０秒間のスピンコートを行った。このガラス基板を１２０℃のオーブンで９０秒間ベーキングした。これをフォトマスクによって露光し、引き続き現像した。次に、スパッタ蒸着法によって、ガラス基板上にチタンを１０ｎｍ蒸着した。スパッタ蒸着後のガラス基板を、メチルエチルケトンに浸漬して超音波処理し、リフトオフプロセスによりレジストを溶解・剥離した。次いで、純水流水下で洗浄し、図１の輸送基板１と同様の親水部及び疎水部からなる流路パターンを有する輸送基板Ａを得た（流路高：１０ｎｍ）。その後、輸送基板Ａを、イソプロパノール−水酸化カリウム溶液、エタノール、純水、フッ化アンモニウム溶液を用いて洗浄し、基板表面のＳｉＯ２面をエッチングして親水化処理を施した。該親水化処理により、流路の高さは２０ｎｍとなった。
<Manufacture of transport substrate>
Hexamethyldisiloxane was dropped as a primer on a glass substrate (glass wafer), and spin coating was performed at 500 rpm for 30 seconds and then at 2000 rpm for 30 seconds. Next, a photoresist (TSMR-V90, manufactured by Tokyo Ohka Kogyo Co., Ltd.) was dropped, and spin coating was performed at 500 rpm for 30 seconds, followed by 2000 rpm for 30 seconds. This glass substrate was baked in an oven at 120 ° C. for 90 seconds. This was exposed with a photomask and subsequently developed. Next, 10 nm of titanium was deposited on the glass substrate by sputtering deposition. The sputter-deposited glass substrate was immersed in methyl ethyl ketone and subjected to ultrasonic treatment, and the resist was dissolved and peeled off by a lift-off process. Next, the substrate was washed under running pure water to obtain a transport substrate A having a flow path pattern composed of a hydrophilic portion and a hydrophobic portion similar to the transport substrate 1 of FIG. 1 (flow path height: 10 nm). Thereafter, the transport substrate A was washed with an isopropanol-potassium hydroxide solution, ethanol, pure water, and an ammonium fluoride solution, and the SiO 2 surface of the substrate surface was etched to perform a hydrophilic treatment. By the hydrophilization treatment, the height of the flow path became 20 nm.
＜共焦点レーザー蛍光顕微鏡測定＞
「＜輸送用試料の調製＞」で得られた輸送用試料をガラス製キャピラリーの先端に付着させ、輸送基板Ａの第一の試料収容部に配置した。その後、共焦点レーザー蛍光顕微鏡の対物レンズ（４０倍レンズ使用）と試料との間に、ＰＢＳ緩衝液を静かに注入した。共焦点レーザー蛍光顕微鏡の観測は、以下の２つの観測チャネルを同時に用いた。
（１）量子ドット観測用、励起：４８８ｎｍレーザー、観測：５０５〜５２５ｎｍ領域観測用の蛍光フィルター
（２）Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ ＤＨＰＥ観測用、励起：５４３ｎｍレーザー、観測：６１０ｎｍ以上領域観測用の蛍光フィルター
ＰＢＳ緩衝液の注入から、０、１５０、３００、４５０、６００、７５０、９００、１０５０秒後の蛍光像を図１８（ａ）〜（ｈ）に示す。図１８中、符号３１４は第一の試料収容部を示し、符号３１６は流路を示す（以降において同じ）。
<Confocal laser fluorescence microscope measurement>
The transport sample obtained in “<Preparation of transport sample>” was attached to the tip of a glass capillary and placed in the first sample storage portion of transport substrate A. Thereafter, a PBS buffer solution was gently injected between the objective lens (using a 40 × lens) of the confocal laser fluorescence microscope and the sample. The confocal laser fluorescence microscope used the following two observation channels simultaneously.
(1) Quantum dot observation, excitation: 488 nm laser, observation: fluorescent filter for 505-525 nm region observation (2) Texas Red DHPE observation, excitation: 543 nm laser, observation: fluorescent filter for 610 nm region observation PBS buffer FIGS. 18A to 18H show fluorescent images after 0, 150, 300, 450, 600, 750, 900, and 1050 seconds from the injection of the liquid. In FIG. 18, reference numeral 314 indicates a first sample storage section, and reference numeral 316 indicates a flow path (the same applies hereinafter).
図１８（ａ）〜（ｈ）に示すように、流動性の高い脂質分子が親水性の流路内で自発展開する様子が、前記観測チャネル（２）を用いたＴｅｘａｓ Ｒｅｄ ＤＨＰＥの蛍光像から観測された。この脂質分子の自発展開は、疎水的な金属からなる流路外の部分には展開しなかった。また、この輸送基板は、表面を洗浄して親水性処理を施していたため、有機物質の不純物の存在等によって自発展開速度が遅延する等の不都合は確認されなかった。しかしながら、ここでは観測チャネル（１）から、ナノ粒子−生体関連分子複合体の輸送を示唆する明確な像は得られなかった。 As shown in FIGS. 18 (a) to (h), a state in which lipid molecules having high fluidity spontaneously develop in a hydrophilic flow path is shown in a fluorescence image of Texas Red DHPE using the observation channel (2). Observed. This spontaneous development of lipid molecules did not develop in the part outside the channel made of a hydrophobic metal. In addition, since this transport substrate was subjected to hydrophilic treatment by cleaning the surface, there was no inconvenience that the spontaneous development speed was delayed due to the presence of impurities of the organic substance. However, here, a clear image suggesting the transport of the nanoparticle-biorelevant molecule complex was not obtained from the observation channel (1).
図１９に、脂質膜の自発展開後の蛍光像を示す。図１９（ａ）は観測チャネル（１）を用いてナノ粒子−生体関連分子複合体を観測した蛍光像、図１９（ｂ）は観測チャネル（２）を用いて、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ ＤＨＰＥを観測した蛍光像、図１９（ｃ）は図１９（ａ）及び（ｂ）の重ね合わせ蛍光像である。図１９（ａ）に示すように、第一の試料収容部３１４では、脂質二分子膜の多層膜の自発展開により、ナノ粒子−生体関連分子複合体が輸送されている様子が確認された。一方、流路３１６では、ナノ粒子−生体関連分子複合体に由来する明確な蛍光像が得られなかった。流路３１６には、脂質二分子膜の単層膜のみが自発展開により進入することが可能である。そのため、流路３１６においては、単層の脂質二分子膜の自発展開により輸送されるナノ粒子−生体関連分子複合体の粒子数が少なく、蛍光顕微鏡の感度では観測できないことが推量される。そこで以下に示すように、原子間力顕微鏡を用いて、流路３１６で自発展開する脂質二分子膜、ならびに輸送されるナノ粒子−生体関連分子複合体の解析を行った。 FIG. 19 shows a fluorescence image after the spontaneous development of the lipid membrane. FIG. 19A is a fluorescence image obtained by observing the nanoparticle-biorelevant molecule complex using the observation channel (1), and FIG. 19B is a fluorescence image obtained by observing Texas Red DHPE using the observation channel (2). FIG. 19 (c) is a superimposed fluorescence image of FIGS. 19 (a) and (b). As shown in FIG. 19A, in the first sample storage unit 314, it was confirmed that the nanoparticle-biorelevant molecular complex was transported by the spontaneous expansion of the lipid bilayer multilayer film. On the other hand, in the channel 316, a clear fluorescent image derived from the nanoparticle-biologically relevant molecule complex was not obtained. Only the monolayer of the lipid bilayer can enter the channel 316 by spontaneous deployment. Therefore, in the channel 316, it is assumed that the number of nanoparticles-biologically related molecule complex transported by the spontaneous development of the monolayer lipid bilayer membrane is small and cannot be observed with the sensitivity of the fluorescence microscope. Therefore, as shown below, an atomic force microscope was used to analyze the lipid bilayer membrane that spontaneously develops in the channel 316 and the transported nanoparticle-biorelevant molecular complex.
＜原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）測定＞
「＜輸送用試料の調製＞」で得られた輸送用試料をガラス製キャピラリーの先端に付着させ、輸送基板Ａの第一の試料収容部３１４に配置した。その後、ＡＦＭのカンチレバーと試料との間に、ＰＢＳ緩衝液を静かに注入した。この試料に関し、室温、溶液中でＡＦＭ測定を行った。ＡＦＭ測定では、特定の流路３１６のみを連続的に観測し、自発展開される脂質二分子膜が該観測地点に到達するまで測定を継続した。この結果を図２０（ａ）〜（ｉ）、図２１（ａ）〜（ｄ）に示す。ここでは、便宜上、脂質二分子膜が観測地点に到着する直前を０秒（図２０（ａ））とした。図２１（ａ）は、図２０（ｇ）のＡの直線における断面、図２１（ｂ）は、図２０（ｇ）のＢの直線における断面、図２１（ｃ）は、図２０（ｇ）のＣの直線における断面、図２１（ｄ）は、図２０（ｇ）のＤの直線における断面をそれぞれ測定した結果を示すグラフである。
図２０（ａ）〜（ｉ）に示すように、時間経過とともに、脂質二分子膜が輸送基板Ａの流路３１６を自発展開する様子が確認できた。また、図２１の結果から、膜厚約５ｎｍの脂質二分子膜の単分子膜が、流路３１６内を自発展開し、徐々に流路３１６を充填して行くことが明らかとなった。
<Atomic force microscope (AFM) measurement>
The transport sample obtained in “<Preparation of transport sample>” was attached to the tip of a glass capillary and placed in the first sample storage portion 314 of the transport substrate A. Thereafter, PBS buffer was gently injected between the AFM cantilever and the sample. This sample was subjected to AFM measurement at room temperature in a solution. In the AFM measurement, only a specific flow path 316 was continuously observed, and the measurement was continued until the spontaneously developed lipid bilayer reached the observation point. The results are shown in FIGS. 20 (a) to (i) and FIGS. 21 (a) to (d). Here, for convenience, the time immediately before the lipid bilayer arrived at the observation point was set to 0 second (FIG. 20A). 21 (a) is a cross section taken along the line A in FIG. 20 (g), FIG. 21 (b) is a cross section taken along the line B in FIG. 20 (g), and FIG. 21 (c) is the same as FIG. FIG. 21 (d) is a graph showing the results of measuring the cross section along the straight line D in FIG. 20 (g).
As shown in FIGS. 20A to 20I, it was confirmed that the lipid bilayer membrane spontaneously developed in the flow path 316 of the transport substrate A with time. Further, from the results of FIG. 21, it was revealed that a lipid bimolecular monolayer having a film thickness of about 5 nm spontaneously expands in the channel 316 and gradually fills the channel 316.
図２２〜２３に、自発展開後の脂質二分子膜のＡＦＭ像を示す。図２２は、輸送基板Ａにおける任意の流路３１６を観察した結果であり、図２３は、輸送基板Ａにおける任意の他の流路３１６を観察した結果である。観察した２つの流路３１６は、互いにその幅が異なるものである。図２２（ａ）、図２３（ａ）に示すように、自発展開後の脂質二分子膜内に、ナノ粒子−生体関連分子複合体に由来するドット状の粒子３３０、３３２、３３４が多数観測された。図２２（ｂ）に示すように、粒子３３２の高さは８ｎｍ程度であった。また、図２３（ｂ）に示すように、粒子３３４の高さは１２ｎｍ程度であった。この結果から、輸送基板Ａの流路３１６において、脂質二分子膜の自発展開に伴い、ナノ粒子−生体関連分子複合体が輸送されていることが判った。 22-23 show the AFM images of the lipid bilayer after spontaneous development. FIG. 22 shows the result of observing an arbitrary channel 316 in the transport substrate A, and FIG. 23 shows the result of observing any other channel 316 in the transport substrate A. The observed two flow paths 316 have different widths. As shown in FIG. 22 (a) and FIG. 23 (a), a large number of dot-like particles 330, 332, and 334 derived from the nanoparticle-biorelevant molecule complex are observed in the lipid bilayer after spontaneous development. It was done. As shown in FIG. 22B, the height of the particles 332 was about 8 nm. Further, as shown in FIG. 23B, the height of the particles 334 was about 12 nm. From this result, it was found that the nanoparticle-biorelevant molecular complex was transported in the flow path 316 of the transport substrate A along with the spontaneous development of the lipid bilayer membrane.
１ 輸送基板
１２ 疎水部
１３ 親水部
５０、６０、７０、８０、９０、１００ ナノ粒子−生体関連分子複合体
５２ ナノ粒子
５８、９３ リン脂質
６１ ＰＥＧ化リン脂質
７１ ビオチン化ＰＥＧ
８１ タンパク質結合型ＰＥＧ
９１ ビオチン−ＰＥＧ化リン脂質
９２ ベシクル
９４ ナノ粒子複合体
９６ 内孔
９８ 化学物質
１０１ タンパク質結合型ＰＥＧ化リン脂質
１１０ ストレプトアビジン
１２０ タンパク質
２００ バイオリアクターチップ
２１０、２２０、２３０ 輸送部
２１９、２２９、２３９ ナノギャップ電極
Ｓ２ 脂質二分子膜
DESCRIPTION OF SYMBOLS 1 Transport substrate 12 Hydrophobic part 13 Hydrophilic part 50, 60, 70, 80, 90, 100 Nanoparticle-biorelevant molecular complex 52 Nanoparticle 58, 93 Phospholipid 61 PEGylated phospholipid 71 Biotinylated PEG
81 Protein-binding PEG
91 Biotin-PEGylated phospholipid 92 Vesicle 94 Nanoparticle complex 96 Inner pore 98 Chemical substance 101 Protein-linked PEGylated phospholipid 110 Streptavidin 120 Protein 200 Bioreactor chip 210, 220, 230 Transport part 219, 229, 239 Nano Gap electrode S2 Lipid bilayer
Claims (14)
前記脂質二分子膜に導入され、前記脂質二分子膜の自発展開により輸送されるナノ粒子−生体関連分子複合体とを備えた生体分子分析用キットであって、
前記ナノ粒子−生体関連分子複合体は、表面に反応活性基を備えるナノ粒子と、該ナノ粒子の表面の反応活性基に結合した生体関連分子とを備えるナノ粒子複合体を含有することを特徴とする生体分子分析用キット。 An analyzer comprising a transport substrate on which a hydrophilic part where a lipid bilayer membrane spontaneously develops is formed;
A biomolecule analysis kit comprising a nanoparticle-biorelevant molecule complex introduced into the lipid bilayer membrane and transported by spontaneous development of the lipid bilayer membrane,
The nanoparticle-biorelevant molecule complex includes a nanoparticle complex comprising a nanoparticle having a reactive group on its surface and a biorelevant molecule bound to the reactive group on the surface of the nanoparticle. A biomolecule analysis kit.
前記脂質二分子膜は、前記親水部の表面を自発展開することを特徴とする、請求項１に記載の生体分子分析用キット。 The transport substrate is formed with a flow path pattern composed of a hydrophilic part and a hydrophobic part,
The kit for biomolecule analysis according to claim 1, wherein the lipid bilayer membrane spontaneously develops the surface of the hydrophilic portion.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2010053685A JP2011185874A (en) | 2010-03-10 | 2010-03-10 | Kit for analyzing biomolecules and method for analyzing biomolecules using the same |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2010053685A JP2011185874A (en) | 2010-03-10 | 2010-03-10 | Kit for analyzing biomolecules and method for analyzing biomolecules using the same |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2011185874A true JP2011185874A (en) | 2011-09-22 |
Family
ID=44792328
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2010053685A Pending JP2011185874A (en) | 2010-03-10 | 2010-03-10 | Kit for analyzing biomolecules and method for analyzing biomolecules using the same |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2011185874A (en) |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013080491A1 (en) * | 2011-11-29 | 2013-06-06 | 国立大学法人東京工業大学 | Biosensing method in which functional substance-containing microparticles are used |
| JP2015231588A (en) * | 2014-06-09 | 2015-12-24 | 公益財団法人神奈川科学技術アカデミー | Production method of liposome aggregate |
| JP2017503788A (en) * | 2013-12-20 | 2017-02-02 | エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ | Compounds useful for binding cells comprising one or more hydrophobic domains and a hydrophilic domain comprising a PEG moiety |
| US10890585B2 (en) | 2013-12-20 | 2021-01-12 | Roche Diagnostics Operations, Inc. | Method of immobilizing a cell on a support using compounds comprising a polyethylene glycol moiety |
| US11021472B2 (en) | 2013-12-20 | 2021-06-01 | Roche Diagnostics Operations, Inc. | Use of compounds comprising two or more hydrophobic domains and a hydrophilic domain comprising PEG moieties for stabilization of a cell |
| WO2022114696A1 (en) * | 2020-11-24 | 2022-06-02 | 한국전자기술연구원 | Method for manufacturing working electrode for biosensor including metal nanoparticles, electrode manufactured thereby, and method for measuring concentration of biomarkers in sample using manufactured electrode |
| US11965886B2 (en) | 2013-12-20 | 2024-04-23 | Roche Diagnostics Operations, Inc. | Method of immobilizing a cell on a support using compounds comprising a polyethylene glycol moiety |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0333657A (en) * | 1989-06-30 | 1991-02-13 | Nippon Telegr & Teleph Corp <Ntt> | Magnetic marker for immunoassay coated with molecular aggregate |
| JPH11106391A (en) * | 1997-10-02 | 1999-04-20 | Jsr Corp | Fine particle having phospholipid membrane and immobilization of biopolymer to the same particle |
| JP2007248290A (en) * | 2006-03-16 | 2007-09-27 | Nippon Telegr & Teleph Corp <Ntt> | Microchannel element |
| JP2008007815A (en) * | 2006-06-29 | 2008-01-17 | Nippon Telegr & Teleph Corp <Ntt> | Metal nanoparticulate composite, method for producing the same, metal nanoparticulate composite thin film and method for producing the same |
| JP2009192228A (en) * | 2008-02-12 | 2009-08-27 | Fujifilm Corp | Labelling particle comprising fixing fragmented antibody to labelling substance |
| JP2009210272A (en) * | 2008-02-29 | 2009-09-17 | Nippon Telegr & Teleph Corp <Ntt> | Molecule analysis method and molecule analysis element |
-
2010
- 2010-03-10 JP JP2010053685A patent/JP2011185874A/en active Pending
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0333657A (en) * | 1989-06-30 | 1991-02-13 | Nippon Telegr & Teleph Corp <Ntt> | Magnetic marker for immunoassay coated with molecular aggregate |
| JPH11106391A (en) * | 1997-10-02 | 1999-04-20 | Jsr Corp | Fine particle having phospholipid membrane and immobilization of biopolymer to the same particle |
| JP2007248290A (en) * | 2006-03-16 | 2007-09-27 | Nippon Telegr & Teleph Corp <Ntt> | Microchannel element |
| JP2008007815A (en) * | 2006-06-29 | 2008-01-17 | Nippon Telegr & Teleph Corp <Ntt> | Metal nanoparticulate composite, method for producing the same, metal nanoparticulate composite thin film and method for producing the same |
| JP2009192228A (en) * | 2008-02-12 | 2009-08-27 | Fujifilm Corp | Labelling particle comprising fixing fragmented antibody to labelling substance |
| JP2009210272A (en) * | 2008-02-29 | 2009-09-17 | Nippon Telegr & Teleph Corp <Ntt> | Molecule analysis method and molecule analysis element |
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013080491A1 (en) * | 2011-11-29 | 2013-06-06 | 国立大学法人東京工業大学 | Biosensing method in which functional substance-containing microparticles are used |
| JP2013113735A (en) * | 2011-11-29 | 2013-06-10 | Tokyo Institute Of Technology | Biosensing method using fine particle containing functional material |
| JP2017503788A (en) * | 2013-12-20 | 2017-02-02 | エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ | Compounds useful for binding cells comprising one or more hydrophobic domains and a hydrophilic domain comprising a PEG moiety |
| US10718769B2 (en) | 2013-12-20 | 2020-07-21 | Roche Diagnostics Operations, Inc. | Compounds comprising one or more hydrophobic domains and a hydrophilic domain comprising peg moieties, useful for binding cells |
| US10890585B2 (en) | 2013-12-20 | 2021-01-12 | Roche Diagnostics Operations, Inc. | Method of immobilizing a cell on a support using compounds comprising a polyethylene glycol moiety |
| US11021472B2 (en) | 2013-12-20 | 2021-06-01 | Roche Diagnostics Operations, Inc. | Use of compounds comprising two or more hydrophobic domains and a hydrophilic domain comprising PEG moieties for stabilization of a cell |
| US11965886B2 (en) | 2013-12-20 | 2024-04-23 | Roche Diagnostics Operations, Inc. | Method of immobilizing a cell on a support using compounds comprising a polyethylene glycol moiety |
| JP2015231588A (en) * | 2014-06-09 | 2015-12-24 | 公益財団法人神奈川科学技術アカデミー | Production method of liposome aggregate |
| WO2022114696A1 (en) * | 2020-11-24 | 2022-06-02 | 한국전자기술연구원 | Method for manufacturing working electrode for biosensor including metal nanoparticles, electrode manufactured thereby, and method for measuring concentration of biomarkers in sample using manufactured electrode |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Grieshaber et al. | Electrochemical biosensors-sensor principles and architectures | |
| Castellana et al. | Solid supported lipid bilayers: From biophysical studies to sensor design | |
| Rebaud et al. | Tethered bilayer lipid membranes (tBLMs): Interest and applications for biological membrane investigations | |
| JP2007040974A (en) | Biomolecule immobilized substrate, biochip, and biosensor | |
| Li et al. | N-heterocyclic carbene self-assembled monolayers on gold as surface plasmon resonance biosensors | |
| JP2011185874A (en) | Kit for analyzing biomolecules and method for analyzing biomolecules using the same | |
| CN110954686A (en) | Hybrid nanopore sensor | |
| JP6462746B2 (en) | Surface with a continuous gradient of charged nanoparticles, apparatus for analysis of adhesion phenomena, and use of the surface and apparatus | |
| Mahmoudpour et al. | Rational design of smart nano-platforms based on antifouling-nanomaterials toward multifunctional bioanalysis | |
| JP2011027632A (en) | Biomolecule immobilized substrate, biomolecule transport substrate, and biochip | |
| Watanabe et al. | Establishing ultimate biointerfaces covered with phosphorylcholine groups | |
| Reimhult et al. | Advances in nanopatterned and nanostructured supported lipid membranes and their applications | |
| Belling et al. | Lipid bicelle micropatterning using chemical lift-off lithography | |
| JP5355456B2 (en) | Quantum dot composite-containing vesicle and method for producing the same | |
| Ando et al. | Nanometric Gap Structure with a Fluid Lipid Bilayer for the Selective Transport and Detection of Biological Molecules | |
| CN107589254B (en) | Preparation method and application of immunoliposome complex nanoparticle biochip | |
| WO2014096324A1 (en) | Lipid membrane enveloped particles with membrane proteins | |
| Novikova et al. | Nanostructured Biosensors Based on Components of Bacterial Membranes | |
| Lee et al. | Trends in the development and application of functional biomembrane surfaces | |
| Han et al. | 3D artificial cell membranes as versatile platforms for biological applications | |
| Han et al. | Lipid bilayer membrane arrays: fabrication and applications | |
| CN1892219A (en) | Biomolecule mobilization substrate, bio-chip and biological sensor | |
| Bally et al. | Lipid-Based Bioanalytical Sensors | |
| JP4925820B2 (en) | Multilayer structure of vesicles fixed on the surface | |
| Fordyce et al. | Advances in surface-based assays for single molecules |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20120119 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20121030 |
|
| A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20121031 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20130312 |
|
| RD02 | Notification of acceptance of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7422 Effective date: 20130605 |