JP5015404B2 - 可溶性ｚｃｙｔｏｒ１１サイトカイン受容体 - Google Patents

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Description

【０００１】
発明の背景：
サイトカインは、多くの細胞型の増殖及び分化に影響を及ぼす可溶性タンパク質である。それらの受容体は、高い親和性でサイトカインを結合し、そしてこの結合現象を、一定の受容体サブユニットの細胞質部分を通して細胞に形質導入する１又は複数の内在性膜タンパク質から構成される。サイトカイン受容体は、それらの細胞外リガンド結合ドメインにおける類似性に基づいて、いくつかの種類のグループ分けされている。例えば、インターフェロン（IFN）の効果の結合及び/又は形質導入を担当する受容体鎖は、特徴的な200個の残基の細胞外ドメインに基づいて、第II型サイトカイン受容体ファミリー（CRF2）のメンバーである。それらのインターフェロンの例示されるインビボ活性は、他のサイトカイン、サイトカインアゴニスト及びサイトカインアンタゴニストの莫大な臨床学的可能性及びそれらのための必要性を表示する。
【０００２】
発明の記載：
本発明は、新規サイトカイン受容体、及び関連する組成物及び方法を提供することによってこの必要性を満たす。特に、本発明は、他方ではまた、トランスメンブランドメイン、又は細胞内ドメイン及びトランスメンブランドメインの両者のいずれかを含む、哺乳類Zcytor11受容体の細胞外リガンド−結合領域を提供する。
さらに、本発明は、一定のヒト疾病状態におけるT−細胞誘発因子（IL−TIF）の効果を拮抗するために使用され得る新規の可溶性サイトカイン受容体を提供することによって、この必要性を満たす。特に、本発明は、ホモダイマー、ヘテロダイマー又はマルチマーのいずれかである、哺乳類Zcytor11受容体の細胞外リガンド−結合領域を提供する。
【０００３】
1つの観点においては、本発明は、配列番号３に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも90％同一であるアミノ酸残基の配列を含んで成る可溶性サイトカイン受容体ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供し、ここで前記ポリヌクレオチド配列によりコードされる可溶性サイトカイン受容体ポリペプチドがIL−TIF（配列番号８）を結合するか、又は拮抗することを特徴とする。１つの態様においては、前記ポリヌクレオチドは上記に開示される通りであり、ここで前記ポリヌクレオチドによりコードされる可溶性サイトカイン受容体ポリペプチドが、ホモダイマー受容体複合体を形成する。
【０００４】
第２の観点においては、本発明は、配列番号３に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも90％同一であるアミノ酸残基の配列を含んで成る可溶性サイトカイン受容体ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供し、ここで前記ポリヌクレオチドによりコードされる可溶性サイトカイン受容体ポリペプチドがヘテロダイマー又はマルチマー受容体複合体を形成するすることを特徴とする。１つの態様においては、前記ポリヌクレオチドは上記に開示される通りであり、ここで前記ポリヌクレオチドによりコードされる可溶性サイトカイン受容体ポリペプチドは、可溶性クラスI又はクラスIIサイトカイン受容体をさらに含んで成るヘテロダイマー又はマルチマー受容体複合体を形成する。
【０００５】
もう１つの態様においては、前記ポリヌクレオチドは上記に開示される通りであり、ここで前記ポリヌクレオチドによりコードされる可溶性サイトカイン受容体ポリペプチドは、可溶性CRF2−4受容体ポリペプチド（配列番号33）、可溶性IL−10受容体ポリペプチド（配列番号34）、又は可溶性DIRS1受容体ポリペプチド（配列番号35）をさらに含んで成るヘテロダイマー又はマルチマー受容体複合体を形成する。もう１つの態様においては、前記ポリヌクレオチドは上記に開示される通りであり、ここで前記ポリヌクレオチドによりコードされる可溶性サイトカイン受容体ポリペプチドは、可溶性CRF2−4受容体ポリペプチド（配列番号33）、可溶性IL−10受容体ポリペプチド（配列番号34）、又は可溶性DIRS1受容体ポリペプチド（配列番号35）をさらに含んで成るヘテロダイマー又はマルチマー受容体複合体を形成する。
【０００６】
第３の観点においては、本発明は、配列番号３に示されるようなアミノ酸残基の配列を含んで成る可溶性サイトカイン受容体ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供し、ここで前記ポリヌクレオチドによりコードされる可溶性サイトカイン受容体ポリペプチドはヘテロダイマー又はマルチマー受容体複合体を形成することを特徴とする。もう１つの態様においては、前記ポリヌクレオチドは上記に開示される通りであり、ここで前記ポリヌクレオチドによりコードされる可溶性サイトカイン受容体ポリペプチドは、可溶性クラスI又はクラスIIサイトカイン受容体をさらに含んで成る。
【０００７】
もう１つの態様においては、前記ポリヌクレオチドは上記に開示される通りであり、ここで前記ポリヌクレオチドによりコードされる可溶性サイトカイン受容体ポリペプチドは、可溶性CRF2−4受容体ポリペプチド（配列番号33）、可溶性IL−10受容体ポリペプチド（配列番号34）、又は可溶性DIRS1受容体ポリペプチド（配列番号35）をさらに含んで成るヘテロダイマー又はマルチマー受容体複合体を形成する。もう１つの態様においては、前記ポリヌクレオチドは上記に開示される通りであり、ここで前記可溶性サイトカイン受容体ポリペプチドはさらに、細胞内ドメインをコードする。もう１つの態様においては、前記ポリヌクレオチドは上記に開示される通りであり、ここで前記可溶性サイトカイン受容体ポリペプチドはさらに、親和性標識を含んで成る。
【０００８】
もう１つの観点においては、本発明は、次の作用可能に連続された要素：（ａ）転写プロモーター；配列番号３に示されるようなアミノ酸配列を有する可溶性サイトカイン受容体ポリペプチドをコードする第１DNAセグメント；及び転写ターミネーター；及び（ｂ）第２転写プロモーター；可溶性クラスI又はクラスIIサイトカイン受容体ポリペプチドをコードする第２DNAセグメント；及び転写ターミネーターを含んで成り、ここで前記第１及び第２DNAセグメントが単一の発現のベクター内に含まれるか、又は独立した発現ベクター内に含まれることを特徴とする発現ベクターを提供する。
【０００９】
１つの態様においては、上記に開示される発現ベクターは、前記第１及び第２DNAセグメントに作用可能に連結される分泌シグナル配列をさらに含んで成る。１つの態様においては、前記発現ベクターは、上記に開示される通りであり、ここで前記第２DNAセグメントは、可溶性CRF2−4受容体ポリペプチド（配列番号33）、可溶性IL−10受容体ポリペプチド（配列番号34）、又は可溶性DIRS1受容体ポリペプチド（配列番号35）をコードする。
【００１０】
もう１つの観点においては、本発明は、上記に開示されるような発現ベクターを含んで成る培養された細胞を提供し、ここで前記細胞はDNAセグメントによりコードされるポリペプチドを発現する。もう１つの観点においては、前記培養された細胞は、上記に開示されるような発現ベクターを含んで成り、ここで前記第１及び第２DNAセグメントは独立した発現ベクター上に位置し、そして細胞中に同時トランスフェクトされ、そして細胞は前記DNAセグメントによりコードされるポリペプチドを発現する。もう１つの観点においては、前記培養された細胞は、上記に開示されるような発現ベクターを含んで成り、ここで前記細胞はDNAセグメントによりコードされるヘテロダイマー又はマルチマー可溶性受容体ポリペプチドを発現する。
【００１１】
もう１つの観点においては、前記培養された細胞は、上記に開示される通りであり、ここで前記細胞は、可溶性サイトカイン受容体ポリペプチドヘテロダイマー又はマルチマー複合体を分泌する。もう１つの観点においては、前記培養された細胞は、上記に開示される通りであり、ここで前記細胞は、IL−TIFを結合し、又はIL−TIF活性を拮抗する可溶性サイトカイン受容体ポリペプチドヘテロダイマー又はマルチマー複合体を分泌する。
【００１２】
もう１つの観点においては、本発明は、下記成分：配列番号３に示されるようなアミノ酸残基の配列を有するポリペプチドをコードする第１DNAセグメント；及び可溶性クラスI又はクラスIIサイトカイン受容体ポリペプチドをコードする少なくとも１つの他のDNAセグメントを含んで成る融合タンパク質をコードするDNA構造体を提供し、ここで前記第１及び他のDNAセグメントが読み取り枠の整合して連結され；そして前記第１及び他のDNAセグメントが前記融合タンパク質をコードすることを特徴とする。
【００１３】
もう１つの観点においては、本発明は、上記に開示されるよう融合タンパク質をコードするDNA構造体を提供し、ここで少なくとも１つの他のDNAセグメントは、可溶性CRF2−4受容体ポリペプチド（配列番号33）、可溶性IL−10受容体ポリペプチド（配列番号34）又は可溶性DIRS1受容体ポリペプチド（配列番号35）をコードする。
もう１つの観点においては、本発明は、次の作用可能に連結された要素：転写プロモーター：上記に開示されるような融合タンパク質をコードするDNA構造体：及び転写ターミネーターを含んで成る発現ベクターを提供し、ここで前記プロモーターは前記DNA構造体に作用可能に連結され、そして前記DNA構造体が前記転写ターミネーターに作用可能に連結されることを特徴とする。
【００１４】
もう１つの観点においては、本発明は、上記に開示されるような発現ベクターを含んで成る培養された細胞を提供し、ここで前記細胞はDNA構造体によりコードされるポリペプチドを発現する。
もう１つの観点においては、本発明は、融合タンパク質の生成方法を提供し、ここで上記に開示されるような細胞を培養し；そして前記細胞により生成されるポリペプチドを単離することを含んで成る。
【００１５】
もう１つの観点においては、本発明は、配列番号３に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも90％同一であるアミノ酸残基の配列を含んで成る、IL−TIFを結合するか又はIL−TIF活性を拮抗する単離された可溶性サイトカイン受容体ポリペプチドを提供する。１つの態様においては、前記単離されたポリペプチドは上記に記載される通りであり、ここで前記可溶性サイトカイン受容体ポリペプチドは、ホモダイマー受容体複合体を形成する。
【００１６】
もう１つの観点においては、本発明は、配列番号３に示されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも90％同一であるアミノ酸残基の配列を含んで成る単離されたポリぺプチドを提供し、ここで前記可溶性サイトカイン受容体ポリペプチドはヘテロダイマー又はマルチマー受容体複合体を形成するすることを特徴とする。１つの態様においては、前記単離されたポリペプチドは上記に記載される通りであり、ここで前記可溶性サイトカイン受容体ポリペプチドは、可溶性クラスI又はクラスIIサイトカイン受容体をさらに含んで成るヘテロダイマー又はマルチマー受容体複合体を形成する。
【００１７】
もう１つの態様においては、前記単離されたポリペプチドは上記に記載される通りであり、ここで前記可溶性サイトカイン受容体ポリペプチドは、可溶性CRF2−4受容体ポリペプチド（配列番号33）、可溶性IL−10受容体ポリペプチド（配列番号34）、又は可溶性DIRS1受容体ポリペプチド（配列番号35）をさらに含んで成るヘテロダイマー又はマルチマー受容体複合体を形成する。１つの態様においては、前記単離されたポリペプチドは上記に記載される通りであり、ここで前記ポリペプチドは、可溶性CRF2−4受容体ポリペプチド（配列番号33）、可溶性IL−10受容体ポリペプチド（配列番号34）、又は可溶性DIRS1受容体ポリペプチド（配列番号35）をさらに含んで成るヘテロダイマー又はマルチマー受容体複合体を形成する。
【００１８】
もう１つの観点においては、本発明は、配列番号３に示されるようなアミノ酸残基の配列を含んで成る単離された可溶性サイトカイン受容体ポリペプチドを提供し、ここで前記可溶性サイトカイン受容体ポリペプチドはヘテロダイマー又はマルチマー受容体複合体を形成することを特徴とする。もう１つの態様においては、前記単離されたポリペプチドは上記に記載される通りであり、ここで前記可溶性サイトカイン受容体ポリペプチドは、可溶性クラスI又はクラスIIサイトカイン受容体をさらに含んで成るヘテロダイマー又はマルチマー受容体複合体を形成する。
【００１９】
もう１つの態様においては、前記単離されたポリペプチドは上記に記載される通りであり、ここで前記可溶性サイトカイン受容体ポリペプチドは、可溶性CRF2−4受容体ポリペプチド（配列番号33）、可溶性IL−10受容体ポリペプチド（配列番号34）、又は可溶性DIES1受容体ポリペプチド（配列番号35）を含んで成るヘテロダイマー又はマルチマー受容体複合体を形成する。もう１つの態様においては、前記単離されたポリペプチドは上記に開示される通りであり、ここで前記可溶性サイトカイン受容体ポリペプチドは、親和性標識、化学的成分、毒素又はラベルをさらに含んで成る。
【００２０】
もう１つの観点においては、本発明は、可溶性受容体サブユニットを含んで成る単離されたヘテロダイマー又はマルチマー可溶性受容体複合体を提供し、ここで前記可溶性受容体サブユニットの少なくとも１つは、配列番号３に示されるようなアミノ酸残基の配列を含んで成る可溶性サイトカイン受容体ポリペプチドを含んで成る。１つの態様においては、上記に開示される単離されたヘテロダイマー又はマルチマー可溶性受容体複合体は、さらに可溶性クラスI又はクラスIIサイトカイン受容体ポリペプチドを含んで成る。１つの態様においては、前記単離されたヘテロダイマー又はマルチマー可溶性受容体複合体は、さらに可溶性CRF2−4受容体ポリペプチド（配列番号33）、可溶性IL−10受容体ポリペプチド（配列番号34）、又は可溶性DIRS1受容体ポリペプチド（配列番号35）を含んで成る。
【００２１】
もう１つの観点においては、本発明は、ヘテロダイマー又はマルチマー複合体を形成する可溶性サイトカイン受容体ポリペプチドの生成方法を提供し、ここで上記に開示されるような細胞を培養し；そして前記細胞により生成される可溶性受容体ポリペプチドを単離することを含んで成る。
【００２２】
もう１つの観点においては、本発明は、可溶性サイトカイン受容体ポリペプチドに対する抗体を生成するための方法を提供し、ここで下記群：
（ａ）ホモダイマー可溶性サイトカイン受容体複合体を含んで成るポリペプチド；
（ｂ）可溶性クラスＩ又はクラスIIサイトカイン受容体ポリペプチドを含んで成る可溶性サイトカイン受容体へテロダイマー又はマルチマー受容体複合体を含んで成るポリペプチド；
（ｃ）可溶性CRF2−4受容体ポリペプチド（配列番号33）を含んで成る可溶性サイトカイン受容体ヘテロダイマー又はマルチマー受容体複合体を含んで成るポリペプチド；
【００２３】
（ｄ）可溶性IL−10受容体ポリペプチド（配列番号34）を含んで成る可溶性サイトカイン受容体へテロダイマー又はマルチマー受容体複合体を含んで成るポリペプチド；及び
（ｅ）可溶性DIRS1受容体ポリペプチド（配列番号35）を含んで成る可溶性サイトカイン受容体へテロダイマー又はマルチマー受容体複合体を含んで成るポリペプチドから選択された可溶性サイトカイン受容体ポリペプチドにより動物を接種し；ここで前記ポリペプチドが、抗体を生成するために前記動物において免疫応答を誘発し；そして前記動物から抗体を単離することを含んで成る。
【００２４】
もう１つの観点においては、本発明は、可溶性サイトカイン受容体ポリペプチドを含んで成るホモダイマー、ヘテロダイマー又はマルチマー受容体複合体に対して特異的に結合する上記に開示されるような方法により生成される抗体を提供する。１つの観点においては、前記抗体はモノクローナル抗体である。
もう１つの観点においては、本発明は、ホモダイマー、ヘテロダイマー又はマルチマー受容体複合体に対して特異的に結合する抗体を提供する。
【００２５】
もう１つの観点においては、本発明は、可溶性サイトカイン受容体の不在下で培養された骨髄又は末梢血液細胞に比較して、骨髄又は末梢血液細胞における造血細胞の増殖を低めるのに十分な量の可溶性サイトカイン受容体を含んで成る組成物と共に骨髄又は末梢血液細胞を培養することを含んで成る、造血細胞及び造血細胞前駆体のIL−TIF−誘発された増殖を阻害するための方法を提供する。１つの態様においては、本発明は上記に開示される通りであり、ここで前記造血細胞及び造血前駆体細胞は、リンパ球である。１つの態様においては、本発明は上記に開示される通りであり、ここで前記リンパ球は、マクロファージ又はT細胞である。
もう１つの観点においては、本発明は、炎症を低めるために十分な量の可溶性サイトカイン受容体の組成物を、炎症を有する哺乳類に投与することを含んで成る、IL−TIF−誘発された又はIL−9誘発された炎症を低めるための方法を提供する。
【００２６】
もう１つの観点においては、本発明は、（１）抗原−又は病原体−特異的抗体のレベルを決定し；（２）医薬的に許容できるビークル中、可溶性サイトカイン受容体ポリペプチドを含んで成る組成物を投与し；（３）抗原−又は病原体−特異的抗体の後−投与レベルを決定し；（４）段階（３）における抗体のレベルに、段階（１）における抗体のレベルを比較し、ここで抗体レベルの上昇又は下降の欠失が免疫応答の抑制の表示である、抗原又は病原体に対して暴露された哺乳類において免疫応答を抑制するための方法を提供する。
本発明のそれらの及び他の観点は、次の詳細な記載に基づいて明らかに成るであろう。
【００２７】
用語“対立遺伝子変異体”とは、同じ染色体遺伝子座を占める遺伝子の複数の遺伝子の二者択一形のいずれかを示すために、本明細書において使用される。対立遺伝子変異は、突然変異を通して天然では生じ、そして集団内の表現型多型現象をもたらすことができる。遺伝子突然変異は、サイレントであり(コードされたポリペプチドにおいて変化がない)、又は変更されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることができる。用語、対立遺伝子変異体はまた、遺伝子の対立遺伝子変異体によりコードされるタンパク質を示すために本明細書において使用される。
【００２８】
用語“〜に対応する”とは、ヌクレオチド又はアミノ酸配列に関して使用される場合、２種の配列が最適に一列整列される場合、対照位置と一列整列する第２配列における位置を示す。
用語“発現ベクター”とは、その転写を提供する追加のセグメントに作用可能に連結される興味あるポリペプチドをコードするセグメントを含んで成る線状又は環状DNA分子を示すために使用される。そのような追加のセグメントは、プロモーター及びターミネーター配列及び複製の１又は複数の起点、１又は複数の選択マーカー、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、及び同様のものを包含する。発現ベクターは一般的に、プラスミド又はウィルスDNAから誘導され、又は両者の要素を含むことができる。
【００２９】
用語“単離された”とは、ポリヌクレオチドに適用される場合、ポリヌクレオチドがその天然の遺伝的環境から除去され、そして従って、他の無関係な又は所望しないコード配列を有さず、そして遺伝子的に構築されたタンパク質生成システム内での使用のために適切な形で存在することを示す。
“作用可能に連結された”とは、DNAセグメントに適用される場合、前記セグメントが、それらの意図された目的のために協力して機能し、例えば転写がプロモーターにおいて開始し、そしてコードセグメントを通してターミネーターに進行するよう配列されることを示す。
【００３０】
“ポリヌクレオチド”は、5’末端から3’末端に読み取られるデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド塩基の一本鎖又は二本鎖ポリマーである。ポリヌクレオチドは、RNA及びDNAを包含し、そして天然源から単離され、インビトロで合成され、又は天然及び合成分子の組み合わせから調製され得る。
用語“プロモーター”とは、RNA ポリメラーゼの結合及び転写の開始を提供するDNA配列を含む遺伝子の部分を示すために本明細書において使用される。プロモーター配列は通常、遺伝子の5’ 非コード領域に見出されるが、しかし必ずしもそうではない。
【００３１】
用語“受容体”は、生物活性分子(すなわち“リガンド”)に結合し、そして細胞上のリガンドの効果を仲介する細胞関連タンパク質、又はそのようなタンパク質のポリペプチドサブユニットを示す。受容体へのリガンドの結合は、細胞におけるエフェクタードメインと他の分子との間の相互作用を引き起こす受容体におけるコンホメーション変化（及び多くの場合、受容体多重化、すなわち同一油又は異なった受容体サブウニットの会合）をもたらす。この相互作用は、細胞の代謝の変更を誘導する。受容体−リガンド相互作用に連結される代謝現象は、遺伝子転写、リン酸化、脱リン酸化、細胞増殖、cAMP生成の上昇、細胞カルシュウムの代謝、膜脂質の代謝、細胞付着、イノシトール脂質の加水分解、及びリン脂質の加水分解を包含する。用語“受容体ポリペプチド”とは、受容体ポリペプチド鎖及びその一部、例えば単離された機能的ドメイン（例えば、リガンド−結合ドメイン）を表すために使用される。
【００３２】
用語“分泌シグナル配列”とは、それが合成される細胞の分泌路を通してより大きなポリペプチドを、より大きなポリペプチドの成分として方向ずけるポリペプチド（“分泌ペプチド”）をコードするDNA配列を示す。前記のより大きなポリペプチドは、分泌路を通しての移動の間、分泌ペプチドを除去するために通常分解される。
【００３３】
“可溶性受容体”とは、細胞膜に結合されない受容体ポリペプチドである。可溶性受容体は、最も通常には、トランスメンブラン及び細胞質ドメインを欠いているリガンド−結合受容体ポリペプチドである。可溶性受容体は、追加のアミノ酸残基、例えばポリペプチドの精製を提供し、又は基質へのポリペプチドの結合のための部位、又は免疫グロブリン不変領域配列を提供する親和性標識を含んで成る。多くの細胞−表面受容体は、タンパク質加水分解により、又は交互にスプライシングされたmRNAから翻訳される天然に存在する可溶性相対物を有する。受容体ポリペプチドは、それがそれぞれ、膜固定化又はシグナルトランスダクションを提供するために、それらのセグメントの十分な部分を欠いている場合、トランスメンブラン及び細胞内ポリペプチドセグメントを実質的に有さないと言われる。
【００３４】
用語“スプライス変異体”とは、遺伝子から転写されるRNAの二者択一の形を示すために、本明細書において使用される。スプライス変異は、転写されたRNA分子内の、又は通常低いが、別々に転写されたRNA分子間の二者択一のスプライシング部位の使用を通して天然において生じ、そして同じ遺伝子から転写されるいくつかのmRNAをもたらすことができる。スプライス変異体は、変更されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることができる。用語スプライス変異体はまた、遺伝子から転写されるmRNAのスプライス変異体によりコードされるタンパク質を示すために本明細書において使用される。
【００３５】
不正確な分析方法（例えば、ゲル電気泳動）により決定されるポリマーの分子量及び長さは、おおよその値であることが理解されるであろう。そのような値が“約”X又は“おおよそ”Xとして表される場合、その言及されたXの値は、正確には±１０％であることが理解されるであろう。
【００３６】
サイトカイン受容体サブユニットは、リガンド−結合ドメイン、典型的には、シグナルトランスダクションに関与するエフェクタードメインを含んで成る多重−ドメイン構造により特徴づけられる。マルチマーサイトカイン受容体は、ホモダイマー（例えば、PDGF受容体αα及びββイソフォーム、エリトロポエチン受容体、MPL（トロンボポイエチン受容体）及びG−CSF受容体）、サブユニットがそれぞれリガンド−結合及びエフェクタードメインを有するヘテロダイマー（例えば、PDGF受容体αβイソフォーム）、及び種々の機能を有する成分サブユニットを有するマルチマー（例えば、IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7及びGM−CSF受容体）を包含する。
【００３７】
いくつかの受容体サブユニットは、多くの受容体に共通する。例えば、単独ではリガンドを結合できないが、しかし細胞内シグナルトランスダクションドメインを包含するAIC2Bサブユニットは、IL-3, GM-CSF及びIL-5受容体の成分である。多くのサイトカイン受容体は、その構造及び機能に基づいて、４種の関連するファミリーの１つに配置され得る。例えば、クラスI造血受容体は、保存されたシステイン残基及びWSXWSモチーフを含むドメインの存在により特徴づけられる。タンパク質キナーゼドメイン；フィブロネクチン第III型ドメイン；及びジスルフィド結合されたループにより特徴づけられる免疫グロブリンドメインを包含する追加のドメインは、一定の造血受容体に存在する。
【００３８】
サイトカイン受容体構造は、Urdal, Ann. Reports Med. Chem. 26: 221-228, 1991及びCosman, Cytokine 5:95-106, 1993により再考されている。新規生物学的機能を生物が獲得するための選択的圧力下で、新規のファミリーメンバーは、多重遺伝子ファミリーの存在を導く存在する受容体遺伝子の重複から、たぶん生まれると思われる。従って、ファミリーメンバーは、祖先遺伝子の痕跡を含み、そしてそれらの特徴は、追加のファミリーメンバーの単離及び同定において利用され得る。
【００３９】
細胞表面サイトカイン受容体はさらに、追加のドメインの存在により特徴づけられる。それらの受容体は、正に荷電された残基（Lys又はArg）を通常、両端に有する疎水性アミノ酸残基（典型的には、約21〜25個の残基）の配列に特徴づけられるトランスメンブランドメインにより細胞膜に固定される。細胞外ドメインからの、及びそれからトランスメンブランにより分離されるタンパク質の反対側の末端に、細胞内ドメインが存在する。
【００４０】
zcytor11受容体は、クラスIIサイトカイン受容体である。それらの受容体は通常、４−ヘリックス−束サイトカインに結合する。インターロイキン−10及びインターフェロンは、このクラスに受容体を有する（例えば、インターフェロン−γ、α及びβ鎖及びインターフェロン−α/β受容体α及びβ鎖）。クラスIIサイトカイン受容体は、それらのドメインに１又は複数のサイトカイン受容体モジュール（CRM）の存在により特徴づけられる。クラスIIサイトカイン受容体のCRMは、クラスIサイトカイン受容体のより知られているCRMとは幾分異なる。クラスII CRMは２種のIII型フィブロネクチン−様ドメインを含むが、それらは構成的に異なる。
【００４１】
インターフェロン−α/β受容体α鎖を除いて、すべての既知のクラスII受容体と同様にzcytor11は、その細胞外ドメインに単一のクラスII CRMのみを有する。zcytor11は、インターフェロン/IL−10クラスのヘリカルサイトカインのための受容体である。上記に言及されたように、zcytor11は、インターフェロンα受容体α鎖に類似する。Uzeなど., Cell 60: 255-265 (1996)を参照のこと。zcytor11（配列番号１）をコードするヒトcDNAクローンの分析は、約211個のアミノ酸残基（配列番号２の残基18〜228；配列番号３）の細胞外リガンド−結合ドメイン、約23個のアミノ酸残基（配列番号２の残基229〜251）のトランスメンブランドメイン、及び約313個のアミノ酸残基（配列番号２の残基252〜574）の細胞内ドメインを含んで成る574個のアミノ酸（配列番号２）をコードする読み取り枠を表した。当業者は、それらのドメイン境界がおおよそであり、そして既知タンパク質との一列整列及びタンパク質折りたたみの予測に基づかれていることを認識するであろう。ドメインの末端からの残基の欠失は可能である。
【００４２】
さらに、zcytor11受容体は、T−細胞誘発因子（TIF又はIL−TIF）と呼ばれるリガンドを結合することが知られている（WIPO公開WO 00/24768号；Dumontierなど., J. Immunol. 164: 1814-1819, 2000; 及びXieなど., J. Biol. Chem. 出版物M005304200における原稿を参照のこと）。ヒトIL−TIFヌクレオチド配列は、配列番号７に示され、そして対応するポリペプチド配列は、配列番号８に示される。好ましい態様においては、zcytor11, すなわち配列番号２の残基18〜228（配列番号３）の可溶性受容体形は、IL−TIFの効果をインビボで拮抗する、ホモダイマー、ヘテロダイマー又はマルチマーである。そのようなホモダイマー、ヘテロダイマー又はマルチマーに対する抗体はまた、IL−TIF活性のアンタゴニストとしても作用する。
【００４３】
IL−TIFは、IL−９の存在下で誘発されることが示されており、そしてTh1−型免疫応答の促進に関与すると思われる。IL−９は、種々の手段で、免疫機能の増殖、活性化、分化及び/又は誘発を刺激し、そしてぜん息、肺肥満細胞症及び他の疾病に関与し、並びにSTAT経路を活性化する。IL−TIF又はIL−９機能のアンタゴニストは、そのようなヒト疾病に対して有益に使用され得る。本発明は、IL−TIFのそのような新規アンタゴニストを提供する。
【００４４】
本発明は、クラスIIサイトカイン受容体の構造を有する新規ヘテロダイマー可溶性受容体タンパク質、及びそれに対する抗体の発見に基づかれる。ヘテロダイマー可溶性受容体は、所有のアメリカ特許第5,965,704号に開示される少なくとも１つのzcytor11可溶性受容体サブユニットを含む。ヘテロダイマー可溶性受容体に包含される第２可溶性受容体ポリペプチドは、インターロイキン−10（liu Yなど., J. Immunol. 152: 1821-1829, 1994 (IL-10R cDNA)（配列番号34）、インターフェロン（例えば、インターフェロン−γ、α及びβ鎖、及びインターフェロン−α/β受容体α及びβ鎖）、CRF2-4 (Genbank 受容体Z17227号；配列番号33)、及びDIRS1（WIPO公開WO99/46379号，Schering Corporation, 1999; 配列番号35）を包含する受容体サブファミリーに属する。
【００４５】
CRF2−4及びIL−10受容体に関連してのzcytor11受容体は、zcytor11受容体、すなわちIL−TIFのための天然リガンドに応答してシグナルJAK−STAT経路に示された（Xieなど.,前記）。本発明によれば、可溶性zcytor11受容体＋可溶性CRF2-4受容体へテロダイマー（zcytor11/CRF2-4）の好ましい態様により例示されるようなヘテロダイマー可溶性zcytor11受容体は、IL−TIFの有能なアンタゴニストとして作用することができる。他の態様は、可溶性ヘテロダイマーzcytor11/IL-10R、zcytor11/IL-9R及び他のクラスII受容体サブユニット、並びにマルチマー受容体、例えばzcytor11/CRF2-4/IL-10R及びzcytor11/CRF2-4/IL-9R（但し、それらだけには限定されない）を包含する。
【００４６】
zcytor11 cDNAに対応するmRNAの組織分布の分析は、mRNAレベルが膵臓において最高であり、続いて胸腺、結腸、肝臓、皮膚、肺、腎臓及び小腸においてはより低いレベルであったことを示した。従って、本発明の特定の態様は、炎症及び免疫疾患又は次のような病状、例えば膵炎、I型糖尿病（IDDM）、膵癌、グレーヴス病、炎症性腸疾患（IBD）、クローン病、結腸及び腸癌、憩室症、自己免疫疾患、敗血症、ぜん息、最終段階腎疾患、器官又は骨髄移植においてアンタゴニストとしての可溶性zcytor11ヘテロダイマーの使用に向けられ；そして炎症の阻害、すなわち免疫抑制の場合、造血、免疫、炎症又はリンパ細胞、マクロファージ、T−細胞（Th1及びTh2細胞を包含する）の増殖の低下、病原体又は抗原に対する免疫応答の抑制、又はIL−TIF又はIL−９サイトカイン生成の阻害が所望される。
【００４７】
さらに、zcytor11、可溶性zcytor11/CRF2-4ヘテロダイマー及び本明細書に記載さらるマルチマーを認識する抗体、及び/又は可溶性zcytor11/CRF2-4ヘテロダイマー及びマルチマー自体は、次のようなために有用である：
１）zcytor11を通して免疫細胞（例えば、リンパ球、単球、白血球）におけるシグナル化を妨げるか又は阻害するために、自己免疫疾患、IDDM、多発性硬化症（MS）、全身性エリテマトーデス（SLE）、重症筋無力症、リウマチ様関節炎及びIBDの処理においてIL-TIF受容体を通してシグナル化を拮抗するか又は阻止するために（Hughes C. など., J. Immunol. 153: 3319-3325, 1994）。
【００４８】
他方では、抗−可溶性zcytor11、抗−可溶性zcytor11/CRF2-4ヘテロダイマー又はマルチマーモノクローナル抗体（MAb）が、自己免疫疾患を処理するために、所望しない免疫細胞を消耗するためのアンタゴニストとして使用され得る。ぜん息、アレルギー及び他のアトピー性疾患は、免疫応答を阻害するか又は攻撃性を消耗するために、可溶性zcytor11可溶性zcytor11/CRF2-4ヘテロダイマーに対するMAbにより処理され得る。本発明のポリペプチド及び抗体を用いて、zcytor11を通してシグナル化を阻止するか又は阻害することはまた、膵臓、腎臓、下垂体及びニューロン細胞の疾病のために有益であり得る。IDDM, NIDDM, 膵炎及び膵臓も有益であり得る。
【００４９】
zcytor11は、拮抗性MAbが癌増殖を阻害し、そして免疫−介在性殺害を標的化する、癌のMAb治療のための標的物として作用することができる（Hollige P. and Hougenboum, H: Nature Biotech 16: 1015-1016, 1998）。可溶性zcytor11、及び可溶性zcytor11/CRF2-4ヘテロダイマー及びマルチマーに対するMAbはまた、ネフロパシー、例えば糸球体硬化症、膜ニューロパシー、アミロイドーシス（他の組織の中で腎臓に影響を及ぼす）、腎動脈硬化症、種々の起源の糸球体腎炎、腎臓の線維増殖性疾患、及びSLE、IDDM、II型糖尿病（NIDDM）、腎腫瘍及び他の疾病に関連する腎不全を処理するためにも有用であり得る。
【００５０】
２）自己免疫疾患、例えばIDDM、MS、SLE、重症筋無力症、リウマチ様関節炎及びIBDの処理においてIL−TIFを通してシグナル化を作用せしめるか又は開始するために。抗−可溶性zcytor11、抗−可溶性zcytor11/CRF2-4ヘテロダイマー及びマルチマーモノクローナル抗体は、自己免疫を改善するサイトカイン又は細胞表面タンパク質を増殖し、その増殖を変更するか又はその生成を変えるために、リンパ球又は他の免疫細胞をシグナル化することができる。特に、他のパターンのサイトカイン分泌に対するT−ヘルパー細胞応答の調節は、疾病を改善するために自己免疫応答を変更することができる（Smith JAなど., J. Immunol. 160: 4841-4849, 1998）。
【００５１】
同様に、作用性抗−可溶性zcytor11、抗−可溶性zcytor11/CRF2-4ヘテロダイマー及びマルチマーモノクローナル抗体は、ぜん息、アレルギー及びアトピー性疾病に関与する免疫細胞をシグナル化し、消耗し、そして偏向するために使用され得る。zcytor11を通してのシグナル化はまた、膵臓、腎臓、下垂体及びニューロン細胞の疾病のために有益である。zcytor11は、シグナル化MAbが癌増殖を阻害し、そして免疫介在性殺害を標的化する、膵癌のMAb治療のための標的物として作用することができる（Tutt, ALなど., J. Immunol. 161: 3175-3185, 1998）。同様に、腎細胞癌は、本発明のzcytor11含有可溶性受容体に対するモノクローナル抗体により処理され得る。
【００５２】
本明細書に記載される可溶性zcytor11、可溶性zcytor11/CRF2-4ヘテロダイマー及びマルチマーは、上記に記載されるような自己免疫疾患、アトピー性疾患、NIDDM、膵炎及び腎不全の処理においてIL−TIF活性を中和するか又は阻止するために使用され得る。可溶性形のzcytor11は、Th細胞により介在される抗体応答を促進するために、そして/又はリンパ球又は他の免疫細胞によるIL−４又は他のサイトカインの生成を促進するために使用され得る。
【００５３】
本発明の可溶性受容体は、IL−TIFサイトカインのアンタゴニストとして使用である。アンタゴニスト使用の他に、本発明の可溶性受容体は、身体内の異なった組織、器官及び細胞リガンドを輸送するために、IL−TIFを結合し、そしてIL−TIFサイトカインのためのキャリヤータンパク質として作用することができる。本発明の可溶性受容体は、特定部位、例えば組織、特定の免疫細胞又は腫瘍に可溶性−受容体−リガンド複合体を向ける、分子、ポリペプチド又は化学分子に融合されるか又はカップリングされ得る。従って、本発明の可溶性受容体は、IL−TIFの作用を特異的に方向づけるために使用され得る。Cosman, D. Cytokine 5: 95-106, 1993; 及びFermandez-Botran, R. Exp. Opin. Invest. Drugs 9: 497-513, 2000を参照のこと。
【００５４】
さらに、本発明の可溶性受容体は、分解又はクリアランスからリガンドを安定化するか、又は身体内の作用部位にリガンドを標的化することによって、リガンドの生物利用性、治療持続性及び/又は効能を高めるために、IL−TIFの安定化に使用され得る。例えば、天然に存在するIL−６/可溶性IL−６R複合体は、IL−６を安定化し、そしてgp130受容体を通してシグナル化することができる。Cosman, D. 前記及びfernandez−Boran, R. 前記を参照のこと。
【００５５】
本発明の好ましい態様においては、単離されたポリヌクレオチドは、配列番号３、又はそれに対して相補的な配列の類似するサイズの領域に対して、緊縮条件下でハイブリダイズするであろう。一般的に、緊縮条件は、定義されたイオン強度及びpHで、特定の配列のための熱溶融点（Tm）よりも約５℃低くあるよう選択される。Tmは、標的配列の50％が好ましく適合されたプローブに対してハイブリダイズする温度（定義されたイオン強度及びpH下で）である。典型的な緊縮条件は、塩濃度がpH７で少なくとも約0.02Mであり、そして温度が少なくとも約60℃であるそれらの条件である。前で示されたように、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、DNA及びRNAを包含する。
【００５６】
DNA及びRNAを調製するための方法は、当業界において良く知られている。一般的に、cDNAはまた、他の組織からのRNAを用いて調製され得るか化又はゲノムDNAとして単離され得るが、膵臓又は前立腺からRNAを単離することが好ましい。全RNAは、グアニジン HCl抽出、続くCsClグラジエントにおける遠心分離による単離により調製され得る（Chirgwinなど.,Biochemistry 18:52−94, 1979）。ポリ（A）+ RNAは、Aviv and Leder (Proc.Natl. Acad. Sci.USA 69: 1408−1412, 1972 )の方法を用いて全RNAから調製される。相補的DNA(ｃDNA)は、既知の方法を用いて、ポリ（A）+ RNAから調製される。次に、zcytor11ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、例えばハイブリダイゼーション又はPCRにより同定され、そして単離される。
【００５７】
当業者は、配列番号３に開示される配列及び配列番号１のその対応するヌクレオチドが、ヒトzcytor11受容体の単一の対立遺伝子を表すことを認識するであろう。それらの配列の対立遺伝子変異体は、標準の方法に従って、異なった個人からのcDNA又はゲノムライブラリーをプローブすることによってクローン化され得る。
【００５８】
本発明はさらに、他の種（“種オルト体”）からの相対物受容体及びポリヌクレオチドを供給する。特に興味あるものは、他の哺乳類種、例えばネズミ、ブタ、羊、ウシ、犬、ネコ、馬及び他の霊長類ポリペプチドからのzcytor11受容体である。ヒトzcytor11受容体の種オルト体は、従来のクローニング技法と組合して、本発明により供給される情報及び組成物を用いてクローン化され得る。例えば、ｃDNAは、前記受容体を発現する組織又は細胞型から得られるｍRNAを用いてクローン化され得る。ｍRNAの適切な源は、本明細書に開示される配列から企画されたプローブによりノザン ブロットをプローブすることによって同定され得る。次に、ライブラリーが陽性の組織又は細胞系のｍRNAから調製される。
【００５９】
次に、受容体−コードのｃDNAが種々の方法、例えばヒト又は他の霊長類の完全な又は部分的なｃDNAにより、又は前記開示される配列に基づく１又は複数の変性プローブにより、プローブすることによって単離され得る。ｃDNAはまた、本明細書に開示される配列から企画されたプライマーを用いて、ポリメラーゼ鎖反応又はPCR（Mullis, アメリカ特許第4,683,202号）を用いてもクローン化され得る。さらなる方法においては、ｃDNAライブラリーが宿主細胞を形質転換し、又はトランスフェクトするために使用され、そして興味あるｃDNAの発現が前記受容体に対する抗体により検出され得る。類似する技法がまた、ゲノム クローンの単離に適用され得る。
【００６０】
本発明はまた、配列番号３の受容体ポリペプチドに実質的に相同である少なくとも１つのzcytor11受容体サブユニットを含んで成る、単離された可溶性モノマー、ホモダイマー、ヘテロダイマー及びマルチマー受容体ポリペプチドを提供する。“単離された”とは、その生来の環境以外の、例えば血液及び動物組織とは別の状態において見出されるタンパク質又はポリペプチドを意味する。好ましい形においては、単離されたポリペプチドは、他のポリペプチド、特に動物起源の他のポリペプチドを実質的に有さない。高く精製された形、すなわち95％以上の純度、より好ましくは99％以上の純度の形で、ポリペプチドを供給することが好ましい。用語“実質的に同一である”とは、配列番号３に示される配列に対して、50％，好ましくは60％、及びより好ましくは少なくとも80％の配列同一性を有するポリペプチドを示すために本明細書において使用される。
【００６１】
そのようなポリペプチドは、より好ましくは、配列番号３に対して、少なくとも 90％、及び最も好ましくは95％又はそれ以上同一であろう。％配列同一性は、従来の方法により決定される。例えば、Altschulなど., Bull. Math. Bio. 48 : 603−616, 1986及びhenikoff and Henikoff, Pruc.Natl. Acad. Sci. USA 89 :10915−10919, 1992を参照のこと。手短に言及するば、２種のアミノ酸配列が、10のギャップ開始ペナルティー、１のギャップ延長ペナルティー、及び第２表（アミノ酸は標準の１文字コードにより示される）に示されるようなHenikoff and Henikoff （前記）の“blosum 62”評点マトリックスを用いて、その整合評点を最適化するために整合される。次に、％同一性が次のようにして計算される：
【００６２】
【数１】
Figure 0005015404
【００６３】
【表１】
Figure 0005015404
【００６４】
ポリヌクレオチド分子の配列同一性は、上記に開示されるような割合を用いて、類似する方法により決定される。
当業者は、２種のアミノ酸配列を整列するために多くの確立されたアルゴリズムが存在することを理解している。Pearson and Lipmanの“FASTA”類似性調査アルゴリズムは、本明細書に開示されるアミノ酸配列及び推定上の変異体zcytor11のアミノ酸配列により共有される同一性のレベルを試験するための適切なタンパク質整列方法である。前記FASTAアルゴリズムは、Pearson and Lipman, Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988), 及びPearson, Meth. Enzymol. 183: 63 (1990) により記載される。
【００６５】
手短には、FASTAがまず、問題の配列（例えば、配列番号３）及び保存性アミノ酸置換、挿入又は欠失を考慮しないで、最高密度の同一性（ktup変数が１である場合）又は対の同一性（ktup＝2である場合）のいずれかを有する試験配列により共有される領域を同定することによって配列を特徴づける。次に、最高密度の同一性を有する10の領域が、アミノ酸置換マトリックスを用いて、すべての対合されたアミノ酸の類似性を比較することによって再評価され、そして前記領域の末端が、最高の評点に寄与するそれらの残基のみを含むよう“整えられる”。
【００６６】
“カットオフ”値（配列の長さ及びktup値に基づいて予定された式により計算される）よりも高い評点を有するいくつかの領域が存在する場合、その整えられた初期領域が、その領域がギャップとのおおよその一列配列を形成するために結合され得るかどうかを決定するために試験される。最終的に、２種のアミノ酸配列の最高評点領域が、アミノ酸挿入及び欠失を可能にする、Needleman-Wunsch アルゴリズム（Needleman and winsch, J. Mol. Biol. 48: 444, 1970; Sellers, SIAM J. Appl. Math. 26: 787, 1974）の変法を用いて整列される。FASTA 分析のための例示的なパラメーターは次のものである：ktup＝１、ギャップ開始ペナルティー＝10、ギャップ拡張ペナルティー＝１及び置換マトリックス＝BLOSUM62。それらのパラメーターは、Appendix 2 of Pearson, Meth. Enzymol., (前記)に説明されるように、評点マトリックスを調節することによってFASTAプログラム中に導入され得る。
【００６７】
FASTAはまた、上記に開示されるような割合を用いて、核酸分子の配列同一性を決定するためにも使用され得る。ヌクレオチド配列比較のためには、ktup値は、誤りとして設定される他のFASTAパラメーターを伴って、１〜６、好ましくは３〜６、最も好ましくは３であり得る。
【００６８】
BLOSUM62表（第２表）は、関連するタンパク質の500以上のグループの高く保存された領域を表す、タンパク質配列セグメントの約2,000の局部の複数整列に由来するアミノ酸置換マトリックスである［Henikoff and Henikoff, Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 89: 10915 (1992) ］。従って、BLOSUM62置換頻度は、本発明のアミノ酸配列中に導入され得る保存性アミノ酸置換を定義するために使用され得る。化学的性質に基づいてのみアミノ酸置換を企画することが可能であるが（上記のように）、用語“保存性アミノ酸置換”とは、−１よりも大きなBLOSUM62値により表される置換を言及する。例えば、アミノ酸置換は、その置換が０，１，２又は３のBLOSUM62値により特徴づけられる場合、保存性である。このシステムによれば、好ましい保存性アミノ酸置換は、少なくとも１（例えば、１，２又は３）のBLOSUM62値により特徴づけられ、ところがより好ましくは保存性置換は、少なくとも２（例えば、２又は３）のBLOSUM62値により特徴づけられる。
【００６９】
実質的に相同のタンパク質及びポリペプチドは、１又は複数のアミノ酸置換、欠失又は付加を有するものとして特徴づけられる。それらの変化は、好ましくは、保存性アミノ酸置換（第３表を参照のこと）及びタンパク質又はポリペプチドの折りたたみ又は活性に実質的に影響を及ぼさない他の置換；小さな欠失、典型的には１〜約３０個のアミノ酸の欠失；及び小さなアミノ−又はカルボキシル−末端の延長、例えばアミノ−末端メチオニン残基、約20〜25個までの残基の小さなリンカーペプチドの延長、又は精製を促進する小さな延長（親和性標識）、例えばポリ−ヒスチジン系、すなわちプロテインA (Nilsson など., EMBO J. 4: 1075, 1985; Nilsson など., Methods Enzymol. 198: 3, 1991), グルタチオンＳ トランスフェラーゼ（Smits and Johnson, Gene 67; 31, 1988）、又は 他の抗原性エピトープ又は結合ドメインを包含する。一般的に、Ford など., Protein Expression and Purification 2:95-107, 1991を参照のこと。DNAコードの親和性標識は、商品供給者（例えばPharmacia Biotech, Piscataway, NJ）から入手できる。
【００７０】
【表２】
Figure 0005015404
【００７１】
本発明の受容体ポリペプチドにおける必須アミノ酸は、当業界において知られている方法、例えば特定部位の突然変異誘発又はアラニン−走査突然変異誘発により同定され得る（Cunningham and Wells, Science 244: 1081−1085, 1989; Bassなど., Proc. Natl. Scad. Sci. USA 88: 4498−502, 1991）。後者の技法においては、単一のアラニン突然変異が分子中のあらゆる残基で導入され、そして得られる変異体分子が、前記分子の活性に対して決定的であるアミノ酸残基を同定するために、生物学的活性（例えば、リガンド結合及びシグナルトランスダクション）について試験される。
【００７２】
リガンド−受容体相互作用の部位はまた、核磁気共鳴、結晶学、又は光親和性ラベリングのような技法により決定されるように、結晶構造の分析により決定され得る。例えば、de Vos など.,Science 255: 306−312, 1992; Smith など., J. Mol. Biol. 224: 899−904, 1992; Wlodaver など., FEBS Lett. 309: 59−64, 1992を参照のこと。必須アミノ酸の同一性は、関連する受容体との相同性の分析からも推定され得る。
【００７３】
複数アミノ酸置換は、突然変異誘発及びスクリーニングの既知方法、例えばReidhaar−Olson and Sauer （science 241: 53−57, 1988）又はBowie and Sauer（ Proc. Natl. Acad. Sci. USA86:2152−2156,1989 ）により開示される方法を用いて行われ、そして試験される。
【００７４】
手短に言及すれば、それらの著者は、ポリペプチドにおける複数の位置を同時ランダム化し、機能的ポリペプチドをスクリーンし、そして次に個々の位置での可能な置換の範囲を決定するために、突然変異誘発されたポリペプチドを配列決定するための方法を開示する。使用され得る他の方法は、ファージ表示（例えば、Lowman など., Biochem. 30 : 10832−10837,1991; Ladner など., アメリカ特許第5,223,409号; Huse, WIPO公開WO 92／06204号）、及び領域−指図された突然変異誘発（Derbyshire など., Gene 46 : 145, 1986; Ner など., DNA 7 : 127, 1988 ）を包含する。
【００７５】
本明細書に開示されるような突然変異誘発方法は、宿主細胞におけるクローン化された突然変異誘発された受容体の活性を検出するために高処理量のスクリーニング方法と組み合わされ得る。これに関する好ましいアッセイは、下記に記載される、細胞増殖アッセイ及びバイオセンサーに基づくリガンド−結合アッセイを包含する。活性受容体又はその一部（例えば、リガンド−結合フラグメント）をコードする突然変異誘発されたDNA分子が、宿主細胞から回収され、そしてすぐに、近代的装置を用いて配列され得る。それらの方法は、興味あるポリペプチドにおける個々のアミノ酸残基の重要性の急速な決定を可能にし、そして未知の構造のポリペプチドに適用され得る。
【００７６】
上記に論じられる方法を用いて、当業者は、配列番号３又はその対立遺伝子変異体に対して実質的に相同である可溶性受容体サブユニットを含んで成り、そして野生型受容体のリガンド−結合性質を保持する種々のポリペプチドを調製することができる。そのようなポリペプチドは、zcytor11受容体の細胞外リガンド結合ドメイン、又はトランスメンブラン及び細胞内ドメインの一部又はすべてからの追加のアミノ酸を包含することができる。そのようなポリペプチドはまた、上記に一般的に開示されるような追加のポリペプチドセグメントを包含することができる。
【００７７】
本発明の受容体ポリペプチド、例えば可溶性ホモダイマー、ヘテロダイマー及びマルチマー受容体、十分な長さの受容体、受容体フラグメント（例えば、リガンド−結合フラグメント）、及び融合ポリペプチドは、従来の技法に従って、遺伝的に構築された宿主細胞において生成され得る。適切な宿主細胞は、外因性DNAにより形質転換又はトランスフェクトされ得、そして培養において増殖され得るそれらの細胞型であり、そして細菌、菌類細胞、及び培養された高等真核細胞を包含する。真核細胞、特に多細胞生物の培養された細胞が好ましい。クローン化されたDNA分子を操作し、そして種々の宿主細胞中に外因性DNAを導入するための技法は次の文献に開示される：Sambrool など., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, 及びAusubel など., eds., 前記（それらの文献は引用により本明細書に組み込まれる）。
【００７８】
一般的に、zcytor11可溶性受容体ポリペプチドをコードするDNA配列、又はヘテロダイマー又はマルチマーzcytor11可溶性受容体、例えばCRF2-4又はIL10Rポリペプチドの追加のサブユニットをコードするDNA配列は、その発現のために必要とされる他の遺伝子的要素、例えば一般的に、発現ベクター内の転写プロモーター及びターミネーターに作用可能に連結される。ベクターはまた、通常、１又は複数の選択マーカー及び１又は複数の複製の起点を含むであろうが、しかし当業者は、一定のシステム内で、選択マーカーが別のベクター上に供給され得、そして外因性DNAの複製が宿主細胞ゲノム中への組み込みにより供給され得ることを認識するであろう。
【００７９】
プロモーター、ターミネーター、選択マーカー、ベクター及び要素の選択は、当業者のレベルの範囲内の通常のことである。多くのそのような要素は文献に記載されており、そして商業的供給者を通して入手できる。可溶性受容体複合体の複数成分が、個々の発現ベクター上に同時トランスフェクトされ得、又は単一の発現ベクターに包含され得る。タンパク質複合体の複数成分を発現するそのような技法は、当業界において良く知られている。
【００８０】
ホモダイマー、ヘテロダイマー及びマルチマーzcytor11受容体ポリペプチドを、宿主細胞の分泌路中に方向づけるためには、分泌シグナル配列（又は、シグナル配列、リーダー配列、プレプロ配列又はプレ配列としても知られている）が、発現ベクターに供給される。分泌シグナル配列は、受容体の配列であり得、又はもう１つの分泌されたタンパク質（例えばt−PA ）に由来し、又は新たに合成され得る。分泌シグナル配列は、zcytor11 DNA配列に正しく読み取り枠を整合して、作用可能に連結さる。分泌シグナル配列は通常、興味あるポリペプチドをコードするDNA配列の5’ 側に位置するが、但し一定の分泌シグナル配列は、興味あるDNA配列の他の場所に位置することもできる（例えば、Welchなど.,アメリカ特許第5,037,743号；Hollandなど., アメリカ特許第5,143,830号を参照のこと）。
【００８１】
培養された哺乳類細胞または、本発明内の適切な宿主である。外因性DNAを 、哺乳類宿主細胞中に導入するための方法は、リン酸カルシュウム−仲介トランスフェクション（Wiglerなど., Cell 14 : 725, 1978; Corsaro and Pearson, Somatic Cell Genetics 7 :603, 1981; Graham など., Virology 52; 456, 1973）,エレクトロポレーション( Neumann など., EMBO J. 1: 841−845, 1982 ); DEAE−デキストラン仲介トランスフェクション（Ausubel など.,eds., Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley and Sons, Inc., NY, 1987)）、及びリポソーム−仲介トランスフェクション（Hawley −Nelson など., Focus 15: 73, 1993; Ciccarone など.,Focus 15: 80, 1993 ）を包含する（それらの文献は引用により本明細書に組み込まれる）。
【００８２】
培養された哺乳類細胞における組換えポリペプチドの生成は、例えばlevinson など., アメリカ特許第4,713,339 号; Hagen など., アメリカ特許第4,784,950 号; Palmiter など., アメリカ特許第 4,579,821 号; 及びRingold, アメリカ特許第 4,656,134 号により開示される。培養された適切な哺乳類細胞は、COS−1（ATCC No. CRL 165）、COS−7（ATCC No. CRL 1651）、BHK（ATCC No. CRL 1632）、BHK 570 （ATCC No. CRL 10314 ）、293（ATCC No. CRL 1573 ; Graham など., J. Gen. Viro. 36: 59−72, 1977 ）、及びチャイニーズ ハムスター卵巣(例えば CHO−K1; ATCC No. CCL61 )細胞系を包含する。
【００８３】
追加の適切な細胞系は当業界において知られており、そして公的な寄託所、例えば American Type Culture Collection,Manassas,VAから入手できる。一般的に、強い転写プロモーター、例えばSV−40 又はサイトメガロウィルスからのプロモーターが好ましい。例えば、アメリカ特許第4,956,288 号を参照のこと。他の適切なプロモーターは、メタロチオネイン遺伝子からのプロモーター（アメリカ特許 4,579,821 号及び第 4,601,978 号）、アデノウィルス主要後期プロモーターを包含する。
【００８４】
薬物選択は一般的に、外来性DNAが挿入されている、培養された哺乳類細胞を選択するために使用される。そのような細胞は通常、“トランスフェクタント”として言及される。選択剤の存在下で培養され、そしてそれらの子孫に興味ある遺伝子を伝達することができる細胞は、“適切なトランスフェクタント”として言及される。好ましい選択マーカーは、抗生物質ネオマイシンに対する耐性をコードする遺伝子である。選択は、ネオマイシン型薬物、例えばG−418又は同様のもの存在下で実施される。
【００８５】
“増幅”として言及される方法である選択システムは、興味ある遺伝子の発現レベルを高めるためにも使用される。増幅は、低レベルの選択剤の存在下でトランスフェクタントを培養し、そして次に、導入された遺伝子の生成物を高レベルで生成する細胞を選択するために選択剤の量を高めることによって実施される。好ましい増幅可能選択マーカーは、メトトレキセートに対する耐性を付与するジヒドロ葉酸レダクターゼである。他の耐薬物性遺伝子(例えば、ヒグロマイシン耐性、複数薬物耐性、ピューロマイシン アセチルトランスフェラーゼ)もまた、使用され得る。
【００８６】
他の高等真核細胞、例えば植物細胞、昆虫細胞、及び鳥類細胞もまた、宿主として使用され得る。昆虫細胞の形質転換、及びそこにおける外来性ポリペプチドの生成は、Guarino など.,アメリカ特許第5,162,222号；Bangなど．，アメリカ特許4,775,624号；及びWIPO公開WO94／06463号により公開される（それらの文献は引用により本明細書に組み込まれる）。植物細胞において遺伝子を発現するためのベクターとしてのアグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes ）の使用は、Sinkarなど.、J. Biosci. ( Bangalore ) 11: 47−58, 1987 により再考されている。
【００８７】
菌類細胞、例えば酵母細胞、及び特に、サッカロミセス属の細胞はまた、例えば受容体フラグメント又はポリペプチド融合体を精製するために、本発明内で使用され得る。外因性DNAにより酵母細胞を形質転換し、そしてそれから組換えポリペプチドを生成するための方法は、例えばKawasaki, アメリカ特許第4,599,311号；Kawasaki など., アメリカ特許第4,931,373号；Brake, アメリカ特許第4,870,008号；Welchなど., アメリカ特許第5,037,743号；及びMurray など., アメリカ特許第4,845,075号により開示される。形質転換された細胞は、選択マーカー、通常、耐薬物性、又は、特定の栄養物（例えばロイシン）の不在下で増殖する能力により決定される表現型により選択される。
【００８８】
酵母への使用のための好ましいベクターシステムは、グルコース含有培地における増殖により形質転換された細胞の選択を可能にする、Kawasaki など. (アメリカ特許第4,931,373号)により開示されるPOT１ベクターシステムである。酵母への使用のための適切なプロモーター及びターミネーターは、解糖酵素遺伝子（例えば、Kawasaki, アメリカ特許第4,599,311号；Kingsmanなど., アメリカ特許第4,615,974号；及びBitter, アメリカ特許第4,977,092 号を参照のこと）及びアルコール デヒドロゲナーゼ遺伝子からのものを包含する。また、アメリカ特許第4,990,446 号；第5,063,154号；第5,139,936 号；及び第4,661,454号を参照のこと。
【００８９】
他の酵素、例えばハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、シゾサッカロミセス・ポンベ（ Schizosaccharomyces pombe ）、クルイベリミセス・ラクチス（ Kluyveromyces lactis ）、クルイベリミセス・フラギリス（Kluyveromyces fragilis ）、ウスチラゴ・マイジス（Ustilago maydis ）、ピチア・パストリス（ Pichia pastoris ）、ピチア・メタノリカ（Pichia methanolica）、ピチア・グイレルモンジ（ Pichia guillermondii ）、及びカンジタ・マルトサ（Candida maltosa ）のための形質転換システムは、当業界において知られている。
【００９０】
例えば、Gleeson など., J. Gen. Microbiol. 132: 3459−3465, 1986 及びCregg, アメリカ特許第4,882,279 号を参照のこと。アスペルギラス細胞は、Mcknight など.,アメリカ特許第4,935,349号の方法に従って使用され得る。アクレモニウム・クリソゲナム（Acremonium chrysogenum）を形質転換するための方法は、Sumino ., アメリカ特許第5,162,228号により開示される。ニューロスポラ（Neurospora）を形質転換するための方法は、Lambowitz, アメリカ特許第4,486,533号により開示される。
【００９１】
形質転換され又はトランスフェクトされた宿主細胞は、選択された宿主細胞の増殖のために必要とされる栄養物及び他の成分を含む培養培地において、従来の方法に従って培養される。種々の適切な培地、例えば定義された培地及び複合培地は、当業界において知られており、そして一般的には、炭素源、窒素源、必須アミノ酸、ビタミン及び鉱物を含む。培地はまた、必要とされる場合、成長因子又は血清のような成分も含むことができる。増殖培地は一般的に、外因的に付加されたDNAを含む細胞を、例えば発現ベクター上に担持される選択マーカーにより補足され、又は宿主細胞中に同時トランスフェクトされる必須栄養物における薬物選択又は栄養欠乏により選択するであろう。
【００９２】
本発明の1つの観点においては、本発明の新規可溶性受容体は、培養された細胞により生成され、そして細胞は、受容体のためのリガンド、例えば天然のリガンド、IL-TIF及び天然のリガンドのアゴニスト及びアンタゴニストについてスクリーンするために使用される。このアプローチを要約すると、受容体をコードするcDNA又は遺伝子がその発現のために必要とされる他の遺伝子要素（例えば、転写プロモーター）と組合され、そしてその得られる発現ベクターが宿主細胞中に挿入される。DNAを発現し、そして機能的受容体を生成する細胞が選択され、そして種々のスクリーニングシステム内に使用される。ホモダイマー、ヘテロダイマー及びマルチマー受容体複合体の個々の成分は、その同じ細胞において発現され得る。
【００９３】
zcytor11受容体を発現し、そして受容体介在性シグナルを形質導入することへの使用のために適切な哺乳類細胞は、zcytor11と共に機能的複合体を形成できる他の受容体サブユニットを発現する細胞を包含する。それらのサブユニットは、インターフェロン受容体又は他のクラスII又はIサイトカイン受容体、例えばCRF2−4、IL−10R及びIL−9Rのそれらのサブユニットを包含する。発現される受容体と同じ種からの細胞を使用することがまた好ましい。好ましい態様においては、細胞は、その増殖のための外因的に供給された造血成長因子に依存する。このタイプの好ましい細胞系は、GM−CSF−依存性ヒト白血病細胞系、及びIL−３依存性ネズミプレ−B細胞系であるBaF3（Palacion and Steinmetz, Cell41: 727-734 (1985)）である、ヒトTF−１細胞系（ATCC No. CRL−2003）及びAML−193細胞系（ATCC No. CRL−9589）である。他の細胞系は、BHK、COS−１及びCHO細胞を包含する。
【００９４】
適切な宿主細胞は、必要な受容体サブユニット、又は所望する細胞応答のために必要とされる他の細胞成分を生成するために構築され得る。このアプローチは、細胞系がいずれかの種からの受容体サブユニットを発現するために構築され得、それにより、種特異性から生じる可能性ある制限を克服するので、好都合である。ヒト受容体cDNAの種オルト体は、同じ種からの細胞系、例えばBaF3細胞系におけるマウスcDNA内にクローン化され、そして使用され得る。従って、１つの造血成長因子、例えばGM−CSF又はIL−３に依存する細胞系が、IL−TIFに依存性に成るよう構築され得る。
【００９５】
機能的受容体を発現する細胞が、スクリーニングアッセイ内に使用される。種々の適切なアッセイは、当業界において良く知られている。それらのアッセイは、標的細胞における生物学的反応の検出に依存する。1つのそのようなアッセイは、細胞増殖アッセイである。細胞は、試験化合物の存在又は不在下で培養され、そして細胞増殖は、例えばトリチウム化されたチミジンの組み込みを測定することにより、又は３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（MTT）（Mosman, J. Immunol. Meth. 65: 55-63, 1983）の代謝性分解に基づく比色分析により検出される。他のアッセイ型は、レポーター遺伝子を発現するよう、さらに構築される細胞を用いる。
【００９６】
レポーター遺伝子は、レポーター−連結経路に応答するプロモーター要素に連結され、そしてアッセイは、レポーター遺伝子の転写の活性化を検出する。これに関しての好ましいプロモーター要素は、血清応答要素、又はSREである（例えば、Shawなど., Cell 563-572, 1989を参照のこと）。好ましいそのようなレポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ遺伝子である（de Wetなど., Mol. Cell. Biol. 7: 1987）。ルシフェラーゼ遺伝子の発現は、当業界において知られている方法を用いて発光により検出される（Baumgartnerなど., J. Biol. Chem. 269: 19094-29101, 1994; Schenborn and Goiffin, Promega Notes 41; 11, 1993）。ルシフェラーゼアッセイキットは、例えばPromega Corp., Madison, WIから市販されている。
【００９７】
この型の標的細胞系は、化学物質、細胞−ならし培養培地、菌類ブイヨン、土壌サンプル、水サンプル及び同様のもののライブラリーをスクリーンするために使用され得る。例えば、細胞−又は組織−ならし培地サンプルのバンクが、リガンドを生成する細胞を同定するために標的細胞に対してアッセイされ得る。次に、陽性細胞が、プールに分けられ、宿主細胞中にトランスフェクトされ、そして発現される、哺乳類細胞発現ベクターにおいてcDNAライブラリーを生成するために使用される。次にトランスフェクトされた細胞からの培地サンプルがアッセイされ、続くプールの分割、トランスフェクション、継代培養、及び陽性細胞の再アッセイが伴ない、リガンドをコードするクローン化されたcDNAが単離され得る。
【００９８】
Zcytor11受容体のための天然のリガンドはまた、十分な長さの受容体を発現する細胞系を突然変異誘発し、そしてそれを、オートクライン増殖について選択する条件下で培養することによって同定され得る。WIPO公開WO95/21930号を参照のこと。典型的な方法においては、zcytor11及び必要な追加のサブユニットを発現するIL-3依存性BaF3細胞が、例えば２−エチルメタンスルホネート（EMS）により突然変異誘発される。次に、細胞が、IL-3の存在下で回収され、次に、IL-3及びIL-4を欠いている培養培地にトランスファーされる。生存細胞が、IL-TIF生成のために、可溶性受容体を、培養培地に添加することにより、又は受容体を発現する野生型BaF3細胞及びBaF3細胞に基づくならし培地をアッセイすることによりスクリーンされる。この方法を用いて、IL-TIFを発現する細胞及び組織が同定され得る。
【００９９】
本発明により提供される追加のスクリーニングアプローチは、ハイブリッド受容体ポリペプチドの使用を包含する。それらのハイブリッドポリペプチドは、２種の一般的なクラスに分けられる。第１のクラスにおいては、配列番号２の残基252〜574を含んで成るzcytor11の細胞内ドメインは、第２受容体のリガンド−結合ドメインに連結される。好ましくは、第２受容体は造血サイトカイン受容体、例えばmpl受容体である（Souyriなど., Cell 63: 1137-1147, 1990）。ハイブリッド受容体はさらに、いずれかの受容体に由来するトランスメンブランドメインを含んで成るであろう。次に、ハイブリッド受容体をコードするDNA構造体が宿主細胞中に挿入される。
【０１００】
ハイブリッド受容体を発現する細胞が、結合ドメインのためのリガンドの存在下で培養され、そして応答についてアッセイされる。このシステムは、容易に入手できるリガンドを用いて、zcytor11により介在されるシグナルトランスダクションを分析するための手段を提供する。このシステムはまた、特定の細胞系が本発明のzcytor11ヘテロダイマー及びマルチマーにより形質導入されたシグナルに応答できるかどうかを決定するためにも使用され得る。第２クラスのハイブリッド受容体ポリペプチドは、第２受容体、好ましくは造血サイトカイン受容体の細胞質ドメイン及びトランスメンブランドメインと共に、zcytor11の細胞外（リガンド結合）ドメイン（配列番号２及び３の残基18〜228）を含んで成る。
【０１０１】
この第２クラスの本発明の受容体のハイブリッドzcytor11ヘテロダイマー及びマルチマーは、第２受容体により形質導入されるシグナルに応答することが知らされている細胞において発現される。それらの２種のハイブリッド受容体は、IL-TIFを検出するためのアッセイの開発のための応答性細胞型の同定を可能にする。さらに、そのような細胞は、競争型アッセイにおいて本発明の可溶性受容体アンタゴニストをアッセイするために、IL−TIFの存在下で使用され得る。そのようなアッセイにおいては、本発明の可溶性受容体の存在下でのIL−TIFの増殖又はシグナルトランスダクション活性の低下が拮抗活性を示す。さらに、IL−TIF−可溶性受容体結合アッセイが、可溶性受容体がIL−TIF活性を拮抗するかどうかを評価するために使用され得る。
【０１０２】
次に、前記リガンドを発現することが見出された細胞が、リガンド−コードのcDNAが上記に開示されるように単離され得るcDNAライブラリーを調製するために使用される。従って、本発明は、新規受容体ポリペプチドの他に、受容体のためのポリペプチドリガンドをクローニングするための方法を提供する。
【０１０３】
zcytor11発現の組織特異性は、膵臓、小腸、結腸及び胸腺の成長において役割を演じることができる。この受容体に関して観察される組織特異性の観点から、アゴニスト（天然のリガンドを包含する）及びアンタゴニストは、インビトロ及びインビボ用途において莫大な可能性を有する。受容体アゴニストに同定される化合物は、インビトロ及びインビボで、標的細胞の増殖及び進化を刺激するために有用である。
【０１０４】
例えば、アゴニスト化合物は、定義された細胞培養培地の成分として有用であり、そして細胞培養において通常使用される血清を置換するために、単独で又は他のサイトカイン及びホルモンと組合して使用され得る。アゴニスト又はアンタゴニストは、培養における膵臓、胃腸又は胸腺由来の細胞の増殖及び/又は進化を特異的に調節することにおいて有用である。それらの化合物は、リガンド−受容体相互作用の部位を特徴づけるための調査用試薬として有用である。インビボで、受容体アゴニスト又はアンタゴニストは、膵臓、胃腸又は胸腺疾患の処理に使用される。
【０１０５】
zcytor11に対するアゴニスト又はアンタゴニストは、小ファミリーのペプチドを包含することができる。それらのペプチドは、当業界において知られている親和性選択条件を用いて、ペプチドライブラリーに存在する候補体の集団から同定され得る。ペプチドライブラリーは、固体支持体上で化学的に合成され、そして提供される結合ライブラリーを包含し（Lamなど., Nature 354: 82-84 (1991)）、又は溶液において存在し（Houghtenなど., Biotechniques 13: 412-421 (1992)）、発現され、次にプラスミドDNAに連結され（Cullなど., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1865-1869 (1992)）、又はウィルス又は細胞の表面上で発現され、そして続いて表示される（Boder and Wittrup, Nature Biotechnology 15: 553-557 (1997); Cwirla など., Science 276: 1695-1699 (1997)）。
【０１０６】
zcytor11ホモダイマー、ヘテロダイマー/及びマルチマーはまた、循環レベルのIL−TIFリガンドの検出のために診断システム内で使用され得る。関連する態様においては、本発明のzcytor11可溶性受容体に対して特異的に結合する抗体又は他の剤が循環受容体ポリペプチドを検出するために使用され得る。高められた又は低められたレベルのリガンド又は受容体ポリペプチドが、病理学的状態、例えば癌の表示であり得る。
【０１０７】
zcytor11ホモダイマー、ヘテロダイマー及びマルチマー受容体ポリペプチドは、細胞外ドメインをコードする切断されたDNA、例えば配列番号３又はヒト受容体のその対応する領域を含むポリペプチドを発現することによって調製され得る。好ましくは、細胞外ドメインポリペプチドは、トランスメンブラン及び細胞内ポリペプチドセグメントを実質的に有さない形で調製される。例えば、受容体ポリペプチドのC−末端は、配列番号２の残基228、又は対立遺伝子変異体又は非ヒト受容体のその対応する領域に存在することができる。
【０１０８】
宿主細胞からの受容体ドメインの輸送を方向づけるために、受容体DNAが、分泌シグナル、例えばｔ−PA分泌ペプチドをコードする第２DNAセグメントに連結される。分泌された受容体ドメインの精製を促進するために、C−末端延長、ポリ−ヒスチジン標識、物質P、FlagTM ペプチド（Hoppなど., Biotechnology 6: 1204-1210 (1988)；Eastman Kodak Co., New Haven, CTから入手できる）、又は抗体又は他の特異的結合剤が利用できるもう１つのポリペプチド又はタンパク質が、受容体ポリペプチドに融合され得る。さらに、ヘテロダイマー及びマルチマー非−zcytor11サブユニット細胞外サイトカイン結合ドメインがまた、上記のようにして調製される。
【０１０９】
もう1つのアプローチにおいては、zcytor11又は他のクラスI又はIIサイトカイン受容体成分の受容体細胞外ドメインは、２種の不変領域ドメイン及びヒンジ領域を含み、そして可変領域を欠いている、免疫グロブリンH鎖不変領域、典型的には、Fcフラグメントとの融合体として発現され得る（Sledziewski， AZなど., アメリカ特許第6,018,026号及び第5,750,375号を参照のこと）。本発明の可溶性zcytor11/CRF2-4ヘテロダイマー及びマルチマーはそのような融合体を包含する。そのような融合体は典型的には、マルチマー分子として分泌され、ここでFc部分はお互いジスルフィド結合され、そして２種の受容体ポリペプチドがお互い密接に接近して整列されている。
【０１１０】
このタイプの融合体は、溶液から同種リガンドを親和性精製するために、インビトロアッセイ手段として、リガンドを特異的に滴定することによってインビボでシグナルを阻止するために、及び循環リガンドを結合し、そしてそれを循環から洗浄するために、それらを非経口投与することによってインビボでのアンタゴニストとして使用され得る。リガンドを精製するためには、zcytor11−Igキメラが、リガンドを含むサンプル（例えば、細胞−ならし培地又は組織抽出物）に、受容体−リガンド結合を促進する条件（典型的には、生理学的に近い温度、pH及びイオン強度）下で添加される。次に、キメラ−リガンド複合体が、固体支持体（例えば、不溶性樹脂ビーズ）上に固定されているタンパク質Aを用いて、混合物により分離される。
【０１１１】
次に、リガンドは、従来の化学的技法、例えば塩又はpHグラジエントを用いて溶出される。他方では、キメラ自体は、固体支持体に結合され、そして結合及び溶出は上記のようにして行われる。キメラは、胃腸、膵臓又は胸腺機能を調節するためにインビボで使用され得る。高い結合親和性を有するキメラは、非経口に投与される（例えば、筋肉内、皮下又は静脈内注射により）。循環分子は、リガンドを結合し、そして通常の生理学的工程により循環からクリアランスされる。アッセイに使用のためには、キメラは、Fc領域を通して支持体に結合され、そしてELISA型に使用される。
【０１１２】
本発明はさらに、種々の他のポリペプチド融合体、及び１又は複数のポリペプチド融合体を含んで成る関連するマルチマータンパク質を提供する。例えば、可溶性zcytor11受容体又は可溶性zcytor11ヘテロダイマーポリペプチド、例えば可溶性zcytor11/CRF2-4は、アメリカ特許第5,155,027号及び第5,567,584号に開示されるようなダイマータンパク質への融合として調製され得る。それに関しての好ましいダイマータンパク質は、免疫グロブリン不変領域ドメイン、例えばIgGγ1、及びヒトκL鎖を包含する。免疫グロブリン−可溶性zcytor11受容体又は免疫グロブリン−可溶性zcytor11ヘテロダイマーポリペプチド、例えば免疫グロブリン−可溶性zcytor11/ CRF2-4融合体は、種々のマルチマーzcytor11受容体類似体を生成するために、遺伝子的に構築された細胞において発現され得る。
【０１１３】
補助ドメインは、特定の細胞、組織又は高分子（例えば、コラーゲン、又はIL-TIFを発現する細胞）に対してそれらを標的化するために可溶性zcytor11受容体又は可溶性zcytor11ヘテロダイマーポリペプチド、例えば可溶性zcytor11/CRF2-4に融合され得る。zcytor11ポリペプチドは、複数の成分、例えば精製のための親和性標識及び標的化ドメインに融合され得る。ポリペプチド融合はまた、特にドメイン間に、１又は複数の切断部位を含むことができる。Tuanなど., Connective Tissue Research 34: 1-9, 1996を参照のこと。
【０１１４】
リガンド−結合受容体フラグメントを用いる好ましいアッセイシステムは、市販のバイオセンサー装置（例えば、BIAcore, Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ）を使用し、ここで受容体フラグメントが、受容体チップの表面上に固定される。この装置の使用は、Karlsson, J. Immunol. Methods 145: 229−40, 1991 及びCunningham and Wells, J. Mol.Biol. 234: 554−63,1993により開示される。受容体フラグメントは、アミン又はスルフヒドリル化学を用いて、流動細胞内の金フィルムに結合されるデキストラン繊維に共有結合される。試験サンプルが細胞に通される。リガンドがサンプルに存在する場合、それは、固定された受容体ポリペプチドに結合し、金フィルムの表面のプラズモン共鳴の変化として検出される、媒体の屈折率の変化を引き起こす。このシステムは、オン−及びオフ−速度の決定を可能にし、これから、結合親和性が計算され、そして結合の化学量の評価が可能にされる。
【０１１５】
リガンド−結合受容体ポリペプチドはまた当業界において知られている他のアッセイシステム内でも使用され得る。そのようなシステムは、結合親和性の決定のためのスカチャード分析（Scatchard, Ann. NY. Acad. Sci. 51:660−72, 1949）及び熱量測定アッセイ（Cunningham など., Science 253: 545−48, 1991;Cunningham など., Science 245: 821−25, 1991）を包含する。
【０１１６】
受容体リガンド−結合ポリペプチドはまた、IL-TIFリガンドの精製のためにも使用される。前記受容体ポリペプチドは、固体支持体、例えばアガロース、架橋されたアガロース、ガラス、セルロース樹脂、シリカ基材の樹脂、ポリスチレン、架橋されたポリアクリルアミド又は使用の条件下で安定している同様の材料のビーズ上に固定される。固体支持体にポリペプチドを結合するための方法は、当業界において知られており、そしてアミン化学、臭化シアノゲン活性化、N−ヒドロキシスクシンイミド活性化、エポキシド活性化、スルフヒドリル活性化及びヒドラジド活性化を包含する。得られる媒体は一般的に、カラムの形で形状化され、そしてリガンドを含む流体が、受容体ポリペプチドへのリガンドの結合を可能にするために、カラムに１又は複数回、通される。次に、リガンドが、塩濃度の変化、又はリガンド−受容体結合を破壊するpHを用いて溶出される。
【０１１７】
さらに、可溶性zcytor11受容体又は可溶性zcytor11ヘテロダイマー受容体ポリペプチド、例えば可溶性zcytor11/CRF2-4は、リガンドの存在が所望されない治療又は他の用途において、インビボ又はインビトロでリガンドを結合するために、“リガンドシンク（ligand sink）”、すなわちアンタゴニストとして使用され得る。
【０１１８】
例えば、多量の生物活性IL−TIFを発現する癌においては、可溶性zcytor11受容体又は可溶性zcytor11ヘテロダイマー受容体ポリペプチド、例えば可溶性zcytor11/CRF2-4は、インビボで、リガンドの直接的なアンタゴニストとして使用され得、そして疾病に関連する進行及び病状の低下を助けることができ、そして進行及び徴候を低め、そして再発を妨げることにおいて治療の効果を増強するために、他の療法（例えば、化学療法）と組合して使用され得る。さらに、可溶性zcytor11受容体又は可溶性zcytor11ヘテロダイマー受容体ポリペプチド、例えば可溶性zcytor11/CRF2-4は、zcytor11受容体を過剰発現する癌の進行を、それらの癌の増殖を増強するリガンドをインビボで結合することによって遅延するために使用され得る。
【０１１９】
さらに、可溶性zcytor11受容体又は可溶性zcytor11ヘテロダイマー受容体ポリペプチド、例えば可溶性zcytor11/CRF2-4は、インビボで、又は組織サンプルにおいて、IL−TIF−発現性癌を検出するために、インビボで又は診断用途において使用され得る。例えば、可溶性zcytor11受容体又は可溶性zcytor11ヘテロダイマー受容体ポリペプチド、例えば可溶性zcytor11/CRF2-4は、本明細書に記載されるような放射性ラベル又は蛍光ラベルに接合され得、そしてインビトロリガンド−受容体型結合アッセイ又は蛍光イメージングアッセイを用いて、組織サンプルにおけるIL−TIFの存在を検出するために使用され得る。さらに、放射性ラベルされた可溶性zcytor11受容体又は可溶性zcytor11ヘテロダイマー受容体ポリペプチド、例えば可溶性zcytor11/CRF2-4は、当業界において知られている放射性−イメージングを通して、リガンド発現性固形腫瘍を検出するために、インビボで投与され得る。
【０１２０】
可溶性zcytor11受容体又は可溶性zcytor11ヘテロダイマーポリペプチド、例えば可溶性zcytor11/CRF2-4ポリペプチドはまた、抗原内に含まれるエピトープ、ペプチド又はポリペプチドに結合する抗体を調製するために使用される。zcytor11ポリペプチド又はそのフラグメントは、動物を接種し、そして免疫応答を誘発するために抗原（免疫原）として作用する。当業者は、抗原又は免疫原性エピトープが、長いポリペプチド内の一連のアミノ酸、約10個のアミノ酸〜ポリペプチドのほぼ完全な長さのアミノ酸、又はポリペプチドに依存してより長いアミン酸から成ることを認識するであろう。適切な抗原は、配列番号３によりコードされるzcytor11ポリペプチド、又は連続した９〜211個のAAのそのアミノ酸フラグメントを包含する。
【０１２１】
抗原として使用するための好ましいペプチドは、本明細書に開示されるサイトカイン結合ドメイン、zcytor11親水性ペプチオド、例えば隠されたG, S及びT残基及び暴露されたH, Y及びW残基の無視を伴なって、スライドする６個の残基の窓に基づいてのHopp/Woods親水性プロフィールから、又はDNA★STARプログラムを用いての配列番号３のJameson−Wolfプロットから決定される、親水性プロットから当業者により推定されるそれらのペプチドである。さらに、保存されるモチーフ、及びzcytor11可溶性受容体の保存されるモチーフ間の可変領域が適切な抗原である。適切な抗原はまた、もう１つのクラスI又はIIサイトカイン細胞外ドメイン、例えば可溶性zcytor11ヘテロダイマーポリペプチド、例えば可溶性zcytor11/CRF2-4からのそれらのドメインと組合して、上記に開示されるzcytor11ポリペプチドを包含する。
【０１２２】
さらに、マウス可溶性zcytor11受容体ポリペプチド（配列番号３）の対応する領域が、可溶性マウスzcytor11受容体に対する抗体を生成するために使用され得る。さらに、この免疫応答から生成される抗体は、本明細書に記載のようにして単離され、そして精製され得る。ポリクローナル及びモノクローナル抗体を調製し、そして単離するための方法は、当業界において良く知られている。例えば、Current Protocols in Immunology, Cooligan, など., (eds.), National Institutes of Health, John Wiley and Sons, Inc., 1995; Sambrook など., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, NY, 1989; 及びHurrell, J.G.R., Ed., Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications, CRC Press, Inc., Boca Raton, FL, 1982 を参照のこと。
【０１２３】
当業者に明らかなように、ポリクローナル抗体は、種々の温血動物、例えば馬、ウシ、ヤギ、羊、犬、鶏、ウサギ、マウス、及びラットを、可溶性zcytor11受容体又は可溶性zcytor11ヘテロダイマーポリペプチド、例えばその可溶性zcytor11/CRF2-4ポリペプチド又はフラグメントにより接種することにより生成され得る。Zcytor11ポリペプチドの免疫性は、アジュバント、例えばミヨウバン（水酸化アルミニュウム）又はフロイント完全又は不完全アジュバントの使用により高められ得る。
【０１２４】
免疫化のために有用なポリペプチドはまた、免疫グロブリン ポリペプチド又はマルトース結合タンパク質との融合体ポリペプチド、例えばzcytor11又はその一部の融合体を包含する。ポリペプチド免疫原は、十分な長さの分子又はその一部であり得る。ポリペプチド部分が“ハプテン−様”である場合、そのような部分は、免疫化のために、高分子キャリヤー（例えば、カサガイヘモシアニン（KLH）、ウシ血清アルブミン（BSA）又は破傷風トキソイド）に都合良く連結又は結合され得る。
【０１２５】
本明細書で使用される場合、用語“抗体”とは、ポリクローナル抗体、親和性精製されたポリクローナル抗体、モノクローナル抗体及び抗原結合フラグメント、例えばF(ab’)2及びFabタンパク質分解性フラグメントを包含する。遺伝子的に構築された損なわれていない抗体又はフラグメント、例えばキメラ抗体、Fvフラグメント、一本鎖抗体及び同様のもの、並びに合成抗原結合ペプチド及びポリペプチドもまた包含される。
【０１２６】
非ヒト抗体は、ヒト骨格及び不変領域上に非ヒトCDRのみを移植することによって、又は完全な非ヒト可変ドメインを組み込むことによって（任意には、暴露された残基の置換によってヒト−様表面によりそれらのドメインを“おおう（cloaking）”ことによって；ここで結果物は“張り合わされた”抗体である）、ヒト適合され得る。多くの場合、ヒト適合された抗体は、正しい結合特性を増強するために、ヒト可変領域骨格ドメイン内に非ヒト残基を保持することができる。ヒト適合化抗体を通して、生物学的半減期が高められ、そしてヒトへの投与に基づく有害な免疫反応の可能性が低められる。
【０１２７】
抗体は、１）それらが限界レベルの結合活性を示す場合、及び２）それらが関連するポリペプチド分子と有意に交差反応しない場合、特異的に結合すると考えられる。限界レベルの結合は、本明細書における抗−可溶性zcytor11受容体又は抗−可溶性zcytor11ヘテロダイマーポリペプチド、例えば抗−可溶性zcytor11/CRF2-4抗体が対照（非−可溶性zcytor11受容体又は可溶性zcytor11ヘテロダイマーポリペプチド、例えば可溶性zcytor11/CRF2-4）ポリペプチドへの結合親和性よりも少なくとも10倍高い親和性を伴って、可溶性zcytor11受容体又は可溶性zcytor11ヘテロダイマーポリペプチド、例えば可溶性zcytor11/CRF2-4ポリペプチド、ペプチド又はエピトープに結合するかどうか決定される。好ましくは、抗体は、106M-1又はそれ以上、好ましくは107M-1又はそれ以上、より好ましくは108M-1又はそれ以上、及び最も好ましくは109M-1又はそれ以上の結合親和性（Ka）を示す。抗体の結合親和性は、例えばScatchard 分析（Scatchard, G., Ann. NY Acad. Sci. 51: 660-672, 1949）を用いて、当業者によって容易に決定され得る。
【０１２８】
抗−可溶性zcytor11受容体又は抗−可溶性zcytor11ヘテロダイマーポリペプチド、例えば抗−可溶性zcytor11/CRF2-4抗体は関連するポリペプチド分子と有意に交差反応しないかどうかは、例えば、標準のウェスターンブロット分析を用いて、可溶性zcytor11受容体又は可溶性zcytor11ヘテロダイマーポリペプチド、例えば可溶性zcytor11/CRF2-4ポリペプチドであるが、しかし知られていない関連するポリペプチドを検出する抗体により示される（Ausubel など., 前記）。既知の関連するポリペプチドの例は、従来技術に開示されているそれらのもの、例えば既知のオルト体及びパラ体、及びタンパク質ファミリーの類似する既知メンバーである。
【０１２９】
スクリーニングはまた、非ヒト可溶性zcytor11受容体又は可溶性zcytor11ヘテロダイマーポリペプチド、例えば可溶性zcytor11/CRF2-4及び可溶性zcytor11受容体又は可溶性zcytor11ヘテロダイマーポリペプチド、例えば可溶性zcytor11/CRF2-4ポチペプチドを用いて行われ得る。さらに、抗体は、可溶性zcytor11受容体又は可溶性zcytor11ヘテロダイマーポリペプチド、例えば可溶性zcytor11/CRF2-4ポリペプチドに対して特異的に結合する集団を単離するために、既知の関連するポリペプチドに“対してスクリーンされ得る”。例えば、可溶性zcytor11受容体又は可溶性zcytor11ヘテロダイマーポリペプチド、例えば可溶性zcytor11/CRF2-4に対して生ぜしめられた抗体は不溶性マトリックスに付着される関連するポリペプチドに吸着され；可溶性zcytor11受容体又は可溶性zcytor11ヘテロダイマーポリペプチド、例えば可溶性zcytor11/CRF2-4に対して特異的な抗体は適切な緩衝液条件下で前記マトリックスを通して流れるであろう。
【０１３０】
スクリーニングは、既知の溶接に関連するポリペプチドに対して交差反応しないポリクローナル及びモノクローナル抗体の単離を可能にする（Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988; Current Protocols in Immunology, Cooligan, など. (eds.), National Institutes of Health, John Wiley and Sons, Inc., 1995）。特異的抗体のスクリーニング及び単離は当業界において当業界において良く知られている。
【０１３１】
Fundamental Immunology, Paul (eds.), Raven Press, 1993; Getzoffなど., Adv.in Immunol. 43: 1-98, 1988; Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Goding, J.W. (eds.), Academic Press Ltd., 1996; Benjamin など., Ann. Rev. Immunol. 2: 67-101, 1984を参照のこと。特異的に結合する抗−zcytor17抗体は、当業界において知られており、そして下記に開示される多くの方法により検出され得る。
【０１３２】
当業者に知られている種々のアッセイが可溶性zcytor11受容体又は可溶性zcytor11ヘテロダイマーポリペプチド、例えば可溶性zcytor11/CRF2-4タンパク質又はペプチドに特異的に結合する抗体を検出するために使用され得る。典型的なアッセイは、Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and lane (Eds.), Cold Speing Harbor Laboratory Press, 1988 に詳細に記載されている。そのようなアッセイの代表的な例は次のものを包含する:同時免疫電気泳動、ラジオイムノアッセイ、ラジオイムノ沈殿、酵素結合の免疫吸着アッセイ（ELISA）、ドットブロット又はウェスターンブロットアッセイ、阻害又は競争アッセイ、及びサンドイッチアッセイ。さらに、野生型対変異体の可溶性zcytor11受容体又は可溶性zcytor11ヘテロダイマーポリペプチド、例えば可溶性zcytor11/CRF2-4タンパク質又はペプチドに結合する抗体がスクリーンされ得る。
【０１３３】
本明細書において有用な抗体を生成するか又は選択するための他の技法は、インビトロで、可溶性zcytor11受容体又は可溶性zcytor11ヘテロダイマーポリペプチド、例えば可溶性zcytor11/CRF2-4タンパク質又はペプチドにリンパ球を暴露し、そしてファージ又は類似するベクターにおける抗体表示ライブラリーを選択すること（例えば、固定された又はラベルされた可溶性zcytor11受容体又は可溶性zcytor11ヘテロダイマーポリペプチド、例えば可溶性zcytor11/CRF2-4タンパク質又はペプチドの作用を通して）を包含する。
【０１３４】
可溶性zcytor11受容体又は可溶性zcytor11ヘテロダイマーポリペプチド、例えば可溶性zcytor11/CRF2-4ポリペプチドのための可能性ある結合ドメインを有するポリペプチドをコードする遺伝子は、ファージ（ファージ表示）又は細菌、例えばＥ．コリ上に表示されるランダムペプチドライブラリーをスクリーニングすることによって得られる。前記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、多くの手段、例えばランダム突然変異誘発及びランダムポリヌクレオチド合成を通して得られる。
【０１３５】
それらのランダムペプチド表示ライブラリーは、タンパク質又はポリペプチドであり得る既知の標的物、例えばリガンド又は受容体、生物学的又は合成高分子、又は有機又は無機物質と相互作用するペプチドについてスクリーンするために使用され得る。そのようなランダム ペプチド表示ライブラリーを創造し、そしてスクリーニングするための技法は、当業界において知られており（Ladner など., アメリカ特許第5,223,409 号; Ladner など., アメリカ特許第4,946,778 号； Ladner など., アメリカ特許第5,403,484 号及びLadner など., アメリカ特許第5,571,698 号、及びKayなど., Phage Display of Peputides and Proteins (Academic Press, Inc. 1996)）、そしてランダムペプチド表示ライブラリー及びそのようなライブラリーをスクリーニングするためのキットは、例えばClontech (Palo Alto, CA), Invitrogen Inc. (San Diego, CA), New England Biolabs, Inc. (Beverly, MA) 及びPharmacia LKB Biotechnology Inc. (Piccataway, MJ) から市販されている。
【０１３６】
ランダムペプチド表示ライブラリーは、可溶性zcytor11受容体又は可溶性zcytor11ヘテロダイマーポリペプチド、例えば可溶性zcytor11/CRF2-4に結合するタンパク質を同定するために、本明細書に開示される可溶性zcytor11受容体又は可溶性zcytor11ヘテロダイマーポリペプチド、例えば可溶性zcytor11/CRF2-4配列を用いてスクリーンされ得る。可溶性zcytor11受容体又は可溶性zcytor11ヘテロダイマーポリペプチド、例えば可溶性zcytor11/CRF2-4ポリペプチドと相互作用するそれらの“結合ペプチド”は、細胞を標識するために；親和性精製により相同体ポリペプチドを単離するために使用され得る；それらは薬物、トキシン、放射性核種及び同様のものに直接的にまたは間接的に接合され得る。
【０１３７】
それらの結合ペプチドはまた、分析方法に、例えば発現ライブラリーをスクリーニングし、そして活性を中和するために、例えばIL-TIFリガンドと受容体、又は受容体に結合するウィルスとの間の相互作用を阻止するためにも使用され得る。結合ペプチドはまた、可溶性zcytor11受容体又は可溶性zcytor11ヘテロダイマーポリペプチド、例えば可溶性zcytor11/CRF2-4ポリペプチドの循環レベルを決定するために；根本的な病理学又は疾病のマーカーとして可溶性zcytor11受容体又は可溶性zcytor11ヘテロダイマーポリペプチド、例えば可溶性zcytor11/CRF2-4ポリペプチドを検出し又は定量化するために、診断アッセイにも使用され得る。
【０１３８】
それらの結合ペプチドはまた、zcytor11受容体又はzcytor11ヘテロダイマーポリペプチド、例えばzcytor11/CRF2-4結合及びシグナルトランスダクションをインビトロ及びインビボで阻止するために、zcytor11受容体又はzcytor11ヘテロダイマーポリペプチド、例えばzcytor11/CRF2-4 “アンタゴニス”として使用することができる。それらの抗−可溶性zcytor11受容体又は抗−可溶性zcytor11ヘテロダイマーポリペプチド、例えば抗−可溶性zcytor11/CRF2-4結合ペプチドは、IIL−TIF活性、及び受容体活性又はタンパク質結合を阻害するために有用である。本発明のヘテロダイマー又はマルチマー組合せに対して生ぜしめられた抗体は、それらがIL−TIFに対してより特異的に、又はわずか１つのサブユニットに対して生ぜしめられた抗体よりも有力に作用するので、好ましい態様である。さらに、本発明の抗体のアンタゴニスト及び結合活性は、IL−TIF増殖、及び本明細書に記載される他の生物学的アッセイによりアッセイされ得る。
【０１３９】
可溶性zcytor11受容体又は可溶性zcytor11ヘテロダイマーポリペプチド、例えば可溶性zcytor11/CRF2-4に対する抗体は、可溶性zcytor11受容体又は可溶性zcytor11ヘテロダイマーポリペプチド、例えば可溶性zcytor11/CRF2-4を発現する細胞を標識するために；アフィニティー精製により可溶性zcytor11受容体又は可溶性zcytor11ヘテロダイマーポリペプチド、例えば可溶性zcytor11/CRF2-4ポリペプチドを単離するために；可溶性zcytor11受容体又は可溶性zcytor11ヘテロダイマーポリペプチド、例えば可溶性zcytor11/CRF2-4ポリペプチドの循環レベルを決定するための診断アッセイのために；根本的な病理学又は疾病のマーカーとして可溶性zcytor11受容体又は可溶性zcytor11ヘテロダイマーポリペプチド、例えば可溶性zcytor11/CRF2-4を検出し又は定量化するために；FACS を使用する分析方法において、発現ライブラリーをスクリーニングするために；抗-インディオタイプ抗体を生成するために；及びインビトロで可溶性zcytor11受容体又は可溶性zcytor11ヘテロダイマーポリペプチド、例えば可溶性zcytor11/CRF2-4、又はIL−TIF活性を阻止するための中和抗体又はアンタゴニスとして使用され得る。
【０１４０】
適切な直接的標識又はラベルは、放射性核種、酵素、基質、補因子、インヒビター、蛍光マーカー、化学発光マーカー、磁気粒子及び同様のものを包含し；間接的な標識又はラベルは、中間体としてのビオチン−アビジン又は他の補体／抗−補体対の使用を特徴とする。本発明書における抗体及び結合タンパク質はまた、薬物、トキシン、放射性核種、及び同様のものに直接的に又は間接的に接合され得、そしてそれらの接合体はインビボ診断又は治療用途のために使用され得る。
【０１４１】
さらに可溶性zcytor11受容体又は可溶性zcytor11ヘテロダイマーポリペプチド、例えば可溶性zcytor11/CRF2-4又はそのフラグメントに対する抗体は、アッセイ、例えば当業界において知られているウェスターンブロット又は他のアッセイにおいて、変性され手入る可又は変性されていない可溶性zcytor11受容体又は可溶性zcytor11ヘテロダイマーポリペプチド、例えば可溶性zcytor11/CRF2-4又はそのフラグメントを検出するためにインビトロで使用され得る。
【０１４２】
可溶性zcytor11受容体又は可溶性zcytor11ヘテロダイマーポリペプチド、例えば可溶性zcytor11/CRF2-4に対する抗体は、その対応する受容体を発現する細胞を標識し、そしてそれらの発現レベルをアッセイするために、可溶性受容体ポリペプチドの循環レベルを決定するために診断アッセイ内での親和性精製のために、蛍光−活性化された細胞分類を用いる分析方法のために有用である。さらに、二価抗体は、IL−TIFの効果を模倣するアゴニストとして使用され得る。
【０１４３】
本明細書における抗体はまた、薬剤、トキシン、放射性核種及び同様のものに直接的に又は間接的に接合され得、そしてそれらの接合体は、治療用途を研究するためのネズミモデルにおいて、又は治療の用途において、インビボ診断のために使用される。例えば、本発明の可溶性zcytor11受容体又は可溶性zcytor11ヘテロダイマーポリペプチド、例えば可溶性zcytor11/CRF2-4ポリペプチドを認識する抗体又は結合ポリペプチドは、対応する抗−相補的分子（すなわち、zcytor11受容体又はzcytor11ヘテロダイマー受容体、例えばzcytor11/CRF2-4）を発現する組織又は器官を同定し、又は処理するために使用され得る。
【０１４４】
より特定には、抗−可溶性zcytor11受容体又は抗−可溶性zcytor11ヘテロダイマーポリペプチド、例えば抗−可溶性zcytor11/CRF2-4抗体又はその生物活性フラグメント又は一部が、検出可能な又は細胞毒性の分子に連結され、そしてzcytor11受容体又はzcytor11ヘテロダイマー受容体、例えばzcytor11/CRF2-4受容体分子を発現する細胞、組織又は器官を有する哺乳類に供給され得る。
【０１４５】
適切な検出可能分子は、可溶性zcytor11受容体又は可溶性zcytor11ヘテロダイマーポリペプチド、例えば可溶性zcytor11/CRF2-4（上記に開示される結合ペプチドを包含する“結合ポリペプチド”、抗体、又はその生物活性フラグメント又は一部に直接的に又は間接的に結合され得る。適切な検出可能分子は、放射性核種、酵素、基質、補因子、インヒビター、蛍光マーカー、化学発光マーカー、磁気粒子、及び同様のものを包含する。適切な細胞毒性分子は、ポリペプチド又は抗体に直接的に又は間接的に結合され得、そして細菌又は植物毒性（例えば、ジフテリア毒素、プソイドモナシス内毒素、リシン、アブリン及び同様のもの）、及び治療用放射性核種、例えばI−131、レニウム−188又はイットニウム−90（ポリペプチド又は抗体に直接的に結合されるか、又はキレ−ト成分により間接的に結合される）を包含する。
【０１４６】
結合ポリペプチド又は抗体はまた、細胞毒性薬物、例えばアドリアマイシンに結合され得る。検出可能又は細胞毒性分子の間接的な結合に関しては、検出可能又は細胞毒性分子は相補的/抗相補的対のメンバーにより結合され得、ここで他のメンバーは結合ポリペプチド又は抗体部分に結合される。それらの目的のためには、ビオチン/ストレプタビジンが典型的な相補的/抗相補的対である。
【０１４７】
もう１つの態様においては、結合ポリペプチド−毒素融合タンパク質又は抗体−毒素融合タンパク質は、標的化された細胞又は組織阻害又は除去（例えば、癌細胞又は組織を処理するために）のために使用され得る。他方では、結合ポリペプチドが複数の機能ドメイン（すなわち、活性化ドメイン又はリガンド結合ドメイン、及び標的化ドメイン）を有する場合、標的化ドメインのみを包含する融合タンパク質は、検出可能分子、細胞毒性分子又は相補的分子を、興味ある細胞又は組織型に向けるために適切である。例えば、単一のドメインのみのを包含する融合タンパク質が相補的分子を含む場合、抗−相補的分子は検出可能又は細胞毒性分子に接合され得る。従って、そのようなドメイン−相補的分子融合タンパク質は、一般的抗−相補的−検出可能/細胞毒性分子接合体のための一般的標的化ビークルを表す。
【０１４８】
もう１つの態様においては、可溶性zcytor11受容体又は可溶性zcytor11ヘテロダイマーポリペプチド、例えば可溶性zcytor11/CRF2-4結合ポリペプチド−サイトカイン又は抗体―サイトカイン融合タンパク質は、結合ポリペプチドサイトカイン又は抗−可溶性zcytor11受容体又は抗−可溶性zcytor11ヘテロダイマーポリペプチド、例えば抗−可溶性zcytor11/CRF2-4抗体が過剰増殖性細胞を標的化する場合、標的組織（例えば、膵臓、血液、リンパ球、結腸及び骨髄癌）のインビボ殺害を増強するために使用され得る（一般的には、Hornickなど., Blood 89: 4437-4447, 1997を参照のこと）。
【０１４９】
記載される融合タンパク質は、作用の所望する部位へのサイトカインの標的化を可能にし、それにより、サイトカインの高められた局部濃度を提供する。適切な抗−zcytor11ホモダイマー及びヘテロダイマー抗体は、所望しない細胞又は組織（例えば、腫瘍又は白血病）を標的化し、そして融合されたサイトカインはエフェクター細胞による改良された標的細胞溶解を仲介する。例えば、この目的のための適切なサイトカインは、インターロイキン−２及び顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（GM−CSM）を包含する。
【０１５０】
他方では、本明細書に記載される可溶性zcytor11受容体又は可溶性zcytor11ヘテロダイマーポリペプチド、例えば可溶性zcytor11/CRF2-4結合ポリペプチド又は抗体融合タンパク質は、zcytor11−調節されたアポプトシス経路を直接的に刺激することにより、標的組織のインビボ殺害の増強のために使用され、zcytor11受容体又はzcytor11ヘテロダイマー受容体、例えば可溶性zcytor11/CRF2-4受容体を発現する高増殖性細胞の細胞死がもたらされる。
本発明は、次の非−例示的な例によりさらに例示される。
【０１５１】
実施例
例１．次の zcytor11 可溶性受容体を発現する哺乳類発現ベクターの構成： zcytor11 CEE, zcytor11 CFLG ， zcytor11 CHIS 及び zcytor11 − Fc4
A. zcytor11 CEE, zcytor11 CFLG 及び zcytor11 CHIS を含む zcytor11 哺乳類発現ベクターの構成
発現ベクター、すなわちpC4zalpha11 CEEを、zcytor11ポリペプチド(配列番号３）の可溶性、細胞外ドメインの発現のために調製し、ここで前記構造体は、予測される開始メチオニンから成り、そして予測されるトランスメンブランドメインに隣接して切断され、そしてC−末端Glu−Glu標識（配列番号４）を有するzcytor11ポリペプチドを発現するよう企画されている。
【０１５２】
zcytor11細胞外サイトカイン結合ドメインを含んで成るzcytor11 DNAフラグメント（配列番号３）を、PCRを用いて創造し、そして精製した。切断されたDNAを、シグナルペプチド、例えば生来のzcytor11シグナルペプチドを有し、そしてGlu−Glu標識（配列番号４）を、zcytor11ポリペプチド−コードのポリヌクレオチド配列のC−末端に結合するプラスミド発現ベクター中にサブクローン化する。そのような発現ベクターである哺乳類ベクターは、哺乳類プロモーター、コード配列の挿入のための複数の制限部位、停止コドン及び哺乳類ターミネーターを有する発現カセットを含む。プラスミドはまた、複製のE.コリ起点、SV40プロモーター、エンハンサー及び複製の起点を有する哺乳類選択マーカー発現単位、DHFR遺伝子及びSV40ターミネーターを有することができる。
【０１５３】
制限消化されたzcytor11挿入体及び前もって消化されたベクターを、標準の分子生物学技法を用いて、連結し、そして、コンピテント細胞、たとえばDH10Bコンピテント細胞（GIBCO BRL, Gaithersburg, MD）中に、製造業者の説明書に従ってエレクトロポレートし、そして50mg/mlのアンピシリンを含むLBプレート上にプレートし、そして一晩インキュベートした。コロニーを、個々のコロニーから調製されたDNAの制限分析によりスクリーンした。陽性クローンの挿入体配列を、配列分析により確かめた。大規模プラスミド調製を、QIAGEN（商標）Maxi prepキット（Qiagen）を用いて、製造業者の説明書に従って行った。
【０１５４】
同じ方法を用いて、一列に並んでの６個のHis残基から成るC−末端his標識及びC−末端フラッグ（配列番号５）標識、すなわちzcytor11 CF1.AGを有するzcytor11可溶性ホモダイマー、ヘテロダイマー又はマルチマー受容体（非−zcytor11可溶性受容体サブユニット、例えば可溶性CRF2-4又はIL−10Rを包含する）を調製した。それらの構造体を調製するためには、前記ベクターは、glu-glu標識（配列番号４）の変わりにHIS又はFLAG（商標）標識のいずれかを有する。
【０１５５】
B. 可溶性 zcytor11 受容体 zcytor11 − Fc4 の哺乳類発現構造体
zcytor11をコードするポリヌクレオチドのすべて又は一部を含む発現プラスミドを、相同組換えを通して構成した。zcytor11 cDNAのフラグメントを、zcytor11受容体の細胞外ドメインからのポリヌクレオチド配列を包含するPCRを用いて単離した。zcytor11フラグメントの生成のためのPCRに使用されるプライマーは、5’側から3’側の方に向かって、次のものを有した：（１）ベクターを端に有する配列（挿入体の5’末端）の40bp及びzcytor11細胞ドメインの3’末端に対応する17bpを包含し；そして（２）Fc4ポリヌクレオチド配列の5’末端の40bp（配列番号６）及びzcytor11細胞外ドメインの3’末端に対応する17bpを包含する。
【０１５６】
zcytor11との融合のためのFc4のフラグメントを、類似する態様でPCRにより生成した。Fc4フラグメントの生成に使用される２種のプライマーは、次のものであった：（１）zcytor11細胞外ドメインの3’末端からの40bpの配列及びFc4の5’末端からの17bpの配列（配列番号６）から成る5’プライマー；及び（２）ベクター配列（挿入体の3’側）の40bpの配列及びFc4の3’末端の17bpの配列（配列番号６）から成る3’プライマー。次に、上記反応の個々のPCR増幅を、当業界における標準の条件を用いて行った。
【０１５７】
典型的な発現ベクターを、SamI（BRL）により切断される、プラスミドpCZR199（American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209に寄託された； 寄託番号98668号）から誘導する。発現ベクターを、プラスミドpCZR199から誘導し、そしてそれは、CMV即時初期プロモーター、マウス免疫グロブリンH鎖遺伝子座の可変領域からのコンセンサスイントロン、コード配列の挿入のための複数の制限部位、停止コドン及びヒト成長ホルモンターミネーターを有する発現カッセイトを含む哺乳類発現ベクターである。発現ベクターはまた、複製のE.コリ起点、SV40プロモーター、エンハンサー及び複製の起点を有する哺乳類選択マーカー発現単位、DHFR遺伝子及びSV40ターミネーターを有する。使用される発現ベクターを、CMV即時初期プロモーターによるメタロチオネインプロモーターの置換によりpCZR199から構成した。
【０１５８】
コンピテント酵母細胞（S.セレビシアエ）を、それぞれ約１μgのzcytor11及びFc４挿入体及びSmaI（BRL）消化された発現ベクター100ngと共に組合し、そしてエレクトロポレートする。酵母/DNA混合物を、0.75kV(5kV/cm)、“無限”Ω、25μFで、電気パルスした。個々のキュベットに、1.2Mのソルビトール600μlを添加し、そして酵母を、２種のURA−Dプレート上の２つの300μlアリコートにプレートし、そして30℃でインキュベートした。
【０１５９】
約48時間後、単一のプレートからのUra＋酵母形質転換体を、採取し、DNAを単離し、そしてエレクトロコンピテントE.コリ細胞（DH10B、GibcoBRL）を形質転換し、そして標準の方法を用いてプレートする。0.5−２mlの酵母DNA調製物及び40μlのDH10B細胞により行った。zcytor11−Fc4のための正しい発現構造体を有する個々のクローンを、制限消化により同定し、zcytor11−Fc4挿入体の存在を確かめ、そして種々のDNA配列がお互いに正しく連結されていることを確かめた。陽性クローンの挿入体を配列分析した。大規模プラスミドDNAを、Qiagen Maxiキット（Qiagen）を用いて、製造業者の説明書に従って単離する。
類似する方法を用いて、ヘテロダイマー及びマルチマー受容体の非−zcytor11サブユニット、例えばFc4により標的化されたCRF2-4及びIL−10Rを調製した。
【０１６０】
例２．可溶性受容体ポリペプチドのトランフェクション及び発現
BHK 570細胞（ATCC No. CRL-10314）, DG44 CHO, 又は他の哺乳類細胞を、800μlの適切な血清フリー（SF）培地（例えば、DMEM、Gibco/BRL High Glucose）(Gibco BRL, Gaithersburg, MD) において、約1.2×106個の細胞/ウェル（６−ウェルプレート）でプレートする。細胞を、血清フリー（SF）培地において、LipofectinTM (Gibco BRL) を用いて、製造業者の説明書に従って、zcytor11 CEE, zcytor11 CFLG, zcytor11 CHIS又はFc4（例１）、又はヘテロダイマー及びマルチマー受容体の非−zcytor11サブユニット、例えば-CEE-、CFLG、-CHIS、又は-Fc4標識されたCRF2-4及びIL−10Rを含む発現プラスミドによりトランスフェクトする。可溶性受容体を発現する単一のクローンを単離し、スクリーンし、そして細胞培養培地において増殖せしめ、そして標準の方法を用いて精製する。
【０１６１】
例３．E. コリにおける zcytor11 可溶性受容体の発現
A.huzcytor11/MBP-6H 融合ポリペプチドを発現する発現ベクター pCZR225 の構成
マルトース結合タンパク質（MBP）にC−末端で融合されるzcytor11可溶性受容体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを、相同組換えにより構成する。融合ポリペプチドは、zcytor11可溶性受容体（配列番号３）に融合される約388個のN−末端アミノ酸MBP部分を含む。zcytor11 cDNAのフラグメント（配列番号３）を、本明細書に記載のようなPCRを用いて単離する。次の２種のプライマーを、標準のPCR反応におけるzcytor11フラグメントの生成に使用する：（１）１つは、約40bpのベクターフランキング配列及び約25bpのアミノ末端に対する配列を含み、及び（２）もう１つは、前記フランキングベクター配列に対応する3’末端約40bp及びzcytor11のカルボキシル末端に応答する配列約25bpを含む。
【０１６２】
100μlのPCR反応物２μlを、分析するために、１×TBE緩衝液中、1.0％アガロースゲル上で試験し、そして予測されるおおよそのフラグメントが見られる。残るPCR反応物を、第２のPCR管において組合し、そして無水エタノール400μlにより沈殿せしめる。沈殿されたDNAを、下記のようにして、SmaI切断された受容体ベクターpTAP98中への組換えのために使用し、MBP−zcytor11融合体をコードする構造体を生成する。
【０１６３】
プラスミドpTAP98は、プラスミドpRS316及びpMAL-c2に由来する。プラスミドpRS316は、サッカロミセス・セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）シャトルベクターである（Hieter P. and Sikorski, R., Genetics 122: 19-27, 1989）。pMAL-C2 (NEB)は、E.コリ発現プラスミドである。それは、tacプロモーター駆動MalE（MBPコードの遺伝子）、続いて、His標識、トロンビン切断部位、クローニング部位及びrrnBターミネーターを担持する。ベクターpTAP98を、酵母相同組換えを用いて構成する。100ngのEcoRI切断された、pMAL-c2を、１μgのPvuI切断されたpRS316, 1μgのリンカーと共に組合し、そして１μgのScaI/EcoRI切断されたpRS316を、PCR反応において組合す。PCR生成物を、100％エタノール沈殿により濃縮する。
【０１６４】
コンピテント酵母細胞（S.セレビシアエ）を、約１μgの上記zcytor11受容体PCR生成物及び100ngのSmaI消化されたpTAP98ベクターを含む混合物数10μLと共に組合し、そして標準方法を用いてエレクトロポレートし、そしてURA−Dプレート上にプレートし、そして30℃でインキュベートする。
【０１６５】
約48時間後、単一プレートからUra+酵母形質転換体を採取し、DNAを単離し、そしてエレクトロコンピテントE.コリ細胞（例えば、MC1061, Casadabanなど., J. Mol. Biol. 138, 179-207）を形質転換し、そして標準方法を用いて、MM/CA＋AMP 100mg/lプレート（Pryor and Leiting, Protein Ezpression and Purification. 10:309-319, 1997）上にプレーtする。細胞を、100μg/mlのアンピシリンと共に、MM/CAにおいて、２時間、37℃で、振盪しながら増殖する。その培養物1mlを、1mMのIPTGにより誘発する。
【０１６６】
２〜４時間後、個々の培養物250μlを、酸により洗浄されたガラスビーズ250μ、及び5％βME及び色素を含むThomer緩衝液（８Mの尿酸、100mMトリス、pH7.0, 10％グリセロール、２mMのEDTA，５％SDS）250μlと共に混合する。サンプルを１分間、振盪し、そして65℃に10分間、加熱する。その20μlを、４％〜12％PAGEゲル（NOVEX）上のライン当たりに負荷する。ゲルを、１×MES緩衝液において試験する。陽性クローンを、pCZR225と命名し、そして配列決定分析にゆだねる。
【０１６７】
１μlの配列決定DNAを用いて、BL21株を形質転換する。細胞を、2.0kV, 25μF及び400オームで電気パルスする。エレクトロポレーションに続いて、100mg/lのアンピシリンを含むMM/CA溶液0.6ml上にプレートする。細胞を、MM/CAにおいて増殖し、そして上記のようにして、IPTGにより誘発する。陽性クローンを用いて、huzcytor11/MBP-6H融合タンパク質のタンパク質精製のために、標準技法により増殖する。
【０１６８】
例４．zcytor11 可溶性受容体ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体を、精製されたhuzcytor11/MBP-6Hポリペプチド（例3）、又は精製された組換えzcytor11可溶性受容体（例1）により、雌New zealand 白色ウサギを免疫化することによって、調製する。ウサギは、完全フロイントアジュバント（Pierce, Rockford, IL）中、精製されたタンパク質200mgの初期腹腔内（IP）注射、続いて、不完全フロイトアジュバント中、精製されたタンパク質100mgの追加免疫IP注射を、３週ごとに与えられる。第３の追加免疫注射の投与後７〜10日で、動物は放血され、そして血清が集められる。次に、ウサギを、追加免疫し、そして３週ごとに放血する。
【０１６９】
zcytor11−特異的ポリクローナル抗体を、CNBr-SEPHAROSE 1g当たり約10mgの精製されたhuzcytor11/MBP-6Hポリペプチドを用いて調製されるCNBr−SEPHAROSE 4Bタンパク質カラム（Pharmacia LKB）を用いて、ウサギ血清から親和性精製し、続いて、PBSにおける20倍の透析を一晩、行う。zcytor11−特異的抗体を、抗体標的物として適切な1mg/mlのタンパク質抗原を用いてのELISA力価調査により特徴づけるウサギ抗−zcytor11親和性精製された抗体の検出の下限（LLD）を、標準方法を用いて決定する。
【０１７０】
例 5．zcytor11 受容体モノクローナル体
zcytor11可溶性受容体モノクローナル抗体を、本明細書に記載される精製された組換え可溶性zcytor11タンパク質により、雄BalbCマウス（Harlan Sprague Dawley, Indianapolis, IN）を免疫化することによって、調製する。マウスは、完全フロイントアジュバント（Pierce, Rockford, IL）中、精製されたタンパク質20mgの初期腹腔内（IP）注射、続いて、不完全フロイトアジュバント中、精製されたタンパク質10mgの追加免疫IP注射を、２週ごとに与えられる。第３の追加免疫注射の投与後７〜10日で、動物は放血され、そして血清が集められ、そして抗体力化を評価する。
【０１７１】
脾臓細胞を、高い力価のマウスから収穫し、そして４：１の融合比の脾臓細胞：骨髄腫細胞を用いての２つの別々の融合方法において、PEG 1500 (Boerhinger Mannheim, UK) を用いて、ネズミSP2/0骨髄腫細胞に融合する（Antibodies: A Laboratory Manual, E. Harlow and D. Lane, Cold Spring Harbor Press）。融合の後、10日間の増殖に続いて、特定の抗体−生成ハイブリドマーを、抗体標的物として、精製された組換えzcytor11可溶性受容体タンパク質（例６C）を用いて、ELISAにより、そして抗体標的物として、zcytor11配列を発現するBa F3細胞（例８）を用いて、FACSにより同定する。両方法によるその得られる陽性ハイブリドマーを、限界希釈法により３度クローン化する。
【０１７２】
例 6．ORIGEN アッセイを用いての zcytor11 受容体へテロダイマー化の評価
可溶性zcytor11受容体zcytor11 CFLAG (例11)、又はgp130 (Hibi, M. など., Cell63: 1149-1157, 1990) を、5倍モル過剰のスルホ−NHS−LC−ビオチン（Piece， Inc., Rockford, IL）との反応により、製造業者のプロトコールに従って、ビオチニル化する。可溶性zcytor11受容体及び他の可溶性受容体サブユニット、例えば可溶性IL−10 R（sIL-10 R）又はCRF2-4受容体（CRF2-4）（R＆D Systems, Minneapolis, MN）、又は可溶性zcytor11受容体（アメリカ特許出願第5,965,704号）を、5倍モル過剰のRu−BPY−NHS（Igen、Inc., Gaithersburg, MD）により、製造業者のプロトコールに従って、ラベルする。
【０１７３】
可溶性zcytor11受容体のビオチニル化され、そしてRu−BPY−NHP−ラベルされた形は、それぞれBio−zcytor11受容体及びRu−zcytor11と命名され；他の可溶性受容体サブユニットのビオチニル化され、そしてRu−BPY−NHS−ラベルされた形も同様に命名され得る。アッセイを、zcytor11へテロダイマー受容体を結合するリガンド、例えばIL−TIFを発現する細胞からのならし培地を用いて、又は精製されたIL−TIFを用いて行うことができる。
【０１７４】
初期受容体結合特徴化のために、一連サイトカイン又はならし培地を、それらがzcytor11受容体ホモダイマー化を介在することができるかどうか、及びそれらが上記の可溶性サブユニットzcytor11受容体へのヘテロダイマー化を介在できるかどうかを決定するために試験する。これを行うために、50μlのならし培地又はTBS−B含有の精製されたサイトカインを、例えば400ng/mlのRu−zcytor11受容体及びBio−zcytor11、又は400ng/mlのRu−zcytor11受容体及びBio−gp130、又は400ng/mlのRu−CRF2-4及びBio−zcytor11を含むTBS−B（20mMのトリス、150mMのNaCl、1mg/mlのBSA、pH7.2）50μlと組合す。
【０１７５】
室温での１時間のインキュベーションに続いて、30μgのストレプタビジン被覆された、2.8mmの磁気ビーズ（Dynal, Inc., Oslo, Norway）を添加し、そしてその反応を、室温でさらに１時間インキュベートする。次に、200μlのORIGENアッセイ緩衝液（Igen, Inc., Gaithersburg, MD）を添加し、そして受容体会合の程度を、M8 ORIGEN分析機（Igen，Inc.）を用いて測定する。
【０１７６】
例７．zcytor11 受容体ヘテロダイマーを生成するための構造体
分泌されたヒトzcytor11ヘテロダイマーを発現するベクターを構成した。この構造体においては、zcytor11の細胞外サイトカイン−結合ドメインを、そのC−末端でGlu−Glu標識を有するIgGγ１pH鎖（配列番号４）に融合し、そしてヘテロダイマーサイトカイン受容体サブユニット（例えば、CRF2-4, IL-9, IL-10 IL-4受容体成分）の細胞外部分を、そのC−末端でHis標識を有するIgGγ１のH鎖に融合した。
【０１７７】
A．IgG γ１ 6 − His 及び IgG γ１ Glu-Glu 融合ベクターの構成
６−His C−末端標識を有するIgGγ１のH鎖（配列番号13）を、pZP-9哺乳発現ベクター（ATCC寄託番号98668号）中にクローン化し、その結果、5’EcoRI及び3’BamHI部位を有するいずれかの所望するサイトカイン受容体細胞外ドメインをクローン化でき、N−末端細胞外ドメイン−C−末端IgGγ１融合体をもたらすことができる。この構造体に使用されるIgGγ１フラグメントを、オリゴヌクレオチドプライマーZC29,239（配列番号14）及びZC29,232（配列番号15）を用いて、IgGγ１配列を単離するために、PCRを用いることにより製造する。PCR生成物を、本明細書に記載される方法を用いて、精製し、そしてXhoI及びBamHI（Boerhinger-Mannheim）により消化し、そしてゲル精製した。
【０１７８】
CRF2-4（配列番号18）の細胞外部分を、オリゴヌクレオチドプライマーZC39,319（配列番号16）及びZC39,325（配列番号17）を用いて、PCRにより増幅し、PCR生成物を、本明細書に記載される方法を用いて精製し、そしてEcoRI及びBamHI（Boerhinger−Mannheim）により消化し、そして続いて、ゲル精製した。上記由来のBamHI/XhoI IgGγフラグメント及びEcoRI/BamHI CRF2-4フラグメントを、EcoRI及びXhoIにより前もって消化されたpZP-9中に連結し、C−末端で６−HIS標識を有するIgGγ１に融合されたCRF2-4細胞外サイトカイン結合ドメインの細胞外部分を有する構造体を誘導した。
【０１７９】
続いて、この構造体を修飾し、CRF2-4の3’側及び6-HIS標識の5’側にトロンビン切断部位を導入した。これは、オリゴヌクレオチドプライマーZC38,981（配列番号20）及びZC39,042（配列番号21）と共に、PCRにおける鋳型として上記構造体を用いることによって行われた。PCR生成物を、本明細書に記載される方法を用いて精製し、そしてSacII及びXhoIにより消化した。このSacII/XhoIフラグメントを、SacII及びXhoIにより前もって消化された、上記構造体中に連結した。6-HIS標識を有するIgGγに融合されたCRF2-4細胞外サイトカイン結合ドメインのポリヌクレオチド配列は、配列番号22に示され、そしてその対応するポリペプチド配列は配列番号23に示される。
【０１８０】
Glu-Glu C-末端標識（配列番号４）を有するIgGγ1のH鎖を、5’EcoRI部位及び3’BamHI部位を有するいずれかの所望するサイトカイン受容体細胞外ドメインがクローン化され、N−末端サイトカイン細胞外ドメイン−C−末端IgGγ１融合が得られるよう、Zem228R哺乳類発現ベクター（ATCC寄託番号69446号）中にクローン化した。この構造体に使用されるIgGγ１フラグメントを、オリゴヌクレオチドプライマーZC29,238（配列番号24）及びZC29,231（配列番号25）を用いてIgGγ１配列を単離するために、PCRを用いることによって製造した。PCR生成物を、本明細書に記載される方法を用いて精製し、そしてXhoI及びEcoRI（Boerhinger−Mannheim）により消化し、そして続いてゲル精製した。
【０１８１】
hzcytor11（配列番号１）の細胞外部分を、オリゴヌクレオチドZC39,335（配列番号26）及びZC28,981（配列番号27）を用いてPCRにより増幅した。PCR生成物を、本明細書に記載される方法を用いて精製し、そしてEcoRI及びBamHI（Boerhinger-Mannheim）により消化し、そして続いて、ゲル精製した。次に、上記のように誘導されたBamHI/XhoI IgGγIフラグメント及びEcoRI/BamHI hzcytor11フラグメントを、EcoRI及びXhoIにより前もって消化されたZem228R中に連結し、C−末端でGlu−Gluエピトープ標識を有するIgGγ１に融合されたhzcytor11の細胞外ドメインを有する構造体を誘導した。
【０１８２】
続いて、この構造体を修飾し、CRF2-4の3’側及び6-HIS標識の5’側にトロンビン切断部位を導入した。これは、オリゴヌクレオチドプライマーZC38,981（配列番号27）及びZC39,043（配列番号28）と共に、PCRにおける鋳型として上記構造体を用いることによって行われた。PCR生成物を、本明細書に記載される方法を用いて精製し、そしてSacII及びXhoIにより消化した。このSacII/XhoIフラグメントを、SacII及びXhoIにより前もって消化された、上記構造体中に連結した。6-HIS標識を有するIgGγに融合されたCRF2-4細胞外サイトカイン結合ドメインのポリヌクレオチド配列は、配列番号29に示され、そしてその対応するポリペプチド配列は配列番号30に示される。
【０１８３】
B.zcytor11 及びヘテロダイマーサイトカイン受容体サブユニット細胞外ドメインの同時−発現
約16μgの個々の上記ベクターを、LipofectaminePlusTM 試薬（Gibco/BRL）を用いて、製造業者の説明書に従って、哺乳類細胞、例えばBHK−570細胞（ATCC No. CRL-10314）中に同時トランスフェクトする。トランスフェクトされた細胞を、１μMのメトトレキセート（MTX）（Sigma，St. Louis, MO）及び0.5mg/mlのG418（Gibco/BRL）を含むDMEM＋5％FBS（Gibco/BRL）において、10日間、選択する。得られるトランスフェクタントのプールを、10μmのMTX及び0.5mg/mlのG418において再び選択する。
【０１８４】
得られる二重選択された細胞のプールを用いて、zcytor11/CRF2-4可溶性受容体タンパク質を生成する。このプールの３種の画分（Nunc, Denmark）を用いて、血清フリーのならし培地10Lを生成する。このならし培地を、ニッケルカラム、続いてGlu−Gluカラム上に通し、そしてホモダイマーからヘテロだ合間−を精製した。
【０１８５】
例８．zcytor11 受容体とヘテロダイマー化又は多重化する受容体サブユニットの決定
本明細書に記載される標準の方法を用いて、追加のヘテロダイマーサイトカイン受容体サブユニットによりトランスフェクトされたBaF3/MPL−zcytor11キメラ細胞は、TPOの存在下でルシフェラーゼレポーターへのヘテロダイマーzcytor11受容体複合体のシグナルトランスダクション応答を測定するために、バイオアッセイ細胞系として作用する。
【０１８６】
TPOの存在下で、BaF3/MPL−zcytor11細胞はシグナル化せず、このことは、zcytor11受容体がシグナルにヘテロダイマー化すべきであることを示唆する。TPOリガンドの存在下でシグナル化する追加のMPL−クラスIサイトカイン受容体融合体によるBaF3/MPL−zcytor11細胞トランスフェクションは、ヘテロダイマーサイトカイン受容体サブユニットがzcytor11受容体シグナル化のために必要とされることを決定する。この目的のためへのMPL−受容体融合体の使用は、zcytor11受容体のための天然のリガンドの存在についての必要性を緩和する。
【０１８７】
MPL−クラスIサイトカイン受容体融合体を、MPL受容体の細胞外ドメイン及びトランスメンブランドメイン、及び所望するクラスIサイトカイン受容体の細胞内シグナルドメインを用いて、例５に従って製造する。BaF3/MPL−zcytor11バイオアッセイ細胞系を、例６におけるようにして、個々のMPL−クラスIサイトカイン受容体融合体により同時トランスフェクトし、BaF3/MPL−zcytor11/MPL-クラスIサイトカイン受容体細胞系を形成する。受容体複合体は、１又は複数のCRF2-4、IL-9、IL−10IL-4受容体成分を含んで成るMPL−サイトカイン受容体融合体と組合してのzcytor11受容体を包含するが、但しそれらだけには限定されない。次に、個々の独立した受容体複合体細胞系を、TPO（例６）の存在下でアッセイし、そして増殖性を、通常の方法（例えば、Alamar Blueアッセイ）を用いて測定する。
【０１８８】
BaF3/MPL−zcytor11バイオアッセイ細胞系は、バックグラウンドルシフェラーゼ活性についての対照として作用し、そして従って、種々の受容体複合体組み合わせによりシグナル化を比較するための基線として使用される。さらに、BaF3/MPL−クラスIサイトカイン受容体細胞系を構成し、ホモダイマー化に基づいてシグナル化することが知られているそれらのクラスIサイトカイン受容体についてのMPL−クラスIサイトカイン受容体ホモダイマー化効果を制御することができる。正しい受容体複合体の存在下でのTPOは、TPOの存在下で、バックグラウンドより約５倍又はそれ以上、BaF3/MPL−zcytor11/MPL−クラスIサイトカイン受容体細胞系の増殖を高めることが予測される。
【０１８９】
類似する増殖アッセイは、ヘテロダイマー及びマルチマー複合体を表示する追加の非−zcytor11サブユニットについてスクリーンするために十分な長さのzcytor11（配列番号２）を使用する。十分な長さのzcytor11（配列番号２）を発現する細胞を、非−zcytor11サブユニットによりトランスフェクトし、そしてIL−TIFリガンドの存在下で増幅についてアッセイする。Zcytor11ヘテロダイマー及びマルチマー受容体の成分を発現する細胞は、IL−TIFの存在下で増殖するべきである。
【０１９０】
例９．インビトロでの zcytor11 受容体の再構成
zcytor11−シグナル化複合体に包含される成分を同定するために、受容体再構成の研究を、次の通りにして行う。ルシフェラーゼレポーター哺乳類発現ベクタープラスミドにより、本明細書に記載される標準方法を用いて、トランスフェクトされたBHK570細胞（ATCC No. CRL-10314）は、IL-TIFの存在下でルシフェラーゼレポーターに対する、トランスフェクトされたzcytor11受容体複合体からのシグナルトランスダクション応答を測定するために、バイオアッセイ細胞系として作用する。BHK細胞は、zcytor11受容体を内因的に発現しない。
【０１９１】
典型的なルシフェラーゼレポーター哺乳類発現ベクターは、次の４種の遺伝子からのSTAT転写因子結合要素を含む相補的オリゴヌクレオチドにより構成されたKZ134プラスミドである：修飾されたc-fos Sis誘発性要素（m67SIE又はhSIE）(Sadowski, H. など., Science 261: 1739-1744, 1993)、 p21 WAF1遺伝子からのp21 SIE1（Chin，Y. など., Science 272: 719-722, 1996）、β−カゼイン遺伝子の乳腺応答要素（Schmitt-Ney, M. など., Mol. Cell. Biol. 11: 3745-3755, 1991）、及びFcg RI遺伝子のSTAT誘発性要素（Seidel，H. など., Proc. Natl. Acad. Sci. 92: 3041-3045, 1995）。
【０１９２】
それらのオリゴヌクレオチドは、Asp718−XhoI適合性末端を含み、そして同じ酵素により消化されたc-fosプロモーター（Poulsen, L.K. など., J. Biol. Chem. 273: 6229-6232, 1998）を有し、そしてネオマイシン選択マーカーを含む受容体ホタルルシフェラーゼレポーターベクター中に、標準の方法を用いて連結された。KZ134プラスミドを用いて、BHK又はBaF3細胞を標準のトランスフェクション及び選択方法により安定してトランスフェクトし、それぞれ、BHK/KZ134又はBaF3/KZ134細胞系を製造する。
【０１９３】
バイオアッセイ細胞を、zcytor11受容体のみによりトランスフェクトし、zcytor11受容体及び種々の他の既知受容体サブユニットの1つにより同時にトランスフェクトする。受容体複合体は、zcytor11受容体のみ、１又は複数のCRF2-4、IL-9、IL−10 IL-4受容体成分、クラスIIサイトカイン受容体サビユニット、又はIL-2受容体成分（IL-2Rα、IL-2Rβ、IL-2Rγ）を有するzcytor11受容体、１又は複数のIL−4/IL-13受容体ファミリー受容体成分（IL-4Rα、IL-13Rα、IL-13Rα’）を有するzcytor11受容体、及び他のインターロイキン受容体（例えば、IL-15Rα、IL-7Rα、IL-9Rα、IL-21R（Zalpha 11受容体））と、zcytor11受容体との種々の組み合わせを包含するが、但しそれらだけには限定されない。
【０１９４】
次に、個々の独立した受容体複合体細胞系を、サイトカイン−ならし培地又は精製されたサイトカインの存在下でアッセイし、そしてルシフェラーゼ活性を通常の方法を用いて測定する。トランスフェクトされていないバイオアッセイ細胞系は、バックグランドルシフェラーゼ活性のための対照として作用し、そして従って、種々の受容体複合体組み合わせによるシグナルを比較するための基線として使用される。正しい受容体複合体の存在下でzcytor11受容体を結合するならし培地又はサイトカインは、バックグラウンドよりも約５倍又はそれ以上のルシフェラーゼ読み取りを付与することが予測される。
他方では、BaF3/zcytor11-mpl及びBaF3/zcytor11細胞系が上記のように同時−トランスフェクトされ、そして増殖が測定される類似するアッセイを行うことができる。
【０１９５】
例 10．CEE −標識された IL − TIF を生成するための構造体
オリゴヌクレオチドを、Kozak配列及びIL−TIFのためのコード領域を含むが、その停止コドンを有さないPCRフラグメントを生成するために企画した。それらのオリゴヌクレオチドを、5’末端でKpnI部位及び3’末端でBanHI部位を有するよう企画し、C−末端Glu−Glu標識された（配列番号４）タンパク質の哺乳類発現のための本発明の標準ベクターのpHZ200−CEE中へのクローニングを促進した。pHZ200ベクターはMT−１プロモーターを含む。
【０１９６】
PCR反応を、IL−TIF cDNAフラグメントを増幅するために、Turbo Pfuポリメラーゼ（Stratagene）を用いて行った。約20ngのヒトIL−TIFポリヌクレオチド鋳型（配列番号７）、及びオリゴヌクレオチドZC28,590（配列番号９）及びZC28,580（配列番号10）を、PCR反応に使用した。PCR反応条件は次の通りであった：90℃で60秒、55℃で60秒及び72℃で60秒（30サイクル）；及び72℃で10分；続いて４℃での維持。PCR生成物を、アガロース電気泳動により分離し、そしてQiaQuickTM (Qiagen) ゲル抽出キットを用いて精製した。単離された約600bpのDNAフラグメントを、KpnI及びBamHI（Boerhinger−Mannheim）により消化し、上記のようにしてゲル精製し、そしてKpnI及びBamHIにより前もって消化されたpHZ200−CEE中に連結した。
【０１９７】
約１μlの連結反応物を、DH10B ElectroMaxTM コンピテント細胞（GIBCO BRL, Gaithersburg, MD）中に、製造業者の説明書に従ってエレクトロポレートし、そして100μg/mlのアンピシリンを含むLBプレート上にプレートし、そして一晩インキュベートした。コロニーを採取し、そして上記のようなPCR条件と共に、オリゴヌクレオチドZC28,590（配列番号９）及びZC28,580（配列番号10）を用いて、PCRによりスクリーンした。次に、挿入体を含むクローンを配列決定し、誤りのないIL−TIF挿入体を確認した。配列分析により確かめられるような正しいpHZ200−IL−TIF−CEE構造体のMaxiprepsを行った。
【０１９８】
例 11．IL − TIF ポリペプチドのトランスフェクション及び発現
BHK570細胞（ATCC No. CRL-10314）を、800μlの血清フリー（SF）DMEM培地（DMEM, Gibco/BRL High Glucose）（Gibco BRL, Gaithersburg, MD）において、約1.2×106個の細胞/ウェル（６−ウェルプレート）でプレートした。細胞を、血清フリー（SF）DMEM中、LipofectinTM (Gibco BRL) を用いて、製造業者の説明書に従って、上記（例10）IL−TIF−CEE包含発現プラスミドによりトランスフェクトした。
【０１９９】
細胞を、37℃で約５時間インキュベートし、次に、30mlのDMEM/5％のウシ胎児血清（FBS）（Hyclone, Logan, UT）の最終体積で150mmのMAXIプレートを分離するために移した。プレートを37℃、5％CO2下で一晩インキュベートし、そしてDNA：LipofectinTM 混合物を、選択培地（5％FBS/DMEM及び１μMのメトトレキセート（MTX））により次の日、置換した。
【０２００】
トランスフェクションの約10〜12日後、コロニーを、５μMのMTXを有する5％FCS/DMEM 1mlを含む12−ウェルプレートに機械的に採取し、次に、集密性まで増殖した。次に、陽性の発現クローンコロニーのならし培地サンプルを、SDS−PAGE及びウェスターン分析により、発現レベルについて試験した。高い発現性のクローンを採取し、そして前記細胞により発現されるIL−TIF−CEEの精製についてのならし培地のアンプル生成のために拡張した（例12）。
【０２０１】
例 12．BHK570 細胞からの IL − TIF − CEE ポリペプチドの精製
特にことわらない限り、すべての操作は４℃で行われた。次の方法を、C−末端Glu−Glu（EE）標識（配列番号４）を含むIL−TIFポリペプチドを精製するために使用した。IL−TIF−CEE（例11）を発現するBHK細胞からのならし培地を、ProFlux A30上でAmicon S10Y3スパイラル遠心分離機により濃縮した。プロテアーゼインヒビター溶液を、前記濃縮されたならし培地に添加し、2.5mMのエチレンジアミン四酢酸（EDTA, Sigma Chemical Co. St. Louis, MO）、0.003mMのロイペプチン（Boehringer−Mannheim, Indianapolis, IN）、0.001mMのペプスタチン（Boehringer−Mannheim）及び0.4mMのPefabloc（Boehringer−Mannheim）の最終濃度にした。サンプルを分析のために除去し、そして多量の体積を、精製を開始するまで、−80℃で凍結した。濃縮されたならし培地の合計の標的物タンパク質濃度を、抗−EE HRP接合された抗体を用いて、SDS−PAGE及びウェスターンブロット分析により決定した。
【０２０２】
約100mlカラムの抗−EE G−Sephrose（下記のように調製された）を、Waters AP-5, 5cm×10cmガラスカラムに充填した。カラムを流動充填し、そしてリン酸緩衝溶液（PBS）（pH7.4）により、BioCad Sprint (PerSeptive BioSystems, Framingham, MA) 上で平衡化した。濃縮されたならし培地を融解し、0.2ミクロンの無菌膜を通して濾過し、pHを7.4に調節し、次に、約1ml/分の流速で一晩カラム上に負荷した。カラムを、10カラム体積（CV）のリン酸緩衝溶液（PBS, pH7.4 ）により洗浄し、次に、5ml/分で、0.5mg/mlのEEペプチド（Anaspec, San Jose, CA） を含むPBS（pH6.0）200mlによりプラグ溶出した。
【０２０３】
使用されるEEペプチドは、配列EYMPME（配列番号４）を有する。カラムを10CVのPBSにより洗浄し、次に、5CVの0.2Mグリシン（pH3.0）により溶出した。グリシン溶出されたカラムのpHを、２CVの５×PBSにより7.0に調節し、次にPBS（pH24）により平衡化した。5mlの画分を、全溶出クロマトグラフィーにおいて集め、そして280及び215nMでの吸光度をモニターし；通過及び洗浄プールをまた、保存し、そして分析した。EE−ポリペプチド溶出ピーク画分を、抗−EE HRP接合抗体を用いて、SDS−PAGE銀染色及びウェスターンブロットを通して標的タンパク質について分析した。興味あるポリペプチド溶出画分をプールし、そして10,000ドルトン分子量カットオフ膜回転濃縮機（Millipore, Bedford, MA）を用いて、その製造業者の説明書に従って、60mlから5.0mlに濃縮した。
【０２０４】
他の同時精製タンパク質からIL−TIF−CEEを分離するために、前記濃縮されたポリペプチド溶出のプールされた画分を、pH8.0で、POROS HQ-50 (PerSeptive BioSystems, Framingham, MAからの強アニオン交換樹脂) にゆだねた。1.0×6.0cmのカラムを充填し、そしてBioCad Sprint上に流動充填した。カラムを、対向イオンに荷電しし、次に20mMのTRIS（pH8.0）（トリス（ヒドロキシメチルアミノメタン））により平衡化した。
【０２０５】
サンプルを、１：13に希釈し（PBSのイオン強度を低めるために）、次に5ml/分でPoros HQカラム上に充填した。カラムを、10CVの20mMのトリス（pH8.0）により洗浄し、次に、40CVグラジエントの20mMのトリス/1Mの塩化ナトリウム（NaCl）により10ml/分で溶出した。1.5mlの画分を、全クロマトグラフィー上で集め、そして280及び215nMでの吸光度をモニターした。溶出ピーク画分を、SDS−PAGE銀染色により分析した。興味ある画分をプールし、そして10,000ドルトン分子カットオフ膜回転濃縮機（Millipore, Bedford, MA）を用いて、製造業者の説明に従って、1.5〜2mlに濃縮した。
【０２０６】
遊離EEペプチド及びいずれかの汚染性同時精製タンパク質からIL−TIF−CEEポリペプチドを分離するために、プールされた濃縮画分を、PBSにより平衡化し、そしてBioCad Sprintを用いて、1.0ml/分の流速で充填される、1.5×90cmのSephadex S200 (Pharmacia, Piscataway, NJ) カラム上でのサイズ排除クロマトグラフィー処理にゆだねた。1.5mlの画分を、全クロマトグラフィーを通して集め、そして280及び215nMでの吸光度をモニターした。ピーク画分を、SDS−PAGE銀染色により特徴づけ、そして最も純粋な画分のみをプールした。この材料は、精製されたIL−TIF−CEEポリペプチドを提供した。
【０２０７】
この精製された材料を、最終的に、4mlのActiClean Etox (Sterogene) カラムにゆだね、いずれかの存存する内毒素を除去した。サンプルを、PBSにより平衡化された重力カラム上に４度、通し、次にカラムを１回の３ml体積のPBSにより洗浄し、これを“清浄された”サンプルとしてプールした。次に、その材料を、0.2ミクロンの無菌膜を通して濾過し、そしてそれを等分するまで、−80℃で貯蔵した。
ウェスターンブロットされた、クーマシーブルー及び銀色されたSDS−PAGEゲル上で、IL−TIF−CEEポリペプチドは、１つの主要バンドであった。精製された材料のタンパク質濃度を、BCA分析（Pierce, Rockford, IL）により行い、そしてタンパク質を等分し、そして標準の方法に従って、−80℃で貯蔵した。
【０２０８】
抗−EE Sepharoseを調製するために、100mlの層体積のプロテインG−Sepharose（Pharmacia, Piscataway, NJ）を、500mlのNalgene 0.45ミクロンフィルターユニットを用いて、0.02％アジ化ナトリウムを含むPBS100mlにより３度、洗浄した。ゲルを、6.0体積の200mMトリエタノールアミン（pH8.2）（TEA, Sigma, St. Louis, MO）により洗浄し、そして900mgの抗体を含む、等体積のEE抗体溶液を添加した。４℃での一晩のインキュベーションの後、結合されなかった抗体を、上記のように、５体積の200mMのTEAにより樹脂を洗浄することによって除去した。
【０２０９】
樹脂を２体積のTEAに再懸濁し、適切な容器に移し、そしてTEAに溶解されたジメチルピリミデート−2HCl（Pierce, Rockford, IL）を、プロテインG−Sepharoseゲルに添加し、36mg/mlの最終濃度にした。ゲルを室温で45分間、揺り動かし、そして液体を、上記のようにしてフィルターユニットを用いて除去した。次に、ゲル上の非特異的部位を、200mMのTEA中、５体積の20mMのエタノールアミンと共に室温で10分間インキュベートすることによってブロックした。次に、ゲルを、0.02％のアジ化ナトリウムを含むPBS５体積により洗浄し、そしてこの溶液において4℃で貯蔵した。
【０２１０】
例 13．IL − TIF ポリペプチドのインビボ効果
マウス（雌、C57B1、生後８週；Charles River Labs, Kingston, NY）を、３種のグループに分けた。IL−TIFポリペプチド（配列番号８）を発現するアデノウィルスを、標準方法を用いて前もって製造した。日０で、親又はIL−TIFアデノウィルスを、第１グループ（n＝８）及び第２グループ（n＝８）にそれぞれ、尾の静脈を通して投与し、そして個々のマウスは、約0.1mlの体積中、約１×1011の粒子の用量を受けた。第３グループ（n＝８）は、処理を受けなかった。日12で、マウスを計量し、そして血液をマウスから採血した。サンプルを、完全な血液計数（CBC）及び血清化学について分析した。
【０２１１】
好中球及び血小板計数の統計学的に有意な上昇が、親アデノウィルス処理グループに対して、IL−TIFアデノウィルス投与されたグループからの血液サンプルにおいて検出された。また、リンパ球及び赤血球細胞計数が、親アデノウィルス処理のグループに対して、IL−TIFアデノウィルス投与されたグループから有意に低められた。さらに、IL−TIFアデノウィルス処理されたマウスは、体重が低下し、ところが親アデノウィルス処理されたマウスは体重が増加した。SAA及びグロブリンレベルが高められ、そしてグルコースレベルが低められた。アデノ−zcyto18マウスは、るいそう症候群を表した。要約すると、zcyto18は、TNF−α、IL−１及びgp130サイトカインの前炎症活性に影響を及ぼす急性相応答（APR）を引き起こす。
【０２１２】
その結果は、IL−TIFがインビボで免疫及び炎症応答に関与する前炎症因子であることを示唆した。IL−TIF受容体（zcytor11）の組織分布は、IL−TIFの循環又は特定の組織における高められた発現が、一定の急性/慢性炎症疾患、例えば膵炎、IBD（クローン病、大腸塩）、ぜん息、ESRD（最終段階腎臓疾患）、リウマチ様関節炎、乾癬及び自己免疫疾患（GVHD、狼痕、敗血症）を導くことができることを示した。
【０２１３】
前記結果は、IL−TIFが造血、すなわちインビボでの血液細胞形成に影響を及ぼすことを示した。IL−TIF自体は、異なった血液幹細胞に影響を及ぼす生物学的活性を有し、従って、特定の系統において一定の分化された血液細胞の上昇又は低下をもたらす。例えば、IL−TIFは、リンパ球を低めると思われ、これはたぶん、リンパ細胞を高める傾倒した前駆体の阻害のためである。この発見は、骨髄球性幹細胞の増殖及び/又は成長に対するIL−TIFの阻害効果と一致し（例13）、これは、IL−TIFが、それらの工程に関与する血液細胞に影響を及ぼすことによって、貧血、感染、炎症及び/又は免疫疾患において役割を演じることができる概念を支持する。IL−TIFに対するアンタゴニスト、例えば本発明の抗体又はzcytor11可溶性受容体は、それらの疾病における治療剤として使用され得る。
【０２１４】
さらに、マウスにおけるIL−TIFアデノウィルスを用いるそれらの実験は、IL−TIFの過剰発現がインビボで好中球及び血小板のレベルを高めることを示唆する。完全な動物システムにおいてIL−TIFに対する応答に関与する他の因子（例えば、サイトカイン及びモディファイアー遺伝子）が存在すると思われる。それにもかかわらず、IL−TIF及びその受容体は、種々の障害、例えば炎症、免疫障害、感染、貧血、造血及び他の癌及び同様のものの診断及び処理のための適切な試薬/標的物である。
【０２１５】
例 14．現場ハイブリダイゼーションを用いての zcytor11 を発現する細胞の同定
特にヒト組織を単離し、そして現場ハイブリダイゼーションによりzcytor発現についてスクリーンした。虫垂、脳、軟骨、結腸、腸、腎臓、肝臓、肺、リンパ節、リンパ、卵巣、膵臓、胎盤、前立腺、皮膚、脾臓及び胸腺に関する種々のヒト組織を調製し、断片化し、そして現場ハイブリダイゼーションにゆだねた。組織を、標準方法を用いて、10％の緩衝化されたホルマリンに固定し、そしてパラフィンにおいてブロックした。
【０２１６】
組織を、４〜８ミクロンに断片化した。組織を、標準のプロトコール（”Development of non-isotopic in situ hybridization” at The Laboratory of Experiment Pathology (LEP), NIEHS, Research Triangle Park, NC; Webアドレスhttp://dir.niehs.nih.gov/dirlep/ish.html）を用いて調製した。手短には、組織断片を、HistoClear (National Diagnostics, Atlanta, GA) により脱パラフィン化し、そして次に、エタノールにより脱水した。次に、それらを、37℃で２〜７分間、プロティナーゼK（50μg/ml）（Boehringer Diagnostics, Indianapolis, IN）により消化した。この段階に続いて、組織をアセチル化し、そして脱水した。
【０２１７】
１つの現場プローブを、ヒトzcytor11配列（配列番号１におけるヌクレオチド234−1105）に対して企画し、そして標準方法を用いて、配列番号１を含むプラスミドから単離した。T7 RNAポリメラーゼを用いて、アンチセンスプローブを生成した。そのプローブを、In Vitro Transcription System (Promega, Madison, WI) を用いて、ジゴキシゲニン（Boehringer）により、製造業者の説明書に従ってラベルした。
【０２１８】
現場ハイブリダイゼーションを、ジゴキシゲニンによりラベルされたzcytor11プローブ（上記）により行った。プローブを、60℃で12〜16時間、１〜5pモル/mlの濃度でスライドに付加した。続いて、スライドを、２×SSC及び0.1×SSCにより55℃で洗浄した。シグナルを、チラミドシグナル増幅（TSA）（TSA、現場間接的キット；NEN）を用いて増幅し、そしてVector Red基質キット（Vector Lab）により、その製造業者の説明書に従って可視化した。次に、スライドを、ヘマトキシリン（Vector Laboratories, Burlingame, CA）により対比染色した。
【０２１９】
シグナルを、試験されるいくつかの組織において観察した：小節の副皮質における細胞を含むリンパ節が強い陽性であった。リンパ腫サンプルにおいては、試験されるサンプルにはシグナルはほとんどか又はまったく存在しない。脾臓においては、陽性シグナルが、小胞の末梢で拡散された単核細胞に見出された。胸腺においては、陽性のシグナルが、皮質及び骨髄の両者において拡散された単核細胞において見出された。胎児肝臓においては、強いシグナルが、洞様空間において、単核細胞の混合された集団において観察された。いくつかの循環単核細胞はまた、陽性であった。肝細胞は陰性であった。
【０２２０】
炎症性虫垂においては、Peyerパッチ及び炎症部位における単核細胞が陽性であった。腸においては、層状プロプリア（propria）及びPeyerパッチにおける細胞が強い陽性であった。筋肉における神経節細胞は陽性であった。正常な肺においては、zcytor11が、肺胞上皮、及び間隙組織及び循環における単核細胞において発現された。肺癌組織においては、弱いシグナルが、癌細胞、及び癌部位の末梢における単核細胞において観察された。卵巣癌においては、上皮細胞は強い陽性であった。いくつかの間隙細胞、たぶん単核細胞もまた陽性であった。正常な卵巣においては、シグナルは観察されなかった。腎臓においては、腎小体におけるボーマン被膜の壁側層における有定突起及び単純上皮細胞は陽性であった。
【０２２１】
遠位渦巻管の立方骨上皮細胞もまた陽性であった。正常及び膵炎の膵臓サンプルにおいては、線房細胞、及び腸間膜におけるいくつかの単核細胞が陽性であった。膵臓のランゲルハンス島における細胞に弱いシグナルがまた存在する。初期（８週）胎盤において、シグナルが栄養膜に観察された。皮膚においては、強いシグナルが、ケラチノサイト、及び表皮における炎症浸潤物における単核細胞に観察された。脳においては、側頭葉における大部分のニューロンは陽性であったが、前頭葉は陰性のように思える。関節軟骨においては、軟骨細胞は陽性であった。試験された他の組織、例えば正常卵巣、皮膚メラノーマ、前立腺癌及びBPHは陰性であった。
【０２２２】
要約すると、現場データは、zcytor11についての上記の発現データと一致した。zcytor11発現は、単核細胞の混合された集団において主として観察され、そしてそこにおいて一定して発現された。上皮はまた陽性であった。それらの結果は、ヒト細胞におけるzcytor11発現の存在、及び炎症、自己免疫疾患、又は他の免疫機能における、例えばプロ−炎症サイトカイン、例えばIL−ILF（但し、それだけには限定されない）の結合における役割点を確証した。さらに、zcytor11発現の検出は、例えば組織学的サンプルにおける単核細胞のためのマーカーとして使用され得る。
【０２２３】
zcytor11は、単核細胞、例えば正常組織（リンパ節、脾臓、胸腺、膵臓、腎臓、肝臓及び肺）、及び異常組織（炎症虫垂、肺癌、卵巣癌、膵炎、炎症性皮膚及び前立腺癌）において発現される。リンパ節、腸及び肺癌における血漿細胞がzcytor11に関して陽性であることは、注目すべきである。血漿細胞は、抗体合成を担当する、免疫学的に活性化されたリンパ球である。さらに、IL−TIFは、活性化されたT細胞において発現され、そしてzcytor11の発現は静止CD19＋細胞においてのみ検出された（例13）（但し、活性化された細胞においては検出されなかった）。従って、zcytor11は、一定のリンパ球、例えば単核リンパ球及び制限された型の活性化されたリンパ球、例えば静止CD19＋の単離においてマーカーとして又は標的物として使用され得る。
【０２２４】
さらに、免疫細胞、例えばCD8＋T細胞及びCD19＋B細胞におけるzcytor11発現の存在は、zcytor11が外来性侵入体、例えば微生物及び細胞残骸に対する身体の免疫防御反応に関与し、そして炎症及び癌形成の間、免疫応答において役割を演じることを示した。zcytor11受容体の活性化は、自己免疫及び炎症疾患、例えばGVHD、敗血症及び狼痕を引き起こすことができる。
【０２２５】
さらに、本明細書において論じられるように、いくつかの上皮形組織、例えば皮膚、腎臓、腸、肝細胞（内皮由来の上皮）、肺胞上皮（内皮由来の上皮）及び卵巣癌上皮（中胚葉由来の上皮）は、zcytor11発現に関して陽性であった。それらの組織における炎症応答は、急性/慢性炎症疾患、例えば乾癬（皮膚）、最終段階腎疾患ESRD（腎臓）、IBD（クローン病、大腸炎）（腸）及びぜん息/呼吸アレルギー/慢性気管支炎（肺）を引き起こすことができる。
【０２２６】
zcytor11の上皮発現は、肝臓及び肺における炎症応答及び/又は癌状態において変更され得る。従って、zcytor11、例えばIL−TIF又はその受容体結合フラグメントのためのリガンドが、炎症又は癌の結果として、それらの組織における変化をモニターするためにマーカーとして使用され得る。さらに、zcytor11現場発現の分析は、正常卵巣上皮がzcytor11発現に関して陰性であり、ところがそれは、卵巣癌上皮において強い陽性であることを示し、このことは、IL−TIFポリペプチド又はその受容体結合フラグメントが、本明細書に記載されるように、卵巣癌の診断及び処理のために診断マーカー及び/又は治療標的物として使用され得る証拠をさらに提供する。
【０２２７】
zcytor11はまた、他の組織、例えば膵臓（正常及び膵炎組織）における腺房細胞、胎盤（外胚葉由来の）における栄養膜、軟骨（中胚葉由来のにおける軟骨細胞、及び腸（外胚葉由来の）における神経節細胞においても検出された。zcytor11自体は、それらの器官における対応する細胞の分化及び/又は正常機能に関与している。zcytor11の可能性ある使用は、正常な代謝及び妊娠、骨形成/恒常性、及び腸の生理学的機能の維持及び同様のものを包含する。さらに、IL−TIFのアップ−レギュレーションは、一定の炎症性疾患、例えば膵炎、リウマチ様関節炎、IBD（大腸炎及びクローン病）を導くそれらの組織における炎症応答を実質的に引き起こすことができる。
【０２２８】
例 15．ノザンブロット及び PCR を用いての組織パネルにおけるヒト zcytor11 組織分布
A. PCR を用いての組織パネルにおけるヒト zcytor11 組織分布
ヒト組織からのcDNAのパネルを、PCRを用いて、zcytor11発現についてスクリーンした。パネルは自家製造され、そして種々の正常及び癌性ヒト組織からの94種のマラソンcDNA及びcDNAサンプルを包含し、そして細胞系は下記表４に示される。PCR反応の他に、使用される方法は、例12に示される通りであった。PCR反応は、オリゴヌクレオチドZC14,666（配列番号11）及びZC14,742（配列番号12）、Advantage 2 cDNAポリメラーゼ混合物（Clontech, Palo Alto, CA）及びRediload色素（Research Genetics, Inc., Huntsville, AL）を用いて設定された。
【０２２９】
増幅を、次の通りにして行った：94℃で２分（１サイクル）、94℃で15秒、51℃で30秒、及び72℃で30秒（40サイクル）、続いて72℃で７分（１サイクル）。正しい予測されるDNAフラグメントは、膀胱、脳、頸部、結腸、胎児脳、胎児心臓、胎児腎臓、胎児肝臓、胎児肺、胎児皮膚、心臓、腎臓、肝臓、肺、メラノーマ、卵巣、膵臓、胎盤、前立腺、直腺、唾液腺、小腸、卵巣、胸腺、気管支、脊椎、甲状腺、肺腫瘍、卵巣腫瘍、直腸腫瘍、及び胃腫瘍において観察された。zcytor11発現は、このパネルにおいて試験された他の組織及び細胞系においては観察されなかった。
【０２３０】
市販の第１鎖cDNAパネル（Human Blood Fractions MTC Panel, Clontech, Palo Alto, CA）をまた、上記のようにしてアッセイした。パネルは次のサンプルを含んだ：単核細胞、活性化された単核細胞、静止CD4＋細胞、活性化されたCD4＋細胞、静止CD8＋細胞、活性化されたCD8＋細胞、静止CD14＋細胞、静止CD19＋細胞及び活性化されたCD19＋細胞。活性化されたCD8＋及び活性化されたCD19＋を除くすべてのサンプルは、zcytor11の発現を示した。
【０２３１】
【表３】
Figure 0005015404
【０２３２】
B. RT − PCR を用いてのヒト細胞系及び組織パネルにおける zcytor11 の組織分布
ヒト細胞系からのRNAのパネルを、RT−PCRを用いて、zcytor11発現についてスクリーンした。パネルは自家製造され、そして第５表〜第８表に示されるように、種々の正常及び癌性ヒト組織及び細胞系からの84種のRNAを含んだ。RNAは、自家又は購入された組織及び細胞系から、RNAeasy Midi又はMiniキット（Qiagen, Valencia, CA）を用いて製造された。パネルは、サンプル当たり100ngのRNAを用いて、96−ウェル型で設定された。RT−PCR反応は、オリゴヌクレオチドZC14,666（配列番号11）及びZC14,742（配列番号12）、Rediload組織及びSUPERSCRIPT One RT-PCR System (Life Technologies, Gaithersburg, MD) を用いて設定された。
【０２３３】
増幅を次の通りにして行った：50℃で30分（１サイクル）、続いて94℃で15秒、52℃で30秒、72℃で30秒、次に72℃で７分の最終延長（45サイクル）。８〜10μlのPCR反応生成物を、４％アガロースゲルを用いて、標準のアガロースゲル電気泳動にゆだねた。正しい推定されるcDNAフラグメントは、副腎、膀胱、***、気管支、正常結腸、結腸癌、十二指腸、子宮内膜、食道、胃癌、胃食道癌、心室、腸骨、正常腎臓、肝臓癌、肝臓、肺、リンパ節、膵臓、耳下腺、皮膚、小腸、胃、甲状腺及び子宮において観察された。
【０２３４】
zcytor11の発現を示す細胞系は、A-431、 分化されたCaCo2、 DLD-1、 HBL-100、 HCT-15、 HepG2、 HepG2+IL6、 HuH7及びNHEK#1-4であった。zcytor11発現は、このパネルにおいて試験された他の組織及び細胞系においては観察されなかった。Zcytor11の発現パターンは、特定組織及び組織特異的腫瘍における発現を示す。当業者は、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体及び結合パターンが、生検、組織又は組織学的サンプル、特にzcytor11が発現される組織における癌又は癌性組織を検出するための診断剤として使用され得る。本発明の分子のためのそのような診断使用は、当業界において知られており、そして本明細書に記載されている。
【０２３５】
さらに、zcytor11、すなわちIL−TIF受容体の１つの発現パターンは、一定の特定の組織における発現を示すので、天然のリガンドIL−TIFを包含する結合パターンはまた、生検、組織又は組織学的サンプルにおける、特にIL−TIF受容体が発現される組織における特定の組織（正常又は異常）、癌又は癌組織を検出するための診断剤として使用され得る。IL−TIFはまた、その受容体、例えばzcytor11及びCRF2−4が発現される他の組織を標的化するために使用され得る。さらに、そのような結合パターンは、腫瘍又は疾病組織の部位に治療を標的化するために、化学療法剤、毒性成分及び同様のものに結合され得る。そのような診断及び標的化された治療は、当業界において知られており、そして本明細書に記載されている。
【０２３６】
zcytor11の発現パターン（上記）は、IL−TIFの作用のための標的組織及び細胞型、及び従って、IL−TIFアンタゴニスト、例えば本発明の可溶性zcytor11受容体を示した。zcytor11は一般的に、次の３種の生理学的システムにおいて発現される：消化系、女性生殖系及び免疫系。受容体系（zcytor11）の発現パターンは、本発明の可溶性zcytor11受容体のIL−TIFアンタゴニストが、次の２種の領域、すなわち炎症（例えば、IBD、クローン症、膵炎）及び癌（例えば、卵巣、結腸）におけるヒト疾病のための治療に使用されることを示した。すなわち、本発明のポリヌクレオチド及び抗体は、炎症、及びzcytor11受容体を発現する細胞とのIL−TIF相互作用の他のサイトカイン誘発効果を拮抗するために使用され得る。
【０２３７】
さらに、zcytor11の発現は、潰瘍性大腸炎組織、IL−６により誘発されたHepG2肝臓細胞系、活性化されたCD8＋T−細胞及びCD19＋B−細胞においてダウンレギュレートされるか又は不在であると思われた。それらのRT−PCR実験は、CD10＋末梢血液細胞、すなわちBリンパ球がIL−TIFのための受容体、すなわちzcytoR11を発現することを示す。本発明の可溶性zcytor11受容体は、B細胞に対するIL−TIFの効果を中和するためにアンタゴニストとして作用する。
【０２３８】
これは、B細胞がキープレーヤーである次の疾患において有益である：自己免疫疾患、例えば全身性エリトーマシス（SLE）、重症筋無力症、免疫複合体病、及びIL−TIFにより悪化されるB−細胞癌。また、B細胞が疾病病理学に寄与する次の自己免疫患者は、zcytor11可溶性受容体治療のための標的である：多発性硬化症、炎症性腸疾患（IBD）及びリウマチ様関節炎。可溶性zcytor11受容体治療は、アトピー性疾患、例えばぜん息、アレルギー性及びアトピー性皮膚炎（IgEの生成が疾病の病原に寄与する）においてIgEを生成するB細胞を低めるか又は阻害するために有益である。
【０２３９】
B細胞悪性疾患は、サイトカイン、例えばIL−TIFによる調節の欠失を示すことができる。手術による再切開又は化学療法に続いての本発明の可溶性zcytor11受容体の投与は、B細胞悪性疾患を有する患者における最少の残存疾患を処理するために有用であり得る。調節の欠失は、zcytoR11の高められた発現の維持を導くことができる。従って、zcytoR11包含受容体、例えば本明細書に記載されるそれらを標的化する治療用モノクローナル抗体のための標的物を創造する。
【０２４０】
【表４】
Figure 0005015404
【０２４１】
【表５】
Figure 0005015404
【０２４２】
【表６】
Figure 0005015404
【０２４３】
【表７】
Figure 0005015404
【０２４４】
【表８】
Figure 0005015404
【０２４５】
C. RT-PCR を用いてのヒト Origene TM 組織及びヒト血液画分 MTC パネルにおける zcytor11 の組織分布
ヒト組織、すなわちヒトOrigeneTM 組織ヒト血液画分MTCパネル（Origene Technologies, Reckville, MD；及びClontech, Palo Alto, CA）からのRNAのパネルを、RT−PCRを用いて、zcytor11発現についてスクリーンした。パネルは、下記第９表〜第10表に示されるように、上昇する濃度での種々の正常ヒト組織からの24種のRNAを含んだ。RT−PCR反応を、Advantage PCRキット（Clontech）を用いて、オリゴヌクレオチドZC37,693（配列番号31）及びZC37,449（配列番号32）を用いて設定した。増幅を次の通りにして行った：94℃で２分（１サイクル）、94℃で15秒、72℃で1.5分、72℃で２分（35サイクル）、続いて４℃での維持。８〜10μlのPCR反応生成物を、４％アガロースゲルを用いて、標準のアガロースゲル電気泳動にゆだねた。
【０２４６】
第９表に示されるように、Origene Panelを用いて、正しい推定されるcDNAフラグメントサイズ（440bp）が、膵臓、筋肉、胎盤、PBL、骨髄及び胎児脳を除くすべての組織に観察された。しかしながら、小腸、結腸、腎臓、皮膚、肺、膵臓及び肝臓において、特に高い発現が存在した。zcytor11の弱い発現がまた、卵巣、子宮、前立腺、脳、心臓、卵巣、胃及び甲状腺において観察された。zcytor11発現は、このパネルにおいて試験された他の組織及び細胞系においては観察されなかった。
【０２４７】
zcytor11の発現パターンは、特定の組織における発現を示す。当業者は、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体及び結合パートナーが、生検、組織、又は組織学的サンプル、特にzcytor11が発現される組織におけるそのような組織、癌又は癌組織を検出するための診断剤として使用され得ることを認識する。本発明の分子についてのそのような診断使用は、当業界において知られており、そして本明細書に記載される。
【０２４８】
第10表に示されるように、ヒト血液画分MTCパネルを用いて、正しい推定されるcDNAフラグメントサイズ（440bp）が、単核細胞、静止CD8＋細胞、静止CD19＋細胞及び胎盤において観察された。zcytor11発現は、このパネルにおいて試験された他の組織及び細胞系、例えば活性化されたCD8＋及びCD19＋細胞において観察された。zcytor11の発現パターンは、特定の組織における発現を示す。当業者は、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体及び結合パターンが、生検、組織又は組織学的サンプル、特にzcytor11が発現される組織におけるそのような組織、癌又は癌組織を検出するための診断剤として使用され得ることを認識する。本発明の分子についてのそのような診断使用は、当業界において知られており、そして本明細書に記載される。
【０２４９】
【表９】
Figure 0005015404
【０２５０】
【表１０】
Figure 0005015404
【０２５１】
D. RT − PCR を用いてのヒト一次免疫細胞及び免疫細胞系における zcytor11 の組織分布
一次ヒト免疫細胞集団及びヒト免疫細胞系からのRNAのパネルを、RT−PCRを用いてzcytor11発現についてスクリーンした。パネルは、自家製造され、そして下記表11に示されるように、種々の静止及び活性化された細胞集団及び細胞系からの24種のRNAを含んだ。すべての一次免疫細胞集団は、何人かの匿名のドナーの血液から単離された。次に、種々の免疫細胞サブセット（CD4＋、CD8＋、CD14＋、CD19＋及びCD56＋）を、Miltenyi Biotecからの微小ビース及び磁気細胞分離システムを用いて単離した。RNAを、RNeasy MidiprepTM キット（Qiagen, Valencia, CA）を用いて、その製造業者の説明書に従って、それらの静止状態でのCD19＋及びDC56＋集団から調製した。
【０２５２】
CD4＋及びDC8＋集団を、200ng/mlのプレート−結合された抗−CD3抗体及び５μg/mlの可溶性抗−CD28抗体を用いて活性化し、そして細胞を、０、４及び６時間で、RNA単離のために集めた。CD19＋サンプルを、ヒト扁桃から単離し、そして0.5μg/mlのイノマイシン及び10ng/mlのPMAにより活性化された。次に、細胞を、０、４及び24時間で集め、そしてRNAを単離した。ヒトCD14＋単球を、0.1μg/mlのLPS又は1.0μg/mlのLPSのいずれかにより、20時間、活性化した。次に、静止及び活性化された細胞を集め、そしてRNAを単離した。さらに、RNAを、静止及び活性化された（10.0μg/mlのLPS）ヒト単球細胞系HL−60、THP−１及びU937から単離した。また、静止Raji、Ramos, Daudi及びJurkat RNAを試験した。
【０２５３】
RT−PCR反応は、白金Tgqと共にSuperscript One−Steq RT-PCRシステムを使用した。個々の25μlの反応物は、次のものから成った：12.5μlの２×反応緩衝液、0.5μl（20pモル/μl）のZC14,666（配列番号11）、0.5μl（20pモル/μl）のZC14,742（配列番号12）、0.4μlのRT/Taqポリメラーゼ混合物、10μlのRNアーゼを含まない水、1.0μlの鋳型RNA（100ng/μl）（Life Technologies, Gaithersburg, MD）。増幅を次の通りに行った。50℃で30分（１サイクル）、続いて、94℃で30秒、52℃で30秒、72℃で60秒（35サイクル）、次に72℃で７分間の最終延長。
【０２５４】
８〜10μlのPCR反応生成物を、２％アガロースゲルを用いて、標準のアガロースゲル電気泳動にゆだねた。正しい推定されるcDNAフラグメントサイズは、静止CD19＋B細胞において観察され、そして活性化されたCD19＋B細胞、静止CD8＋T細胞、CD56＋NK細胞及び活性化されたCD14＋単球においては、より低く観察された。zcytor11の発現を示す細胞系は、Jurkat、活性化されたTHP−１及び活性化されたHL−60であった。zcytor11発現は、このパネルにおいて試験された他の組織及び細胞系においては観察されなかった。それらの結果は、いくつかの免疫細胞集団及び免疫細胞系におけるzcytor11の発現を示す。
【０２５５】
【表１１】
Figure 0005015404
【０２５６】
例 16．CRF2-4 受容体を発現する BaF3 細胞（ BaF3/CRF2-4 細胞）及び zcytor11 受容体と共に CRF2-4 受容体を発現する BaF3 細胞（ BaF3/CRF2-4/zcytor11 細胞）の構成
十分な長さのCFR2-4受容体を発現するBaF3細胞を、下記CFR2-4発現ベクター30μgを用いて構成した。CFR2-4受容体を発現する前記BaF3細胞を、BaF3/CFR2-4を命名した。それらの細胞を対照として使用し、そしてさらに、十分な長さのzcytor11受容体によりトランスフェクトし（アメリカ特許第5,965,704号）、そして下記のようにしてIL−TIF活性についてのスクリーンを構成するために使用した。
【０２５７】
A．CRF2-4 受容体を発現する BaF3 細胞の構成
CRF2-4（Genbank受容体番号Z17227号）の十分な長さのcDNA配列を、Daudi細胞系cDNAライブラリーから単離し、そして次に、発現ベクターpZP7P中にクローン化した。
BaF3、すなわちネズミ骨髄に由来するインターロイキン−3 (IL-3) 依存性プレ−リンパ球細胞系（Palacios and Steinmetz, Cell 41: 727-734, 1985; Mathey-Prevot など．，Mol. Cell. Biol. 6:4133-4135, 1986）を、10％熱−不活性化されたウシ胎児血清、2ng/mlのネズミIL-3 (mIL-3) (R&D. Minneapolis, MN)、2mMのL-glutaMax-1TM (Gibco BRL), 1mMのピルビン酸ナトリウム（Gibco BRL）及びPSN抗生物質（Gibco BRL）により補充された完全倍地（RPMI培地（JRH Bioscience Inc., Lenexa, KS））において維持した。
【０２５８】
エレクトロポレーションの前、CRF2-4/pZP7Pを調製し、そしてQiagen Maxi Prepキット（Qiagen）を用いて、製造業者の説明書に従って精製した。エレクトロポレーションのためのBaF3細胞を、血清フリーRPMI培地により１度洗浄し、そして次に、血清フリーRPMI培地に107個の細胞/mlの細胞密度で再懸濁した。１mlの再懸濁されたBaF3細胞を、30μgのCRF2-4/pZP7PプラスミドDNAと共に混合し、そして別々の使い捨てエレクトロポレーションチャンバー（GIBCO BRL）に移した。
【０２５９】
室温で、15分間のインキュベーシヨンの後、細胞に、エレクトロポレーション装置（CELL-PORATORTM; GIBCO BRL）により供給される２回の連続したショック（800 1Fad/300V.; 1180 1Fad/300V.）を与えた。５−分間の回収時間の後、エレクトロポレートされた細胞を、50mlの完全培地に移し、そしてインキュベーターに、15−24時間（37℃、5％CO2）配置した。次に、細胞を回転沈降し、そしてT-162フラスコにおいて、2μg/mlのプロマイシンを含む完全培地50mlに再懸濁し、プロマイシン耐性プールを単離した。この後、BaF3/CRF2-4細胞と呼ばれる、トランスフェクトされたBaF3細胞のプールを、下記のようにして、シグナル化能力についてアッセイした。さらに、それらの細胞を、下記のようにして、zcytor11受容体によりトランスフェクトした。
【０２６０】
B．CRF2-4 及び zcytor11 受容体を発現する BaF3 細胞の構成
十分な長さのzcytor11受容体を発現するBaF3/CRF2-4細胞を、上記例６に記載されるzcytor11発現ベクター30μgを用いて、上記例5Aに従って構成した。回収に続いて、トランスフェクタントを、200μg/mlのゼオシン及び2μg/mlのプロマイシンを用いて選択した。zcytor11受容体を発現するBaF3/CRF2-4細胞を、BaF3/CRF2-4/zcytor11細胞として命名した。それらの細胞を用いて、IL−TIF活性、及び例17に記載されるzcytor16アンタゴニスト活性についてスクリーンした。
【０２６１】
例 17．Alamar ブルー増幅アッセイにおける BaF3/CRF2-4/zcytor11 細胞を用いての CRF2-4 zcytor11-Fc 活性についてのスクリーニング
BaF3/CRF2-4/zcytor11細胞（例16）を、回転沈降し、そしてPBSにより２度、洗浄し、mIL-3除去を確証し、そして次に、回転し、そして上記例16に記載される完全培地（RPMI 1640,10％FBS, 1％GlutaMAX, 1%ピルビン酸ナトリウム）（但し、mIL3を含まない）（この後、“mIL-3フリー培地”と言及する）に再懸濁した。次に、細胞を、血液計により計数した。細胞を、mIL-3フリー培地を用いて、ウェル当たり50μlの体積でウェル当たり500個の細胞で、96−ウェルプレートにプレートした。
【０２６２】
IL−TIFタンパク質を、mIL-3フリー培地により、及びまた、トランスフェクトされたBHK細胞（例７）から製造された約0.4μg/mlの濃度でのCRF2-4/zcytor11-Fcならし培地により、200pg/mlに希釈した。CRF2-4/zcytor11-Fc CMを、mIL-3フリー/IL−TIF培地により、96−ウェルプレート上のすべての８個の横列上に連続して１：２希釈度で、個々のウェルに50μlの体積を残しながら希釈した。次に、これを、50μlの細胞に添加し、すべてのウェルにおいて100pg/mlの最終IL−TIF濃度及び約200, 100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.1及び1.6ng/mlの最終CRF2-4/zcytor11-Fc濃度、及び100μlの合計アッセイ体積にした。
【０２６３】
アッセイプレートを、37℃、５％CO2下で４日間インキュベートし、この時点で、Alamarブルー（Accumed，Chicago, IL）を、20μl/ウェルで添加した。プレートを再び、37℃、５％CO2下で24時間インキュベートした。Alamarブルーは、生存細胞の数に基づいて蛍光読み出しを付与し、そして従って、負の対照に比較しての細胞増殖の直接的な測定を付与する。プレートを、Wallac Victor2 1420 Multilabel Counter (Wallac, Turku, Finland) 上で、530（励起）及び590（発光）の波長で読み取った。
【０２６４】
結果は、BaF3/CRF2-4/zcytor11細胞に対するIL−TIFの増殖効果のCRF2-4/zcytor11-Fcによる用量依存性阻害を確証した。IL−TIFは単独で、バックグラウンドよりも30倍、細胞を刺激した。CRF2-4/zcytor11-Fcは、25〜200ng/mlの濃度でその増殖を完全に阻害し、3.1〜12.5ng/mlで増殖を部分的に阻害し、そして阻害1.6ng/mlでほとんど検出できなかった。同じ設定が、mIL−TIFにより行われ、そして類似する結果を生成した。
【０２６５】
例 18．zcytor11 のみ、 CRF2-4 のみ、 zcytor11/CRF-4 又は zcytor11/pDIRS1 を発現する BaF3 −トランスフェクタントの流動細胞計測分析
zcytor11のみ、CRF2-4のみ、zcytor11/CRF2-4又はzcytor11/pDIRS1によりトランスフェクトされたBaF3細胞を、例16に記載のようにして、それぞれのサイトカイン受容体により生成した。手短には、30μgのzcytor11/pZP7Zを、エレクトロポレーションを用いて、BaF3細胞中にトランスフェクトし、そして安定したトランスフェクタント（BaF3/zcytor11）を、200μg/mlのゼオシンにより選択した。同様に、BaF3細胞を、CRF2-4/pZP7Pによりトランスフェクトし、そしてトランスフェクタント（BaF3/CRF2-4）を、２μg/mlのプロマイシンにより選択した。
【０２６６】
続いて、30μgのCRF2-4/pZP7Pを、エレクトロポレーションを用いて、BaF3/zcytor11細胞中にトランスフェクトし、そして安定した細胞系（BaF3/zcytor11/CRF2-4）を、200μg/mlのゼオシン及び２μg/mlのプロマイシンにより選択した。同様に、30μgのpDIRS1/pZP7Pを、エレクトロポレーションを用いて、BaF3/zcytor11細胞中にトランスフェクトし、そして安定した細胞系（BaF3/zcytor11/pDIRS1）を、200μg/mlのゼオシン及び２μg/mlのプロマイシンにより選択した。BHKトランスフェクタントを、BaF3トランスフェクタントのためのzcytor11，CRF2-4又はpDIRS1のいずれかの同じ発現ベクターを用いて生成した。DNAを、LipofectamineTM (Gibco BRL, Gaitersburg, MD) を用いて、BHK細胞中に、製造業者の説明書に従ってトランスフェクトし、選択を、BaF3選択についての同じプロトコールに従って、トランスフェクションの48時間後、開始した。
【０２６７】
ヒトIL−TIF−CEE（例12）タンパク質のビオチニル化を次の通りにして行った：DMSOに溶解された1.6μlの10％Tween20、50μlの１Mの硼酸（pH8.5）及び42μlの0.9mg/mlのEZ−様Sulfo−NHS−LC−ビオチン（Pierce, Rockford, IL）を、100μlの2.2mg/mlのIL−TIF−CEE中に添加した。室温での１時間のインキュベーションの後、反応を、２Mのグリシン10μlにより10分間、急冷した。
【０２６８】
いくつかの可能性ある受容体成分へのIL−TIFリガンドの結合性質を試験するために、BaF3及びBHK細胞を、発現プラスミド、例えばzcytor11のみ、CRF2-4のみ（Genbank受託番号Z17227号）、zcytor11（配列番号１）及びCRF2-4、又はzcytor11及びpDIRS1（WIPO公開WO99/46379号、Schering Corporation, 1999） により、上記のようにしてトランスフェクトした。トランスフェクトされていないBaF3及びBHK細胞は、対照として包含された。細胞を、FACS洗浄緩衝液（WB：３％ヒトUltrasperm（Gemini BioProducts, Calabasas, CA）により補充されたPBS/1％BSA）に再懸濁し、計数し、そして１×106個の個々のタイプを、5mlのポリスチレン管中に等分した。
【０２６９】
細胞を洗浄し、そしてペレット化し、次に、100μlのWBのみ、又はWB＋10μg/ml又は１μg/mlビオチニル化されたzcyto10タンパク質と共に氷上で20％間インキュベートした。細胞を、1.5mlのWBにより洗浄し、そしてペレット化し、次に、100μlの2.5μg/mlのフィコリリトリン−接合ストレプタビシン（PE-SA, Pharmingen, San Diego, CA）において、氷上でさらに20分間、インキュベートした。細胞を、前記のようにして洗浄し、0.4mlのWBに再懸濁し、そしてCellQuestソフトウェア（Becton Dickinson, Moutain View, CA）を用いて、FACScam上で分析した。
【０２７０】
ビオチン−IL−TIFは、zcytor11（すなわち、単独で、又はCRF2-4又はDIRS1と組合してトランスフェクトされたzcytor11）を含む、すべての３種のトランスフェクトされたBaF3細胞系に対して、用量依存性態様で結合したが、しかし親系又はBaF3×CRF2-4トランスフェクトに対して結合しなかった。同じ結果が、その対応するBHKトランスフェクタントにより得られた。
前述から、本発明の特定の態様が例示のために本明細書において記載されて来たが、種々の修飾が本発明の範囲内で行われ得ることが理解されるであろう。従って、本発明は、請求の範囲を除いて制限されない。
【配列表】
Figure 0005015404
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Claims (20)

  1. ポリヌクレオチドであって、当該ポリヌクレオチドは、
    （Ａ）配列番号：８に示されるアミノ酸配列を含んで成るIL-TIFに結合し、そして配列番号：３に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも90％の同一性を有するアミノ酸残基の配列を含んで成る第一の受容体サブユニット、及び
    （Ｂ）配列番号：33に示されるアミノ酸配列を含んで成る可溶性CRF2-4受容体ポリペプチドを含んで成る第二の受容体サブユニット、
    をコードし、ここで、前記第一の受容体サブユニット及び第二の受容体サブユニットは、IL-TIFに結合する又は拮抗するヘテロダイマーサイトカイン受容体複合体を形成することができる、
    ことを特徴とするポリヌクレオチド。
  2. 前記第一の受容体サブユニットが、配列番号：３に示されるアミノ酸残基の配列を含んで成る、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
  3. 前記第一の受容体サブユニットが配列番号：３に示されるアミノ酸残基の配列から成り、そして前記第二の受容体サブユニットが配列番号：33に示されるアミノ酸配列を含んで成る可溶性CRF2-4受容体ポリペプチドから成る、請求項１又は２に記載のポリヌクレオチド。
  4. 下記の要素：
    （ａ）配列番号：３に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも90％の同一性を有するアミノ酸残基の配列を含んで成り、IL-TIFに結合する可溶性サイトカイン受容体ポリペプチドをコードする第一のDNAセグメント；
    （ｂ）配列番号：33に示されるアミノ酸配列を含んで成る可溶性CRF2-4受容体ポリペプチドをコードする第二のDNAセグメント；
    （ｃ）前記第一のDNAセグメントに作用可能に連結されている第一の転写プロモーター及び第一の転写ターミネーター；
    及び
    （ｄ）前記第二のDNAセグメントに作用可能に連結されている第二の転写プロモーター及び第二の転写ターミネーター；
    を含んで成る発現ベクター。
  5. 前記第一のDNAセグメントに作用可能に連結されている第一の分泌シグナル配列、及び前記第二のDNAセグメントに作用可能に連結されている第二の分泌シグナル配列を更に含んで成る、請求項４に記載の発現ベクター。
  6. 請求項４又は５に記載の発現ベクターを含んで成る培養された細胞。
  7. 第一の発現ベクター及び第二の発現ベクターを含んで成る培養された細胞であって、
    （ａ）前記第一の発現ベクターが、第一の転写プロモーター、当該第一の転写プロモーターに作用可能に連結された第一のDNAセグメント及び当該第一のDNAセグメントに作用可能に連結された第一の転写ターミネーターを含んで成り、ここで当該第一のDNAセグメントは、配列番号：３に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも90％の同一性を有するアミノ酸残基の配列を含んで成り、IL-TIFに結合する可溶性サイトカイン受容体ポリペプチドをコードし；そして
    （ｂ）前記第二の発現ベクターが、第二の転写プロモーター、当該第二の転写プロモーターに作用可能に連結された第二のDNAセグメント及び当該第二のDNAセグメントに作用可能に連結された第二の転写ターミネーターを含んで成り、ここで当該第二のDNAセグメントは、配列番号：33に示されるアミノ酸配列を含んで成る可溶性CRF2-4受容体ポリペプチドをコードする；
    ことを特徴とする培養された細胞。
  8. 前記DNAセグメントによりコードされた可溶性ヘテロダイマーサイトカイン受容体複合体を発現する、請求項６又は７に記載の培養された細胞。
  9. 前記可溶性ヘテロダイマーサイトカイン受容体複合体を分泌する、請求項８に記載の培養された細胞。
  10. 前記可溶性ヘテロダイマーサイトカイン受容体複合体が、配列番号：８に示されるアミノ酸配列を含んで成るIL-TIFと結合するか又は配列番号：８に示されるアミノ酸配列を含んで成るIL-TIFの活性に拮抗する、請求項９に記載の培養された細胞。
  11. 配列番号：８に示されるアミノ酸配列を含んで成るIL-TIFと結合するか又は配列番号：８に示されるアミノ酸配列を含んで成るIL-TIFの活性に拮抗する可溶性サイトカイン受容体であって、当該可溶性サイトカイン受容体はヘテロダイマー受容体複合体を含んで成り、当該ヘテロダイマー受容体複合体は、
    （Ａ）IL-TIFに結合しそして配列番号：３に対して少なくとも90％のアミノ酸残基の配列を含んで成る第一の受容体サブユニット；及び
    （Ｂ）配列番号：33に示されるアミノ酸配列を含んで成る可溶性CRF2-4受容体ポリペプチドを含んで成る第二の受容体サブユニット；
    を含んで成る、ことを特徴とする可溶性サイトカイン受容体。
  12. 前記第一の受容体サブユニットが、配列番号：３に示されるアミノ酸残基の配列を含んで成り、請求項11に記載の受容体。
  13. 前記第一の受容体サブユニットが配列番号：３に示されるアミノ酸残基の配列から成り、そして前記第二の受容体サブユニットが配列番号：33に示されるアミノ酸配列を含んで成る可溶性CRF2-4受容体ポリペプチドから成る、請求項11に記載の受容体のヘテロダイマー複合体。
  14. 前記受容体サブユニットの少なくとも１つが、親和性標識、ラベル、化学的成分、毒素、ビオチン／アビジン標識、放射性核種、酵素、基質、コファクター、阻害剤、蛍光マーカー、化学発光マーカー、細胞障害性分子、又は免疫グロブリンFcドメインを更に含んで成る、請求項11〜13のいずれか１項に記載の受容体のヘテロダイマー複合体。
  15. 可溶性ヘテロダイマー受容体ポリペプチドの製造方法において、
    （ａ）請求項６〜10のいずれか１項に記載の細胞を培養し；そして
    （ｂ）当該細胞により発現された可溶性ヘテロダイマー受容体ポリペプチドを単離する；
    ことを含んで成る方法。
  16. 造血細胞又は造血細胞の子孫のIL-TIFで誘導される分化又は増殖を阻害するためのイン−ビトロ法であって、請求項11〜14のいずれか１項に記載の可溶性サイトカイン受容体を含んで成る組成物と共に、骨髄細胞又は末梢血細胞を培養することを含んで成る方法。
  17. 前記造血細胞又は造血細胞の子孫がリンパ系細胞である、請求項16に記載の方法。
  18. 前記リンパ系細胞がマクロファージ又はＴ細胞である、請求項17に記載の方法。
  19. 炎症を減少させ又は炎症応答を抑制するための、請求項11〜14のいずれか１項に記載の受容体を含んで成る医薬組成物。
  20. 炎症性疾患に罹患している哺乳類を治療するための、請求項19に記載の医薬組成物。
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