JP4868152B2 - 癌細胞の悪性度判定法 - Google Patents
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Description
これまでのところ、病態や腫瘍マーカー、病理組織検査などによって癌の悪性度を判定(鑑別)することが試みられている。しかしながら、ほぼすべての悪性腫瘍に共通して採用できる決定的な判定手法は確立されていないのが現状である。また、従来の判定手法では、同程度の悪性度と判定される二つの病態であってもそれらの予後が全く異なることも多く経験されるために、それらの鑑別が望まれているところである。
尚、本発明に関連する報告を以下に列挙する。
本発明は以上の背景に鑑み、癌細胞の悪性度を簡便に判定するための手段を提供することを目的とする。
number:L32832を参照)を配列番号3に示す。)とATBF1-B(306kDa、アミノ酸配列を配列番号4に示す。また、ATBF1-Bをコードする塩基配列(GenBank accession
number:L32833を参照)を配列番号5に示す。)の存在が知られている(非特許文献1を参照)。尚、ATBF1-Aはタンパク質N末端側がATBF1-Bよりも920アミノ酸長い構造を有している。
また既報(非特許文献6)ですでに示したごとく、胃癌の培養細胞において、ATBF1は癌抑制遺伝子p53と蛋白−蛋白結合し機能する。このATBF1とp53複合体が癌抑制遺伝子p21のプロモーターを活性化して、p21の発現上昇を導き、癌細胞をアポトーシスに陥らせることが想定される。実際にある種の抗ガン剤(アルキル化剤)を作用させてDNA修飾シグナルを活性化するとATBF1の発現を誘導する事実も明らかになっている。癌治療効果はATBF1の誘導および、ATBF1を細胞質から核へ移動させる効果に大きく依存する。これは本発明者らが、以下臨床的な応用実験でATBF1の発現様式から各種癌細胞のアポトーシス、各種治療の効果を評価する原理となっている。
(1)癌の悪性度によって局在が大きく異なるのはD1-120が認識する部位(D1-120部位)とAT6が認識する部位(AT6部位)である。従ってこれらの部位を検出することは、癌の悪性度を判定する上での重要度が高い。また、D1-120単独での検索が癌の悪性度の判定の指標となることが明らかとなっており(後述の実施例を参照)、癌細胞の悪性度判定においてD1-120部位の検出が最も重要であると考えられる。一方で、D1-120部位とAT6部位の局在を同時に検討する事により、より特異性の高い悪性度判定法を提供できることが判明した。
(2)D1-120以外の抗体を使用した研究により、ATBF1は腫瘍の種類あるいは悪性化に伴い、一つの巨大タンパク質として常に存在している訳ではなく、タンパク質のプロセッシングを受けたり、あるいは時にはATBF1遺伝子転写の際にmRNAのaltenative
splicingによりエクソンのスキッピングが起こり、タンパク質構造に変化が起こる病態が存在する事が明らかになった。(図47を参照)。
(3)NT440と1-12の染色性はともに概して核主体に局在する傾向であった。従って、これらの抗体が認識する部位、即ちATBF1遺伝子のエクソン3に対応するN末端のATBF1部位の検出は細胞全体でのATBF1量が増加、減少したのか、あるいはATBF1が欠落するかの指標になる。またNT440が細胞質に残り1-12が核に存在する場合には148番のセリンがリン酸化を受けATBF1のN末端が核に移行するという動きが存在する事を意味するから、NT440と1-12で染色されるタンパク質量の比率を求めれば同部の核移行の比率を知る事が可能である。さらにNT440部位又は1-12部位の存在、欠落、核細胞質の局在位置を、ATBF1タンパク質中央を認識する抗体(D1-120)及び/又はC末端側を認識する抗体の染色性と比較する事で、ATBF1タンパク質のプロセッシングの状況、さらにはmRNAレベルで起こる異常なスプライシングによるエクソンスキップの判定が可能である。以上の理由から巨大な転写因子であるATBF1のゲノム構造異常の全体像を正確に把握するには、重要なDNA結合ドメインをコードするのエクソン10に対応する抗体のみならず、N末端をコードするエクソン3に対応する抗体(さらにはC末端をコードするエクソン11に対応する抗体)でそれぞれ染色して比較することが有効である。このように、ATBF1-AのN末端側を認識する抗体の染色性を調べることは、癌の悪性度を判定する上で補助的ながらも有益な情報を与える。
(4)現在までの検討結果を、D1-120部位が核主体に存在する場合と細胞質主体或いは欠落する場合の二つに分けて考える。まず、D1-120が核主体に存在する場合はさらに、AT6部位が核主体に存在する症例と、細胞質主体に存在する症例の二つに分かれる。Bcl-2やBcl-xLが発現する腫瘍においてその発現をATBF1発現と関連づけると、[A] AT6部位が核主体に存在すれば、Bcl-2, Bcl-xLの発現が抑制される傾向が明確であり、悪性度が低いと判定できる。[B] AT6部位が細胞質主体に存在すれば、腫瘍によってはBcl-2, Bcl-xLの発現が抑制できず、AT6部位が核主体に存在する場合よりは悪性度が高いと判定できる。
次に、D1-120部位が細胞質主体に存在する場合、あるいは欠落する傾向のある場合であるが、大部分の腫瘍でAT6部位の局在は細胞質主体となる。一般にD1-120部位とAT6部位は同時に細胞質に検出される。しかしながらある種の腫瘍でD1-120部位が欠落した場合でも、AT6の染色性が細胞質ではなく核に局在する例外が認められた(現在までの検索では後述のごとくB細胞リンパ腫のある特定の部位)。この場合、D1-120部位が欠落する観察だけでは極めて悪性度が高いと判断される可能性があるが、実際にはAT6が核に局在するとBcl-2が抑制される事が理論的に予想され、かつ観察自体がそれを証明している。従って同じD1-120部位が欠落する悪性度が高い腫瘍の中でも、AT6が核に局在する腫瘍の診断は注意を要し、AT6が細胞質に存在する腫瘍に比較すると悪性度は低いと判断する必要があると考えられる。
上述したNT440, 1-12, D1-120, AT6の染色性から、同一腫瘍において、ATBF1のN末端部位 (NT440, 1-12)、中央に近い部位 (D1-120)、C末端部位 (AT6) の三箇所の染色性が全て核主体、あるいは全て細胞質主体であるといった統一性が症例ごとに存在しないことは、ATBF1はタンパク質プロセシングによる断片化や、エクソンの使われ方や突然変異など遺伝子レベルの変異などの影響で、タンパク質の全体構造に変化が起こる病態が存在する事実を表している。
splicing異常は広く他の腫瘍にも共通して存在する可能性が示唆される。またこのようにエクソン3,10,11に対応する抗体を使用したATBF1の特定の部位の細胞内の発現、核、細胞質の局在検索をゲノムのシークエンス、mRNAのシークエンスの異常の検索と平行して継続することにより、種々の腫瘍の悪性度だけでなく、予想されるmRNAのAlternative splicingの遺伝子レベルの異常を容易に検出できるようになる。
本発明の一形態では、ATBF1量として、以下の(1)〜(3)からなる群より選択される一又は二以上が検出される。
(1)ATBF1遺伝子のエクソン10に対応する領域の核内存在量及び/又は細胞質内存在量、(2)ATBF1遺伝子のエクソン11に対応する領域の核内存在量及び/又は細胞質内存在量、(3)ATBF1遺伝子のエクソン3に対応する領域の核内存在量及び/又は細胞質内存在量。
本発明の好ましい一形態では少なくとも(1)が検出される。本発明のさらに好ましい一形態では上記(1)〜(3)が検出される。
本発明の方法では、検出法として免疫組織化学的染色法が好適に利用される。
本発明は他の局面として、本発明の方法に利用可能な試薬(被検癌細胞の悪性度判定用試薬)及びキット(被検癌細胞の悪性度判定用キット)を提供する。本発明の試薬は抗ATBF1抗体からなる。抗ATBF1として、(1)ATBF1遺伝子のエクソン10に対応する領域を認識する抗体、(2)ATBF1遺伝子のエクソン11に対応する領域を認識する抗体、又は(3)ATBF1遺伝子のエクソン3に対応する領域を認識する抗体を用いることができる。
本発明のキットは以下の(1)〜(3)からなる群より選択される一以上の抗体を含む。
(1)ATBF1遺伝子のエクソン10に対応する領域を認識する抗体、(2)ATBF1遺伝子のエクソン11に対応する領域を認識する抗体、及び(3)ATBF1遺伝子のエクソン3に対応する領域を認識する抗体。
好ましい形態では、本発明のキットは付加的にATBF1を含む。また、タグ又はキャリアタンパク質との融合タンパク質である抗原を用いて作製された抗体をキットに使用する場合には、付加的にタグ又はキャリアタンパク質を更に含めてキットとしてもよい。
本発明における被検癌細胞には、他の診断法によって癌であると判断される細胞、癌である蓋然性が高いと判断される細胞、及び癌である可能性を有する細胞が含まれる。好ましくは、他の診断法によって癌であると判断される細胞、又は癌である蓋然性が高いと判断される細胞が用いられる。ここでの他の診断法としては例えば、X線造影検査、内視鏡検査、超音波検査、CT検査、MRI検査、PET検査、腫瘍マーカーを用いた診断法などが該当する。通常は、これらの一つ以上によって癌が疑われる組織から被検癌細胞が採取される。
本発明において「癌」は広義に解釈することとし、癌腫及び肉腫を含む。また、本発明において用語「癌」は「腫瘍」と互換的に使用される。また、病理学的に診断が確定される前の段階、すなわち腫瘍としての良性、悪性のどちらかが確定される前には、良性腫瘍、良性悪性境界病変、悪性腫瘍を総括的に含む場合もあり得る。
「ATBF1」とは、AT motif binding factor 1(ATモチーフ結合因子1)をいう。ATBF1は、AFP(アルファフェトプロテイン)調節因子のATリッチドメインに結合し、AFP遺伝子の発現を下方調節する転写因子であることが知られている(非特許文献1を参照)。上記の通り「ATBF1」には2つのアイソフォーム(ATBF1-A及びATBF1-B)が存在する。本明細書では用語「ATBF1」をこれら2つのアイソフォームを包括する表現として使用する。従って、特に言及しない限り、「ATBF1量」とは各アイソフォームの存在量の総和を意味する。本発明の方法では原則として当該総和を検出対象とする。但し、いずれかのアイソフォームの量のみを検出対象にすることを妨げるものではない。尚、単に「ATBF1」と記載した場合、その他の意味であることが明らかであるときを除いて、それはATBF1タンパク質を意味する。
ATBF1遺伝子の構造を図47に示す(非特許文献1、非特許文献9を参照)。また、ATBF1遺伝子のエクソン2〜11の配列を図50〜図53に示す。ATBF1遺伝子にはエクソン1〜11が存在し、選択的スプライシングの結果としてATBF1-A及びATBF1-BのmRNAが形成される。尚、図47においてエクソン10及び11として示した領域は、非特許文献9ではそれぞれエクソン9及び10と記載されている。
エクソン3、エクソン10、及びエクソン11に対応するアミノ酸配列及び塩基配列については、添付の配列表に以下の配列番号で記載する。
エクソン3に対応する領域のアミノ酸配列(配列番号:11)、エクソン3の塩基配列(配列番号:12)、エクソン10に対応する領域のアミノ酸配列(配列番号:13)、エクソン10の塩基配列(配列番号:14)、エクソン11に対応する領域のアミノ酸配列(配列番号:15)、エクソン11の塩基配列(配列番号:16)。
「被検癌細胞内のATBF1量」とは、被検癌細胞の核内および細胞質におけるATBF1の存在量の総計をいう。本明細書において、「被検癌細胞内のATBF1量」のことを「被検癌細胞の細胞全体のATBF1量」ともいう。一方「被検癌細胞の核内のATBF1量」とは、被検癌細胞の核内におけるATBF1の存在量をいう。同様に、「被検癌細胞の細胞質内のATBF1量」とは、被検癌細胞の細胞質内におけるATBF1の存在量をいう。
「ATBF1量を検出する」とは、ATBF1の存在量を絶対量として又は相対量として把握することをいう。ここでの相対量の基準は例えば、悪性度に応じて用意した標準試料のATBF1量とすることができる。或いは核内のATBF1量が検出対象のときに、細胞質内のATBF1量を基準とし、同様に細胞質内のATBF1量が検出対象のときに核内のATBF1量を基準とすることもできる。尚、「ATBF1量を検出する」は、ATBF1が存在するか否かを調べることも含む。通常は、ATBF1の存否及び、存在する場合にはその量が調べられることになる。厳密にATBF1量を定量することは必須でなく、例えば、悪性度の指標となる対照のATBF1量と比較することによって、被検癌細胞の悪性度を判定することが可能な程度にATBF1量を測定できればよい。
本発明において「悪性度判定法」とは、被検癌細胞の悪性度を判定する方法をいう。癌の悪性度は一般に細胞異型、細胞、組織構築の異形性、増殖性、浸潤性、転移性などを基準に分類(判定)される。一般に悪性度が低い癌では細胞の増殖速度が遅く、浸潤転移を来し難いため外科的切除が容易である場合と、化学療法や放射線療法が有効であるが故に腫瘍を容易に縮小させ得る場合が考えられ、これらが組み合わさって予後が良好となる。これに対して悪性度が高い癌では細胞の増殖速度が早く、浸潤転移を来し易いため外科的切除が困難となりやすい場合と、化学療法や放射線療法が無効であるが故に腫瘍を縮小させるのが困難な場合が考えられ、これらが組み合わさって予後が不良となる。悪性度が特に高い癌の場合には迅速、的確な外科的摘出が望まれるし、的確な補助治療(放射線療法又は化学療法)を含む集学的治療が必須となる。本発明では、癌の増殖速度に起因する浸潤、転移の容易さ、すなわち癌の増殖能の予測、および化学療法又は放射線療法による有効な治療効果が得られるか否かの予測をもって、悪性度判定の基準とすることができる。従って、増殖能が低く(細胞周期停止を来し易く)、化学療法又は放射線療法が有効と予測される(DNAダメージによりアポトーシスが導入され易い)癌の場合に悪性度が低いということができ、逆に増殖能が高く(細胞周期停止を来し難く)、化学療法又は放射線療法が無効と予測される(DNAダメージによってもアポトーシスが導入され難い)癌の場合に悪性度が高いということができる。ここで、増殖能、化学療法又は放射線療法の有効さという2つの因子を考慮すべき理由および注意点に関して、肺の小細胞癌(燕麦細胞癌)を例にあげて説明することにする。一般的に肺の小細胞癌は高度悪性とされ、予後が悪い事で有名な癌である。しかし希ながら症例によっては、早期に化学療法を施行する事により完全治癒が可能な場合もある。本発明者らの検索では、肺の小細胞癌は核にも細胞質にも強いATBF1の発現を認めた(エクソン10に対応する抗体を使用)。細胞質の染色性の強さから高い増殖能を予測すれば、早急に浸潤、転移して進展するため外科治療が不可能な場合が多い事を意味し、それは高度悪性と判断する事になる。しかし一方で、核の強い染色性よりDNAダメージによりアポトーシスを導入しやすい事を予測すると、化学療法に反応し易く、時に癌細胞を完全に死滅させ得る可能性から、低悪性度の癌と判断する事にもなる。従って悪性度を決める際には、癌の増殖能、化学療法又は放射線療法の有効さの2つの因子を常に考慮する必要があるのが現実であり、また実際的、実用的である。さらに悪性度を考える時の注意点でもある。但し、以上の2つの因子のいずれかを指標として癌の悪性度を評価することもできる。
本発明の方法では、典型的には、悪性度が順に高くなる複数の区分のいずれに被検癌細胞が分類されるかを判定する。ここでの区分の数は特に限定されない。例えば3区分(具体的には例えば悪性度1(低い):ATBF1が核に局在する傾向、悪性度2(中程度):ATBF1が細胞質に局在する傾向、悪性度3(高い):ATBF1が核細胞質ともに欠落する傾向とする。あるいは悪性度4区分(具体的には例えば悪性度1(低い:ATBF1が核に高度に局在する傾向、悪性度2(中程度):ATBF1が核に軽度から中等度局在する傾向、悪性度3(高い):ATBF1が細胞質に限局し、核での発現が少ない傾向、悪性度4(非常に高い):ATBF1が核にも細胞質にも欠落する傾向とする)などを設けることが可能である。なお前述した化学療法前の肺小細胞癌のごとく核・細胞質ともに高度のATBF1発現を示し、増殖能も高度だが化学療法の感受性も高い癌を上記悪性度1〜3、あるいは1〜4のどの範疇に属する悪性度と捉えるかについては一律には判断が難しいと予想される。このような場合には、増殖能、化学療法又は放射線療法の感受性という悪性度の指標2つを個別に考慮するとよい。
後述の実施例に示すように、本発明者らの検討によって様々な種類の癌において、その悪性度と細胞内ATBF1発現量との間に関連性が存在することが明らかとなった。また、癌の悪性度と癌細胞の核内及び細胞質内のATBF1量(ATBF1の核・細胞質局在)との間にも関連性が認められた。以下、ヒト各種癌(腫瘍)についての検討結果の概略を示す(例1〜例12)。
例1) ATBF1 mRNA発現を指標としたヒト乳癌症例153例の検討で、ATBF1 mRNAの発現量の多い症例群は、発現量が低下または欠落している症例群より予後が良好であることが判明した。この結果から、本発明の方法では例えば、被疑乳癌細胞を被検癌細胞としてその細胞内ATBF1量を測定した結果、発現量が多い場合に悪性度が低い(または、被検癌細胞が由来する対象の予後が良好である)と判定することができる。これとは逆に、被検癌細胞内のATBF1量が少ない場合に悪性度が高い(または、被検癌細胞が由来する対象の予後が 不良である)と判定することができる。
例2) 癌抑制遺伝子p21, p53の変異および抗ガン剤シスプラチンの効果がすでに確認されている膀胱癌培養細胞 (Int J Cancer. 1996 Nov 15;68(4):501-5)において、抗ガン剤で腫瘍のアポトーシスを誘導できる細胞株ではATBF1が核に存在した。これに対して抗ガン剤が効果を示さない細胞株ではATBF1発現量が少ないか、発現総量は多くても細胞質に局在し、核での染色性が認められなかった。これらの結果から、本発明の方法では例えば、被疑膀胱癌細胞を被検癌細胞としてその細胞内ATBF1量を測定した結果、発現量が多い場合に悪性度が低いと判定することができる。または、被検癌細胞においてATBF1が核に局在している場合に悪性度が低いと判定することができる。一方、被検癌細胞内のATBF1量が少ない場合に悪性度が高いと判定することができる。または、被検癌細胞においてATBF1量が細胞質に局在している場合に悪性度が高いと判定することができる。
例3) ヒトの膀胱癌の臨床例、乳頭状尿路上皮癌ではATBF1が核に局在する傾向を示したが、上皮下への浸潤癌はATBF1が細胞質に局在する傾向を示した。この結果から、本発明の方法では例えば、被疑乳頭状尿路上皮癌細胞又は被疑浸潤性膀胱癌細胞を被検癌細胞としてその細胞内におけるATBF1の存在状態を調べた結果、ATBF1が核に局在している場合に悪性度が低いと判定することができる。一方、被検癌細胞においてATBF1が細胞質に局在している場合に悪性度が高いと判定することができる。
例4) 胃における一連の腺腫から癌腫のシリーズ(生検診断、Group III〜V)の検索で、Group
IIIの腺腫、軽度異型、中等度異型ではATBF1が核に局在したが、Group IIIの腺腫、高度異型ではATBF1が細胞質に局在した。Group Vの癌腫では、ATBF1が細胞質に存在する場合と欠落する場合を認めた。高悪性度とされるAFP産生胃癌では既報(非特許文献2、5、7)のごとくATBF1は欠落した。また胃原発の印環細胞癌の症例ではATBF1欠落する癌細胞とATBF1が細胞質のみに局在する癌細胞が混在した。さらに胃原発の印環細胞癌が胆嚢へ転移し浸潤性となった部位の観察で、印環細胞癌細胞でATBF1が完全に欠落していた症例を見出した。この例では、転移能のより高い癌細胞がリンパ行性に転移し、浸潤を示したと判断出来、ATBF1の欠落が悪性度をより高める可能性をも指摘できた。これらの結果から、本発明の方法では例えば、被疑腺癌細胞を被検癌細胞としてその細胞内ATBF1量を測定した結果、ATBF1量が多い場合に悪性度が低いと判定することができる。または、被検癌細胞においてATBF1が核に局在している場合に悪性度が低いと判定することができる。一方、被検癌細胞の細胞内ATBF1量が少ない場合に悪性度が高いと判定することができる。または、被検癌細胞においてATBF1が細胞質に局在している場合にも悪性度が高いと判定することができる。
例5) 肺腺癌で、化学療法に反応を示し腫瘍が縮小した例では細胞全体のATBF1発現量が多く、核、細胞質ともに発現を認めたが、治療に反応しない症例では、ATBF1の発現自体が少量で、細胞質のみに限局した。この結果から、本発明の方法では例えば、被疑肺腺癌細胞を被検癌細胞としてその細胞内ATBF1量を測定した結果、ATBF1量が多い場合に悪性度が低いと判定することができる。または、被検癌細胞においてATBF1が核にも存在している場合若しくは核に局在している場合に悪性度が低いと判定することができる。一方、被検癌細胞の細胞内ATBF1量が少ない場合に悪性度が高いと判定することができる。または、被検癌細胞においてATBF1が細胞質に限局している場合に悪性度が高いと判定することができる。
例6) 肺腺癌の前癌病変とされる異型腺腫様過形成ではATBF1が細胞質だけでなく、核にも存在した。それに対し、腺癌と判定できる場合は、大部分は核の染色性が無く、細胞質にATBF1が限局する傾向があった。この結果から、本発明の方法では例えば、被疑肺腺癌細胞を被検癌細胞としてその細胞内におけるATBF1の存在状態を調べた結果、ATBF1が核にも存在している場合に悪性度が低いと判定することができる。一方、被検癌細胞においてATBF1が細胞質に限局している場合に悪性度が高いと判定することができる。
例7) 正常の脊髄の造血細胞は核・細胞質ともに高度のATBF1発現を示した。この事実は骨髄造血細胞が増殖***の盛んな細胞群であることと、各種癌治療の際、正常細胞の中では造血機能を有する骨髄細胞が最も影響を受けやすい細胞群である事(骨髄抑制と称する。DNAダメージでアポトーシスに陥りやすい)の裏付けとなる。
例8) 骨髄造血細胞同様に、肺の小細胞癌(燕麦細胞癌)でも核・細胞質ともに非常に大量のATBF1が存在しており、これもやはり、小細胞癌の増殖の速さと化学療法への反応しやすさの裏付けとなる。この結果から、本発明の方法では例えば、被疑肺小細胞癌細胞を被検癌細胞としてその細胞内におけるATBF1の存在状態を調べた結果、ATBF1が細胞質に局在している場合に悪性度が高いと判定することができる。一方、被検癌細胞においてATBF1量が核に局在している場合に悪性度が低いと判定することができる。
例9) 高分化前立腺癌ではATBF1が核に限局、中分化、低分化となるとATBF1が細胞質に限局あるいは発現が欠落する傾向を認めた。この結果から、本発明の方法では例えば、被疑前立腺癌細胞を被検癌細胞としてその細胞内ATBF1量を測定した結果、ATBF1量が多い場合に悪性度が低いと判定することができる。または、被検癌細胞においてATBF1が核に限局している場合に悪性度が低いと判定することができる。一方、被検癌細胞の細胞内ATBF1量が少ない場合(特にATBF1の発現を認めない場合)に悪性度が高いと判定することができる。または、被検癌細胞においてATBF1が細胞質に限局している場合に悪性度が高いと判定することができる。
例10) 新生児、幼児の副腎腫瘍の中で、死亡例もあるが自然消退もある神経芽細胞腫が知られる。その予後予測は、医師にとっても、児の両親にとっても重要な問題である。結果として良性であり、最終的に生存し得た症例の殆どの腫瘍細胞でATBF1は核に局在した。逆に最終的に生存し得なかった症例で、解剖の結果、腫瘍が浸潤、転移、脈管侵襲などを示し、腫瘍の悪性度自体に起因する腫瘍死が明らかであった症例では、大部分の腫瘍細胞でATBF1が細胞質に局在していた。これは生検の段階で、腫瘍の進展、患者の予後を予測できる可能性を意味している。これらの結果から、本発明の方法では例えば、被疑神経芽腫細胞を被検癌細胞としてその細胞内におけるATBF1の存在状態を調べた結果、ATBF1が核に局在している場合に悪性度が低いと判定することができる。一方、被検癌細胞においてATBF1が細胞質に局在している場合に悪性度が高いと判定することができる。
例11) 消化管間質腫瘍 (GIST)は通常ATBF1が核に限局するが、肝転移で死亡し、高度悪性GISTと診断された症例ではATBF1が細胞質に存在していた。この結果から、本発明の方法では例えば、被疑GIST細胞を被検癌細胞としてその細胞内におけるATBF1の存在状態を調べた結果、ATBF1が核に限局している場合に悪性度が低いと判定することができる。一方、被検癌細胞においてATBF1が細胞質にも存在している場合に悪性度が高いと判定することができる。
例12) 良性腫瘍に分類される髄膜腫(WHO Grade I)の腫瘍細胞では、ATBF1は核に限局したが、悪性の経過を取りうるとされる異型髄膜腫(WHO Grade II)、明細胞髄膜腫 (WHO Grade II) においては、ATBF1は細胞質で発現を認めた。この結果から、本発明の方法では例えば、被疑髄膜腫細胞を被検癌細胞としてその細胞内におけるATBF1の存在状態を調べた結果、ATBF1が核に限局している場合に悪性度が低いと判定することができる。一方、被検癌細胞においてATBF1が細胞質にも存在している場合に悪性度が高いと判定することができる。
(1)ATBF1遺伝子のエクソン10に対応する領域の核内存在量及び/又は細胞質内存在量。
(2)ATBF1遺伝子のエクソン11に対応する領域(C末端領域)の核内存在量及び/又は細胞質内存在量。
(3)ATBF1遺伝子のエクソン3に対応する領域(N末端領域)の核内存在量及び/又は細胞質内存在量。
この検出では、被検癌細胞において、ATBF1遺伝子のエクソン10に対応する領域(部分タンパク質。以下、「ATBF1タンパク質の第1領域」又は省略して「第1領域」ともいう。当該領域のアミノ酸配列を配列番号:13に、当該領域をコードする塩基配列を配列番号:14にそれぞれ示す)の核内存在量及び/又は細胞質内存在量が検出対象となる。後述の実施例に示すように、いくつかの被検癌細胞を用いて第1領域の量及び局在態様と悪性度との関係を検証した結果、一般に、(a)第1領域が核主体に局在していると悪性度が低いこと、(b)第1領域が細胞質主体に局在していると悪性度が高いこと、及び(c)第1領域が欠落(細胞質内、核内)していると悪性度が高いことを認めた。即ち(a)〜(c)が、癌細胞の悪性度を判定するための好適且つ重要な指標になることが判明した。従って例えば、被検癌細胞の核内に多量の第1領域が検出されたとき(又は第1領域が核主体に局在していたとき)、被検癌細胞の悪性度が低いと判定できる。同様に例えば、被検癌細胞の細胞質内に多量の第1領域が検出されたとき(又は第1領域が細胞質主体に局在していたとき)、被検癌細胞の悪性度が高いと判定できる。さらに例えば、被検癌細胞において第1領域の欠落が認められたとき(又は存在量が微量であったとき)、被検癌細胞の悪性度が高いと判定できる。
ここで、被検癌細胞内における第1領域の局在態様を指標として判定を行う場合は通常、第1領域の核内存在量及び細胞質内存在量を同時に検出する。そして、検出結果を比較することで第1領域の局在態様を調べ、第1領域が細胞質主体に局在していたとき又は第1領域の欠落が認められたとき、被検癌細胞の悪性度が高いと判定する。このように核内での検出量と細胞質での検出量とを比較することによって、第1領域の細胞内局在態様を明確に把握することが可能となる。尚、第1領域の核内存在量及び細胞質内存在量のいずれかの検出結果から第1領域の細胞内局在を予想し判定することにしてもよい。この場合、いずれかの存在量のみを検出すればよいことになる。
この検出では、被検癌細胞において、ATBF1遺伝子のエクソン11に対応する領域(部分タンパク質。以下、「ATBF1タンパク質の第2領域」又は省略して「第2領域」ともいう。当該領域のアミノ酸配列を配列番号:15に、当該領域をコードする塩基配列を配列番号:16にそれぞれ示す)の核内存在量及び/又は細胞質内存在量が検出対象となる。後述の実施例に示すように、いくつかの被検癌細胞を用いて第2領域の量及び局在態様と悪性度との関係を検証した結果、一般に、(a)第2領域が核主体に局在していると悪性度が低いこと、及び(b)第2領域が細胞質主体に局在していると悪性度が高いことを認めた。即ち(a)及び(b)が、癌細胞の悪性度を判定するための好適且つ重要な指標になることが判明した。従って例えば、被検癌細胞の核内に多量の第2領域が検出されたとき(又は第2領域が核主体に局在していたとき)、被検癌細胞の悪性度が低いと判定できる。同様に例えば、被検癌細胞の細胞質内に多量の第2領域が検出されたとき(又は第2領域が細胞質主体に局在していたとき)、被検癌細胞の悪性度が高いと判定できる。
ここで、被検癌細胞内における第2領域の局在態様を指標として判定を行う場合は通常、第2領域の核内存在量及び細胞質内存在量を同時に検出する。そして、検出結果を比較することで第2領域の局在態様を調べ、第2領域が細胞質主体に局在していたとき、被検癌細胞の悪性度が高いと判定する。このように核内での検出量と細胞質での検出量とを比較することによって、第2領域の細胞内局在態様を明確に把握することが可能となる。尚、第2領域の核内存在量及び細胞質内存在量のいずれかの検出結果から第2領域の細胞内局在を予想し判定することにしてもよい。この場合、いずれかの存在量のみを検出すればよいことになる。
この検出では、被検癌細胞において、ATBF1遺伝子のエクソン3に対応する領域(部分タンパク質。以下、「ATBF1タンパク質の第3領域」又は省略して「第3領域」ともいう。当該領域のアミノ酸配列を配列番号:11に、当該領域をコードする塩基配列を配列番号:12にそれぞれ示す)の核内存在量及び/又は細胞質内存在量が検出対象となる。
後述の実施例に示すように、第3領域(NT440、1-12が認識する部位)の検出は細胞全体でのATBF1量が増加、減少したのか、あるいは欠落するかの指標になる。また、第3領域における148番セリンのリン酸化状態を検出することによって、第3領域の核移行の比率を知る事が可能である。さらにその存在、欠落、核細胞質の局在位置を、ATBF1タンパク質の中央領域(即ち第1領域)の局在状態などと比較する事で、ATBF1タンパク質のプロセッシングの状況、さらにはmRNAレベルで起こる異常なスプライシングによるエクソンスキップの判定が可能である。以上のように、第3領域の検出は、癌の悪性度を判定する上で補助的ながらも有益な情報を与える。
検出項目の中に、上記(1)、即ち第1領域の検出を含めることが好ましい。(1)で検出される第1領域の存在量又は細胞内局在態様は癌の悪性度を最も特徴付けるものといえる。従って、悪性度の判定において(1)の検出は特に重要度が高い。
悪性度 第1領域の存在量又は局在 第2領域の存在量又は局在
4 欠落(検出されず) 細胞質に局在
3 細胞質に局在 細胞質に局在
2 核に局在 細胞質に局在
1 核に局在 核に局在
尚、悪性度4の代表例として副鼻腔の未分化癌、びまん性悪性リンパ腫の一部を挙げることができる。同様に悪性度3の代表例として多形膠芽腫の一部、びまん性悪性リンパ腫の一部を、悪性度2の代表例としてGISTの一部(Bcl-2+)、髄膜腫の一部を、悪性度1の代表例としてGISTの一部(Bcl-2−)、髄膜腫の一部を挙げることができる。
細胞内においてATBF1が完全な状態であれば(全長タンパク質として存在していれば)、「ATBF1遺伝子のエクソン10に対応する領域(即ち第1領域)」、「ATBF1遺伝子のエクソン11に対応する領域(即ち第2領域)」、及び「ATBF1遺伝子のエクソン3に対応する領域(即ち第3領域)」はそれぞれ、このようなATBF1の一部として存在する。一方、翻訳後のプロセスにおいてATBF1が分断されたときは、分断によって生じた部分ATBF1の一つ(又はその中の一部)として各領域は存在する。
尚、第1領域は、ATBF1-Aタンパク質の中央領域の一部(エクソン10のホメオドメイン以外の領域)を抗原として作製された抗体D1-120によって認識される。同様に第2領域は、ATBF1-Aタンパク質のC末端領域の一部を抗原として作製された抗体AT6によって認識され、第3領域は、ATBF1-Aタンパク質のN末端領域の一部を抗原として作製された抗体NT440及び1-12によって認識される。これらの抗体の作製方法は後述の実施例の欄で詳述される。
免疫組織化学的染色法では検出対象を特異的に認識する抗体(抗ATBF1抗体、抗第1領域抗体など)が使用され、当該抗体の結合性(結合量)を指標としてATBF1量が検出される。
免疫組織化学的染色法では通常、まず被検癌細胞に対して、検出対象に特的な抗体(例えば抗ATBF1抗体)を接触させる。その後、細胞全体、核、及び/又は細胞質に対する当該抗体の結合量を測定する。そして測定結果から、被検癌細胞の細胞全体、核内、及び/又は細胞質内の検出対象の存在量を算出する。具体的には、以下に示す免疫組織化学的染色法に従って本発明の方法を実施することができる。
(1)固定・パラフィン包埋
外科的に生体より採取した組織をホルマリンやパラフォルムアルデヒド、無水エチルアルコール等によって固定する。その後パラフィン包埋する。一般にアルコールで脱水した後キシレンで処理し、最後にパラフィンで包埋する。パラフィンで包埋された標本を所望の厚さ(例えば3〜5μm厚)に薄切し、スライドガラス上に伸展させる。尚、パラフィン包埋標本に代えてアルコール固定標本、乾燥封入した標本、凍結標本などを用いる場合もある。
(2)脱パラフィン
一般にキシレン、アルコール、及び精製水で順に処理する。
(3)前処理(抗原賦活)
必要に応じて抗原賦活のために酵素処理、加熱処理及び/又は加圧処理等を行う。
(4)内因性ペルオキシダーゼ除去
染色の際の標識物質としてペルオキシダーゼを使用する場合、過酸化水素水で処理して内因性ペルオキシダーゼ活性を除去しておく。
(5)非特異的反応阻害
切片をウシ血清アルブミン溶液(例えば1%溶液)で数分から数十分程度処理して非特異的反応を阻害する。尚、ウシ血清アルブミンを含有させた抗体溶液を使用して次の一次抗体反応を行うこととし、この工程を省略してもよい。
(5)一次抗体反応
適当な濃度に希釈した抗体をスライドガラス上の切片に滴下し、その後数十分〜数時間反応させる。反応終了後、リン酸緩衝液など適当な緩衝液で洗浄する。
(6)標識試薬の添加
標識物質としてペルオキシダーゼが頻用される。ペルオキシダーゼを結合させた2次抗体をスライドガラス上の切片に滴下し、その後数十分〜数時間反応させる。反応終了後、リン酸緩衝液など適当な緩衝液で洗浄する。
(7)発色反応
トリス緩衝液にDAB(3,3'-diaminobenzidine)を溶解する。続いて過酸化水素水を添加する。このようにして調製した発色用溶液を数分間(例えば5分間)切片に浸透させ、発色させる。発色後、切片を水道水で十分に洗浄し、DABを除去する。
(8)核染色
マイヤーのヘマトキシリンを数秒〜数十秒反応させて核染色を行う。流水で洗浄し色出しする(通常、数分間)。
(9)脱水、透徹、封入
アルコールで脱水した後、キシレンで透徹処理し、最後に合成樹脂やグリセリン、ゴムシロップなどで封入する。
尚、ATBF1量の測定には、後述の実施例に示すD1-120抗体を使用することができる。この抗体は、ATBF1-AとATBF1-Bの共通部分であるD1-120部位(エクソン10に対応する領域であってホメオドメイン1のごく一部およびその直前の領域)を特異的に認識する。従って、この抗体を用いればATBF1-AとATBF1-Bの両者を同時に検出することが可能である。一方、この抗体はATBF1の第1領域に対して特異的に結合することから、この抗体による検出量は第1領域の存在量を反映したものとなる。従って、この抗体を用いれば、第1領域の量又はその局在を把握することが可能となる。同様に、ATBF1遺伝子のエクソン11に対応する領域を認識する抗体AT6を用いれば、C末端領域である第2領域の量又はその局在を把握することが可能となり、ATBF1遺伝子のエクソン3に対応する領域を認識する抗体NT440又は1-12を用いればN末端領域である第3領域の量又はその局在を把握することが可能となる。
免疫学的手法によるポリクローナル抗体の調製は次の手順で行うことができる。抗原(例えばATBF1のD1-120部位又はその一部)を調製し、これを用いてウサギ等の動物に免疫を施す。ヒト以外の種(例えばマウス)のATBF1(又はその一部)を抗原として用いることができる。抗原は生体試料を精製することにより得ることができる。また、遺伝子組換え技術を利用して得た抗原を用いることもできる。組換えヒトATBF1は例えば、ATBF1をコードする遺伝子(遺伝子の一部であってもよい)を、ベクターを用いて適当な宿主に導入し、得られた組換え細胞内で発現させることにより調製される。
低分子量のために有効な免疫惹起作用を期待できない場合には、キャリアタンパク質を結合させた抗原を用いることが好ましい。キャリアタンパク質としてはKLM(Keyhole Light Hemocyanin)、BSA(Bovine Serum Albumin)、OVA(Ovalbumin)などが使用される。キャリアタンパク質の結合にはカルボジイミド法、グルタルアルデヒド法、ジアゾ縮合法、MBS(マレイミドベンゾイルオキシコハク酸イミド)法などを使用できる。一方、ATBF1(又はその一部)を、GST、βガラクトシダーゼ、マルトース結合タンパク、又はヒスチジン(His)タグ等との融合タンパク質として発現させた抗原を用いることもできる。このような融合タンパク質は、汎用的な方法により簡便に精製することができる。
本発明の試薬の一形態は、上記のように免疫学的手法によって本発明の方法を実施する際に使用される抗ATBF1抗体(抗第1領域抗体、抗第2領域抗体、抗第3領域抗体を含む。以下同様)である。ここでの抗体はポリクローナル抗体、オリゴクローナル抗体(数種〜数十種の抗体の混合物)、及びモノクローナル抗体のいずれでもよい。ポリクローナル抗体又はオリゴクローナル抗体としては、動物免疫して得た抗血清由来のIgG画分のほか、抗原によるアフィニティー精製抗体を使用できる。抗ATBF1抗体が、Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、dsFv抗体などの抗体断片であってもよい。所望の標識化が施されている抗体であってもよいことは上記の通りである。
検出用抗体の抗体として、(1)ATBF1遺伝子のエクソン10に対応する領域を認識する抗体、(2)ATBF1遺伝子のエクソン11に対応する領域を認識する抗体、又は(3)ATBF1遺伝子のエクソン3に対応する領域を認識する抗体を好適に用いることができる。
(1)の抗体によれば、エクソン10に対応する領域(ATBF1タンパク質の第1領域)を検出可能である。(2)の抗体によれば、エクソン11に対応する領域(ATBF1タンパク質の第2領域)を検出可能である。(3)の抗体によれば、エクソン3に対応する領域(ATBF1タンパク質の第3領域)をを検出可能である。
(1)の抗体、(2)の抗体、及び(3)の抗体の具体例として、後述の実施例において使用される以下のものを挙げることができる。
(1)の抗体:D1-120、(2)の抗体:AT6、(3)の抗体:1-12、NT440(NT440-1、NT440-2、NT440-3の混合物)
尚、認識する部位、ATBF1遺伝子のエクソンとの対応など、これらの抗体の特性の詳細については図31に示される。
好ましい一形態として、抗ATBF1抗体を含む免疫学的測定(検出)用キットが提供される。抗ATBF1抗体の結合量を直接検出する方法用のキットの場合には、標識化された抗ATBF1抗体が用いられる。一方、間接的検出方法用のキットの場合には、未標識の抗ATBF1抗体が用いられる。この場合には、標識物質で標識化された二次抗体(標識二次抗体)をキットに含めてもよい。二次抗体と標識物質を結合させたポリマーを利用した検出法用のキットとする場合には、当該ポリマーをキットに含めてもよい。
また一方で、タグやキャリアタンパク質(以下、タグ等という)との融合タンパク質を抗原として作製した抗ATBF1抗体をキットに使用する場合には、用いたタグ等をキットに更に含めることにしてもよい。キットを構成する抗ATBF1抗体中に、その作製過程で使用したタグ等に反応性を有する抗体が混在しているおそれのある場合に当該タグ等が必要となる。以下のように当該タグ等を利用すれば、キットを使用して得られた染色性が抗ATBF1抗体とATBF1抗体との特異的結合に基づくものであることを確認することができる。まず、このタグ等で抗ATBF1抗体を処理する。処理後の抗ATBF1抗体を用いて検体の免疫染色を行う。得られた染色像と、未処理の抗ATBF1抗体を使用して得られた染色像とを比較する。両者の間で染色性に相違がなければ、後者の染色像における染色性は抗ATBF1抗体とATBF1との特異的結合に基づくものであることを確認できる。
本発明のキットに、抗原抗体反応や染色等、免疫染色を実施する上で必要な一以上の試薬(例えば、組織固定・包埋用のホルマリンやパラフィン、非特異的結合を阻害するためのBSA、DAB等の発色試薬、核染色用のヘマトキシリン溶液など)や器具などを更に含めてもよい。また通常は、本発明のキットには取り扱い説明書が添付される。
以下、実施例(実験例を含む)を用いて本発明をより詳細に説明する。
本発明者らは分子生物学的手法である酵母ツーハイブリッド(yeast two-hybrid)法による分子相互作用の研究成果として、DNA結合転写調節因子であるATBF1が、DNAと結合するばかりでなく細胞質に存在する細胞骨格タンパク質GFAP (glial fibrillary acidic protein)と結合する新事実を発見した。従来から生理的な状態ではDNA結合タンパク質は核に存在することが当然のように予想され、観察されるが、ATBF1も核タンパク質と予想されながら、核で機能するだけでなく細胞質でも細胞骨格タンパク質と結合して存在する可能性が示されたわけである。これは今回の核細胞質移行を見出す原点となった。しかも、既報(非特許文献6)のごとく胃癌培養細胞を使用した別の実験系で、本発明者らはATBF1が核内ではp53タンパク質と結合し、p21のプロモーターを活性化、細胞周期を抑制する働きがあることを発見した(図1を参照)。故に、ATBF1の細胞周期制御機能に着目することとなり、種々の癌細胞におけるATBF1の動向を調べる事となった。その結果、癌細胞の中には核タンパク質としてATBF1が核に局在する細胞以外に、細胞周期制御系が乱れ、増殖性の強くなった癌細胞においては、ATBF1が核から細胞質に移出が観察され、核のATBF1の染色性が極端に低下する例が存在するという新事実の重要性に本発明者らは気付く事となった(後述の種々の実施例を参照)。
2−1.抗原の調製
マウスATBF1(Ido et al., (1996). Gene, 168, 227-231)の41アミノ酸残基(2114〜2154:LQTLPAQLPPQLGPVEPLPADLAQLYQHQLNPTLLQQQNKR:配列番号1)をグルタチオンSトランスフェラーゼ(GST)に融合した組み換えペプチドを抗原として使用した。尚、上記の41アミノ酸残基は、ヒトATBF1のアミノ酸残基(2170〜2147)と完全に一致する。
具体的には、以下(1)及び(2)の手順で当該抗原を調製した。抗原調製、抗体作製の詳細は既報(J. Compartive Neurology (2003) 465: 57-71:非特許文献3)に記載される。
(1)上記のごとく標的アミノ酸部分をマウスcDNAより切り出し、GST融合タンパク質作製用のベクターpGEX-KT に組換え(サブクローニング)を行った。(2)大腸菌 AD202に遺伝子導入を行い、AD202に発現させたタンパク質をSepharose-glutathione
beaded agarose (Sigma社)を使用して常法で精製を行った(例えば、「はじめての組換えタンパク質精製ハンドブック」1999年発行、アマシャム ファルマシア バイオテク株式会社、を参照)。
2−1.で調製した抗原(ATBF1-GST融合タンパク質)を用いて、以下(1)〜(4)の手順で抗ATBF1抗体(D1-120)を取得した。
(1)PBS(pH7.5)に融解した抗原(1 mg/ml)をTiter Max Gold (CytRx社)と等量混合して、免疫用エマルジョンを作成した。(2)2mlのエマルジョンをウサギ背部に皮下注射して免疫(0,14,28,49,70日目の5度にわたり)を行った。(3)91日間経過した時点で、屠殺採血して血清を分離した。(4)免疫に使用した抗原による抗原カラムを作成し、血清から抗原抗体カラム精製後に抗ATBF1抗体を取得した(例えば、「はじめての抗体精製ハンドブック」2000年発行、アマシャム
ファルマシア バイオテク株式会社、を参照)。
P19マウス胎児性癌(embryonal caricinoma)培養細胞を使用し、未分化な癌培養細胞を神経細胞に分化させる実験を行い、その過程におけるATBF1発現と細胞周期制御との関連に着目した検討を行った。
P19癌細胞培養開始時、特に分化刺激を加えない未分化増殖状態の細胞を採取し以下に示す手順で免疫組織化学的染色(ATBF1染色、D1-120使用)を実施した。細胞をチャンバースライドで培養しPBSで調整した4%パラフォルムアルデヒドで固定し、固定後洗浄を行った。抗ATBF1抗体を5μg/mlとなるように、0.05Mトリス緩衝液(pH7.6、ウシ血清アルブミン1%溶液、アジ化ナトリウム含有)に溶解した一次抗体溶液を切片に滴下し、37度で約30分反応させた(一次抗体反応)。十分に洗浄した後、2次抗体Alexa Fluor 594-conjugated goat anti-rabbit IgG (以下の実施例中で示されるごとく、他のモノクローナル抗体と2重染色を行う場合はAlexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse IgGも同時に使用する。尚、いずれもMolecular Probes社製)を標本に作用させ、室温で約1時間反応させた(二次抗体反応)。十分に洗浄した後、封入を行い。蛍光顕微鏡 (AX70; オリンパス社製) か、共焦点レーザー顕微鏡 (LSM5; ZWISS社製)で観察を行った。染色の結果、ATBF1は核、細胞質ともに発現を認めず(図2aを参照)、フローサイトメトリーを使用した検索では細胞は増殖状態を示し、細胞周期G1期の細胞とともに、S期の細胞、G2,
M期の細胞が高い割合で混在した(図2dを参照)。
培養細胞に神経分化を促す薬剤、レチノイン酸を投与した24時間後、上記3−1に記載した方法でATBF1染色、さらにフローサイトメトリー検索を行った。形態的には細胞はやはり未分化増殖状態を維持したが、ATBF1の細胞質での発現を認めるようになった(図2bを参照)。フローサイトメトリーを使用した検索では細胞はやはり増殖状態を示し、G1期の細胞とともに、S期の細胞、G2,
M期の細胞の割合は依然高かった(図2eを参照)。
レチノイン酸を中断し、さらに4日間培養後に上記3−1に記載した方法でATBF1染色、さらにフローサイトメトリー検索を行った。形態的に培養細胞は神経突起を有する分化した細胞群に変化した。するとATBF1は細胞質から核に移動し、核主体の発現に変化した(図2cを参照)。フローサイトメトリーを使用した検索ではS期の細胞、G2、M期の細胞の割合が極端に減少し、ほとんどがG1期の細胞集団に変化した(図2fを参照)。これは明らかな細胞周期の停止を意味し、G1期停止、言い換えると増殖抑制が認められた。この実験結果は、そのアミノ酸配列番号277及び2987から始まる2箇所の推定核内保留シグナル(Nuclear localization signal)の存在(図3aを参照)から予想されたごとくATBF1が実際に細胞質から核へ移行を示すタンパク質であることを証明しただけでなく、核へのATBF1移行により細胞周期の停止が起こることをも示すものである。
4−1.ATBF1の核への移入の促進機序の検討
P19細胞では、レチノイン酸又はその誘導化学物質を作用させると、ATBF1のmRNA転写量、細胞内タンパク量が増加する。しかしながらP19細胞を培養液に浮遊する状態で培養する限り、ATBF1は細胞質に留まり、核移行は観察されない。ここでは細胞を培養皿に接着するような条件設定をすることによりATBF1発現がどのように変化するかを検索するための検討を行った。生体内の細胞外部環境に類する特徴を持つフィブロネクチン、ラミニンや、ゲラチン、ポリ−L−オルニチン、ポリ-Lリジンを培養皿へ塗布した後の細胞におけるATBF1の局在を観察した。上記3−1.に記載したのと同様の方法でATBF1染色(D1-120を使用)を施行した。フィブロネクチンなどを培養皿へ塗布しない場合、細胞は浮遊状態でATBF1は細胞質には出現するが、核へ移行しない(図4aを参照)のに対して、培養皿にフィブロネクチンとポリ−L−オルニチンを塗布し細胞が付着できる状態にした場合、培養後3時間以内に、かなりの細胞においてATBF1の核への移行が観察され(図4bを参照)、24時間では殆ど全ての細胞でATBF1の核への移行が観察された(図4cを参照)。ラミニンやゲラチンを培養皿へ塗布した場合でも、培養皿表面にP19細胞はよく付着することができ、その条件でもやはりATBF1の核への移行が観察された。これはATBF1の細胞質から核への移行は、細胞の培養皿への接着を促進するフィブロネクチンのごとき因子(あるいは接着刺激それ自体)の影響で調節される事を意味している。浮遊状態から付着状態への変化は細胞表面に存在する受容体が関与する可能性があり、細胞外部環境に応じた情報を細胞内へ伝えることでATBF1の細胞内局在が変化すると思われた。
最近、CRM1(Exportin 1 or chromosome region maintenance 1)により様々な因子の核から細胞質への運搬移出が調節される事実が報告されている。ATBF1では、CRM1の標的配列、即ち核外輸出シグナル(Nuclear export signal)の存在が三箇所(アミノ酸配列の1267番目、2471番目、及び2504番目からそれぞれ始まる)想定されている(図3bを参照)。従ってCRM1の阻害剤である抗生剤Leptomycin Bの作用により、核からの細胞質へのATBF1移出阻害が起こる事が予想された。今回、P19細胞を使用し、上記のフィブロネクチンおよびポリ−L−オルニチンを塗布した培養皿にレチノイン酸を作用させ、さらに抗生剤Leptomycin Bを加える実験を行い、上記3−1.に記載した方法でATBF1染色を施行することでATBF1の動向を観察した。その結果、Leptomycin Bを作用させない場合の発現量に比較して(図5aを参照)、Leptomysin Bを作用させる事で、P19細胞におけるATBF1の核内濃度が明らかに増大する(図5bを参照)とともに、アポトーシスに陥る細胞数が明らかに増加した。また、さらに1日培養を追加すると、翌日には殆どの細胞が死滅した。この実験結果はATBF1の核外輸出はCRM1に制御されている事と、ATBF1濃度が核内で増加する状態は、癌細胞のアポトーシスを促進する状態である事を示すとともに、癌の治療方針に重要な示唆を与えると思われた。
細胞周期に関連する種々の因子などに関して過去に検討された事実として、タンパク質の核・細胞質移行にはアミノ酸のリン酸化が関係する事が知られ、特に核移行には核内保留シグナルのリン酸化及び脱リン酸化が重要であることが判明している。リン酸化反応を触媒する酵素の中でもPI3K (phosphatidylinositol 3-kinase)ファミリータンパク質は良く研究されており、最近ATBF1と同様に、核・細胞質を移行し機能するN-CoR (The nuclear
receptor co-repressor)の核から細胞質へ局在が移行する際、401番セリンのリン酸化にPI3Kが関与している事が報告された(2002, Nature 419, 934-939)。本発明者らはラット胎仔の脳神経細胞におけるATBF1発現とN-CoR発現が相補的であるという事実から、N-CoRが核から細胞質に輸出される場合とは逆に、ATBF1が細胞質から核への移行する際に、PI3Kによる核内保留シグナルのリン酸化が関与する事を予想した。そこで上記同様に、P19細胞を使用し、フィブロネクチン塗布培養皿でレチノイン酸を作用させた後にPI3Kの拮抗剤2種(Wortmannin, LY294002)を作用させる実験を行い、上記3−1.に記載した方法でATBF1染色を施すことでATBF1の動向を観察した。その結果、薬剤を加えない場合のP19細胞内のATBF1は核への移行を示す(図6aを参照)のに比較し、薬剤を加えた場合のP19細胞ではATBF1産生自体は影響を受けなかったものの、核内へのタンパク質の移行は阻止される傾向(作用はWortmanninがLY294002より強い)を示した(図6b, 6cを参照)。その際、細胞は***像が散在し増殖状態を維持した。細胞質のATBF1は核周囲の細胞質部分(小胞体内を予想)にリング状となるように集合する像を認め、これは、ATBF1の細胞質(小胞体)から核への移行がPI3Kに依存した事象である事、核へのATBF1移行が無いと細胞は増殖状態を維持出来る事を意味している。
Telangiectasia Mutated)は毛細血管拡張性小脳運動失調症の原因遺伝子であり、PI3Kファミリータンパク質をコードする遺伝子の代表である。その機能は多彩であるが、特に放射線などによるDNA傷害の監視システムとして細胞死や細胞周期を制御している事が知られている。今回本発明者らはATMの作用を特異的に阻害する薬剤カフェインを使用した実験を行った。まず、P19細胞を培養して培養皿接着性となったのを確認した後、レチノイン酸処理を行い、続いてカフェインを作用させた。その結果、PI3K阻害剤、Wortmannin, LY294002を使用した場合に核移行の阻害が不完全であったのに比較して(図6b、6cを参照)、カフェインでは殆ど全ての培養細胞におけるATBF1の核への移行が阻害され(図6dを参照)、細胞の増殖性は完全に保たれた。この結果はATBF1の核内保留シグナル部位のリン酸化に関与するPI3KはATMである事を意味している。さらに、ATBF1の核への導入が、ATMの活性化(リン酸化)、すなわち放射線などによるDNA傷害の感知によって促進される事を示唆している。
実施例3、4により、ATBF1が細胞質から核へ、さらに細胞質へと行き来をする事で細胞周期の時期や増殖状態が切り替わる事が明らかとなった。ATBF1のみが主な原因でこれらの事象が起こったのか、それとも他の何らかの因子が作用した結果なのかを明らかにするために、本発明者らはATBF1単独発現ベクターを用いて、マウス神経芽細胞腫由来の培養細胞株Neuro2A細胞で強制発現実験を行った。Neuro2AにATBF1発現ベクターを導入して強制的にATBF1を発現させた後、上記3−1.に記載した方法でATBF1染色を施すことでATBF1の動向を観察するとともに、フローサイトメトリーで細胞周期を検索した。また同時に培養液にBrdU (5-bromodeoxyuridine)を混入し、細胞のDNA複製のためのチミジン取り込みが行われているかどうかも検索した。その結果、ATBF1を強制発現させることで核への集積を認める細胞はBrdUが取り込まれない事が明らかとなり(図7bを参照)、培養細胞全体では細胞周期を停止している細胞の割合が増加した(図7cを参照)。この実験結果は、ATBF1の核での発現が、細胞のDNA複製の停止、細胞周期の停止の直接的原因となる事を意味している。
一方、ATBF1発現ベクターの遺伝子導入と同時に培養液にBrdU
(5-bromodeoxyuridine)を添加し、DNA複製中の細胞を標識した。その結果、ATBF1の強制発現を認める細胞では、例外なくBrdUの取り込みを認めない事が明らかとなり、ATBF1が主な原因で細胞周期が停止する事実が明らかとなった。
さらに本発明者らは、胎生14日のラット胎仔脳を使用してATBF1の核移行、増殖能との関係を検索した。胎生期の大脳基底部の神経細胞は脳室直下の傍脳室領域では未分化な状態(神経上皮細胞と称される)を維持しており、そこで最終***を終えた細胞は脳室下領域を通過し、分化領域に移動し神経細胞に最終分化するとされる。ATBF1発現とBrdU取り込みとの関係を検索するために母親ラットの腹腔内にBrdUを投与して3時間後に屠殺し、胎仔の検索を行った。実際のATBF1およびBrdUの染色性の確認するため、以下に示す手順で免疫組織化学的染色を実施した。まず採取した胎仔組織を4%パラフォルムアルデヒドで固定・パラフィン包埋し、約3μm厚に薄切し、スライドガラス上に伸展させた。脱パラフィン後、クエン酸緩衝液(pH6.0)を使用して圧力釜で4分間(110℃)熱処理を実施した(当該抗原賦活法を選択した理由については実施例7を参照)。続いて過酸化水素水で処理して内因性ペルオキシダーゼを除去した。次に、実施例2で調製した抗ATBF1抗体を5μg/mlとなるように0.05Mトリス緩衝液(pH7.6、ウシ血清アルブミン1%溶液、アジ化ナトリウム含有)に溶解した一次抗体溶液を切片に滴下し、室温で約1時間反応させた(一次抗体反応)。十分に洗浄した後、二次抗体(DAKO
Enivision, Labelled polymer, HRP [Code No. K1491] Anti-mouse and Anti rabbit)を標本に作用させ、室温で約1時間反応させた(二次抗体反応)。十分に洗浄した後、トリス緩衝液にDABを溶解し、過酸化水素水を添加した発色溶液を5分間標本に浸透させて発色させた(発色反応)。発色後、標本を水道水で十分に洗浄し、DABを除去した。続いて、マイヤーのヘマトキシリンで15秒程度染色した後、流水で8分間洗浄して色出しを行った。最後にアルコール系列及びキシレン系列を通し、透徹及び封入を行った。以上の手順で胎仔ラット脳組織を染色することにより、ATBF1(D1-120を使用)の核・細胞質の局在を明確に出来た。BrdU染色は一次抗体として抗BrdU抗体を使用し同様な染色手技を行った。DAB発色より核細胞質の染色性の差異は蛍光発色が解りやすい場合もあり、実施例3(3−1.)に示す同様の方法で蛍光染色も行い、蛍光顕微鏡 (AX70; オリンパス社製)による観察も同時に行った。その結果、傍脳室領域に存在する神経上皮細胞はBrdU取り込みを認めるとともにATBF1が細胞質に局在した(図8a、b、d、fを参照)。分化領域に存在する神経細胞はBrdU取り込みが無いことから細胞周期が停止していることが分かり、ATBF1は核に局在した(図8a、b、c、eを参照)。今回の結果は、未分化で***能を有する性質で癌細胞との類似性がある正常神経上皮細胞では、ATBF1が細胞質から核へ移行することによって、細胞増殖を停止した神経細胞へと最終分化して性質を変える事を示している。胎仔期の、***増殖能を有した神経上皮細胞と、***能を失い最終分化した神経細胞におけるATBF1の細胞内局在の比較観察は、癌の悪性度を考える上で非常に参考になる。以下の実施例で詳述するが、癌細胞においてもATBF1の細胞内局在に関して二つの様式が認められており、ATBF1が細胞質だけに存在する悪性度の高い種類と、核にATBF1が存在する比較的悪性度が低い種類に分類できる点において、胎仔期の神経細胞の観察で得られる結果と同一であると判断できる。
外科的に採取され、ホルマリン固定後にパラフィン包埋された通常の病理検体からATBF1を抗体で精密に検出するには、抗原の賦活化反応条件を決定することが重要となる。核・細胞質ともに程良く抗原が賦活される事がATBF1の核細胞質移行を検索する上では特に重要となる。今回、外科的に採取され、診断された膀胱癌のうち、上皮内の乳頭状非浸潤性膀胱尿路上皮癌(非浸潤癌と略す)及び上皮下の浸潤性膀胱尿路上皮癌(浸潤癌と略す)を各一例使用し、最適な抗原賦活法を見出すべく以下の検討を行った。まず、ホルマリン固定後、パラフィン切片を作成し、実施例6と同様の手技でATBF1染色(D1-120を使用)を行った。ただし抗原賦活法として、以下に示すごとく、熱処理3種類と賦活液9種類の組合せ(計27種類の組み合わせ)と、酵素処理3種類を使用しその染色性を検討した。熱処理3種類:(1)オートクレーブ、121℃、15分、(2)圧力釜、4分、(3)電子レンジ、煮沸しない程度の温度設定、15分。抗原賦活液9種類:(1)DAKO Target Retrieval Solution PH 6.0,(2)DAKO
Target Retrieval Solution High pH, pH 10.0,(3)10mM クエン酸バッファー pH6.0,(4)10 mM NaOH加クエン酸バッファーpH7.0,(5)TEバッファー
(1mM EDTA + 10 mM トリス塩酸バッファー) pH9.0,(6)50 mMトリス塩酸バッファー pH10.0, (7)20 mM トリス/0.65 mM EDTA/0.0005% Tween 20,(8)1mM EDTA溶液, pH8.0、(9)5% Urea溶液。酵素処理3種類:(1)トリプシン、(2)ペプシン、(3)プロティナーゼK;である。
8−1.乳癌153症例を使ったATBF1 mRNA発現量と予後の評価
乳癌手術症例153例の臨床検体について、ATBF1 mRNAの発現量を調べるためにリアルタイム半定量PCRを実施した。尚、リアルタイム半定量PCRは、LightCycler ver.3.0(ロッシュダイアグノスティックス社製)を使用し、添付のマニュアルを参考にした上、常法で実施した。その結果、原発巣の大きさ、リンパ節転移の有無、エストロゲンレセプターの発現の有無などの従来の予後因子として重要なパラメータと、ATBF1 mRNAの発現量変化は統計学的に有意な相関を示す事実が判明した(結果は図示せず)。簡略に表現すれば、ATBF1の発現量が多い腫瘍の場合、患者の
予後が良く、発現量が低下するとより悪性で、予後が悪くなる事が明確であった。
組織切片上で4例の乳癌症例(73、66,53、50歳)に対し、実際のATBF1の染色性の確認するため、実施例6に示す手順でATBF1染色(D1-120を使用)を実施した。乳頭腺管癌、硬癌の場合を例示する。組織学的に乳管内に限局し、乳管周囲に浸潤を示さない癌腫(図13a, cを参照)ではATBF1核主体の染色性を認める傾向があった(図13b, d, eを参照)。乳腺内、脂肪組織に浸潤性の発育を示す部位(図13f, h, jを参照)では、ATBF1が細胞質のみに局在する(図13g, i, k,を参照)場合と、ATBF1の染色性が欠落する場合(図13kを参照)が混在した。組織学的な浸潤性との関連で、ATBF1の細胞内局在を比較すると、乳管上皮内に限局し浸潤を示してない状態、つまり悪性度の低い状態ではATBF1は核にも局在するが、浸潤傾向、脂肪への進展傾向を示すとATBF1が細胞質に限局するか、発現欠落する傾向が明らかであった。これは実施例8の8−1で示したATBF1 mRNAの発現量の有無が予後を左右するという事実と矛盾しない結果であり、ATBF1の局在検討は乳癌の悪性度の予測に有用であると判断できる。
以下に示す例はすべて、ヒト癌細胞におけるATBF1染色と、腫瘍の悪性度の関連に関する検討及びその結果である。すべての検討において実施例6に示す手順でATBF1染色(D1-120を使用)を実施した。
発明者の一人である三浦らが既に報告したように(非特許文献6:Microbilo.Immunol. 48(2),137-145, 2004)、ATBF1は腫瘍の核の中において、p53と蛋白−蛋白結合して機能し、腫瘍の悪性度と関与する可能性のあることが解ってきている。すなわちその第一はアルファフェトプロテイン遺伝子の転写抑制する機能、第二はp21遺伝子の活性化による細胞周期抑制する機能である。特にp21を活性化して細胞周期を抑制する機能は放射線、化学物質などで細胞DNAが損傷される事がきっかけで発揮される(図1を参照)。
さて、実際の腫瘍の中でATBF1の核又は細胞質への移行が観察されるが、癌の悪性度を考える場合、その意味するところをより正確に解明するためには他因子との関連も重要である。本発明者らはその第一歩として、p21、p53という、それぞれATBF1と非常に関連の深い(再度図1を参照)2種の癌抑制遺伝子の異常がすでに明確となっているヒト膀胱癌由来の培養細胞3株(RT4, T24, HT1376)を用いてATBF1染色を行い、これらの培養細胞のどこにATBF1が局在するかを検討した。これら3種の培養株は抗ガン剤シスプラチンの効果の有無、p21が導入されるかどうかについてもすでに検索されている(Int J Cancer. 1996 Nov 15;68(4):501-5)。従ってATBF1発現の腫瘍の悪性度評価のためには最適な材料となると思われる。
図14の中央はT24のHE染色像(上段)、ATBF1染色像(中段)及びp53染色像(下段)である。T24は、p21の変異は無いが、p53ナンセンス変異株であり、p53タンパク質は途中で切断されている。通常のp53・p21の経路(図1を参照)が働かないために、この細胞はシスプラチンによりアポトーシスを導入できず、悪性度はRT4より高い。T24ではATBF1は核にも存在するが、細胞質主体に顆粒状の染色性を示している。ナンセンス変異を持つp53が細胞の核に殆ど導入されていない。
図14の右はHT1376のHE染色像(上段)、ATBF1染色像(中段)及びp53染色像(下段)である。HT1376は、p53ミスセンス変異でタンパク質にポイントミューテイションが存在する事に加え、p21フレームシフト変異を伴うことで、シスプラチンでアポトーシスを導入できない。従ってT24同様に悪性度の高い培養株である。この細胞株ではRT4及びT24のいずれとも異なり、ATBF1の弱い発現が核に存在するという特徴を示した。一部、細胞の核でミスセンス変異を持つp53が導入されている。
ヒト膀胱尿路上皮癌における悪性度判定におけるATBF1染色の有用性を検討すべく、悪性度の一つの指標となると考えられる腫瘍細胞の組織学的異型度から分類される様々なWHOグレードの症例についてATBF1染色性を検索した(図15を参照)。図15aは、65歳男性例の乳頭状粘膜内癌、WHO Grade I、組織学的低異型度の症例の染色像(a1:HE染色像、a2:ATBF1染色)である。ATBF1染色性は核のみに認められる。この染色性は培養細胞RT4(上記9−1.および図14bを参照)に類似する。
図15bは、81歳男性例の乳頭状粘膜内癌、WHO Grade I(組織学的低異型度)、WHO Grade II (組織学的中等度異型度)が混在する症例の染色像(図15b1:HE染色像、図15b2:ATBF1染色像)である。Grade Iの部分ではATBF1染色性は核のみに認められる。Grade IIの部分ではATBF1染色性は細胞質に認められる。核での染色性はやはり培養細胞RT4(上記9−1.および図14bを参照)に類似する。一方、細胞質での染色性は培養細胞T24(上記9−1.および図14eを参照)に類似する。
図15cは、55歳男性例の粘膜下への浸潤癌で、WHO Grade II(組織学的中等度異型度)症例の染色像(図15c1:HE染色像、図15c2:ATBF1染色像)である。ATBF1染色性は細胞質に認められる。染色性は培養細胞T24(上記9−1.および図14eを参照)に類似する。
図15dは、84歳男性例の粘膜下への浸潤癌、WHO Grade IIIの症例の染色像(図15d1:HE染色像、図15d2, d3:ATBF1染色像)である。ATBF1染色性が細胞質(図15d2、染色性は培養細胞T24に類似)に認められる細胞と、ATBF1染色性が薄く欠落する傾向(図15d3:染色性は3種の培養細胞のうちでHT1376に近い)の認められる細胞が混在する。
WHOのグレードである組織異型度とATBF1の発現が完全に一致するとは言えないが、WHOのグレードが上がるにつれ、また乳頭状の上皮内尿路上皮癌から浸潤性尿路上皮癌に移行するにつれ、ATBF1が核に局在、そしてATBF1が細胞質に局在、さらにはATBF1が欠落すると順番に移行する傾向があると考えられた。従って上記9−1.の結果をあわせて考えると、ATBF1の局在により膀胱癌の悪性度を判定する事が可能であると思われる。
異型度の異なる胃腺腫、悪性が確実な胃癌についてATBF1染色(D1-120を使用)を実施し、ATBF1の発現局在との関連を検索した。
III)で中等度異型を認める病変(図16b1を参照)でも、ATBF1は主に核に限局し(図16b2を参照)、胃型の腺腫との染色性の強弱の差はあるもののp53, p21の発現を認めた(図16b3、b4を参照)。これに対し高度異型を伴い境界領域の病変と思われる腸型の異型上皮巣あるいは腺腫(Group III、図16c1を参照)では、ATBF1は細胞質に顆粒状の染色性を認め(図16c2を参照)、p53の発現も軽度散在性であり(図16c3を参照)、p21の核への導入を認めなかった(図16c4を参照)。
図1で示したごとく、核に導入されたATBF1がp53と蛋白−蛋白結合を行ってp21を導入し、細胞周期停止やアポトーシスに関わると考えると、同じ腺腫でも軽度、中等度異型の場合、核にATBF1が局在するうちはp21を導入できるが、高度異型と判断されるようになるとATBF1が細胞質へ移行し、p21を導入できないために腺腫の増殖を止められなくなると考える事が出来る。この結果はATBF1染色によって腺腫の悪性度(腺腫は悪性腫瘍ではないので、悪性度というよりは増殖能、アポトーシスに陥りやすさ)を予想する事が可能で、良性病変に留まる腺腫と、癌との鑑別が必要な境界領域病変との区別に有用であると言える。
(1)高分化腺癌(tub1, Group V):食道上皮下、噴門部に発生した胃癌の一例(78歳、男性、図17a1を参照)を示す。ATBF1は癌細胞の細胞質に存在する部位(図17a2を参照)、およびATBF1発現が欠落する部位(図17a3を参照)が混在した。
(2)中分化腺癌 (tub2, Group V)
44歳女性の生検例を示す(図17b1を参照)。この例では細胞質主体にATBF1が存在した(図17b2を参照)。
(3)低分化腺癌、充実型 (por 1, Group V)
68歳女性の生検例を示す。粘膜内で膨張性の発育を示すpor1で(図18a1、a2、a4を参照)、ATBF1の染色性は、細胞全体で染色性が欠落する部位(図18a3を参照)、細胞質での局在を示す部位(図18a5を参照)が混在した。
(4)低分化腺癌、非充実型 (por2)及び印環細胞癌(signet ring cell carcinoma,
sig)
72歳女性の生検例を示す。粘膜内および胃壁全層にわたり浸潤性の発育を示すpor2, sig(図18b1を参照)では、ATBF1は細胞質に限局する染色性が主体であり、核での染色は全く認められなかった(図18b2を参照)。印環細胞癌の部位では(図19a1を参照)、ATBF1は細胞質に存在する細胞およびATBF1の欠落する細胞(図19a2を参照)が混在した。
(5)転移性の印環細胞癌(sig)
74歳のスキルス胃癌、切除不能例である。胆石症のために胆嚢摘出を行った際に胆嚢への転移が発見された症例である。リンパ管侵襲を経由して胆嚢壁に進展、浸潤を示した転移先(図19b1を参照)でATBF1の発現を示す。通常の胃癌原発部における印環細胞癌でATBF1は細胞質に限局する細胞、ATBF1が欠落する細胞の混在(図19a2を参照)を示す。しかし本例の胆嚢への転移を示す部位(図19b1を参照)では、リンパ管侵襲部位(図19b2を参照)、胆嚢壁の結合組織内への浸潤部位(図19b3を参照)ともに完全にATBF1が欠落していた。
(6)AFP産生胃癌
既報(非特許文献2,5,7)の通り、AFP産生胃癌のAFP産生部位ではATBF1発現が完全に欠落した(結果は図示せず)。
まずAFP産生胃癌が非常に悪性度の高い癌である事実を考えれば、ATBF1発現が欠落する現象は胃癌の悪性度を著しく高めると予想しうる。上記および現在継続中の多数の症例でのATBF1発現検索によると、ATBF1が核のみに限局する部位が局所的ではあるが高分化癌の一部および、充実型の低分化癌の一部において見出す事が出来る。しかし大部分の症例のあらゆる組織型の種々の癌に於いて、ATBF1は大部分が細胞質に存在するか、欠落するかのいずれかである。この結果は、胃癌が全般的に悪性度の高い腫瘍であることを意味しているとともに、細胞質主体のATBF1染色性が欠落すると、さらに悪性度が高まる可能性を指摘出来ると考える。胃腺腫、胃癌一連の発現検索を通して、胃においてもやはりATBF1染色は、腫瘍の悪性度、あるいは予後の予想に重要な役割を果たし得ると判断した。
72歳男性、陰茎摘出、鼠径リンパ節郭清を施行した症例を呈示する。パジェット病は元来、1874年、パジェット博士が乳腺の乳頭部で提唱した皮膚疾患の概念である。実際は乳腺以外の種々の部位にも起こる腺癌であり、初期には組織学的にクロマチンに富んだ核と豊富で明るい胞体を有する大型のパジェット細胞が表皮内に限局して存在する(いわゆる上皮内癌、carinoma in situ)。病態が進行するにつれて真皮に浸潤、さらにリンパ行性転移、多臓器浸潤を来す悪性疾患である。本症例ではパジェット細胞が陰茎皮膚の表皮内に限局する部位、真皮に浸潤する部位、さらに腫瘤形成を伴う部位、鼠径部のリンパ節転移部位といわゆる悪性度の異なる種々の段階の病態を同時に観察できたので、ATBF1発現検索(D1-120を使用)を各部位について行った(図20aを参照)。
血液疾患の疑いで骨髄穿刺を施行されたものの正常と診断された症例(67歳女性)の検体を使用、ホルマリン固定後にATBF1染色(D1-120を使用)を施行した。
近年、画像診断技術の進歩、CTを使用した検診の普及などに伴い、非常に小型の末梢発生腺癌が数多く発見されるようになっている。それらはCT上、gland glass opacity (GGO)として知られ、病理学的には異型腺腫様過形成(adenomatous atypical hyperplasia,AAH)、および限局型細気管支肺胞上皮癌
(Bronchiolo-Alveolar Carcinoma, BAC)、野口分類 (AからC)と診断され、予後に関するデータが蓄積しつつある。
1999年の肺癌のWHO分類ではAAHが記述され、大腸癌で提唱されたごときadenoma-carcinoma sequenceの考え方(AAHは大腸腺腫に対応)が導入され、すでに全てのAAHが腺癌に進行する訳では無いことや、AAHを経ることなく発生するde
novoのBACの存在も示されている。GGOでAAHと診断された場合、手術選択の決断は難しく、経過観察の判断がなされる場合もある。
一方、2 cm以下のBACには野口分類が適応される。野口のType A, B は、リンパ節に転移を認めず5年生存率100%で非浸潤癌に相当するとされ、Type
Cは30%にリンパ節転移を示し5年生存率75%の初期浸潤癌に相当するとされる。
このようにGGOとして前癌病変、初期肺腺癌が多数見つけられるようになった現在、末梢肺腺癌における発癌機構を組織形態学的、細胞生物学的、分子生物学的に検討し病理学的に記述する事が、治療方針の決定、予後予測などの上から重要な課題である事は明らかである。しかしながら生検診断、細胞診診断あるいは手術時の迅速診断などでAAHかBACかの診断は決定的な診断基準を欠き、それほど簡単ではなく、病理医、外科医にとって悩みの種となっているのが現状である。
AAH同様にhigh-grade AAHでも細胞質にATBF1染色性の存在する部位も混在したが、核の染色性が主体であった。
参考までに言及するが、野口のtype c相当の初期浸潤癌、さらに進行した浸潤癌でBACと判断できる腺癌については別に検討を行っている。その結果、ATBF1はいずれの症例でも細胞質での局在が主体であった(結果は図示せず)。
AAHでは核主体、BAC(野口のType A, B)では細胞質主体とATBF1発現部位の違いは明らかであった。
今回検討のために選択した症例は、いずれもGGOで、腫瘤の大きさは直径2cm以下、さらに肺の部分切除、あるいは肺葉切除がなされている。従っておそらくいずれもリンパ節転移を来さず、5年生存率は100%近くなると予想される。また組織学的にlow-grade AAH, high-grade AAH, BAC (type
A, B)との最終診断が明確になっている症例に対するATBF1染色結果であり、AAHとBACがATBF1の核、細胞質の局在で区別出来ても、臨床的にはたして意味を持つのかという疑問もでてくる可能性がある。しかしながら実際の臨床の現場では完全に切除された腫瘤に対する診断確定を行うという理想的な状況ばかりとは限らない上にAAHとBACの組織学的な鑑別は容易ではないのが実状なのである。例えば、CT検診で非常に小さな腫瘤を指摘され、細胞診、あるいは生検を行った小検体に対して組織学的な観察を通して今後の予後予想、手術適応に関する示唆を行う状況は必ず生じてくると思われる。そのような場合、AAH, BACの鑑別はまぎらわしいが、「ATBF1が核に限局するので、AAHの可能性が高く、腫瘍径が特に小さいため、年齢も考慮して経過観察を行っても良い」とか、「ATBF1が細胞質に限局するので、BACの可能性が高く、今後の腫瘍の増殖速度が速い可能性も想定し、手術が勧められる」というような本当の意味での質的診断が、ATBF1染色により出来る可能性があると考える。今後、外科的に切除された末梢小型肺腫瘍に対し、AAH, BACの判断、野口分類に加え、ATBF1染色を施す事で、今後の予後研究のみならず細胞生物学的特性を検討するのに役立ち、質的な病理診断の精度を上げる事、過剰な外科治療を防ぐ事にもつながると予想される。
正常肺はもともとATBF1の発現量の多い組織であり、正常肺組織でも2型肺胞上皮細胞などで、量的には少ないがATBF1染色性(D1-120を使用)を示す。肺胞上皮癌(あるいは異型腺腫様過形成)になると、癌細胞の細胞全体のATBF1量が圧倒的に増加することが、低倍の顕微鏡観察によっても認められた(64歳男性例、57歳女性例を提示、図23を参照)。従って、ATBF1染色性が高いという事実だけによっても、癌組織あるいは前癌病変を正常組織と鑑別できることが期待された。このように、ATBF1染色法が病理診断初学者にとって役にたつ鑑別手段となりうることが示された。
進行した肺癌は手術後再発の可能性が高い。再発、転移に対する治療法は、延命や、患者に良質な余命を送ってもらうために、ますます重要な選択となる。中でも、増加を続ける腺癌の治療には定型が無いのが現状である。症例によって、化学療法が著効を示す場合と無効な場合があり、局所再発、リンパ節や他臓器転移に対し、化学療法選択の指標が無く、無駄な化学療法で患者に負担を強いる場合や、結果的に手術的摘出が第一の選択肢であったと後悔する例も存在する。今回、再発肺腺癌症例4例、化学療法著効1例(65歳男性)、無効3例、(53歳男性、65歳女性、78歳男性)を用い、初回手術時の摘出標本に対してATBF1免疫染色を施し比較検討を行った。
著効例は組織学的に低分化の腺癌(図25a3を参照)で、CTで、気管気管支リンパ節の腫脹(図25a1を参照)が明らかであるが、化学療法4ヶ月でほとんど消失した(図25a2を参照)。ATBF1は細胞質に明らかな染色性を示す部位と、核の染色性を示す部位が混在した(図25a4を参照)。
無効例は組織学的に高分化の腺癌で(図25b3を参照)、CTで、左腎上極に転移性腫瘍(図25b1を参照)を認めた。化学療法にもかかわらず、4ヶ月後には腫瘍は明らかに増大を示した(図25b2を参照)。ATBF1の発現は少量で、全てが細胞質に限局し、核の染色性は認めなかった(図25b4を参照)。
肺小細胞癌は肺癌全体の約15〜20%を占めている。非小細胞癌と比較した場合、早期に転移を認めるのが特徴であり、診断時には70%以上に縦隔リンパ節転移を認め、約60%が遠隔転移を有し、剖検の際、遠隔転移を認めないのはわずか4%である。
通常、ほとんどの場合手術適応がないのが特徴で、放置しておくと急速な増大を示し、有効な治療が施されない場合、ほとんどの症例が1年以内に死亡する悪性度の高い腫瘍である。腫瘍の増殖速度が速い反面、抗癌剤、放射線治療に対する感受性が高く、腺癌、扁平上皮癌、大細胞癌などとは著しく異なる臨床上の特徴を有している。近年の化学療法を中心とした治療法の進歩により、小細胞肺癌の治療成績は向上し、治療による明らかな延命効果が期待され、少数ではあるが治癒する症例も認められている。また一方で、同じ組織像を呈しながら化学療法に不応性を示す小細胞癌の存在も少なからずある事も知られている。
我々は診断目的で、肺の生検が行われた4症例(78、52、67、70歳いずれも男性)について、ATBF1染色(D1-120を使用)を行い、ATBF1の腫瘍細胞における局在を検討した。いずれの症例においても小細胞癌の細胞内のATBF1量は非常に多く、細胞質に染色性を示す部位、核に染色性を示す部位、両方とも染色性を有する部位の様々な混在を認めた(図26を参照)。症例によってその割合は種々で一定してなかった。
神経芽細胞腫は、小児悪性固形腫瘍のなかでは、最も多い腫瘍で、年齢、病期、発生部位、遺伝子数や染色体異常などの予後因子が知られ、治療法、予後が左右される。悪性度予測の判断で治療方針が全く異なり、手術だけで治療を終了する場合、化学療法だけで治癒する症例も存在するだけでなく、最近は、自然治癒を期待し様子を見る場合もある。それに対し、進行した例や悪性度の高い神経芽細胞腫では、強力で長期間の化学療法が必要で、時に救命のために骨髄移植を用いた超大量化学療法が必要になる場合もある。従って現在は、予後良好な乳児神経芽細胞腫にはより軽減した治療を目ざし、予後不良の進行神経芽細胞腫にはより強力な化学療法のプロトコールの開発を目指す、という動向がある。
年齢、病期、部位といった臨床的な予後因子に加え、生検による種々の予後因子検査の追加される場合、腫瘍の組織像の他に、N-mycの増幅の有無、DNA ploidy検索(aneuoloidの腫瘍は予後良好で、diploidやtetraploidの腫瘍は予後不良)、染色体の異常解析(1番染色体の短椀欠損の存在は予後不良)、Trk-A, Ha-rasの発現解析(これらのタンパク質発現が多いと予後良好)などの検索が行われる。
消化管に発生する間葉系腫瘍において、組織学的に平滑筋や神経細胞の形質を併せ持つ腫瘍、いずれの形質も有さない腫瘍の存在が明らかになってきており、消化管間質腫瘍、gastrointestinal storomal tumor (GIST)という概念が確立してきている。GISTは消化管自動運動のペースメーカー細胞であるカハール介在細胞由来とされ、未分化間葉系細胞抗原であるCD34、およびc-kit タンパク質(CD117)が診断時のマーカーとして使用される。腫瘍化の機序にはc-kit 遺伝子の機能獲得性突然変異によるチロシンキナーゼの持続的活性化が関与している。GISTに対する有効な治療法の第一選択は外科的手術療法であるが、完全切除が出来ても再発転移を起こす例が知られている。最近、チロシンキナーゼ阻害剤(メシル酸イマチニブ)が胃原発GISTの再発転移例に有効であるとの報告がされ、再発予防、切除不能例の治療薬として臨床使用が開始された。GISTの良、悪性の絶対的な判定基準は遠隔臓器への転移と周囲臓器への浸潤の有無である。しかし予後予想という必要性から現在では腫瘍の大きさが重要な基準として使用されている。2cm以下は超低リスク(経過観察)、2から5 cmは低〜中リスク(手術も考慮)、5cm以上は高リスク(手術)とするなどの基準が使用されている。その他、細胞密度、核***像の有無、患者の年齢、腫瘍の発生部位、DNA aneuploidy、MIB 1 labeling indexなどの有用性も指摘され、現状ではこれらの指標を組み合わせて、予後予測を行わざるを得ない。
臨床的に再発傾向の無い、胃原発GIST(図28の上段、CD117陽性、CD34陽性)では全ての組織部分で、核にATBF1の染色性を認め、細胞質のATBF1染色性は散在性で、軽度であった。それに対して、腹膜播腫で死去した結腸原発GIST症例(図28の下段、CD117陽性、CD34陰性)では核のATBF1染色性も残存したが、大部分の細胞の細胞質において高度で、顆粒状のATBF1染色性が存在した。
現在までの研究で、ATBF1の核での存在はp21を介する細胞周期の停止を意味し、細胞質での存在は細胞の増殖傾向が強い事を意味することが想定されている。今回再発傾向の無いGISTおよび、増大傾向が著しくすでに患者が死去したGISTでのATBF1発現の違いは明らかであった。外科的に切除、生検されたGIST検体にATBF1染色を施し、染色性が核か細胞質かを明らかにする事により、腫瘍の再発、発育傾向を知り、予後や、各種治療追加の必要性を予測することが可能になると考えられる。
脳腫瘍のひとつである髄膜腫は髄膜皮細胞由来で、比較的緩徐な経過を取り、脳腫瘍全体の中では予後の良い腫瘍である。圧倒的に良性腫瘍が多いが、稀ながら組織型によって悪性の経過を辿るものがあり、WHOにより組織型に対応して低異型度から高異型度までGradingされている。MIB1 labeling indexなどが予後予想として使用されているが、その予後予測は容易でないのが現状である。今回、良性に経過し再発も認めない低異型度髄膜腫2例、60歳女性、(線維性髄膜腫 WHO grade I)、68歳男性(髄膜皮性髄膜腫 WHO grade I)と、再発および激しい出血を繰り返した中間異型度髄膜腫1例、52歳女性 (異型性髄膜腫 WHO grade II)、組織型から今後の経過観察が必要と思われる中間異型度髄膜腫1例、63歳男性(明細胞髄膜腫 WHO grade II)について、ATBF1染色(D1-120を使用)を行った。
一方、すでに再発出血を繰り返す異型性髄膜腫(中間異型度 grade II、図29c1, c2)、および組織学的に腫瘍の増殖速度が速いとされ、今後の再発の可能性が高いと予想される明細胞髄膜腫(中間異型度 grade II、図29d1, d2)では核のATBF1染色性、核と細胞質のATBF1染色性、細胞質のみのATBF1染色性を示す細胞が混在した。
現在までの研究で、ATBF1の核での存在は細胞周期の停止、化学療法、放射線療法の効き易さを意味し、一方で細胞質での存在は細胞の増殖性が強い事、各種治療の効き難さを意味している。今回Grade I, Grade IIの腫瘍でのATBF1発現部位の違いは明らかであった。今後、外科的に切除された髄膜腫にATBF1染色を施す事で、組織型にかかわらず髄膜腫のgradeを予測出来る可能性(例えば細胞質の染色を見つけたら少なくとも中間異型以上を疑う事が出来る)、さらには再発の可能性を考慮し、各種治療追加の必要性などを予測できる可能性が示唆されると考える。
高齢化に加えて、生活習慣、食餌の欧米化などが原因で、前立腺癌は年々増加している。前立腺特異抗原Prostate-specificantigen(PSA)検査の日常診療への導入により早い段階で発見されるようになったことも症例数増加の一因である。一般的に前立腺癌の進行は遅いといわれ、高齢者の前立腺癌は無治療で経過観察のみという方針も採用されることがあるが、長期間経過観察後の死亡率の上昇を予防するための外科手術、内分泌療法、放射線療法など局所療法の有用性も証明されてきている。最近の診断は血清中のPSA値の上昇によりスクリーニングし、経直腸的超音波下に Systematic biopsy (14カ所など)を行うのが一般的である。前立腺癌は一般に腺癌で、Gleasonによるグレードシステムが汎用される。このシステムは治療方針決定、予後との関連についてよく整理されているが、正確ではない場合もあり、理想的なgrade systemについて病理学者の間でまだ議論がある。
現在までの研究で、ATBF1の核での存在は細胞周期の停止、化学療法、放射線療法の効き易さを意味し、一方で細胞質での存在は細胞の増殖性が強い事、各種治療の効き難さを意味している。今回の結果は、生検前立腺癌組織を検索する際に、Gleason gradeを決定する事に加え、ATBF1の細胞内局在の検索を組み合わせる事により、患者の予後判定、治療方針決定のためのより正確な指標を提供できる可能性を示すものである。
現在までに検索した上記以外種々の腫瘍におけるATBF1染色(D1-120を使用)結果を以下に列挙する(いずれも図示せず)。
(1) 64歳男性、悪性リンパ腫(Mature
B-cell neoplasm, Mantle cell lymphoma); ATBF1は細胞質に存在する部位を認めたが、大部分の腫瘍細胞で欠落する傾向を示した。
(2) 40歳男性 左精巣腫瘍、(Embryonal
carcinoma 80%, Yolk sac tumor 20 %); ATBF1は細胞質に局在するか、欠落するかのいずれかであった。
(3) 62歳男性 C型肝硬変に合併した肝癌 (moderately to poorly differentiated hepatocellular carcinoma); 腫瘍の辺縁部で周囲被膜に接する部位ではATBF1が細胞質に存在する傾向を認めた。しかし腫瘍の中心部位になるに従いATBF1が欠落する傾向を示した。
(4) 85歳女性、鼻の神経芽細胞腫(olfactory neuroblastoma of hight grade malignancy);ATBF1はほとんど全ての細胞で細胞質に限局した。
(5) 88歳女性、悪性リンパ腫(Mature
B-cell neoplasma, Follicular lymphoma, Grade I);ほとんどの腫瘍細胞でATBF1は細胞質に局在した。
(6) 48歳男性、前縦隔腫瘍(Seminoma);
ほとんどすべての細胞でATBF1は細胞質に局在した。
(7) 56歳男性、胸膜腫瘍(Malignant
mesothelioma); ほとんどすべての細胞でATBF1は細胞質に局在した。
(8) 33歳男性、再発性脳腫瘍
(Hemangiopericytoma, WHO Grade III); ほとんどすべての細胞でATBF1は細胞質に局在した。
(9) 43歳女性、甲状腺癌
(Papillary carcinoma); ATBF1が核に局在を示す部分、細胞質に局在を示す部分の混合であった。
(10) 54歳男性の下垂体腫瘍(pituitary
adenoma); 一部細胞質にATBF1が局在する部位が混在したが、大部分の腫瘍細胞でATBF1は核に局在した。
(11) 25歳男性、膵腫瘍
(Endocrine tumor); ほとんどすべての腫瘍細胞でATBF1は核に限局した。
(12) 58歳女性、手掌腱膜腫瘤(Dupuytren's
palmar fibromatosis); 大部分の腫瘍細胞でATBF1は核に局在した。
10−1.ATBF1-AのN末端を認識する2種類の抗体(NT440、1-12、図31を参照)とATBF1のC末端を認識する抗体(AT6、(図31を参照))の作製
まず、以下の手順で各抗原を調製した。
(1)抗体NT440の場合(ポリクローナル抗体)
ヒトATBF1-A(非特許文献1を参照)の3種類のアミノ酸残基(4〜15:CDSPVVSGKDNG:配列番号:6)、(429〜445: CKSSEGKDSGAAEGEKQE:配列番号:7)、(500〜516:CPSELDEELEDRPHEEPG:配列番号:8)の合成ペプチドを混合してペプチド抗原として使用した。尚、配列番号:7および8の合成ペプチドのN末端の下線を付したCは合成ペプチドの安定性を確保するために本来のヒトのアミノ酸配列に追加してある。
(2)抗体1-12の場合(モノクローナル抗体)
ヒトATBF1-Aのアミノ酸残基(143〜155:CIVESLS 148 QLTQGGG:配列番号:9)の合成ペプチドを使用、N末端にC(下線付き)を付加するとともに、148番のセリン(下線付き、右肩に148と付記)をリン酸化したペプチドを抗原として使用した。従って、この抗体はATBF1-Aの148番のセリンがリン酸化されている場合のみを認識するように設計してある。
(3)抗体AT6の場合(ポリクローナル抗体)
ヒトATBF1-A, B共通のアミノ酸残基(3405〜3549:PGAPSPDKDPAKESPKPEEQKNTPREVSPLLPKLPEEPEAESKSADSLYDPFIVPKVQYKLVCRKCQAGFSDEEAARSHLKSLCFFGQSVVNLQEMVLHVPTGGGGGGSGGGGGGGGGGGGGGSYHCLACESALCGEEALSQHLE:配列番号:10)をグルタチオンSトランスフェラーゼ(GST)に融合した組み換えペプチドを抗原として使用した。
71歳の男性、肺の気管支周辺の正常リンパ組織のリンパ球における、ATBF1発現(NT440, 1-12, D1-120, AT6)を検討した。リンパ組織にはBリンパ球の成熟の場であるリンパ濾胞が含まれている。リンパ濾胞の中央部には胚中心があり、Bリンパ芽球が存在し***増殖を行っている。この部位ではBcl-2の発現が欠落しており(図32Aを参照)、細胞の***増殖が盛んであると同時に、細胞のアポトーシスへの移行も頻度が高く、アポトーシスに陥った細胞を処理する異物を貪食するマクロファージ(Tingible body macrophage)が規則正しく配置されている。それに対して周辺の辺縁領域は分化を終えた成熟Bリンパ球が貯留される場でこれらのBリンパ球には高度のBcl-2発現を認める(図32Aを参照)。Bcl-2タンパク質はミトコンドリアから細胞質へのシトクロムcの放出を抑制する事によりアポトーシス抑制性に機能する。すなわち辺縁領域に蓄えられた正常B細胞はアポトーシスを抑制する機能を獲得している訳である。さてNT440, 1-12, D1-120で得られるATBF1の染色性は胚中心、辺縁領域Bリンパ球で特に差異はなく、NT440, 1-12は核主体、D1-120の染色性は非常に弱く少量であるが細胞質と核に染色性を認めた(図32C, D, E、図33B, Cを参照)。それに対し、AT6は胚中心と辺縁領域で明らかに染色性が異なった(図32B1を参照)。胚中心では核主体、辺縁領域では細胞質主体であった(図32B2, B3、図33B, Cを参照)。
Overexpressing B-Myb Is Associated with B-Myb-dependent bcl-2 Induction, CANCER
RESEARCH 59, 2451-2456, 1999を参照)。追加検索の範囲ではまだ直接的な証明には至っていないが、今回の正常のBリンパ球での検索結果は、ATBF1遺伝子エクソン11に対応するAT6部分が核でMyb癌遺伝子タンパク質との相互作用を介し、bcl-2遺伝子の抑制に関与している可能性を示すと発明者らは理解している(図33Bを参照)。さらにB細胞の成熟、移動に伴って、核で機能を果たしているAT6部分が細胞質に移行すると、bcl-2遺伝子に対する抑制がはずれるためにBリンパ球はBcl-2タンパク質を発現出来るようになる可能性が示唆される(図33Cを参照)。このATBF1のAT6部分の核から細胞質への移動はATBF1がD1-120, AT6の中間位置でプロセッシングされて機能する事を想定させるとともに、Bcl-2タンパク質を発現しアポトーシスから逃れる機序を獲得している腫瘍においてAT6部位が核に存在すれば、Bcl-2発現が抑制されるため、その腫瘍の悪性度は低いと判定でき、AT6部位が細胞質に移行していれば、Bcl-2発現の抑制が解除されるため、悪性度はより高いと判定できる事を示すと思われる(図33を参照)。
10−2.で想定されたATBF1がいくつかの部位で切断されて細胞の各分画で機能する可能性を確認するために、ヒト神経芽細胞腫由来の培養細胞株、NB1, GOTO;マウス未分化胚性癌細胞株P19、以上3種類の培養細胞を使用し抗ATBF1抗体(D1-120)を使用したSDS-PAGE,
ウエスタンブロッティングを行った。P19, NB1, GOTO,それぞれ血清入り培養液で培養した状態の細胞を採取して検索を行った対照群と、レチノイン酸処理(P19は4日間; NB1 と GOTOは24時間)による神経細胞分化誘導群に分けて検索した。ただし、P19細胞の培養法は他の2種の細胞株とは異なり、まず4日間bacterial grade dish上に細胞を浮遊させた状態でレチノイン酸(濃度5x10-7モル)処理を行い、その後、レチノイン酸を除去した血清入り培養液で、通常のtissue
culture dishに移し3日間継続して培養した。この方法でP19細胞は神経突起が認められるニューロンへ分化誘導された。
(SDS-PAGE, ウエスタンブロッティング (Immunoblot分析)
1)P19, NB1,
GOTOいずれの種類の培養細胞もtissue culture dishに付着培養後レチノイン酸で神経分化誘導を行った。ただし、P19細胞の神経分化誘導法は3−1.に記述のごとき手順を取った。
2)培養過程を終了した細胞は培養皿から剥がしてPBS(pH 7.4)に浮遊させた。浮遊細胞は200 g、10分間遠心でペレット状に集め、proteinase inhibitorを加え氷冷したlysis buffer(10
mM Tris-HCL, pH 7.4, 150 mM NaCl, 5mM EDTA, 1% Triton X-100)に再浮遊させた。細胞浮遊液は10分間、氷上に静置した後に、15, 000 gで20分間遠心し、Tritonに可溶性なフラクション部分をサンプルとし、sodium dodecyl
sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)に使用した。
3)サンプルは
SDS-PAGE sample buffer (0.0625 M Tris-HCl, pH 6.8, 2% SDS, 10% glycerol, 5% β-mercaptoethanol)と混合し、2分間 煮沸した。21, 880 g、4℃で30分間遠心後、上清を分離し、ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した。ATBF1-A全長の分子量は404kDaであるので、SDS-PAGEのためのゲルは 4 %を選択した。タンパク質はゲル各レーンに20μgずつマウントした。
4)電気泳動後、ゲル内のタンパク質はpolyvinyldifluoride (PVDF)メンブレンに電気的にトランスファーさせ、免疫染色を施行した。
5)メンブレンをBlock
Ace(雪印乳業、日本)で室温1時間ブロッキングを行った。
6)抗ATBF1抗体, D1-120を0.5μg/mlとなるようにBolck Aceに溶解し、一次抗体溶液中にメンブレンを浸透させ、室温で2時間反応させた(一次抗体反応)。
7)洗浄後、DAKO
Envision+(DAKO社、デンマーク)と30分反応させ洗浄、さらにECL-kitで発色を行い、最終的にHyperfilm ECL(いずれもAmersham Pharmacia Biotech社製、Buckinghamshire,
英国)で感光、観察を行った。
P19細胞ではレチノイン酸処理をしない場合、ATBF1(D1-120部位で指摘)発現はほとんど認めなかった(図34レーン2を参照)。しかしレチノイン酸処理を施すと、404kDaの部位のタンパク質(ATBF1-Aのフルサイズに相当)のタンパク質発現が増加した(図34レーン3を参照)。未分化状態でP19細胞がATBF1の発現を示さず、レチノイン酸処理により神経細胞への分化を開始する時に劇的にATBF1発現を示す事はmRNAレベルでは報告されていた事実であり、404kDa(ATBF1-Aに相当)、306kDa
(ATBF1-Bに相当) のタンパク質が検出されることが予想されていた。今回、さらに小さな断片である230, 210 kDaにバンドを認めることが新たな事実として明らかになった。
次に、NB1ではレチノイン酸処理前にすでにP19同様の全長404-kDaのタンパク質発現を認めた(図34レーン4を参照)、さらにレチノイン酸処理により、ATBF1の全長404-kDaより小さな、210kDaのタンパク質が主体となる事が明らかとなった(図34レーン5を参照)。
GOTOではレチノイン酸処理に反応せず、処理前後でタンパク発現量の変化が無く、最初からすでに230kDa, 210kDaと小さなサイズのタンパク質発現が主体であった(図34レーン6,7を参照)。GOTOにおける小さなサイズ主体のATBF1発現と、404-kDaのATBF1が検出できない事実は、タンパク質が細胞質で出来ると同時にすべてがプロセッシングを受けて分断されてしまう可能性と、GOTO特異的なエクソンの使い方により小さなサイズのタンパク質をコードするmRNAが作られて、404-kDaのタンパク質が発現出来ない機序が存在する可能性をもある。
52歳の男性、胃に発生したGIST (Gastrointestinal stromal tumor) におけるATBF1発現(NT440, 1-12, D1-120, AT6)を検討しBcl-2タンパク質の発現と比較した。本例はc-kit陽性、CD34陽性(図35A,
Bを参照)、胃粘膜下に限局する径20x18x20 mmの腫瘍で、他臓器への転移は無く、核***像は高倍率50視野に2個、壊死、出血も認めてない。従って臨床的に良性に準ずる取り扱いで良いと判断されている。D1-120を使用により検出可能なATBF1部位は腫瘍全体いずれの部位でも核に集中する染色性が主体で(図36C1, C2を参照)悪性度は低いと判定できた。さらに詳細な検討のために腫瘍内でのBcl-2タンパク質発現を4種類の抗体を使用したATBF1発現と比較したところ、NT440, 1-12もD1-120同様核主体の発現を示したが(図36A, B, Cを参照)、AT6による染色性は他の抗体による染色性とは異なる部位が見出された。すなわち腫瘍部位によりAT6染色性が明らかな部位とAT6染色性が欠落傾向を示す部位がそれぞれ散在性に認められた(図35Cを参照)。そのまだらな散在する染色傾向をBcl-2発現と比較すると、その発現は相補的であり(図35Dを参照)、AT6の発現を認める部位ではBcl-2の染色性が欠落し、逆にAT6の発現が欠落する部位ではBcl-2の染色性を認めた。次にAT6局在の詳細を細胞レベルで確認した。AT6発現を認める部位では、細胞の細胞質にも染色性が観察されたが、染色性は核主体(図36D1を参照)でBcl-2発現はほぼ完全に抑制されていた(図36E1を参照)。一方AT6が細胞質に少量局在するか、核細胞質ともに欠落傾向を示す部位(図36D2を参照)ではBcl-2発現は全く抑制されず、核周囲での発現を認めた(図36E2を参照)。
56歳の女性、右鎖骨の上部、右腋窩リンパ節の直径3cm大の腫大を認めたリンパ腫。病理学的にびまん性大型の細胞の増殖で(図37Aを参照)、Bリンパ球のマーカーを含むLCA, CD20 (図37Bを参照),
CD79aが陽性であり、腫瘍細胞のほとんど全てにBcl-2タンパク質の発現を認め(図37Eを参照)、悪性リンパ腫(大細胞びまん型B細胞)と判断した。この悪性リンパ腫におけるATBF1発現(NT440, 1-12, D1-120, AT6)を検討しBcl-2タンパク質の発現と比較した。
まとめると、この悪性リンパ腫はD1-120の染色性が細胞質主体であり、さらにAT6の染色も細胞質主体で悪性度は高いと判断できた。また4種類の抗体の染色局在の比較によりATBF1タンパク質がその中間位置でプロセッシングを受けている可能性が指摘できる(図38Fを参照)。
63歳の男性、大脳半球に発生した多形膠芽腫である。この腫瘍におけるATBF1発現(NT440, 1-12, D1-120, AT6)を検討しGFAP, Bcl-2、Bcl-xLタンパク質の発現、細胞増殖のマーカーであるMIB1発現と比較検討を行った。
Glioblastomaは中高年に好発し、脳腫瘍なのかでも頻度の高い悪性膠腫である。肉眼的にも組織学的にも多彩な像を示すので、glioblastoma multiforme (多形膠芽腫) と称される。組織に腫瘍内には大小の壊死巣が存在し、pseudopalisading necrosis が特徴である。一般にグリア系悪性腫瘍で、Glial fibrillary acidic protein (GFAP) はグリア系細胞を特定する事を目的に使用される。脳腫瘍取り扱い規約には「免疫組織化学的にGFAPが一部の細胞に発現される。陽性細胞の頻度と形態は極めて多様である」とある。この文章における頻度、形態が多様であると言う事はつまりGFAP発現と腫瘍部位との関係は未だ明確にされてない事を意味すると思われる。
上述のように、ATBF1の核、細胞質移行の機序解明の端緒となったのは Yeast two-hybrid 法でのATBF1とGFAPとの蛋白−蛋白結合の証明であった。結合部位はATBF1-A のほぼ中央部とGFAPタンパク質のC末端である事、さらにはルシフェラーゼ分析でATBF1はGFAPのプロモーター活性を上げる事が明らかになっている。4つの抗体を使用する事によって、理論的に予測されていた分子機構が、実際の多形膠芽腫の臨床検体によて証明することができた。
次に腫瘍内でGFAP発現の有無が明確に区分けできる部位を選択して、両部位におけるATBF1発現(NT440, 1-12, D1-120, AT6),Bcl-2, Bcl-xLタンパク質発現、MIB1発現との比較検討を行った。腫瘍内で観察されるGFAP の発現の有無の差異による染色パターンの模様(図40A)は、D1-120(図40B), AT6(図40C), MIB1(図41A), Bcl-2(図41B),
Bcl-xL(図41C)で出来る染色パターンの模様と酷似していた。詳細な観察により、GFAP産生の欠落する部位(図40a1)では、D1-120は核主体(図40b1)、AT6も核主体(図40c1)であり、MIB1 labeling indexは低く(図41a1),Bcl-2(図41b1), Bcl-XL(図41c1)発現は欠落傾向にあった。それとは逆に、GFAP産生をしめす部位(図40a2)では、D1-120は細胞質主体(図40b2)、AT6も細胞質主体(図40c2)であり、MIB1
labeling indexは高く(図41a2),Bcl-2(図41b2), Bcl-xL(図41c2)発現はともに高度となる傾向にあった。
ATBF1発現の中でN末端を検出可能なNT440, 1-12はGFAP産生の有無にかかわらず核主体の発現を示した(図42A, Bを参照)。
実際の多形膠芽腫は手術、化学療法の発達にもかかわらず現在も高悪性の腫瘍とされ、発見されてから一年以内に80%が死亡し、5年生存率の改善もほとんど期待出来ない状況が続いている。化学療法で一時的に腫瘍の縮小を見てもいずれは残存する治療抵抗性の癌細胞が再増殖して再発、進展し患者を死に至らしめる機構がATBF1染色によって理解できる。
A. ATBF1とGFAPとの蛋白−蛋白結合(細胞質での出来事)。
B. ATBF1の導入によるGFAPプロモーター活性の刺激(核内での出来事)。
C. GFAPの産生の有無による、ATBF1のD1-120, AT6部位の細胞内局在変化と細胞増殖(MIB1)、アポトーシス抵抗性(Bcl-2, Bcl-xL)の相関。
上記A, B, Cの事実より発明者らは以下のごとく腫瘍発生から、増殖進展の仮説を考え、ATBF1局在とGFAPの関係を考察している。
(1)膠芽腫発生の初期、腫瘍の増殖が始まる。当然腫瘍血管も増生するが、阻血を起こし腫瘍細胞にDNAダメージが加わるとATBF1が核に出現する (NT440, 1-12, D1-120, AT6 いずれの部位も核主体)。これは細胞周期を止め、アポトーシスへの移行を促進する。同時にATBF1の核での発現はGFAPプロモーターの活性化を引き起こす。この段階でGFAPを発現する前にアポトーシスへ導かれる細胞群も多い(壊死部の散在。壊死部近傍にGFAP陽性細胞が少ない理由)。
(2)膠芽腫はやがて、GFAPを細胞質内に持つようになる。ATBF1の中央部はGFAPのC末端と蛋白−蛋白結合をする性質を有するため、タンパク質産生が細胞質で起こった後に核にATBF1が移行しようとしても細胞質でトラップされるため、ATBF1のN末端側のみが核に移行するも(NT440, 1-12は核に染色性がある)、中央からC末端側は細胞質に残ってしまう(D1-120, AT6いずれも細胞質に染色性)。D1-120, AT6が細胞質に存在する細胞は悪性度判定法が示すごとく悪性度が高く、化学療法によりアポトーシスに陥りにくい。これはGFAP陽性となった細胞群がMIB 1 labeling indexが高く、Bcl-2, Bcl-xLを発現してくる事からも明らかである。(図42B, Cを参照)。
(3)上記(1)、(2)の過程が腫瘍の各部で起こるため小型の膠芽腫はやがてGFAP産生部位が散在し、出血、壊死の混在する多形性を有するようになる(多形膠芽腫)。
(4)さらにここに化学療法などで、ATBF1全体が核に存在しGFAP発現の無い細胞部分をアポトーシスに移行させると、最初は腫瘍の縮小を認めるが、やがてGFAP産生を認めアポトーシスに抵抗性を持つ細胞群が主体の腫瘍に変化する。
(1)多形膠芽腫は特に悪性度が高く、予後の悪い腫瘍である。従来の病理診断からはその分子生物学的メカニズムは不明であったが経験的に、GFAP産生能が一つの悪性度の指標となっていた。
(2)多形膠芽腫はATBF1の核での発現が原因でGFAP産生が活性化される。ATBF1, C末端側半分がATBF1-GFAPの蛋白−蛋白結合で細胞質内に安定化されることから、ATBF1の核移行が阻止されて悪性度が増すと想定される。
(3)多形膠芽腫で、GFAPにATBF1がトラップされるのを予防する工夫を行えば、ATBF1が核移行を果たして放射線治療、化学療法が有効になる事が予想される。今後、新たな治療法が生まれる可能性がある。
52歳男性。食道の高度悪性とされる神経内分泌癌である。この腫瘍におけるATBF1発現(NT440, 1-12, D1-120, AT6)を検討し、腫瘍の形態学的特徴との比較検討を行った。食道悪性腫瘍の大部分は扁平上皮癌であり、未分化癌は稀である。中でも神経内分泌癌は悪性度が高く予後不良とされる。本例は食道原発の神経内分泌癌で、術後2ヶ月、肝転移を来たし死亡した。腫瘍は門歯列より約30cmに存在した4.0×2.8×1.7 cm大、表在***型腫瘤であった(図43Aを参照)。術後の病理検索で、腫瘍細胞はNSE,S-100蛋白が大部分陽性,chromograninA、CD56(NCAM)(図43Bを参照),Synaptophisinも陽性であることより神経内分泌癌と診断した。またリンパ管への侵襲も認めた(図43Cを参照)。腫瘍はAE1/AE3,CAM5.2陽性で明らかに上皮性の性格を有する部位と、Vimentin陽性で肉腫様の部位が混在し多様な分化方向を持つ腫瘍であると判断された。
索状、リボン状で高分化な配列を示す部位は、NT440, 1-12, D1-120, AT6いずれも核主体の染色性を認めた(図44A1-E1,
Fを参照)。それに対し、巣状、低分化な配列を示す部位では、NT440, 1-12が核主体、D1-120, AT6は細胞質主体の染色性を認めた(図44A2-E2, Gを参照)。ATBF1による悪性度判定を行うと、高分化な部位はD1-120, AT6ともに核主体で悪性度は低く、低分化な部位はD1-120, AT6とも細胞質で悪性度が高いと判定できた。
以上ATBF1蛋白の各部に対する抗体の同時利用は、癌細胞の悪性度判定に加え、腫瘍に特徴的な蛋白プロセッシングの異常や、形態学的な特徴との関連さらに腫瘍進展様式の意味を推定する事にも役に立つと判断された。
第1の例は56歳、男性、副鼻腔の未分化癌でリンパ節転移の部位である。MIB1でほとんどの腫瘍細胞がラベルされ(図45Aを参照)、非常に高度のBcl-2蛋白の発現を認める高悪性度腫瘍である。第2の例は47歳女性、脳に発生した大細胞びまん型B細胞リンパ腫の部位である。脳血管周囲にびまん性の発育を示し(図46Aを参照)、CD20, CD79aが陽性(図46B, Cを参照)でB細胞性の悪性リンパ腫と判断でき、Bcl-2蛋白の発現が強い(図46Dを参照)高悪性度の腫瘍である。この2症例においてATBF1(NT440, 1-12,
D1-120, AT6)の染色性を検討した。
2例ともにNT440, 1-12の染色性は核に限局する傾向があり(図45C, D, G, 16E, F, Iを参照)、D1-120はほぼ完全に欠落していた(図45E, G, 16G, Iを参照)。またAT6は細胞質主体の発現を認めた(図45F, G, 16H, Iを参照)。
このようにエクソン3,10,11に対応する抗体を使用したATBF1部分の細胞内の発現、核、細胞質の局在検索することは、対応するATBF1ゲノム領域が担うタンパク質を機能的に評価する意味として重要であり腫瘍の悪性度を決定する分子メカニズムとして、予想されるmRNAのAlternative splicingやゲノムDNA構造の異常をタンパク質レベルで容易に検出することが可能になると思われた。
68歳女性、脳に発生した大細胞びまん型Bリンパ腫である。CD20, CD79a陽性でびまん性の発育を示す悪性リンパ腫で、Bcl-2蛋白は大部分で欠落(図48の絵Aの部位)していたが、腫瘍の周囲に(図48の絵Bの部位)少量の発現を認めた。どちらの部位もMIB1ラベル、PCNA発現は高度であり、ともに高度悪性であることに変わりはないが、Bcl-2発現欠落部位は悪性度がやや低いと判断された。
このA, Bの部位でのATBF1 (NT440, 1-12, D1-120, AT6)の染色性を比較検討した。腫瘍の周辺の部位はNT440, 1-12は核に局在(図48のB1, B2、図49Bを参照)、D1-120, AT6は細胞質主体の局在(図48のB3, B4, 図49Bを参照)を示した。D1-120が細胞質に存在することはこの腫瘍の悪性度が高い事を意味し、AT6が細胞質主体であり、Bcl-2発現がある事に矛盾は無い。それに比較して、腫瘍の中心部位ではNT440,
1-12, D1-120は欠落し(図48A1, A2, A3, 図49Aを参照)、AT6は核主体に局在した(図48A4、図49Aを参照)。D1-120が欠落する事はこの腫瘍の悪性度が高い事を意味し、AT6が細胞質主体であり、Bcl-2発現が抑制されている事に矛盾はない。しかしながらエクソン3および10に対応する部位が欠落して、エクソン11に対応する部位のみが核に局在するという染色性は発明者らが全く経験してない新たなパターンであった。
また今回のエクソン11に対応する部位のみが核に局在するパターンは、エクソン11部位には核内移行シグナルがそれ自身の配列の中には検出されていないが、Mybタンパク質など他の核移行シグナルを有する因子との蛋白相互作用領域を保存しているために、何らかの核移行タンパク質と結合して核移行を果たしている可能性が考えられる。
すでに既報(非特許文献6)で示したごとく、胃癌の培養細胞において、ATBF1は癌抑制遺伝子p53と蛋白−蛋白結合して機能する。このATBF1とp53複合体が癌抑制遺伝子p21のプロモーターを活性化して、p21の発現上昇を導き、細胞周期を止めるとともに、癌細胞をアポトーシスに陥らせることが想定された。実際にアルキル化剤(抗ガン剤)を作用させてDNA修飾シグナルを活性化するとATBF1の発現を誘導できる事実も明らかになっている[細胞周期調節に関するp53タンパク質の関与する経路]。
細胞周期停止、アポトーシスへの移行に関し、ATBF1は癌遺伝子タンパク質c-mybと蛋白−蛋白結合を行い、その機能を抑制することが知られている(非特許文献8を参照)。またMybタンパク質ファミリーはBcl-2を導入し、細胞のアポトーシスを抑制する機能があると考えられている(Grassilli,
E. et al. Resistance to Apoptosis in CTLL-2 Cells Overexpressing B-Myb Is
Associated with B-Myb-dependent bcl-2 Induction, CANCER RESEARCH 59, 2451-2456,
1999を参照)。従ってそのMybタンパク質ファミリーの抑制はすなわち細胞周期停止、アポトーシスの誘導につながると想定される。[細胞周期調節に関するRB(retinoblastoma)タンパク質の関与する経路]。実際に後述の実施例で示すが、正常組織、腫瘍において、ATBF1遺伝子のエクソン11に相当するATBF1部分(AT6で検出)が核に存在する部位ではBcl-2の発現が抑制され、同部位が細胞質に移行する部位でBcl-2の発現が活性化される例が存在している。抗ATBF1抗体(AT6)は、癌遺伝子c-mybと蛋白−蛋白結合するATBF1のエクソン11を等位的に認識する(非特許文献8を参照)。今回の組織学的検索の結果は、ATBF1タンパク質が核に移動することでMyb癌遺伝子タンパク質との相互作用することが可能となり、bcl-2遺伝子の抑制に関与している可能性を示唆している。
以上の2つの細胞周期抑制経路に関する既報研究、および発明者らが行った検索により、癌細胞での細胞周期の停止、アポトーシスへの移行はATBF1発現総量のみならず、その機能断片の細胞内局在に強く依存している事実が明らかとなった。これがATBF1に対する複数の抗体(D1-120のみでなく、NT440, 1-12, AT6を含む)を使用することによる「癌細胞の悪性度判定法」の理論的な基礎となっている。
さらに非特許文献9では、前立腺癌においてATBF1をコードする遺伝子に各種の変異が存在することが明らかとなり、ATBF1の機能障害が前立腺癌の原因の一つである事実が報告された。前立腺癌以外の様々な癌細胞において16番の染色体異常は数多く報告されていたが、それぞれの癌化に関与する責任遺伝子は特定されてなかった。非特許文献9は16番の長腕に存在するATBF1が腫瘍抑制遺伝子(癌抑制遺伝子)の一つとして腫瘍の悪性度を決定する重要な役割を演じていることを明確にするものである。
以下の試薬を組み合わせてキットとした。
A試薬:抗ATBF1抗体原液(D1-120)
B試薬:ATBF1抗原液
C試薬:GST抗原液
A試薬は、実施例2で調製した抗ATBF1抗体を250μg/mlに調整して得られる。B試薬は、D1-120抗体作製時に調整したマウスATBF1の41アミノ酸残基(2114〜2154:LQTLPAQLPPQLGPVEPLPADLAQLYQHQLNPTLLQQQNKR:配列番号1)をGSTに融合した組み換えペプチドを2mg/mlに調整して得られる。C試薬は、GST(例えばSigma社製)を2mg/mlに調整して得られる。
(1)外科的或いは剖検時に切除した被検組織を、通常の病理検査と同様の手順で、10%ホルマリン固定、パラフィン包埋する。ラット、マウスなどを使用した動物実験の検体はホルマリンの代わりにパラフォルムアルデヒド固定を使用してもよい。ATBF1の染色性に関してホルマリンとパラフォルムアルデヒド固定では特に差はない。採取後すぐにホルマリン固定した外科病理組織材料を使用することが基本となる。
(2)パラフィン包埋後の組織を切削、薄切してスライドガラスに載せる。スライドガラスとしては例えばSuperfrost、MASコート付き、S-9441(商品名、マツナミ製)を使用する。当該スライドガラスは圧力釜による熱処理に対する耐久性に優れている。
(3)通常の病理標本作製に使用される、通常の脱パラフィン系列で切片を処理し、最終的にアルコールから精製水に置換する。
(4)(3)の間に圧力釜(一般的な調理に使用されるものを使用できる)にクエン酸緩衝液を2リットル入れ、強火で沸騰させる。市販のクエン酸緩衝液(例えば、三菱化学ヤトロン製、インスタントクエン酸緩衝液[20倍濃縮液RM-102C], pH6.0)を使用することができる。原則、一回熱処理を行った緩衝液は再使用しない。
(5)切片を金属製の標本かごに入れ、圧力釜の蓋をとり、緩衝液中に横向きで、切片の載っている面が上に向くように置く。
(6)蓋をした後、蒸気音が出始めるまで強火で加熱し、その後は弱火にして4分間加熱を続ける。加熱を停止し、1分間放置する。
(7)流水(水道水)で釜全体を冷却する。約40分後に圧力釜の蓋を取り、標本かごを釜から出して精製水に置換する。続いて内因性ペルオキシダーゼをブロックするために、過酸化水素水で処理を行う。次に精製水に置換し、過酸化水素水を除去した後、20mMトリス緩衝液になじませる。その後、0.05Mトリス緩衝液pH7.6に置換する。
(8)アジ化ナトリウム含有ウシ血清アルブミン1%溶液を添加した0.05Mトリス緩衝液pH7.6を用意し、これでA試薬を50倍希釈する(抗体溶液)。切片に抗体溶液を添加し、加湿条件下(モイストチャンバー内)、室温で1時間反応させる(一次抗体反応)。通常の検体には1回の反応に約40μl、比較的大きな検体には約80μlの抗体溶液を使用する。ピペットの先をプレパラート手前にあて、切片に触れないように注意しながら抗体溶液を切片によくなじませる。
(9)0.05Mトリス緩衝液pH7.6を用いて切片を洗浄する(5分間、合計2回)。洗浄処理後、余分な洗浄液を拭き取る。
(10)HRP標識2次抗体(DAKO
Enivision, Labelled polymer, HRP(Code No. K1491)Anti-mouse and Anti-rabbit)を切片に添加し、室温で1時間反応させる(二次抗体反応)。
(11)(9)と同様の洗浄を行う。
(12)DAB Chromogen (DAKO, Code. S3000)を2錠、40mlの0.05Mトリス緩衝液pH7.6に溶解する。これに過酸化水素水を30μl加えた後、切片に浸透させ(5分間)、発色させる。
(13)流水(水道水)でDAB液を洗浄、除去する。
(14)マイヤーヘマトキシリンで切片を15秒程度染色する。
(15)切片を流水中に8分間静置する(色出し洗浄)。
(16)通常の病理標本作製と同様にアルコール系列及びキシレン系列を通し、透徹、封入を行う。
(17)以上の結果得られた標本を用いて顕微鏡観察を行う。
DABによる発色(茶褐色)がATBF1特異的な免疫染色の結果であることを確認するためには以下の操作を行う。
(1)A試薬(ATBF1抗体原液)10μl、B試薬(ATBF1抗原)1μl、PBS 10μl、及び5% BSA 4μlをマイクロチューブ内で混合する。
(2)チューブ全体(全量25μl)を、37℃で2時間反応させる。
(3)反応終了後、抗体希釈時に使用する緩衝液(アジ化ナトリウム含有ウシ血清アルブミン1%溶液を添加した0.05Mトリス緩衝液pH7.6)を25μl添加する。このようにして得られた溶液全量50μlを1次抗体反応用の試薬として使用し、上記の方法で免疫組織化学染色を行う。その結果DABによる染色が認められなければ、ATBF1特異的な免疫染色が行われていることを確認できる。
GST融合抗原を使用して調製したため、抗ATBF1抗体(A試薬)にはGSTに対する反応性が混在している可能性がある。DABによる発色が抗ATBF1抗体のGSTに対する反応性の結果でないことを確認するためには以下の操作を行う。
(1)A試薬(ATBF1抗体原液)10μl、C試薬(GST)1μl、PBS 10μl、及び5% BSA 4μlをマイクロチューブ内で混合する。
(2)チューブ全体(25μl)を、37℃で2時間反応させる。
(3)反応終了後、抗体希釈時に使用する緩衝液(アジ化ナトリウム含有ウシ血清アルブミン1%溶液を添加した0.05Mトリス緩衝液pH7.6)を25μl添加する。このようにして得られた溶液全量50μlを1次抗体反応用の試薬として使用し、上記の方法で免疫組織化学染色を行う。その結果DABによる染色が認められれば、ATBF1特異的な免疫染色が行われていることを確認できる。
本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
Claims (7)
- 生体から分離された被検癌細胞内のATBF1量を検出するステップであって、ATBF1量として、(1)ATBF1遺伝子のエクソン10に対応する領域(第1領域)の核内存在量及び/又は細胞質内存在量、及び/又は(2)ATBF1遺伝子のエクソン11に対応する領域(第2領域)の核内存在量及び/又は細胞質内存在量、が検出されるステップと、
以下の基準、即ち、
(a)第1領域が核主体に局在していると悪性度が低い;
(b)第1領域が細胞質主体に局在していると悪性度が高い;
(c)第1領域が細胞質内及び核内で欠落していると悪性度が高い;
(d)第2領域が核主体に局在していると悪性度が低い;及び
(e)第2領域が細胞質主体に局在していると悪性度が高い;
に従い被検癌細胞の悪性度を判定するステップと、
を含んでなる、被検癌細胞の悪性度判定法。 - 更に、(3)ATBF1遺伝子のエクソン3に対応する領域(第3領域)の核内存在量及び/又は細胞質内存在量も検出され、該検出の結果を補助的に用いて被検癌細胞の悪性度を判定する、請求項1に記載の悪性度判定法。
- 前記検出が免疫組織化学的染色法を利用して実施される、請求項1又は2に記載の悪性度判定法。
- 以下の(1)及び(2)の抗体を含んでなる、請求項1〜3のいずれか一項に記載の悪性度判定法用の悪性度判定用キット:
(1)ATBF1遺伝子のエクソン10に対応する領域(第1領域)を認識する抗体、
(2)ATBF1遺伝子のエクソン11に対応する領域(第2領域)を認識する抗体。 - 以下の(3)の抗体を更に含んでなる、請求項4に記載の悪性度判定用キット:
(3)ATBF1遺伝子のエクソン3に対応する領域(第3領域)を認識する抗体。 - ATBF1を更に含んでなる、請求項4又は5に記載の悪性度判定用キット。
- 前記抗体が、ATBF1と、タグ又はキャリアタンパク質との融合タンパク質を抗原として作製されたものであって、
前記タグ又はキャリアタンパク質を更に含んでなる、請求項4〜6のいずれか一項に記載の悪性度判定用キット。
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