JP3980630B2 - アポトーシスに陥る傾向を判定する方法及びその利用 - Google Patents
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Description
日本は歴史上例のない高齢化社会を迎えており、高齢者の2〜3%はアルツハイマー病になると推定されている。2000年で患者数は45万〜55万となり、2020年にはその倍近い70〜80万人にのぼり、さらに増加するものと推測されている。今後このような問題が日本だけでなく、世界に広がることから我々は逃れることは出来ない状況にある。
数年前まではアルツハイマー病の病理学的な確定診断は治療法がなかったゆえに重要視されていなかった。しかし最近の研究、すなわち家族性アルツハイマー病における原因遺伝子の解明によって、老人斑の根幹をなすアミロイドβ蛋白の形成過程やタウ蛋白質のリン酸化の機序などが明らかにされるとともに、アポリポ蛋白E4が危険因子である点からコレステロール代謝等がアルツハイマー病の病態に大きく関与していること、などが判明してきている。これらの知見に基づき、新しい治療法の開発がすすみつつあり、アルツハイマー病の病態解析、ケアは大きく進歩しつつある。特に今日ではコリンエステラーゼ阻害薬が実際に臨床の場で使用されそれなりの成果をあげ、発病初期であれば症状の進行をある程度抑えることも可能になっている。またワクチン療法の開発は、現在は臨床治験段階でストップしているが、近い将来必ずや再開されアルツハイマー病の予防や治療に大きく貢献できるものと思われる。さらに、昨今の目覚ましい技術の進歩に伴うCT、MRI、PET/SPECTなどの画像診断はアルツハイマー病の早期診断、予後予測診断に重点がおかれるようになってきている。特にPET probeの開発により老人斑の描出までをも可能にしつつある状況である。
日本においては、アルツハイマー病で在命中の確定診断に生検による病理診断法が用いられる事は現在のところ無い。倫理面での問題、安全性の問題、など種々の理由から、海馬あるいはその近傍が実際に生検の標的とされることは無い。しかしながら、海馬がてんかん発作の原因部位である場合を含め、実際に海馬を標的とした電極挿入、あるいは片側海馬の切離術、などの実施例は多数ある。従って同部位のピンポイントで正確な生検は、現在技術的には殆ど問題はない。欧米における生検によるアルツハイマー病の診断状況を考えると、将来的にその必要性が徐々に増してくる事に疑いは無いと思われる。
本発明に関連する報告を以下に列挙する。
少量生検された海馬の脳神経組織において「単純萎縮による神経細胞死」を正確に判定出来ることは、将来的にアルツハイマー病の確定診断、治療方針の決定上、極めて重要である。一方、その判定は、正確であることは勿論のこと、迅速性、簡便性も要求される。海馬領域が記憶に関係する大切な部位であることを考慮すれば、生検により多量の脳神経組織を得ることは不可能である。従って、正確で且つ簡便、再現性のある「神経細胞死」の決定が行えてはじめて正確な診断、さらには出来るだけ早期の治療開始による治療効果を期待できる。従って、正確であることに加えて、過度の負担を患者にかけることなく「神経細胞死」を判定できる手法が開発されれば、アルツハイマー病診断に対する貢献は計り知れない。今後さらに発展が期待されるアルツハイマー病の病態解析、痴呆進行を止めるための治療法の開発への貢献、ひいてはアルツハイマー病患者への大きな福音となると思われる。
本発明は以上の背景の下、アルツハイマー病の診断に有効な手段を提供することを目的とする。
(1)高度の脳萎縮が観察されるアルツハイマー病(以下ADと略す)脳の海馬錐体細胞内ではATBF1量が顕著に増加していた。つまり、ATBF1量の増加とADにおける神経細胞死との間に高い相関を認めた。この結果からATBF1量の増加を指標として神経細胞死を判定できると考えられた。
(2)ATBF1蛋白は少なくとも三つの部分に分断されるプロセシングを受け、AD脳の海馬錐体細胞内ではD1-120に認識される部分ATBF1(ATBF1遺伝子のエクソン10に対応する領域を含む部分であり、ATBF1-Aの中央に位置する)が核に局在するとともに(核主体の局在)、その量も増大していた。つまり、当該部分ATBF1量が核に局在すること及びその発現量とADにおける神経細胞死との間に高い相関を認めた。この結果から、当該部分ATBF1の検出(特に局在態様を明らかにすること)が神経細胞死の判定に有効であると考えられた。
(3)AD脳の海馬錐体細胞内ではAT6に認識される部分ATBF1(ATBF1遺伝子のエクソン11に対応するC末端領域を含む部分)が細胞質に局在するとともに(細胞質主体の局在)、その量も増大していた。つまり、当該部分ATBF1量が細胞質に局在すること及びその発現量とADにおける神経細胞死との間に高い相関を認めた。この結果から当該部分ATBF1の検出(特に局在態様を明らかにすること)が神経細胞死の判定に有効であると考えられた。
(4)AD脳の海馬錐体細胞内では1-12に認識される部分ATBF1(ATBF1遺伝子のエクソン3に対応するN末端領域を含む部分)が細胞質に局在するとともに(細胞質主体の局在)、その量が増大していた。つまり当該部分ATBF1量が細胞質に局在すること及びその発現量とADにおける神経細胞死との間に高い相関を認めた。この結果から、当該部分ATBF1の検出(特に局在態様を明らかにすること)が神経細胞死の判定に有効であると考えられた。
本発明は以上の成果及び知見に基づき完成されたものであって、次の構成を提供する。
本発明は以下のステップを含んでなる、海馬錐体細胞がアポトーシスに陥る傾向を判定する方法である。
(a)被検対象から採取された海馬錐体細胞を用意するステップと(b)前記海馬錐体細胞内におけるATBF1量を検出するステップ。
本発明の一態様では、ステップ(b)において、以下の(1)〜(4)からなる群より選択される一又は二以上が検出される。
(1)前記海馬錐体細胞内における総ATBF1量;(2)ATBF1遺伝子のエクソン10に対応する領域を含む部分ATBF1の前記海馬錐体細胞における核内存在量及び/又は細胞質内存在量;(3)ATBF1遺伝子のエクソン11に対応するC末端領域を含む部分ATBF1の前記海馬錐体細胞における核内存在量及び/又は細胞質内存在量;(4) ATBF1遺伝子のエクソン3に対応するN末端領域を含む部分ATBF1の前記海馬錐体細胞における核内存在量及び/又は細胞質内存在量。
本発明の好ましい一態様では少なくとも(2)が検出される。本発明のさらに好ましい一態様ではステップ(b)において上記(2)〜(4)が検出される。
本発明の方法では、検出法として免疫組織化学的染色法が好適に利用される。
本発明は他の局面として、本発明の方法に利用可能な試薬及びキットを提供する。本発明の試薬は、抗ATBF1抗体からなるアポトーシス傾向判定用試薬である。抗ATBF1として、(1)ATBF1遺伝子のエクソン10に対応する領域を含む部分ATBF1を認識する抗体、(2)ATBF1遺伝子のエクソン11に対応するC末端領域を含む部分ATBF1認識する抗体、又は(3) ATBF1遺伝子のエクソン3に対応するN末端領域を含む部分ATBF(部分ATBF1-A)を認識する抗体を用いることができる。
本発明のキットは以下の(1)〜(3)からなる群より選択される一以上の抗体を含む。
(1)ATBF1遺伝子のエクソン10に対応する領域を含む部分ATBF1を認識する抗体、(2) ATBF1遺伝子のエクソン11に対応するC末端領域を含む部分ATBF1を認識する抗体、及び(3)ATBF1遺伝子のエクソン3に対応するN末端領域を含む部分ATBF(部分ATBF1-A)を認識する抗体からなる群。
好ましい態様では、本発明のキットは付加的にATBF1を含む。また、タグ又はキャリアタンパク質との融合タンパク質である抗原を用いて作製された抗体をキットに使用する場合には、付加的にタグ又はキャリアタンパク質を更に含めてキットとしてもよい。
本明細書において「ある物質の量(例えばATBF1量)を検出する」とは、検出対象の存在量を絶対量として又は相対量として把握することをいう。ここでの相対量は例えば、アルツハイマー病を含めたいわゆる痴呆症状を呈していなかった剖検例の海馬錐体細胞内に認められる検出対象の量を標準存在量として算出することができる。核内の存在量と細胞質内の存在量をそれぞれ求める場合には、細胞質内の存在量を基準とした相対量として核内の存在量を求めることができ、同様に核内の存在量を基準とした相対量として細胞質内の存在量を求めることができる。用語「ある物質の量(例えばATBF1量)の検出」は、検出対象の有無(存在するか否か)を調べることも含む概念を表す。通常は検出対象の有無が調べられると同時にその存在量が調べられることになる(存在する場合)。尚、厳密に検出対象を定量することは必須でなく、例えば、同時に検索を行った標準資料の錐体細胞における検出量と比較することによって、被検海馬錐体細胞のアポトーシス傾向を判定可能となる程度に検出対象の量を測定できればよい。
ATBF1遺伝子の構造を図26に示す(非特許文献1、非特許文献5を参照)。また、ATBF1遺伝子のエクソン2〜11の配列を図27〜図30に示す。ATBF1遺伝子にはエクソン1〜11が存在し、選択的スプライシングの結果としてATBF1-A及びATBF1-BのmRNAが形成される。尚、図26においてエクソン10及び11として示した領域は、非特許文献5ではそれぞれエクソン9及び10と記載されている。
エクソン3、エクソン10、及びエクソン11に対応するアミノ酸配列及び塩基配列については、添付の配列表に以下の配列番号で記載する。
エクソン3に対応する領域のアミノ酸配列(配列番号:11)、エクソン3の塩基配列(配列番号:12)、エクソン10に対応する領域のアミノ酸配列(配列番号:13)、エクソン10の塩基配列(配列番号:14)、エクソン11に対応する領域のアミノ酸配列(配列番号:15)、エクソン11の塩基配列(配列番号:16)。
本発明の第1の局面は、海馬錐体細胞がアポトーシスに陥る傾向(本明細書において「アポトーシス傾向」ともいう)を判定する方法に関する。
上記のように、海馬錐体細胞の「アポトーシス傾向の判定」は「単純萎縮による細胞死の判定」と実質的に差はないとみることができる。従って、アポトーシス傾向の判定結果を利用して、単純萎縮による細胞死で特徴づけられるアルツハイマー病の診断を行うことができる。このように本発明の方法はアルツハイマー病の診断に有用な情報を与える。尚、「アポトーシス傾向の判定」は、実際の細胞の生死区別の判定や、多数の神経細胞の細胞死により脳萎縮を来した状態を判定するものではない。
「アポトーシスに陥る傾向(アポトーシス傾向)」の判定では典型的には、アポトーシス傾向の有無が判定される。アポトーシス傾向に高低を設け、被検海馬錐体細胞がどの程度の確率でアポトーシスに陥るかを判定することにしてもよい。尚、本明細書において「アポトーシス傾向が有る」という判定結果は、アポトーシスに陥る可能性が極めて高いことを意味し、神経細胞死が認定されると考える。
(a)被検対象から採取された海馬錐体細胞を用意するステップ。
(b)前記海馬錐体細胞内におけるATBF1量を検出するステップ。
ステップaでは被検対象から採取された海馬錐体細胞を用意する。ヒトに限らず、例えば、サル、チンパンジー等の非ヒト霊長類、マウス、ラット、モルモット等の齧歯類、ニワトリ、ウズラ等の鳥類等を被検対象とすることができる。ヒト以外の動物を被検対象とした場合に得られる情報(判定結果)は、当該非ヒト動物のアルツハイマー病の診断にも利用され得るが、むしろそれをヒトのアルツハイマー病の診断法の確立に利用できる点で有用である。
特にヒト生体から海馬錐体細胞を採取する場合は通常、他の診断法によってアルツハイマー病が疑われる者(患者)が被検対象となる。ここでの他の診断法としては例えば、臨床症状および病歴、CT検査、MRI検査、PET/SPECT検査、脳波検査、生化学的検査を用いた診断法などが該当する。通常は、これらの一つ以上によってアルツハイマー病が疑われる生体脳組織から海馬錐体細胞が採取される。
ステップbでは、ステップaで用意した海馬錐体細胞(被検海馬錐体細胞)内のATBF1量を検出する。その結果得られたATBF1検出量に基づいて被検海馬錐体細胞のアポトーシスに陥る傾向を判定する。具体的には例えば、多量のATBF1が検出された場合にアポトーシスに陥る傾向がある(又は高い)と判断し、細胞死を認定できる。
ここで「ATBF1」とは、AT motif binding factor 1(ATモチーフ結合因子1)をいう。ATBF1は、AFP(アルファフェトプロテイン)調節因子のATリッチドメインに結合し、AFP遺伝子の発現を下方調節する転写因子であることが知られている(非特許文献1を参照)。ATBF1には2つのアイソフォーム(ATBF1-AとATBF1-B)の存在が知られている。ATBF1-Aはタンパク質N末端側がATBF1-Bよりも920アミノ酸長い構造を有している。ATBF1-Aのアミノ酸配列(404kDa)を配列番号:1に示す。また、ATBF1-Aをコードする塩基配列(GenBank accession number:L32832)を配列番号:2に示す。同様に、ATBF1-Bのアミノ酸配列(306kDa)を配列番号:3に示し、ATBF1-Bをコードする塩基配列(GenBank accession number:L32833)を配列番号:4に示す。
(1)海馬錐体細胞内における総ATBF1量。
(2)ATBF1遺伝子のエクソン10に対応する領域を含む部分ATBF1の海馬錐体細胞における核内存在量及び/又は細胞質内存在量。
(3)ATBF1遺伝子のエクソン11に対応するC末端領域を含む部分ATBF1の海馬錐体細胞における核内存在量及び/又は細胞質内存在量。
(4)ATBF1遺伝子のエクソン3に対応するN末端領域を含む部分ATBF1の海馬錐体細胞における核内存在量及び/又は細胞質内存在量。
総ATBF1量の検出では、ATBF1-A及びATBF1-Bの両者が検出対象となる。但し、海馬錐体細胞内では、ATBF1-Aが主に発現し、ATBF1-Bの発現量は無視できる程度である。従って、ATBF1-A量のみを検出することにしても通常は、ATBF1-A及びATBF1-Bの両者を検出した場合と同等の検出結果が得られる。
典型的には、海馬錐体細胞の核内及び細胞質内においてATBF1量を検出するが、核内又は細胞質内のいずれかにおいてのみATBF1を検出することにしてもよい。また、核内及び細胞質内を区別せずに、海馬錐体細胞全体に含まれるATBF1量を検出することにしてもよい。
後述の実施例に示すようにアルツハイマー病脳の海馬錐体細胞では、ATBF1が増量していることを認めた。つまりATBF1量の増加が、アポトーシス傾向を判定するための好適且つ重要な指標になることが判明した。従って例えば、被検海馬錐体細胞内に多量のATBF1が検出された場合にアポトーシスに陥る傾向がある(又は高い)と判定できる(細胞死を認定)。
この検出では、ATBF1遺伝子のエクソン10に対応する領域を含む部分ATBF1(以下、「第1部分ATBF1」ともいう)の海馬錐体細胞における核内存在量及び/又は細胞質内存在量が検出対象となる。後述の実施例に示すようにアルツハイマー病脳の海馬錐体細胞では、(a)第1部分ATBF1が増量していること、及び(b)第1部分ATBF1が核主体に局在していることを認めた。つまり(a)及び(b)がアポトーシス傾向を判定するための好適且つ重要な指標になることが判明した。従って例えば、被検海馬錐体細胞において多量の第1部分ATBF1が検出されたとき、被検海馬錐体細胞はアポトーシスに陥る傾向がある(又は高い)と判定できる(細胞死を認定)。このように被検海馬錐体細胞内における第1部分ATBF1の発現量を指標として判定を行う場合は通常、第1部分ATBF1の核内存在量及び細胞質内存在量が検出されるが、アポトーシス傾向のある(高い)海馬錐体細胞では第1部分ATBF1が核主体に局在する(即ち、第1部分ATBF1の多くが核に存在する)ことから、核内存在量のみを検出対象としても、第1部分ATBF1の増量傾向を十分に把握することが可能である。従って、核内存在量と細胞質内存在量を検出対象とするのではなく、核内存在量のみを検出対象にしてもよい。
一方、海馬錐体細胞内における第1部分ATBF1の局在態様を指標として判定を行う場合は通常、第1部分ATBF1の核内存在量及び細胞質内存在量を同時に検出する。そして、検出結果を比較することで第1部分ATBF1の局在態様を調べ、第1部分ATBF1が核主体に局在していたとき、被検海馬錐体細胞はアポトーシスに陥る傾向がある(又は高い)と判定する。このように核内での検出量と細胞質での検出量とを比較することによって、第1ATBF1の細胞内局在態様を明確に把握することが可能となる。尚、第1部分ATBF1の核内存在量及び細胞質内存在量のいずれかの検出結果から第1ATBF1の細胞内局在を予想し判定することにしてもよい。この場合、いずれかの存在量のみを検出すればよいことになる。
この検出では、ATBF1遺伝子のエクソン11に対応するC末端領域を含む部分ATBF1領域(以下、「第2部分ATBF1」ともいう)の海馬錐体細胞における核内存在量及び/又は細胞質内存在量が検出対象となる。後述の実施例に示すようにアルツハイマー病脳の海馬錐体細胞では、(c)第2部分ATBF1が増量していること、及び(d)第2部分ATBF1が細胞質主体に局在していることが観察された。つまり(c)及び(d)がアポトーシス傾向を判定するための好適な指標になることが判明した。従って例えば、海馬錐体細胞において多量の第2部分ATBF1が検出されたとき、被検海馬錐体細胞はアポトーシスに陥る傾向がある(又は高い)と判定できる(細胞死を認定)。このように海馬錐体細胞内における第2部分ATBF1の発現量を指標として判定を行う場合は通常、第2部分ATBF1の核内存在量及び細胞質内存在量が検出されるが、アポトーシス傾向のある(高い)海馬錐体細胞では第2部分ATBF1が細胞質主体に局在する(即ち、第2部分ATBF1の多くが細胞質に存在する)ことから、細胞質内存在量のみを検出対象としても、第2部分ATBF1の増量傾向を十分に把握することが可能である。従って、核内存在量と細胞質内存在量を検出対象とするのではなく、細胞質内存在量のみを検出対象にしてもよい。
一方、海馬錐体細胞内における第2部分ATBF1の局在態様を指標として判定を行う場合は通常、第2部分ATBF1の核内存在量及び細胞質内存在量を同時に検出する。そして、検出結果を比較することで第2部分ATBF1の局在態様を調べ、第2部分ATBF1が細胞質主体に局在していたとき、被検海馬錐体細胞はアポトーシスに陥る傾向がある(又は高い)と判定する。このように核内での検出量と細胞質での検出量とを比較することによって、第2部分ATBF1の細胞内局在態様を明確に把握することが可能となる。尚、第2部分ATBF1の核内存在量及び細胞質内存在量のいずれかの検出結果から第2部分ATBF1の細胞内局在を予想し判定することにしてもよい。この場合、いずれかの存在量のみを検出すればよいことになる。
この検出では、ATBF1遺伝子のエクソン3に対応するN末端領域を含む部分ATBF1領域(以下、「第3部分ATBF1」ともいう)の海馬錐体細胞における核内存在量及び/又は細胞質内存在量が検出対象となる。後述の実施例に示すようにアルツハイマー病脳の海馬錐体細胞では、(e)第3部分ATBF1が増量していること、及び(f)第3部分ATBF1が細胞質主体に局在していることが観察された。つまり(e)及び(f)がアポトーシス傾向を判定するための好適な指標になることが判明した。従って例えば、海馬錐体細胞において多量の第3部分ATBF1が検出されたとき、海馬錐体細胞はアポトーシスに陥る傾向がある(又は高い)と判定できる(細胞死を認定)。このように海馬錐体細胞内における第3部分ATBF1の発現量を指標として判定を行う場合は通常、第3部分ATBF1の核内存在量及び細胞質内存在量が検出されるが、アポトーシス傾向のある(高い)海馬錐体細胞では第3部分ATBF1が細胞質主体に局在する(即ち、第3部分ATBF1の多くが細胞質に存在する)ことから、細胞質内存在量のみを検出対象としても、第3部分ATBF1の増量傾向を十分に把握することが可能である。従って、核内存在量と細胞質内存在量を検出対象とするのではなく、細胞質内存在量のみを検出対象にしてもよい。
一方、海馬錐体細胞内における第3部分ATBF1の局在態様を指標として判定を行う場合は通常、第3部分ATBF1の核内存在量及び細胞質内存在量を同時に検出する。そして、検出結果を比較することで第3部分ATBF1の局在態様を調べ、第3部分ATBF1が細胞質主体に局在していたとき、海馬錐体細胞はアポトーシスに陥る傾向がある(又は高い)と判定する。このように核内での検出量と細胞質での検出量とを比較することによって、第3部分ATBF1の細胞内局在態様を明確に把握することが可能となる。尚、第3部分ATBF1の核内存在量及び細胞質内存在量のいずれかの検出結果から第3部分ATBF1の細胞内局在を予想し判定することにしてもよい。この場合、いずれかの存在量のみを検出すればよいことになる。
検出項目の中に、(2)第1部分ATBF1の検出を含めることが好ましい。(2)で検出される第1部分ATBF1の存在量又は細胞内局在態様はアポトーシス傾向を最も特徴付けるものといえる。従って、アポトーシス傾向の判定において(2)の検出は特に重要度が高い。
細胞内においてATBF1が完全な状態であれば(全長タンパク質として存在していれば)、「ATBF1遺伝子のエクソン10に対応する領域を含む部分ATBF1(第1部分ATBF1)」、「ATBF1遺伝子のエクソン11に対応する領域を含む部分ATBF1(第2部分ATBF1)」、及び「ATBF1遺伝子のエクソン3に対応する領域を含む部分ATBF1(第3部分ATBF1)」はそれぞれ、このようなATBF1の一部として存在する。一方、翻訳後のプロセスにおいてATBF1が分断されたときは、分断によって生じた部分ATBF1の一つ(又はその中の一部)として各部分ATBF1は存在する。
尚、第1部分ATBF1は、ATBF1-Aタンパク質の中央領域の一部(エクソン10のホメオドメイン以外の領域)を抗原として作製された抗体D1-120によって認識される。同様に第2部分ATBF1は、ATBF1-Aタンパク質のC末端領域の一部を抗原として作製された抗体AT6によって認識され、第3部分ATBF1は、ATBF1-Aタンパク質のN末端領域の一部を抗原として作製された抗体NT440及び1-12によって認識される。これらの抗体の作製方法は後述の実施例の欄で詳述される。
免疫組織化学的染色法では検出対象を特異的に認識する抗体(抗ATBF1抗体、抗第1部分ATBF1抗体など)が使用され、当該抗体の結合性(結合量)を指標としてATBF1量が検出される。
免疫組織化学的染色法では通常、まず被検海馬錐体細胞に対して、検出対象に特的な抗体(例えば抗ATBF1抗体)を接触させる。その後、細胞全体、核、及び/又は細胞質に対する当該抗体の結合量を測定する。そして測定結果から、被検海馬錐体細胞の細胞全体、核内、及び/又は細胞質内の検出対象の存在量を算出する。具体的には、以下に示す免疫組織化学的染色法に従って本発明の方法を実施することができる。
(1)固定・パラフィン包埋
生体(剖検症例の場合は死体)より採取した組織をホルマリンやパラフォルムアルデヒド等によって固定する。その後パラフィン包埋する。一般にアルコールで脱水した後キシレンで処理し、最後にパラフィンで包埋する。パラフィンで包埋された標本を所望の厚さ(例えば3〜5μm)に薄切し、スライドガラス上に伸展させる。尚、パラフィン包埋標本に代えて凍結標本を用いる場合もある。
(2)脱パラフィン
一般にキシレン、アルコール、及び精製水で順に処理する。
(3)前処理(抗原賦活)
必要に応じて抗原賦活のために酵素処理、加熱処理及び/又は加圧処理等を行う。
(4)内因性ペルオキシダーゼ除去
染色の際の標識物質としてペルオキシダーゼを使用する場合、過酸化水素水で処理して内因性ペルオキシダーゼ活性を除去しておく。
(5)非特異的反応阻害
切片をウシ血清アルブミン溶液(例えば1%溶液)で数分から数十分程度処理して非特異的反応を阻害する。尚、ウシ血清アルブミンを含有させた抗体溶液を使用して次の一次抗体反応を行うこととし、この工程を省略してもよい。
(5)一次抗体反応
適当な濃度に希釈した抗体をスライドガラス上の切片に滴下し、その後数十分〜数時間反応させる。反応終了後、リン酸緩衝液など適当な緩衝液で洗浄する。
(6)標識試薬の添加
標識物質としてペルオキシダーゼが頻用される。ペルオキシダーゼを結合させた2次抗体をスライドガラス上の切片に滴下し、その後数十分〜数時間反応させる。反応終了後、リン酸緩衝液など適当な緩衝液で洗浄する。
(7)発色反応
トリス緩衝液にDAB(3,3'-diaminobenzidine)を溶解する。続いて過酸化水素水を添加する。このようにして調製した発色用溶液を数分間(例えば5分間)切片に浸透させ、発色させる。発色後、切片を水道水で十分に洗浄し、DABを除去する。
(8)核染色
マイヤーのヘマトキシリンを数秒〜数十秒反応させて核染色を行う。流水で洗浄し色出しする(通常、数分間)。
(9)脱水、透徹、封入
アルコールで脱水した後、キシレンで透徹処理し、最後に合成樹脂やグリセリン、ゴムシロップなどで封入する。
尚、総ATBF1量の測定には、後述の実施例に示すD1-120抗体を使用することができる。この抗体は、ATBF1-AとATBF1-Bの共通部分であるD1-120部位(エクソン10に対応する領域であってホメオドメイン1のごく一部およびその直前の領域)を特異的に認識する。従って、この抗体を用いればATBF1-AとATBF1-Bの両者を同時に検出することが可能である。一方、この抗体はATBF1がプロセシングされて生ずる第1部分ATBF1に対して特異的に結合することから、この抗体による検出量は第1部分ATBF1量を反映したものとなる。従って、この抗体を用いれば、第1部分ATBF1量又はその局在を把握することが可能となる。同様に、ATBF1遺伝子のエクソン11に対応するC末端領域を認識する抗体AT6を用いれば、C末端領域を含む第2部分ATBF1量又はその局在を把握することが可能となり、ATBF1遺伝子のエクソン3に対応するN末端領域を認識する抗体1-12を用いればN末端領域を含む第3部分ATBF1量又はその局在を把握することが可能となる。
免疫学的手法によるポリクローナル抗体の調製は次の手順で行うことができる。抗原(例えばATBF1のD1-120部分又はその一部)を調製し、これを用いてウサギ等の動物に免疫を施す。ヒト以外の種(例えばマウス)のATBF1(又はその一部)を抗原として用いることができる。抗原は生体試料を精製することにより得ることができる。また、遺伝子組換え技術を利用して得た抗原を用いることもできる。組換えヒトATBF1は例えば、ATBF1をコードする遺伝子(遺伝子の一部であってもよい)を、ベクターを用いて適当な宿主に導入し、得られた組換え細胞内で発現させることにより調製される。
低分子量のために有効な免疫惹起作用を期待できないと予想されれば、キャリアタンパク質を結合させた抗原を用いることが好ましい。キャリアタンパク質としてはKLM(Keyhole Light Hemocyanin)、BSA(Bovine Serum Albumin)、OVA(Ovalbumin)などが使用される。キャリアタンパク質の結合にはカルボジイミド法、グルタルアルデヒド法、ジアゾ縮合法、MBS(マレイミドベンゾイルオキシコハク酸イミド)法などを使用できる。一方、ATBF1(又はその一部)を、GST、βガラクトシダーゼ、マルトース結合タンパク、又はヒスチジン(His)タグ等との融合タンパク質として発現させた抗原を用いることもできる。このような融合タンパク質は、汎用的な方法により簡便に精製することができる。
本発明の試薬の一態様は、上記のように免疫学的手法によって本発明の方法を実施する際に使用される抗ATBF1抗体(検出用抗体)である。ここでの抗体はポリクローナル抗体、オリゴクローナル抗体(数種〜数十種の抗体の混合物)、及びモノクローナル抗体のいずれでもよい。ポリクローナル抗体又はオリゴクローナル抗体としては、動物免疫して得た抗血清由来のIgG画分のほか、抗原によるアフィニティー精製抗体を使用できる。抗ATBF1抗体が、Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、dsFv抗体などの抗体断片であってもよい。所望の標識化が施されている抗体であってもよいことは上記の通りである。
検出用抗体の抗体として、(1)ATBF1遺伝子のエクソン10に対応する領域を含む部分ATBF1を認識する抗体、(2)ATBF1遺伝子のエクソン11に対応するC末端領域を含む部分ATBF1を認識する抗体、(3)ATBF1遺伝子のエクソン3に対応するN末端領域を含む部分ATBF(部分ATBF1-A)認識する抗体を好適に用いることができる。
(1)の抗体によれば、エクソン10に対応する領域を含む部分ATBF1、即ち第1部分ATBF1を検出可能である。(2)の抗体によれば、エクソン11に対応するC末端領域を含む部分ATBF1、即ち第2部分ATBF1を検出可能である。(3)の抗体によれば、エクソン3に対応するN末端領域を含む部分ATBF(部分ATBF1-A)、即ち第3部分ATBF1を検出可能である。
(1)の抗体、(2)の抗体、及び(3)の抗体の具体例として、後述の実施例において使用される以下のものを挙げることができる。
(1)の抗体:D1-120、(2)の抗体:AT6、(3)の抗体:1-12、NT440(NT440-1、NT440-2、NT440-3の混合物)
尚、認識する部位、ATBF1遺伝子のエクソンとの対応など、これらの抗体の特性の詳細については図1に示される。
好ましい一態様として、抗ATBF1抗体を含む免疫学的測定(検出)用キットが提供される。抗ATBF1抗体の結合量を直接検出する方法用のキットの場合には、標識化された抗ATBF1抗体が用いられる。一方、間接的検出方法用のキットの場合には、未標識の抗ATBF1抗体が用いられる。この場合には、標識物質で標識化された二次抗体(標識二次抗体)をキットに含めてもよい。二次抗体と標識物質を結合させたポリマーを利用した検出法用のキットとする場合には、当該ポリマーをキットに含めてもよい。
また一方で、タグやキャリアタンパク質(以下、タグ等という)との融合タンパク質を抗原として作製した抗ATBF1抗体をキットに使用する場合には、用いたタグ等をキットに更に含めることにしてもよい。キットを構成する抗ATBF1抗体中に、その作製過程で使用したタグ等に反応性を有する抗体が混在しているおそれのある場合に当該タグ等が必要となる。以下のように当該タグ等を利用すれば、キットを使用して得られた染色性が抗ATBF1抗体とATBF1抗体との特異的結合に基づくものであることを確認することができる。まず、このタグ等で抗ATBF1抗体を処理する。処理後の抗ATBF1抗体を用いて検体の免疫染色を行う。得られた染色像と、未処理の抗ATBF1抗体を使用して得られた染色像とを比較する。両者の間で染色性に相違がなければ、後者の染色像における染色性は抗ATBF1抗体とATBF1との特異的結合に基づくものであることを確認できる。
本発明のキットに、抗原抗体反応や染色等、免疫染色を実施する上で必要な一以上の試薬(例えば、組織固定・包埋用のホルマリンやパラフィン、非特異的結合を阻害するためのBSA、DAB等の発色試薬、核染色用のヘマトキシリン溶液など)や器具などを更に含めてもよい。また通常は、本発明のキットには取り扱い説明書が添付される。
以下、実施例(実験例を含む)を用いて本発明をより詳細に説明する。
本発明者らは分子生物学的手法である酵母ツーハイブリッド(yeast two-hybrid)法による分子相互作用の研究成果として、DNA結合転写調節因子であるATBF1が、DNAと結合するばかりでなく細胞質に存在する細胞骨格タンパク質GFAP (glial fibrillary acidic protein)と結合する新事実を発見した。従来から生理的な状態ではDNA結合タンパク質は核に存在することが当然のように予想され、観察されるが、ATBF1も核タンパク質と予想されながら、核で機能するだけでなく細胞質でも細胞骨格タンパク質と結合して存在する可能性が示されたことになる。これはATBF1の核細胞質移行を見出す原点となった。しかも、既報(非特許文献4)のごとく胃癌培養細胞を使用した別の実験系で、本発明者らはATBF1が核内ではp53タンパク質と結合し、p21のプロモータを活性化、細胞周期を抑制する働きがあることを発見している(図2を参照)。故に、ATBF1の細胞周期制御機能に着目することとなり、種々の癌細胞におけるATBF1の動向を調べる事とした。その結果、癌細胞の中には核タンパク質としてATBF1(ATBF1-Aの中央部を検出するD1-120を使用)が核に局在する細胞以外に、細胞周期制御系が乱れ、増殖性の強くなった癌細胞においては、ATBF1が核から細胞質に移出が観察され、核のATBF1の染色性が極端に低下する例が存在するという新事実の重要性に本発明者らは気付く事となった。さらに、これらの現象は神経細胞に分化させたP19という未分化胚性癌細胞株での研究を通じ、癌細胞以外の正常の神経細胞でも応用できることに発明者らは気付いた。すなわち癌細胞の核でATBF1の染色性が極端に低下した場合その癌細胞が高度の増殖性を獲得する事実や、P19細胞でATBF1の発現が認められない状態および細胞質にATBF1が限局する間は増殖性が維持されるの事実とは全く逆に、脳の神経細胞の核でATBF1の染色性が極端に増強すると正常細胞である神経細胞がアポトーシスへと移行する現象である。この現象を利用して発見者らはアルツハイマー病の診断に重要な神経細胞の細胞死判定法を確立するに至った。以下に示すごとく抗原賦活をふくめた染色条件の検討などの基礎実験は脳の海馬組織ではなく種々の癌組織を使用して行ったが、癌組織で有用だった条件は脳の海馬組織においても全く同様に使用できることを確認している。
2−1.抗原の調製(抗体D1-120の場合)
マウスATBF1(Ido et al., (1996). Gene, 168, 227-231)の41アミノ酸残基(2114〜2154:LQTLPAQLPPQLGPVEPLPADLAQLYQHQLNPTLLQQQNKR:配列番号:5、抗体D1-120作製時の抗原部分)をグルタチオンSトランスフェラーゼ(GST)に融合した組み換えペプチドを抗原として使用した。尚、上記の41アミノ酸残基は、ヒトATBF1のアミノ酸残基(2170〜2147)と完全に一致する。
具体的には、以下(1)及び(2)の手順で当該抗原を調製した。抗原調製、抗体作製の詳細は既報(J. Compartive Neurology (2003) 465: 57-71:非特許文献3)に記載される。
(1)上記のごとく標的アミノ酸部分をマウスcDNAより切り出し、GST融合タンパク質作製用のベクターpGEX-KT に組換え(サブクローニング)を行った。
(2)大腸菌 AD202に遺伝子導入を行い、AD202に発現させたタンパク質をSepharose-glutathione beaded agarose (Sigma社)を使用して常法で精製を行った(例えば、「はじめての組換えタンパク質精製ハンドブック」1999年発行、アマシャム ファルマシア バイオテク株式会社、を参照)。
2−1.で調製した抗原(ATBF1-GST融合タンパク質)を用いて、以下(1)〜(4)の手順で抗ATBF1抗体(D1-120)を取得した。
(1)PBS(pH7.5)に融解した抗原(1 mg/ml)をTiter Max Gold (CytRx社)と等量混合して、免疫用エマルジョンを作成した。
(2)2mlのエマルジョンをウサギ背部に皮下注射して免疫(0,14,28,49,70日目の5度にわたり)を行った。
(3)91日間経過した時点で、屠殺採血して血清を分離した。
(4)免疫に使用した抗原による抗原カラムを作成し、血清から抗原抗体カラム精製後に抗ATBF1抗体を取得した(例えば、「はじめての抗体精製ハンドブック」2000年発行、アマシャム ファルマシア バイオテク株式会社、を参照)。
まず、以下の手順で各抗原を調製した。
(1)抗体NT440の場合(ポリクローナル抗体)
ヒトATBF1-A(非特許文献1を参照)の3種類のアミノ酸残基(4〜15:CDSPVVSGKDNG:配列番号:6、429〜445: CKSSEGKDSGAAEGEKQE:配列番号:7、500〜516:CPSELDEELEDRPHEEPG:配列番号:8)の合成ペプチドを混合して [配列番号:7および8の合成ペプチドのN末端の下線を付したCは合成ペプチドの安定性を確保するために本来のヒトのアミノ酸配列に追加してある] ペプチド抗原として使用した。
(2)抗体1-12の場合(モノクローナル抗体)
ヒトATBF1-Aのアミノ酸残基(143〜155:CIVESLS 148QLTQGGG:配列番号:9)の合成ペプチドを使用、N末端にC(下線付き)を付加するとともに、148番のセリン(下線付き、右肩に148と付記)をリン酸化したペプチドを抗原として使用した。従って、この抗体はATBF1-Aの148番のセリンがリン酸化されている場合のみを認識するように設計してある。
(3)抗体AT6の場合(ポリクローナル抗体)
ヒトATBF1-A, B共通のアミノ酸残基(3405〜3549:PGAPSPDKDPAKESPKPEEQKNTPREVSPLLPKLPEEPEAESKSADSLYDPFIVPKVQYKLVCRKCQAGFSDEEAARSHLKSLCFFGQSVVNLQEMVLHVPTGGGGGGSGGGGGGGGGGGGGGSYHCLACESALCGEEALSQHLE:配列番号:10をグルタチオンSトランスフェラーゼ(GST)に融合した組み換えペプチドを抗原として使用した。
マウス未分化胚性癌(embryonal caricinoma)細胞株P19培養細胞を使用し、未分化癌の培養細胞を神経細胞に分化させる実験を行い、その過程におけるATBF1発現(ATBF1-Aの中央部を検出するD1-120を使用)と細胞周期制御との関連に着目した検討を行った。
P19癌細胞培養開始時、特に分化刺激を加えない未分化増殖状態の細胞を採取し以下に示す手順で免疫組織化学的染色(ATBF1染色, D1-120を使用)を実施した。細胞をチャンバースライドで培養しPBSで調整した4%パラフォルムアルデヒドで固定し、固定後洗浄を行った。抗ATBF1抗体, D1-120を5μg/mlとなるように、0.05Mトリス緩衝液(pH7.6、ウシ血清アルブミン1%溶液、アジ化ナトリウム含有)に溶解した一次抗体溶液を切片に滴下し、37℃で約30分反応させた(一次抗体反応)。十分に洗浄した後、2次抗体Alexa Fluor 594-conjugated goat anti-rabbit IgG (以下の実施例中で示されるごとく、他のモノクローナル抗体と2重染色を行う場合はAlexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse IgGも同時に使用する。尚、いずれもMolecular Probes社製)を標本に作用させ、室温で約1時間反応させた(二次抗体反応)。十分に洗浄した後、封入を行い。蛍光顕微鏡 (AX70; オリンパス社製) か、共焦点レーザー顕微鏡 (LSM5; ZWISS社製)で観察を行った。染色の結果、ATBF1は核、細胞質ともに発現を認めず(図3aを参照)、フローサイトメトリーを使用した検索では細胞は増殖状態を示し、細胞周期G1期の細胞とともに、S期の細胞、G2, M期の細胞が高い割合で混在した(図3dを参照)。
培養細胞に神経分化を促す薬剤、レチノイン酸を投与した24時間後、上記3−1に記載した方法でATBF1染色、さらにフローサイトメトリー検索を行った。形態的には細胞はやはり未分化増殖状態を維持したが、ATBF1の細胞質での発現を認めるようになった(図3bを参照)。フローサイトメトリーを使用した検索では細胞はやはり増殖状態を示し、G1期の細胞とともに、S期の細胞、G2, M期の細胞の割合は依然高かった(図3eを参照)。
レチノイン酸を中断し、さらに4日間培養後に上記3−1に記載した方法でATBF1染色、さらにフローサイトメトリー検索を行った。形態的に培養細胞は突起を有する神経細胞に分化した細胞群に変化した。するとATBF1は細胞質から核に移動し、核主体の発現に変化した(図3cを参照)。フローサイトメトリーを使用した検索ではS期の細胞、G2、M期の細胞の割合が極端に減少し、ほとんどがG1期の細胞集団に変化した(図3fを参照)。これは明らかな細胞周期の停止を意味し、G1期停止、言い換えると増殖抑制が認められた。この実験結果は、そのアミノ酸配列番号:277及び2987から始まる2箇所の推定核内保留シグナル(Nuclear localization signal)の存在(図4aを参照)から予想されたごとくATBF1が実際に細胞質から核へ移行を示すタンパク質であることを証明しただけでなく、核へのATBF1移行により細胞周期の停止が起こることをも示すものである。
4−1.ATBF1の核への移入の促進機序の検討
P19細胞では、レチノイン酸又はその誘導化学物質を作用させると、ATBF1のmRNA転写量、細胞内タンパク量が増加する。しかしながらP19細胞を培養液に浮遊する状態で培養する限り、ATBF1は細胞質に留まり、核移行は観察されない。ここでは細胞を培養皿に接着するような条件設定をすることによりATBF1発現がどのように変化するかを検索するための検討を行った。生体内の細胞外部環境に類する特徴を持つフィブロネクチン、ラミニンや、ゲラチン、ポリ-L-オルニチン、ポリ-Lリジンを培養皿へ塗布した後の細胞におけるATBF1の局在を観察した。上記3−1.に記載したのと同様の方法でATBF1染色を施行した。フィブロネクチンなどを培養皿へ塗布しない場合、細胞は浮遊状態でATBF1は細胞質には出現するが、核へは移行しない(図5aを参照)のに対して、培養皿にフィブロネクチンとポリ−L−オルニチンを塗布し細胞が付着できる状態にした場合、培養後3時間以内に、かなりの細胞においてATBF1の核への移行が観察され(図5bを参照)、24時間では殆ど全ての細胞でATBF1の核への移行が観察された(図5cを参照)。ラミニンやゲラチンを培養皿へ塗布した場合でも、培養皿表面にP19細胞はよく付着することができ、その条件でもやはりATBF1の核への移行が観察された。これはATBF1の細胞質から核への移行は、細胞の培養皿への接着を促進するフィブロネクチンのごとき因子(あるいは接着刺激それ自体)の影響で調節される事を意味している。浮遊状態から付着状態への変化は細胞表面に存在する受容体が関与する可能性があり、細胞外部環境に応じた情報を細胞内へ伝えることでATBF1の細胞内局在が変化すると思われた。
最近、CRM1(Exportin 1 or chromosome region maintenance 1)により様々な因子の核から細胞質への運搬移出が調節される事実が報告されている。ATBF1では、CRM1の標的配列、即ち核外輸出シグナル(Nuclear export signal)の存在が三箇所(アミノ酸配列の1267番目、2471番目、及び2504番目からそれぞれ始まる)想定されている(図4bを参照)。従ってCRM1の阻害剤である抗生剤Leptomycin Bの作用により、核からの細胞質へのATBF1移出阻害が起こる事が予想された。今回、P19細胞を使用し、上記のフィブロネクチンおよびポリ−L−オルニチンを塗布した培養皿にレチノイン酸を作用させ、さらに抗生剤Leptomycin Bを加える実験を行い、上記3−1に記載した方法でATBF1染色(ATBF1-Aの中央部を検出するD1-120を使用)を施行することでATBF1の動向を観察した。その結果、Leptomycin Bを作用させない場合の発現量に比較して(図6aを参照)、Leptomysin Bを作用させる事で、P19細胞におけるATBF1の核内濃度が明らかに増大する(図6bを参照)とともに、アポトーシスに陥る細胞数が明らかに増加した。また、さらに1日培養を追加すると、翌日には殆どの細胞が死滅した。この実験結果はATBF1の核外輸出はCRM1に制御されている事と、ATBF1濃度が核内で増加する状態は、神経細胞への分化を示したP19細胞のアポトーシスを促進する状態である事を示している。この実験結果は、実際にヒト脳の海馬錐体細胞でATBF1(D1-120で検出出来る部位)の核内濃度が極端に増加している状態が、アポトーシスへの移行が促進された状態、すなわち「細胞死」の予想につながる事を理解するのに重要な示唆を与えると思われた。
細胞周期に関連する種々の因子などに関して過去に検討された事実として、タンパク質の核・細胞質移行にはアミノ酸のリン酸化が関係する事が知られ、特に核移行には核内保留シグナルのリン酸化及び脱リン酸化が重要であることが判明している。リン酸化反応を触媒する酵素の中でもPI3K (phosphatidylinositol 3-kinase)ファミリータンパク質は良く研究されており、最近ATBF1と同様に、核・細胞質を移行し機能するN-CoR (The nuclear receptor co-repressor)の核から細胞質へ局在が移行する際、401番セリンのリン酸化にPI3Kが関与している事が報告された(Hermanson O,et al, N-CoR controls differentiation of neural stem cells into astrocytes.Nature 419, 934-939, 2002 を参照)。本発明者らはラット胎仔の脳神経細胞におけるATBF1発現とN-CoR発現が相補的であるという事実から、N-CoRが核から細胞質に輸出される場合とは逆に、ATBF1が細胞質から核への移行する際に、PI3Kによる核内保留シグナルのリン酸化が関与する事を予想した。そこで上記同様に、P19細胞を使用し、フィブロネクチン塗布培養皿でレチノイン酸を作用させた後にPI3Kの拮抗剤2種(Wortmannin、カフェイン)を作用させる実験を行い、上記3-1に記載した方法でATBF1染色(D1-120を使用)を施すことでATBF1の動向を観察した。その結果、薬剤を加えない場合のP19細胞内のATBF1は核への移行を示す(図7aを参照)のに比較し、薬剤を加えた場合のP19細胞ではATBF1産生自体は影響を受けなかったものの、核内へのタンパク質の移行は阻止される傾向(作用はカフェインがWortmanninより強い)を示した(図7b, 7cを参照)。その際、細胞は***像が散在し増殖状態を維持した。細胞質のATBF1は核周囲の細胞質部分(小胞体内を予想)にリング状となるように集合する像を認め、これは、ATBF1の細胞質(小胞体)から核への移行がPI3Kに依存した事象である事、核へのATBF1移行が無いと細胞は増殖状態を維持出来る事を意味している。
3.の結果より、ATBF1が細胞質から核へ、さらに細胞質へと行き来をする事で細胞周期の時期や増殖状態が切り替わる事が明らかとなった。ATBF1のみが主な原因でこれらの事象が起こったのか、それとも他の何らかの因子が作用した結果なのかを明らかにするために、本発明者らはATBF1単独発現ベクターを用いて、マウス神経芽細胞腫由来の培養細胞株Neuro2A細胞で強制発現実験を行った。Neuro2AにATBF1発現ベクターを導入して強制的にATBF1を発現させた後、上記3−1に記載した方法でATBF1染色(ATBF1-Aの中央部を検出するD1-120を使用)を施すことでATBF1の動向を観察するとともに、フローサイトメトリーで細胞周期を検索した。また同時に培養液にBrdU (5-bromodeoxyuridine)を混入し、細胞のDNA複製のためのチミジン取り込みが行われているかどうかも検索した。その結果、ATBF1を強制発現させることで核への集積を認める細胞はBrdUが取り込まれない事が明らかとなり(図8bを参照)、培養細胞全体では細胞周期を停止している細胞の割合が増加した(図8cを参照)。この実験結果は、ATBF1の核での発現が、細胞のDNA複製の停止、細胞周期の停止の直接的原因となる事を意味している。
一方、ATBF1発現ベクターの遺伝子導入と同時に培養液にBrdU (5-bromodeoxyuridine)を添加し、DNA複製中の細胞を標識した。その結果、ATBF1の強制発現を認める細胞では、例外なくBrdUの取り込みを認めない事が明らかとなり、ATBF1が主な原因で細胞周期が停止する事実が明らかとなった。
外科的に採取され、ホルマリン固定後にパラフィン包埋された通常の病理検体からATBF1を抗体で精密に検出するには、抗原の賦活化反応条件を決定することが重要となる。核・細胞質ともに程良く抗原が賦活される事がATBF1の核細胞質移行を検索する上では特に重要となる。今回、外科的に採取され、診断された膀胱癌のうち、上皮内の乳頭状非浸潤性膀胱尿路上皮癌(非浸潤癌と略す)及び上皮下の浸潤性膀胱尿路上皮癌(浸潤癌と略す)を各一例使用し、最適な抗原賦活法を見出すべく以下の検討を行った。使用した抗体はD1-120である。まず、ホルマリン固定後、パラフィン切片を作成し、後述の7.と同様の手技でATBF1染色を行った。ただし抗原賦活法として、以下に示すごとく、熱処理3種類と賦活液9種類の組合せ(計27種類の組み合わせ)と、酵素処理3種類を使用しその染色性を検討した。熱処理3種類:(1)オートクレーブ、121℃、15分、(2)圧力釜、4分、(3)電子レンジ、煮沸しない程度の温度設定、15分。抗原賦活液9種類:(1)DAKO Target Retrieval Solution PH 6.0,(2)DAKO Target Retrieval Solution High pH, pH 10.0,(3)10mM クエン酸バッファー pH6.0,(4)10 mM NaOH加クエン酸バッファーpH7.0,(5)TEバッファー (1mM EDTA + 10 mM トリス塩酸バッファー) pH9.0,(6)50 mMトリス塩酸バッファー pH10.0, (7)20 mM トリス/0.65 mM EDTA/0.0005% Tween 20,(8)1mM EDTA溶液, pH8.0、(9)5% Urea溶液。酵素処理3種類:(1)トリプシン、(2)ペプシン、(3)プロティナーゼK;である。
本発明者らは、剖検されたヒト高齢者正常脳組織(非痴呆症)とアルツハイマー病脳組織を使用して、海馬の錐体細胞におけるATBF1(使用した抗体はNT440, 1-12, D1-120, AT6の4種類)の細胞内存在量及び局在態様を比較検討した。使用したのはアルツハイマー病と臨床的に診断され、剖検において病理所見で確定診断が得られた剖検症例78歳、84歳ともに女性2例の脳である。対照として、特に痴呆性疾患を患っていない正常と思われる剖検症例79歳、88歳ともに女性2例の脳を使用した。
剖検時に採取した脳組織全体を4%パラフォルムアルデヒドで固定した。固定液が浸透した後、海馬、海馬傍回、歯状回を含む部位を切り出し、パラフィン包埋し、約3μmに薄切し、スライドガラス上に伸展させた。脱パラフィン後、クエン酸緩衝液(pH6.0)を使用して圧力釜で4分間(110℃)熱処理を実施した(当該抗原賦活法を選択した理由については実施例5を参照)。続いて過酸化水素水で処理して内因性ペルオキシダーゼを除去した。次に、4種類の抗ATBF1抗体(NT440, 1-12, D1-120, AT6)を5μg/mlとなるように0.05Mトリス緩衝液(pH7.6、ウシ血清アルブミン1%溶液、アジ化ナトリウム含有)に溶解した一次抗体溶液を切片に滴下し、室温で約1時間反応させた(一次抗体反応)。十分に洗浄した後、二次抗体(DAKO Enivision, Labelled polymer, HRP [Code No. K1491] Anti-mouse and Anti rabbit)を標本に作用させ、室温で約1時間反応させた(二次抗体反応)。十分に洗浄した後、トリス緩衝液にDABを溶解し、過酸化水素水を添加した発色溶液を5分間標本に浸透させて発色させた(発色反応)。発色後、標本を水道水で十分に洗浄し、DABを除去した。続いて、マイヤーのヘマトキシリンで15秒程度染色した後、流水で8分間洗浄して色出しを行った。最後にアルコール系列及びキシレン系列を通し、透徹及び封入を行った。以上の手順でヒト脳組織を染色することにより、4種類の抗体で検出可能なATBF1部位に関して、錐体細胞での核・細胞質での局在を明確にすることが出来た。
まずATBF1-AのN末端側を検出可能なNT440(図1を参照)を使用すると、対照の正常脳の大多数の海馬錐体細胞での染色性は細胞質に局在を示したが、一部の錐体細胞で核における局在も認めた(図14を参照)。それに比較してアルツハイマー病の海馬におけるNT440の染色性は、ほぼすべての錐体細胞で細胞質主体に局在を認めた(図15を参照)。この局在の変化はアルツハイマー病におけるNT440染色性の特徴の一つと言える。しかしながら、染色性が核に限局する錐体細胞の割合は正常脳海馬でも非常に少ないため、極少量の材料からアルツハイマー病を診断する際には補助的な特徴に留まると判断した。
次にNT440と同じくATBF1-AのN末端を検出するが、その中でも特に148番目のセリンがリン酸化された場合のみを検出可能な1-12(図1を参照)を使用すると、その染色性は対照の正常脳の大多数の海馬錐体細胞において細胞質に局在を示したが、一部の錐体細胞では核での局在も認めた(図16を参照)。それに比較しアルツハイマー病の海馬においては、ほぼすべての錐体細胞で細胞質主体の局在に認めた(図17を参照)。この局在の変化はNT440同様に、アルツハイマー病における1-12の染色性の特徴であると考えた。さらにNT440と異なる顕著な特徴は、1-12の染色強度がアルツハイマー病の海馬が、正常脳と比較して明らかに強いという点である。しかし染色強度の判定は通常、他の試料との比較が必要であるため、正常の脳、アルツハイマー病の脳を単独で検索した場合には、染色強度が強いか弱いか、その判断は難しい。さらに核から細胞質への局在の変化に関しては、NT440の染色性同様に、染色性が核に限局する錐体細胞の割合が正常脳海馬でも非常に少ないため、1-12による染色性は、アルツハイマー病の診断の指標として有効なものの、極少量の材料からアルツハイマー病を診断する際には補助的な特徴に留まると判断した。
次にATBF1-A, B共通部分で蛋白中央部を検出可能なD1-120(図1を参照)を使用すると、正常の脳組織では、海馬錐体細胞におけるD1-120の染色性は核、細胞質ともに少量であり、核あるいは細胞質に染色性が集中する傾向は不明瞭であった(図18を参照)。それに比較して、アルツハイマー病の海馬錐体細胞ではATBF1量は高度に増加し、D1-120の染色性は明らかに核主体となった(図19を参照)。この核主体の高度のD1-120染色性は正常の脳組織ではほとんど見ることが出来ない現象であるのに対し、アルツハイマー病の錐体細胞でこの核での発現集中が起こる確率が非常に高いため、極少量の海馬材料からアルツハイマー病を診断するのに価する最も顕著で、一番重要な特徴とはなり得ると判断した。
最後にATBF1-A, B共通部分で蛋白のC末端を検出可能なAT6(図1を参照)を使用すると、正常の脳組織では、海馬錐体細胞におけるAT6の染色性は核、細胞質ともに少量であり、核あるいは細胞質に染色性が集中する傾向は不明瞭であった(図20を参照)。それに比較して、アルツハイマー病の海馬錐体細胞ではATBF1量は高度に増加し、AT6の染色性は明らかに細胞質主体となった(図21を参照)。この細胞質主体の高度のAT6染色性は正常の脳組織ではごく一部分しか見出すことが出来ない現象(この点には注意が必要である。逆の言い方をすると一部ではあるが正常でもこの現象を見出す事は出来る。これはD1-120の場合と大きく異なる点である)であるのに対し、アルツハイマー病の錐体細胞でこの細胞質での発現集中が起こる確率は、D1-120程ではないものの、かなり高いため、極少量の海馬材料からアルツハイマー病を診断するのに価する。従ってD1-120に続いて価値のある2番目に重要な特徴となり得ると判断した。
8−1.各試薬の調製
以下の試薬を組み合わせてキットとした。尚、ここでは抗ATBF1抗体としてD1-120を含むキットの構築例を示す。
A試薬:抗ATBF1抗体原液
B試薬:ATBF1抗原液
C試薬:GST抗原液
A試薬は、上記2.で調製した抗ATBF1抗体を250μg/mlに調整して得られる。B試薬は、D1-120抗体作製時に調整したマウスATBF1の41アミノ酸残基(2114〜2154:LQTLPAQLPPQLGPVEPLPADLAQLYQHQLNPTLLQQQNKR:配列番号:5)をGSTに融合した組み換えペプチドを2mg/mlに調整して得られる。C試薬は、GST(例えばSigma社製)を2mg/mlに調整して得られる。
以下、キットの使用方法の一例(DAB発色による免疫組織学的染色)を示す。
(1)脳外科的な生検或いは剖検時に切除した被検脳海馬組織を、通常の病理検査と同様の手順で、10%ホルマリン固定、パラフィン包埋する。ホルマリンの代わりにパラフォルムアルデヒド固定を使用してもよい。ATBF1の染色性に関してホルマリンとパラフォルムアルデヒド固定では特に差はない。採取後即座に固定した脳組織材料を使用することが基本となる。
(2)パラフィン包埋後の組織を切削、薄切してスライドガラスに載せる。スライドガラスとしては例えばSuperfrost、MASコート付き、S-9441(商品名、マツナミ製)を使用する。当該スライドガラスは圧力釜による熱処理に対する耐久性に優れている。
(3)通常の病理標本作製に使用される、通常の脱パラフィン系列で切片を処理し、最終的にアルコールから精製水に置換する。
(4)(3)の間に圧力釜(一般的な調理に使用されるものを使用できる)にクエン酸緩衝液を2リットル入れ、強火で沸騰させる。市販のクエン酸緩衝液(例えば、三菱化学ヤトロン製、インスタントクエン酸緩衝液[20倍濃縮液RM-102C], pH6.0)を使用することができる。原則、一回熱処理を行った緩衝液は再使用しない。
(5)切片を金属製の標本かごに入れ、圧力釜の蓋をとり、緩衝液中に横向きで、切片の載っている面が上に向くように置く。
(6)蓋をした後、蒸気音が出始めるまで強火で加熱し、その後は弱火にして4分間加熱を続ける。加熱を停止し、1分間放置する。
(7)流水(水道水)で釜全体を冷却する。約40分後に圧力釜の蓋を取り、標本かごを釜から出して精製水に置換する。続いて内因性ペルオキシダーゼをブロックするために、過酸化水素水で処理を行う。次に精製水に置換し、過酸化水素水を除去した後、20mMトリス緩衝液になじませる。その後、0.05Mトリス緩衝液pH7.6に置換する。
(8)アジ化ナトリウム含有ウシ血清アルブミン1%溶液を添加した0.05Mトリス緩衝液pH7.6を用意し、これでA試薬を50倍希釈する(抗体溶液)。切片に抗体溶液を添加し、加湿条件下(モイストチャンバー内)、室温で1時間反応させる(一次抗体反応)。通常の検体には1回の反応に約40μl、比較的大きな検体には約80μlの抗体溶液を使用する。ピペットの先をプレパラート手前にあて、切片に触れないように注意しながら抗体溶液を切片によくなじませる。
(9)0.05Mトリス緩衝液pH7.6を用いて切片を洗浄する(5分間、合計2回)。洗浄処理後、余分な洗浄液を拭き取る。
(10)HRP標識2次抗体(DAKO Enivision, Labelled polymer, HRP(Code No. K1491)Anti-mouse and Anti-rabbit)を切片に添加し、室温で1時間反応させる(二次抗体反応)。
(11)(9)と同様の洗浄を行う。
(12)DAB Chromogen (DAKO, Code. S3000)を2錠、40mlの0.05Mトリス緩衝液pH7.6に溶解する。これに過酸化水素水を30μl加えた後、切片に浸透させ(5分間)、発色させる。
(13)流水(水道水)でDAB液を洗浄、除去する。
(14)マイヤーヘマトキシリンで切片を15秒程度染色する。
(15)切片を流水中に8分間静置する(色出し洗浄)。
(16)通常の病理標本作製と同様にアルコール系列及びキシレン系列を通し、透徹、封入を行う。
(17)以上の結果得られた標本を用いて顕微鏡観察を行う。
DABによる発色(茶褐色)がATBF1特異的な免疫染色の結果であることを確認するためには以下の操作を行う。
(1)A試薬(ATBF1抗体原液)10μl、B試薬(ATBF1, D1-120抗原)1μl、PBS 10μl、及び5% BSA 4μlをマイクロチューブ内で混合する。
(2)チューブ全体(全量25μl)を、37℃で2時間反応させる。
(3)反応終了後、抗体希釈時に使用する緩衝液(アジ化ナトリウム含有ウシ血清アルブミン1%溶液を添加した0.05Mトリス緩衝液pH7.6)を25μl添加する。このようにして得られた溶液全量50μlを1次抗体反応用の試薬として使用し、上記の方法で免疫組織化学染色を行う。その結果DABによる染色が認められなければ、ATBF1特異的な免疫染色が行われていることを確認できる。
GST融合抗原を使用して調製したため、抗ATBF1抗体(A試薬)にはGSTに対する反応性が混在している可能性がある。DABによる発色が抗ATBF1抗体のGSTに対する反応性の結果でないことを確認するためには以下の操作を行う。
(1)A試薬(ATBF1, D1-120抗体原液)10μl、C試薬(GST)1μl、PBS 10μl、及び5% BSA 4μlをマイクロチューブ内で混合する。
(2)チューブ全体(25μl)を、37℃で2時間反応させる。
(3)反応終了後、抗体希釈時に使用する緩衝液(アジ化ナトリウム含有ウシ血清アルブミン1%溶液を添加した0.05Mトリス緩衝液pH7.6)を25μl添加する。このようにして得られた溶液全量50μlを1次抗体反応用の試薬として使用し、上記の方法で免疫組織化学染色を行う。その結果DABによる染色が認められれば、ATBF1特異的な免疫染色が行われていることを確認できる。
A試薬:抗ATBF1抗体原液(NT440, 1-12, D1-120, AT6に合致する4種類のATBF1部分)
B試薬:ATBF1抗原液 (NT440 [3種類のペプチドの混合液], 1-12, D1-120, AT6の4種類、)
C試薬:GST抗原液
このキットでは4種類の抗体による染色結果を得ることができることから、より高い信頼度でアポトーシス傾向の判定が可能となる。
本発明を利用すれば、例えばラット、マウス、モンキーなど各種モデル動物を使用したアルツハイマー病の進行程度のモニターや、新たな治療手段による治療効果のモニターを極少量の生検レベルで頻回に行う事が可能となり、将来大きな社会問題となりうる本疾患の治療法の開発のために役立たせる事が出来ると思われる。剖検症例に対して本発明を適用することもできる。また、従来のアルツハイマー病の診断法に対して補助的に本発明を利用することで、実際に神経細胞のアポトーシスへの移行を一層明確にし、アルツハイマー病の確定診断の信頼度を高めることも可能である。
将来、脳海馬組織の定位脳生検が技術的にも倫理的にも可能となれば、極少量の生検材料を使用した早期のアルツハイマー病診断にも本発明は適用され得る。さらに老人斑を認識するPET probeがすでに開発されている経緯からすると、本法の開発が、神経細胞死を画像的により簡便に捕らえる事を可能にするための重要な出発点となる可能性もあると考える。
本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
Claims (9)
- 以下のステップを含んでなる、海馬錐体細胞がアポトーシスに陥る傾向を判定する方法:
(a)被検対象から採取された海馬錐体細胞を用意するステップ、及び
(b)前記海馬錐体細胞内におけるATBF1量を検出するステップ。 - 前記ステップ(b)において、以下の(1)〜(4)からなる群より選択される一又は二以上が検出される、請求項1に記載の判定方法:
(1)前記海馬錐体細胞内における総ATBF1量、
(2)ATBF1遺伝子のエクソン10に対応する領域を含む部分ATBF1の前記海馬錐体細胞における核内存在量及び/又は細胞質内存在量、
(3)ATBF1遺伝子のエクソン11に対応するC末端領域を含む部分ATBF1の前記海馬錐体細胞における核内存在量及び/又は細胞質内存在量、
(4)ATBF1遺伝子のエクソン3に対応するN末端領域を含む部分ATBF1の前記海馬錐体細胞における核内存在量及び/又は細胞質内存在量。 - 前記ステップ(b)において、以下の(2)〜(4)が検出されることを特徴とする、請求項1に記載の判定方法:
(2)ATBF1遺伝子のエクソン10に対応する領域を含む部分ATBF1の前記海馬錐体細胞における核内存在量及び/又は細胞質内存在量、
(3)ATBF1遺伝子のエクソン11に対応するC末端領域を含む部分ATBF1の前記海馬錐体細胞における核内存在量及び/又は細胞質内存在量、
(4)ATBF1遺伝子のエクソン3に対応するN末端領域を含む部分ATBF1の前記海馬錐体細胞における核内存在量及び/又は細胞質内存在量。 - 前記検出が免疫組織化学的染色法を利用して実施される、請求項1〜3のいずれかに記載の判定方法。
- 抗ATBF1抗体からなる、海馬錐体細胞のアポトーシス傾向判定用試薬。
- 前記抗ATBF1抗体が、以下の(1)〜(3)からなる群より選択される抗体であることを特徴とする、請求項5に記載の海馬錐体細胞のアポトーシス傾向判定用試薬:
(1)ATBF1遺伝子のエクソン10に対応する領域を含む部分ATBF1を認識する抗体、
(2)ATBF1遺伝子のエクソン11に対応するC末端領域を含む部分ATBF1を認識する抗体、
(3)ATBF1遺伝子のエクソン3に対応するN末端領域を含む部分ATBF1を認識する抗体。 - 以下の(1)〜(3)からなる群より選択される一以上の抗体を含んでなる、海馬錐体細胞のアポトーシス傾向判定用キット:
(1)ATBF1遺伝子のエクソン10に対応する領域を含む部分ATBF1を認識する抗体、
(2)ATBF1遺伝子のエクソン11に対応するC末端領域を含む部分ATBF1を認識する抗体、
(3)ATBF1遺伝子のエクソン3に対応するN末端領域を含む部分ATBF1を認識する抗体。 - ATBF1を更に含んでなる、請求項7に記載の海馬錐体細胞のアポトーシス傾向判定用キット。
- 前記抗体が、タグ又はキャリアタンパク質との融合タンパク質である抗原を用いて作製されたものであって、前記タグ又はキャリアタンパク質を更に含んでなる、請求項7又は8に記載の海馬錐体細胞のアポトーシス傾向判定用キット。
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