JP4822371B1 - Fgfr融合タンパク質によって疾患を治療するための組成物および方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、2005年7月22日に出願された出願第60/701,479号;2005年10月21日に出願された出願第60/729,401号;2006年1月10日に出願された出願第60/757,398号;および2006年5月15日に出願された出願第60/800,005号に関連する。これらは全て、その全体が参考として援用される。
本発明は、線維芽細胞成長因子受容体(FGFR)の細胞外ドメインを含む融合分子に関する。本発明は、FGFR融合タンパク質を含むポリペプチドおよびポリヌクレオチド配列、ベクター、宿主細胞、組成物、キット、ならびに動物に関する。本発明はまた、癌および血管形成障害を含めた増殖性疾患の診断、予防、その予後診断の決定、および治療を行うために、FGFR融合分子ならびにその改変体および断片を作製かつ使用する方法にも関する。
線維芽細胞成長因子(FGF)およびその受容体(FGFR)とは、血管形成、脈管形成、および創傷治癒、ならびに胚発生における組織パターン形成および肢形成において助けになる役割を有する、高度に保存されたタンパク質群である。FGFおよびFGFRは細胞遊走、増殖、および生存に影響を与え、健康および疾患に広範な影響を及ぼす。
Zhangら、J. Biol. Chem.、281:15、694〜15、700頁(2006年) Ornitzら、Mol. Cell Biol.、12:240頁(1992年)
本明細書中で用いた用語はその通常の意味をもち、より具体的には以下に記載の意味、また本明細書の文脈においてさらに理解することができる意味をもつ。
本発明のFGFR融合分子は、FGFRポリペプチドの細胞外ドメイン(ECD)と融合パートナーとを含む第1のポリペプチドを含む。FGFRポリペプチドは、FGFR1、FGFR2、FGFR3、およびFGFR4のうちの任意のものであることができ、すべてのその改変体およびアイソフォームが含まれる。したがって、本発明での使用に適したFGFRポリペプチドのファミリーには、例えば、FGFR1−IIIb、FGFR1−IIIc、FGFR2−IIIb、FGFR2−IIIc、FGFR3−IIIb、FGFR3−IIIc、およびFGFR4が含まれる。FGFRの細胞外ドメインは、ECD全体またはその一部分であることができる。FGFRのECDは、野生型FGFRのECDと比較して修飾されており、リガンド結合活性を保有する。修飾は、単一または複数のアミノ酸の欠失、付加、または置換であり得る。FGFR細胞外ドメインは、所望の薬物動態学特性をもたらす、例えばその半減期をin vivoで増加させる融合パートナーに付着させることができる。本発明のFGFR融合分子の融合パートナーは、例えば二量体化ドメイン(例えばFc断片)のオリゴマー化ドメインを有するもの含めた、当分野で慣用の任意の融合パートナーであることができる。本発明の融合パートナーには、ペグ化などの化学修飾によって作製したものも含まれる。
本発明は、本発明のFGFR融合タンパク質をコードしているポリヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。これらの核酸分子は、当分野で慣用の組換えDNA技術を用いて構築することができる。核酸分子には、配列番号183〜189で提供するものなどの、FGFR1−IIIbのECDに関連する分子;配列番号1〜63で提供するものなどの、FGFR1−IIIcのECDに関連する分子;配列番号211〜218で提供するものなどの、FGFR2−IIIbのECDに関連する分子;配列番号219〜226で提供するものなどの、FGFR2−IIIcのECDに関連する分子;配列番号190〜196で提供するものなどの、FGFR3−IIIbのECDに関連する分子;配列番号83〜91で提供するものなどの、FGFR3−IIIcのECDに関連する分子;および配列番号64〜78で提供するものなどの、FGFR4のECDに関連する分子が含まれる。
(ベクター)
本発明は、本発明の融合タンパク質をコードしている核酸分子を含む遺伝子操作した組換えベクター、組換えベクターを含む組換え宿主細胞、本発明の融合タンパク質をコードしている核酸分子、ならびにFGFR融合タンパク質およびその断片の産生を提供する。本発明のベクターには、原核であれ真核であれ選択した宿主中での発現に適したもの、例えば、ファージ、プラスミド、およびウイルスのベクターが、含まれる。ウイルスベクターは、複製可能または複製欠損のどちらかのレトロウイルスベクターであり得る。ウイルスの増殖は、一般に、複製欠損のベクターを含む相補宿主細胞においてのみ起こる。本発明のベクターはコザック配列(Lodishら、「Molecular Cell Biology」、第4版、1999年)を含んでいてよく、また、FGFR細胞外ドメインのATG開始コドンも含んでいてよい。本発明のベクターには、以下にさらに詳細に記載する「ミニサークル」ベクターが含まれる。
本発明のFGFR融合タンパク質は、当分野で知られている手順に従って、例えば以下の例および図に示すように、細菌細胞などの原核細胞ならびに真菌細胞、植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞などの真核細胞によって発現かつ産生させることができる。FGFR融合タンパク質は、細菌性大腸菌細胞;Cos7細胞;哺乳動物腎臓上皮293細胞;ならびにCHO細胞に由来するCHO−SおよびDG44細胞を含めたチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞によって発現かつ産生させることができる。これらはまた、融合タンパク質をコードしている核酸分子を用いて操作または形質移入した動物においてin vivoで産生させることもできる。例えば、FGFR融合分子をコードしているDNAを注射したマウスは、尾静脈形質移入(TVT)後にFGFR融合分子を発現することができる。
本発明は、そのそれぞれが当分野で慣用の技術の組合せを用いてFGFR融合タンパク質を精製する方法を提供する。これらの技術には、それだけには限定されないが、親和性マトリックスの使用および疎水性相互作用クロマトグラフィー、例えばアフィニティークロマトグラフィーが含まれる。適切な親和性リガンドには、FGFR細胞外ドメインもしくは融合パートナー、またはそれに対する抗体の任意のリガンドが含まれる。例えば、プロテインA、プロテインG、プロテインA/G、または抗体親和性カラムを用いてFc融合パートナーを結合し、FGFR融合タンパク質を精製し得る。また、融合タンパク質のFGFR部分または融合パートナーに対する抗体を用いても、融合タンパク質を精製し得る。疎水性相互作用クロマトグラフィーも、本発明のFGFR融合タンパク質の精製に適切である。例えば、ブチルまたはフェニルカラムを用い得る。当業者に知られている他の精製方法も、本発明のFGFR融合分子の精製に適切であり得る。
本発明は、水力学に基づいた尾静脈注射の手順にしたがって、動物におけるFGFR融合タンパク質の発現を提供する(Liu, F.ら、Gene Ther.、6:1258〜1266頁(1999年);米国特許第6,627,616号;およびZhangら、Hum. Gene Ther.、10:1735頁(1999年)。この技術は、ミニサークルベクター構築体中で産生させた、融合タンパク質をコードしている核酸分子の投与後における、in vivoでのFGFR融合タンパク質の産生を提供する。融合タンパク質を含む、このような注射した動物由来の血清を用いて、最初に細胞培養発現系から融合タンパク質を産生および精製せずにタンパク質のさらなる特徴づけを行い得る。
遺伝子操作技術により、望ましい薬物動態学特性を与える融合パートナーを有する組換え治療タンパク質の開発および使用が可能となった。その免疫原性エピトープおよび他の断片を含めたFGFRポリペプチドは、異種分子と組み合わせることができ、その結果、治療上有用な融合分子が生じる。本発明は、FGFR1、FGFR2、FGFR3、およびFGFR4のうちの任意のものの細胞外ドメインを含む融合分子を提供する。これは、好ましい薬物動態学および/または薬力学をFGFRに与えることができる融合パートナーを提供する。一実施形態では、本発明は、FGFR1−IIIb、FGFR1−IIIc、FGFR2−IIIb、FRFR2−IIIc、FGFR3−IIIb、FGFR3−IIIc、FGFR4、またはその断片の細胞外ドメインの全体または一部と抗体Fcドメインなどの融合パートナーとを含む融合分子を提供する。
オリゴマー化は、融合タンパク質に多価結合、結合強度の増加、および異なるドメインの合わせた機能を含めた機能的利点を提供する。これらの特徴は天然タンパク質で見られ、タンパク質工学によっても導入し得る。したがって、本発明はFGFR融合分子を提供し、融合パートナーはオリゴマー化ドメイン、例えば二量体化ドメインを含む。適切なオリゴマー化ドメインには、α−ヘリックスコイルドコイルドメインを含めたコイルドコイルドメイン;コラーゲンドメイン;コラーゲン様ドメイン、および二量体免疫グロブリンドメインが含まれる。本発明の適切なコイルドコイルポリペプチド融合パートナーには、テトラネクチンコイルドコイルドメイン、軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質のコイルドコイルドメイン;アンジオポイエチンコイルドコイルドメイン;およびロイシンジッパードメインが含まれる。融合パートナーとしてコラーゲンまたはコラーゲン様オリゴマー化ドメインを有するFGFR融合分子は、例えば、コラーゲン中に見つかるもの、マンノース結合レクチン、肺界面活性プロテインAおよびD、アディポネクチン、フィコリン、コングルチニン、マクロファージスカベンジャー受容体、およびエミリンを含み得る。
一実施形態では、本発明は、Fc免疫グロブリンドメインを有する融合分子を提供する。本発明のFGFR融合タンパク質は、Fc、哺乳動物免疫グロブリンの重鎖もしくは軽鎖の定常領域の様々なドメインおよび/またはヒトCD4ポリペプチドの最初の2つのドメインを含むことができる。
本発明は、ヒト血清由来のアルブミン(ヒト血清アルブミンすなわち「HSA」)、アルブミンの1つもしくは複数の断片、アルブミンに結合するペプチド、および/またはアルブミンに結合する脂質もしくは他の分子とコンジュゲート形成する分子を含むアルブミン融合パートナーを有する、FGFR融合分子を提供する。一実施形態では、本明細書中に記載し、インターフェロンα−HSA融合分子に関して米国特許第6,686,179号にさらに記載されているように、FGFR−HSA融合分子を調製し得る。
本発明はFGFR融合タンパク質を提供し、融合パートナーはFGFR細胞外ドメインまたはその活性のある断片を含む。例えば、融合タンパク質は、2つのFGFR1、FGFR2、FGFR3、もしくはFGFR4細胞外ドメインまたは生物活性のあるその断片を含み得る。また、融合分子は、上記により詳細に記載したように、2つの異なるFGFR細胞外ドメインまたは生物活性のあるその断片の異種の組合せを含み得る。
上述の組換え分子に加えて、本発明はFGFR融合分子を提供し、融合パートナーは、ポリエチレングリコール(PEG)部分などのポリマーを含む。本発明のPEG部分は、分枝鎖または直鎖ポリマーであり得る。一実施形態では、本発明は、モノ−またはポリ−(例えば2−4)PEG部分を含めた、化学的に誘導体化したポリペプチドを企図する。ペグ化は、当分野で知られている任意のペグ化反応によって実施し得る。ペグ化されたタンパク質産物の調製方法は一般に当分野で知られている。最適な反応条件は、既知のパラメータおよび所望の結果に応じてケースバイケースの基準で決定する。
本発明のFGFR融合タンパク質は、FGFR融合タンパク質のネイティブ特徴を改善または変更するためのタンパク質工学によって作製することができる。当業者に知られている組換えDNA技術を用いて、単一または複数のアミノ酸の置換、欠失、および付加を含めた、新規突然変異体タンパク質すなわち「ムテイン」を作製することができる。このような修飾ポリペプチドは、活性の増強または安定性の増加など、治療剤において望ましい特性を保有することができる。さらに、これらをより高い収量で精製してもよく、少なくとも特定の精製および保存条件下で、対応する天然ポリペプチドよりも水溶性が高くてもよい。
上述のように、本発明は、FGFR細胞外ドメインのアミノ酸配列のアミノおよび/またはカルボキシル末端から1つまたは複数の残基が欠失したポリペプチド融合分子を提供する。例えば、本発明は、C末端領域に欠失を有する、FGFR細胞外ドメインの欠失突然変異体を提供する。本発明は、膜貫通ドメインのN末端側で隣接する領域中の1つまたは複数のアミノ酸を欠く欠失突然変異体を提供する。
本発明は、それぞれ外来性FGFRを発現するおよび内在性FGFRを欠くトランスジェニックおよびノックアウト動物、ならびに本発明のFGFR融合タンパク質またはそれをコードしている核酸分子を注射した動物を提供する。本発明のトランスジェニック動物は一般に、外来性プロモーターおよびFGFR細胞外ドメインを含むベクターを用いて本明細書中に記載のFGFR融合分子を発現させ、ベクターを事前に決定された座位に標的化することによって作製し、FGFR融合導入遺伝子の発現パターンは外来性プロモーターの発現パターンによって決定される。ノックアウトマウスは一般に、内在性FGFRを選択的に失活させ、それを突然変異体対立遺伝子で置き換えることによって作製する。
本発明のFGFR融合タンパク質は、FGFリガンドを捕捉して、細胞表面上のFGFRとのその相互作用を阻害する囮受容体として機能することができる。本発明のものなどの囮受容体は、高い親和性および特異性でそのリガンドを認識するが、シグナル伝達を行う能力を構造的に有さない。これらはリガンド結合に対して野生型受容体と競合し、リガンド/受容体の相互作用に参加し、したがって機能的受容体の活性もしくは数および/または受容体から下流の細胞活性を調節する。囮受容体は、作用リガンドの分子トラップとして働くことによってリガンドに誘発される受容体活性化を阻害することができる。
本明細書中に記載のように、FGFは特定の病状において過剰発現される。囮受容体トラップとして働くことによって、FGFR融合タンパク質は過剰発現されたFGFの生物活性を弱毒化する。特定のFGFR融合タンパク質とin vitroで結合するFGFのプロフィールにより、その融合タンパク質のin vivoでの治療プロフィールを予測することができる。したがって、本発明は、本発明のFGFR融合タンパク質のリガンド結合プロフィールおよびFGFリガンドを過剰発現する疾患を治療するために本発明のFGFR融合分子を使用する方法を提供する。
バイオマーカーを用いて、臨床治験の終点としての有効性の実証を含めた、FGFR融合タンパク質を用いた対象の治療の結果を監視することができる。適切なバイオマーカーは、FGF−FGFRシグナル伝達経路がFGFR融合タンパク質によって影響を受けることを示す。例えば、FGFR1融合タンパク質で治療した対象におけるFGF−2レベルの減少は、融合タンパク質がFGF−2と結合し、活性FGFRからそれを捕捉することを示し、したがって治療の有効性が実証されたことを示すので、FGF−2はFGFR1の適切なバイオマーカーである。
増殖性細胞では、多くの場合、その生存および成長は成長因子による細胞外シグナル伝達に依存する。本発明のFGFR融合タンパク質は、in vitroおよびin vivoのどちらにおいても、癌細胞および他の増殖性細胞の生存度および/または増殖を阻害することができる。したがって、本発明は、本明細書中に記載のFGFR融合タンパク質を提供し、融合タンパク質を対象に投与することによる、増殖性細胞の生存度および/または増殖の阻害方法、血管形成の阻害方法、ならびに対象における癌の治療方法を提供する。in vitroにおける細胞生存度および/または増殖に対するFGFR融合タンパク質の効果を培養腫瘍細胞で検査し、in vivoにおける腫瘍細胞の生存度および増殖に対するその効果を動物腫瘍モデルで検査した。
遺伝子増幅は、特定の種類の癌をもたらすことができる癌遺伝子活性化の機構の1つである。本発明は、登録商標をもつGeneLogicデータベースに属する乳癌組織の遺伝子発現プロフィールの分析、およびFGFR1遺伝子が乳癌患者の10〜15%で増幅されていたという発見を提供する。本明細書中に記載のように、このような遺伝子増幅は腫瘍細胞の成長および/または生存を示唆しており、したがってFGFRとFGFリガンドとの間のシグナル伝達を中断することは、腫瘍成長を阻害するために有用な手法である。
(投与経路および担体)
本発明のFGFR融合分子は、静脈内、動脈内、皮下、非経口、鼻腔内、筋肉内、心臓内、脳室内、気管内、頬側、直腸、腹腔内、皮内、局所的、経皮、およびくも膜下腔内を含めた様々な経路によって、またはそうでない場合移植もしくは吸入によって、in vivoで投与することができる。これらは、以下により詳細に記載するように、配合物中で投与し得る。これらは、鼻腔内または吸入によって散剤形態で投与し得る。これらは、例えば、体温で融解するが室温で固化している、乳化基剤、水溶性基剤、カカオ脂、カーボワックス、およびポリエチレングリコールなどの様々な基剤と混合することによって配合する坐薬として投与し得る。筋肉内または皮内投与にはジェット注射を用いることができる(Furthら、Anal. Biochem.、205:365〜368頁(1992年))。文献(Tangら、Nature 356:152〜154頁(1992年))に記載のようにDNAを金微粒子上にコーティングし、微粒子銃装置、すなわち「遺伝子銃」によって皮内送達することができ、この方法において、金の微粒子弾にDNAをコーティングし、その後、皮膚細胞内に打ち込む。これらのin vivo投与方法は、当分野で知られている。
本発明のFGFR融合分子は、単独で、または他の治療様式と共に投与し得る。これらは、他の治療様式、例えば、手術、化学療法、放射線療法、または治療用抗体などの生物剤の投与の前、実質的に同時に、または後に提供し得る。したがって、本発明は、線維芽細胞成長因子および受容体が利用するシグナル伝達経路を遮断する治療と他の成長因子が利用するシグナル伝達経路を遮断する治療とを組み合わせる方法を提供し、これは、FGFおよび/またはFGFR、ならびに他の成長因子および/またはその受容体を発現する腫瘍を有する患者においてより有効であると予測することができる。この治療手法は、迅速に成長している腫瘍および高度に血管新生した腫瘍、例えば膠芽細胞腫に適用することができる。本発明のFGFR融合分子は、他の成長因子受容体の融合分子と組み合わせて用いることができる。例えば、本発明のFGFR融合タンパク質は、腫瘍成長を阻害するため、および/または腫瘍において血管形成を阻害するために、可溶性VEGFRと組み合わせることができる。
過剰活性もしくは過剰量のFGFリガンドもしくはFGFRによって直接または間接的に媒介される障害を診断するため、その予後診断を提供するため、予防するため、治療するため、およびその治療を開発するために、本発明のFGFR融合分子ならびにその断片および改変体を用い得る。本発明のFGFR融合分子ならびにその断片および改変体を、そのような障害の危険性にある、またはそれに罹患した患者に投与し得る。
純粋に本発明の例示であることを意図し、したがっていかなる様式でも本発明を限定すると見なされるべきでない実施例も、上述の本発明の態様および実施形態を記載および詳述する。実施例は、以下の実験が行った実験のすべてである、または行った実験はこれだけであることを表すことを意図しない。用いた数(例えば、量、温度など)に関して精度を保証する努力はなされているが、ある程度の実験誤差および偏差を考慮すべきである。別段に指定しない限りは、部とは重量部であり、分子量とは重量平均分子量であり、温度とは摂氏であり、圧力は大気圧またはその付近である。
(FGFRおよびFGFR改変体の部分IgIIIドメインおよび膜隣接領域の配列アラインメント)
図1Aは、European Molecular Biology Laboratory(EMBL)生物情報学検索サイトのClustal Wプログラムバージョン1.8を用いた、7つのFGFRファミリーメンバー、すなわちFGFR1−IIIb、FGFR1−IIIc、FGFR2−IIIb、FGFR2−IIIc、FGFR3−IIIb、FGFR3−IIIc、およびFGFR4のそれぞれのIgIIIドメインの一部のアミノ酸配列のアラインメントを示す。
(実施例2)
(FGFR融合タンパク質の発現)
本発明の融合タンパク質は、293−6E細胞(Biotechnology Research Institute;カナダMontreal)内に形質移入したpTT5ベクター(Biotechnology Research Institute;カナダMontreal)を用いて293−6E宿主細胞中で発現させ、その後これを培養することで融合タンパク質を産生させた。ヒトFGFR1−IIIcの細胞外ドメイン(配列番号1)をコードしているFGFR1−IIIc−FcのcDNA(配列番号4)を含む発現ベクターを、内部で調製したオープンリーディングフレームcDNAライブラリから構築した。このcDNAを、アミノ酸GSをコードしているリンカーを介してそのC末端でヒトIgG1重鎖のFc断片をコードしているcDNA(配列番号80)に連結させ、融合構築体を作製した。これを本明細書中で以降「FGFR1−IIIc−Fc cDNA」と呼び、その発現産物を「FGFR1−IIIc−Fcタンパク質」と呼ぶ。Fc断片も内部で調製したオープンリーディングフレームcDNAライブラリから得た。このcDNA融合構築体を慣用技術によってpTT5ベクター内に挿入し、FGFR1−IIIc−Fc/pTT5発現ベクターを作製した。
cDNAをpcDNA3.1ベクター内にサブクローニングした。pcDNA3.1ベクターを用いてCHO−S宿主細胞中でFGFR3−IIIc−FcおよびFGFR4−Fc融合タンパク質を発現させるための発現構築体を、PCRおよび慣用のサブクローニング技術を用いて、上述と同様の様式で作製した。
(実施例3)
(293−6E細胞およびCHO−S宿主細胞中での融合タンパク質の一過的発現)
FGFR1−IIIc−Fc/pTT5発現ベクターを、293−6E宿主細胞中での一過的発現を提供するために設計した。293−6E細胞を無血清懸濁培養Free−Style培地(Invitrogen;カリフォルニア州Carlsbad)に事前に適応させた。対数増殖期(対数期の成長)中の9×105個/ml〜1.2×106個/mlの細胞密度中に、発現ベクターを用いて細胞の形質移入を行った。
Nucleofectorキュベット(Amaxa;ドイツCologne)に移した。約5ugのR1Mut4/pcDNA3.1プラスミドDNAを加え、キュベット中の懸濁させたCHO−S細胞と混合した。その後、U−024プログラムを用いて細胞をAmaxa Nucleofectorで電気穿孔した。
(実施例4)
(CHO−S宿主細胞中で融合タンパク質を安定して産生させるための細胞系の開発)
CHO−Sなどの適切な哺乳動物細胞中で安定した発現を提供するために、FGFR1−IIIc−Fc/pcDNA3.1発現ベクターを設計した。このベクターを、CD−CHO培地(Invitrogen;カリフォルニア州Carlsbad)中での無血清懸濁培養に適応させることによって接着性CHO−K1細胞から由来した、ジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)遺伝子を含むCHO−S細胞内に形質移入した。
(実施例5)
(DG44細胞中で融合タンパク質を安定して産生させるための細胞系の開発)
実施例2に記載のR1Mut4/pDEF38を含む発現ベクターを用いて、R1Mut4融合タンパク質を安定して産生させるためのDG44細胞の形質移入を行った。このプロセスでは、形質移入していないDHFR−陰性CHO細胞系DG44を、8mMのL−グルタミン、1×ヒポキサンチン/チミジン(HT;Invitrogen;カリフォルニア州Carlsbad)、および18ml/LのPluronic−68(Invitrogen;カリフォルニア州Carlsbad)を添加したCHO−CD無血清培地(Irvine Scientific;カリフォルニア州Irvine)中で培養した。最初に、制限酵素PvuIを用いた消化によってR1Mut4/pDEF38を含む約50ugのプラスミドDNAを直鎖状にし、その後、エタノールを加えることによって沈殿させ、手短に空気乾燥させ、次いで400ulの滅菌蒸留水に再懸濁させた。形質移入の前日に、宿主細胞としての培養したDG44細胞を約4×105個/mlの細胞密度で振盪フラスコに播種し、形質移入の日には約0.8×106個/mlの密度に達していた。細胞を収集し、約1×107個の細胞/形質移入単位を遠心分離によってペレットにした。
(実施例6)
(細胞培養物の産生中のFGFR1−III−Fc、R1Mut4および他のFGFR1−IIIc−Fc改変体のin vitro切断の分析)
一過的タンパク質発現中におけるFGFR1−IIIc−Fcのin vitro切断に対する耐性を、FGFR1−IIIc−Fc改変体R1Mut1、R1Mut2、R1Mut3、R1Mut4、R1Mut5、R1Mut6、R1Mut7、R1Mut8およびR1Mut9と比較した。融合タンパク質は、実施例2に記載のpTT5ベクターを用いた一過的の形質移入を介してそれぞれ293−6E細胞中で発現させた。それぞれの形質移入体の上清を形質移入後4日目に採取し、それぞれの約5ulを、還元条件下の4〜12%アクリルアミドゲルのSDS−PAGEを用いて分離した。上清は、細胞数、生存度、および形質移入条件が一致した培養物由来のものであった。その後、分離したタンパク質を、西洋ワサビ−ペルオキシダーゼにコンジュゲートさせた抗ヒトFc抗体(抗ヒトFc HRP;Jackson ImmunoResearch Laboratories,Inc.;ペンシルバニア州West Grove)を用いてプロービングを行った。結果を図3Aに示し、これは、約28〜39kDを移動する親FGFR1−IIIc−Fcから切断されたFc断片を示す。融合タンパク質を切断改変体R1Mut1、R1Mut2、R1Mut3、R1Mut4、およびR1Mut5から作製した場合は、はるかに少ないFc産物が得られた。同様の実験により、FGFR1−IIIc−Fcの改変体R1Mut6、R1Mut7も、一過的タンパク質発現中において親FGFR1−IIIc−Fc融合タンパク質よりも少ないin vitro切断を有していたことが実証された。
(実施例7)
(FGFR1−IIIc−Fcの精製)
タンパク質−Aアフィニティークロマトグラフィーおよびブチル疎水性相互作用クロマトグラフィーの組合せを用いて、組換え宿主細胞から発現させたFGFR1−IIIc−Fcを細胞培養上清から精製した。GE Healthcare Akta Purifier 100(GE Healthcare Bio−Sciences;ニュージャージー州Piscataway)を用いて、培地の構成成分を最初にタンパク質−Aセファロースカラムで、次いでブチルセファロースカラムで分離した。タンパク質−Aセファロース4Fast Flow(GE Healthcare Bio−Sciences;ニュージャージー州Piscataway)を、融合分子のFc領域に結合するためのアフィニティーマトリックスとして用いた。カラムを10倍カラム体積の10mMのリン酸カリウム、500mMのNaCl、pH7.0の滅菌緩衝液で平衡化し、その後、細胞培養上清液をカラムに載せた。カラムを8倍カラム体積の滅菌した10mMのリン酸カリウム、500mMのNaClの緩衝液、pH7.0で洗浄し、その後、FGFR1−IIIc−Fcを含めた結合した物質を、10ml/分の速度で、段階勾配の溶出緩衝液(100mMのグリシン、500mMのNaCl、pH2.7)を用いて、それぞれ2倍カラム体積の15%、30%、45%、60%、75%、および90%の溶出緩衝液、次いで5倍カラム体積の100%の溶出緩衝液の逐次的な段階を用いて溶出させた。溶出液を中和するために、1mlの1Mトリス、pH7.0(Ambion;テキサス州Austin)を含むチューブ内に10ml画分を採取した。FGFR1−IIIc−Fcを含む画分をゲル電気泳動によって同定し、プールした。FGFR1−IIIc−Fcは約30〜45%の勾配強度の溶出緩衝液で溶出された。
(実施例8)
(Biacore分析によって測定した、FGFR1−IIIc−Fc、R1Mut4、FGFR3−IIIc−Fc、およびFGFR4に対するリガンド結合の特異性および親和性)
FGFR1−IIIc−Fc、R1Mut4、FGFR3−IIIc−Fc、およびFGFR4−Fcに対するFGFリガンド結合の特異性は、Biacore(登録商標)T100表面プラズモン共鳴(SPR)技術(Biacore;ニュージャージー州Piscataway)を用いて評価した。FGFR1−IIIc−Fc、R1Mut4、およびFGFR4−Fc融合タンパク質は、実施例2、4、および5に記載のようにCHO−S宿主細胞から産生させた。FGFR3−IIIc−Fc融合タンパク質は、実施例2および3に記載のように293−6E宿主細胞から産生させた。タンパク質−Aを製造者の指示に従ってCM5チップに共有結合させ、その後、Fcドメインとタンパク質−Aとの相互作用によってFGFR融合タンパク質をチップに結合させた。50ug/mlのヘパリン(Sigma;ミズーリ州St.Louis)を添加したHBS−P緩衝液(Biacore;ニュージャージー州Piscataway)の存在下で、やはり製造者の指示に従ってFGFリガンドをFGFR融合タンパク質と接触させた。
(競合ELISAによって測定した、FGFR4−FcおよびFGFR4−Fc欠失突然変異体に対するリガンド結合の特異性および親和性)
実施例1、2、および3に記載のように作製したFGFR4−Fc融合タンパク質および欠失改変体を、可溶性FGFリガンドFGF−1、FGF−2、およびFGF−8bを捕捉し、プレート上にコーティングしたFGFR4−Fc融合タンパク質に対するリガンド結合を阻害するその能力について試験した。
Systems;ミネソタ州Minneapolisから)と共に、PBS中に0.1×BLOTTO中の20ug/mlのヘパリンの存在下で、30分間、37℃で、振盪器上で、それぞれ最初に96ウェルのU字底プレート中でプレインキュベーションを行った。その後、FGF−1と共にプレインキュベーションを行った約40ulの上記融合タンパク質を、FGFR4−Fcをコーティングした洗浄したハーフウェルプレートに加え、30分間、37℃で振盪しながらインキュベーションを行った。インキュベーション後、すべての未結合のFGF−1を除去するために、プレートを以前のようにPBSおよび0.05%のTween−20で6回洗浄した。洗浄後、1×BLOTTO中に約2ug/mlの抗ヒトFGF−1ポリクローナルビオチン標識抗体(R&D Systems;ミネソタ州Minneapolis)をプレートの各ウェルに加え、その後、それを30分間、37℃で振盪しながらインキュベーションを行い、次いで、すべての未結合の抗FGF−1抗体を除去するために、以前のように洗浄した。結合した抗FGF−1抗体は、ABCキット(Vector Laboratories;カリフォルニア州Burlingame)中に提供されたストレプトアビジン−HRPリンカーを用いて、製造者のプロトコルに従って検出した。以前のように洗浄した後、再構成した(OPD)溶液(Sigma;ミズーリ州St.Louis)を加えた。検出反応を10〜20分間、室温で進行させ、次いで450nmでの吸光度を読み取った。競合ELISAからの結合曲線および生じたEC50値を図5Aに示す。
(実施例10)
(直接ELISAによって測定した、FGFR1−IIIc−Fc欠失突然変異体に対するリガンド結合の親和性)
直接FGF−2結合ELISAアッセイによって、R1Mut1、R1Mut2、R1Mut3、R1Mut4、およびR1Mut5融合タンパク質を、FGF−2と結合するその能力について、親FGFR1−IIIc−Fc融合タンパク質と比較した(すべて実施例3に記載のように293−6E宿主細胞から産生)。手短に述べると、FGF−2(R&D Systems;ミネソタ州Minneapolis)を用いて、FGF−2をPBS中に、5ug/mlの濃度、25ul体積/ウェルで希釈し、1時間、室温で振盪しながらインキュベーションを行うことによって、ハーフウェルHI BINDウェル(Becton Dickinson;ニュージャージー州Franklin Lakes)をコーティングした。その後、150ulのBLOTTO(Pierce Biotechnology;イリノイ州Rockford)を各ウェルに加え、1時間、室温でインキュベーションを行うことによって、ウェルを遮断した。その後、FGF−2およびBLOTTOを除去するために、0.05%のTween−20を含むPBSでプレートを6回洗浄し、ウェルを、様々な濃度のFGFR1−IIIc−Fc、R1Mut1、R1Mut2、R1Mut3、R1Mut4、R1Mut5、またはヒトIgG(陰性対照として)と共に、PBS中の0.1×BLOTTOに希釈した10ug/mlのヘパリンの存在下で、終夜4℃でインキュベーションを行った。プレートを以前のように洗浄し、その後、BLOTTO中に2.5ug/mlの25ulのHRPにコンジュゲートさせた抗ヒトFc抗体と共に、1時間、室温、プレート振盪器上でインキュベーションを行った。その後、BLOTTOを除去し、プレートを再度以前のように洗浄した。洗浄後、ウェルを、再構成したOPD溶液(Sigma;ミズーリ州Saint Louis)と共に10〜20分間、室温でインキュベーションを行い、450nmでの吸光度を測定した。
(実施例11)
(FGFR融合タンパク質はFGFR1−IIIc−Fcのリガンド結合を阻害する)
実施例1、2、および3に記載のように作製した、293−6EおよびCHO細胞から産生させたFGFR1−IIIc−Fc融合タンパク質を、可溶性FGFリガンドFGF−1、FGF−2、およびFGF−8bを捕捉し、ならびにプレート上にコーティングしたFGFR1−IIIc−Fc融合タンパク質に対するリガンド結合を阻害するその能力について、競合ELISAアッセイで試験した。
(実施例12)
(FGFR1−IIIc−FcはFGF−2によるphospho−Erkシグナル伝達を阻害した)
293−6EまたはCHO細胞に由来するFGFR1−IIIc−Fc融合タンパク質は、FGF−2による生物学的シグナル伝達の阻害においてほぼ同等に強力であった。T−175フラスコ中で増殖中のFGFR1−IIIcで形質移入したL6細胞(ETH;スイスZurich)をトリプシン処理し、洗浄し、10,000個の細胞/ウェルの濃度、100ulの体積で、96ウェル平底プレート中の0.5%のFCSおよび0.1%のウシ血清アルブミン(BSA)を添加したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)に、16時間播種した。FGFR1−IIIc−Fc融合タンパク質またはヒトIgG1を0.005〜10ug/mlの濃度で含む活性化培地を調製し(100ng/mlのFGF−2、10ug/mlのヘパリンを含む0.1%のBSA DMEM中)、30分間、37℃で、プレート振盪器上でインキュベーションを行った。その後、L6細胞を、25ulの活性化培地/ウェルに5分間、37℃で曝した。その後、細胞を200ulの氷冷PBSで1回洗浄し、PathScan phospho−p44/42MAPK(T202/Y204)Sandwich ELISAキット(Cell Signaling;マサチューセッツ州Danvers)の製造者の推奨に従って、100ulの氷冷1×溶解緩衝液で30分間、氷上で溶解した。溶解期間の終了後、溶解物をピペットで約5回、発泡を最小限にしながら吸入、排出を行った。約80ulのSample Diluent(Pathscan Sandwich ELISAキットから)をphospho−ERK ELISAプレートの各ウェルに加え、80ulの細胞溶解液を加え、混合した。その後、プレートをプラスチック接着材で密封し、2時間、37℃でインキュベーションを行い、0.05%のTween−20を含むPBSで6回洗浄した。その後、100ulのphospho−ERK Detection Antibody(Pathscan Sandwich ELISAキットから)を各ウェルに加えた。プレートを接着性カバーで密封し、1時間、37℃でインキュベーションを行い、以前のように洗浄し、100ulのHRP連結二次抗体(Pathscan Sandwich ELISAキットから)を各ウェルに加えた。プレートを再度密封し、30分間、37℃でインキュベーションを行い、その後、以前のように洗浄した。その後、約100ulのTMB基質(3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン、Pathscan Sandwich ELISAキットから)を各ウェルに加え、プレートを30分間、25℃でインキュベーションを行った。100ulのSTOP Solution(Pathscan Sandwich ELISAキットから)を各ウェルに加えて混合することによって、発色を完了させた。450nmでの吸光度を記録し、図13に示すようにプロットした。
(実施例13)
(FGFR1−IIIc−Fcが癌細胞の生存度および増殖を低下させた)
本発明のFGFR−Fc融合タンパク質は、製造者の指示に従ってCellTiter−Glo(商標)発光性細胞生存度アッセイで測定すると(Promega;ウィスコンシン州Madison)、培養癌細胞の生存度および/または増殖を低下させた。このアッセイでは、発光が生細胞の数と定量的に相関する。
(実施例14)
(FGFR−Fc融合タンパク質は癌細胞の生存度および増殖を低下させた)
FGFR1−IIIb−Fc、FGFR1−IIIc−Fc、FGFR2−IIIb−Fc、FGFR2−IIIc−Fc、FGFR3−IIIb−Fc、FGFR3−IIIc−Fc、およびFGFR4−Fcを、6つの異なる癌細胞系の生存度および/または増殖を阻害する能力について試験した。このアッセイで試験した7つの融合タンパク質は、市販源から得た(R&D Systems)。癌細胞系には、A549(肺)、U118(脳)、U251(脳)、SF268(脳)、T47D(***)およびCaki−1(腎臓)が含まれていた。
(実施例15)
(マウスにおけるin vivoのFGFR1−IIIc−Fcの持続発現)
動物モデル、例えば動物腫瘍モデルにおけるヒトFGFR1−IIIc−Fc融合タンパク質の持続発現の効果を、マウスにおいてFGFR1−IIIc−Fcを発現させるために水力学的尾静脈注射法を用いて試験した。FGFR1−IIIc−Fc融合タンパク質をコードしている裸の「ミニサークル」ベクターcDNAを3カ月齢のC57/B16雌マウス(Charles River Laboratory;カリフォルニア州Hollister)に注射した。この「ミニサークル」ベクターはFGFR1 IIIc−Fc cDNAを含んでおり、実施例2に記載のように作製した。Liu, F.ら、Gene Therapy、6:1258〜1266頁(1999年)および米国特許第6,627,616号に報告されているように、水力学的尾静脈注射法を用いてその尾静脈を介して、生理食塩水中に約15ug/mlのDNA濃度で動物に注射した。約2mlのDNA組成物を5〜8秒間内にそれぞれのマウスに注射した。3匹のマウスにFGFR1−IIIc−Fc cDNAを含むミニサークルDNAを注射し、3匹のマウスに対照として生理食塩水を注射した。約50ulの体積の血清試料を、尾静脈のニックから、注射後2、9、16、24、30、37、および44日目に得た。血清試料中のFGFR1−IIIc−Fcタンパク質の濃度を直接ELISAによって分析し、マウス血清中のFGFR1−IIIc−Fcのリガンド結合活性をFGF−2競合ELISAによって分析した。どちらのELISA方法も以下にさらに詳述する。
(実施例16)
(水力学的形質移入を介したR1Mut4のin vivo発現)
実施例15に記載の実験に類似の実験を、実施例2に記載のミニサークルベクターを用いてマウス内にR1Mut4 cDNAを水力学的形質移入することによって行った。R1Mut4をコードしている裸の「ミニサークル」ベクターcDNAを4カ月齢のCB17 SCIDマウス(Charles River Laboratory;カリフォルニア州Hollister)に注射した。約2mlのDNAを、20μg/mlの濃度で、5〜8秒間内に、4匹の対照マウスおよび4匹のR1Mut4実験マウスのそれぞれに注射した。血清試料を2日目および7日目に採取した。血清試料中のR1Mut4の濃度を、直接ELISA(実施例15参照)、FGF−2競合ELISA(実施例15参照)ウェスタンブロットプロービングによって分析した。
(実施例17)
(293−6EおよびCHO−S宿主細胞によって産生させたFGFR1−IIIc−Fc融合タンパク質のin vivo比較)
実施例5に示すように、CHO−S宿主細胞によって発現させたFGFR1−IIIc−Fcは、293−6E宿主細胞によって発現させたFGFR1−IIIc−Fcよりも優れたin vitroの安定性を示した。CHO−S宿主細胞によって発現させたFGFR1−IIIc−Fcが293−6E宿主細胞によって発現させたFGFR1−IIIc−Fcよりも優れたin vivo安定性プロフィールを示したかどうかを決定するために、両方の起源のFGFR1−IIIc−Fcタンパク質をマウスに注射し、72時間の経時変化にわたってウェスタンブロットによって比較した。
(実施例18)
(FGFR1−IIIc−FcおよびR1Mut4による腫瘍成長のin vivo阻害)
腫瘍成長の異種移植モデルを用いて、癌治療剤のin vivo阻害性特性を評価することができる。Caki−1ヒト腎臓腫瘍細胞(ATCC;バージニア州Manassas)は、重篤な複合免疫不全CB17 scid/scid(CB17SCID)マウスに注射した際に腫瘍を形成する。腫瘍細胞を注射した後にFGFR1−IIIc−FcまたはR1Mut4を用いて治療することによって、マウス中で形成される腫瘍の大きさが減少する。
(実施例19)
(293−6EおよびCHO−S細胞によるFGFR1−IIIc−Fcのシアリル化およびグリコシル化)
293−6E細胞およびCHO−S細胞によって発現させたFGFR1−IIIc−Fcの安定性の差異の原因となる要素を調査するために、2つの融合タンパク質のシアル酸含有量を比較した。293−6E細胞によって産生させたFGFR1−IIIc−Fcは、CHO−S細胞から産生させたFGFR1−IIIc−Fcとは異なるシアリル化パターンを有していた。
(実施例20)
(マウスにおけるFGFR1−IIIc−Fcの薬力学的研究)
C57B16マウスにおけるFGFR1−IIIc−Fcの薬力学的研究は、融合タンパク質が血清中に注射後約25日間存在し、約14日間FGF−2結合活性を保持することを示している。研究は、マウスにCHO−S細胞によって発現させた組換えFGFR1−IIIc−Fcを固定用量で注射することによって行った。9週齢の雌C57/B16マウス(Charles River Laboratory)に、最終用量15mg/kgで200ulのFGFR1−IIIc−Fcタンパク質溶液を注射した。注射後30分、5時間、ならびに1、2、3、4、5、7、14、および25日目に、血清試料(100ul)を眼窩後方から採取し、それぞれの時点で4匹のマウスを検査した。血清試料中のFGFR1−IIIc−Fcの濃度を、実施例15に記載のように、直接ELISAおよびFGF−2競合ELISAの両方によって分析した。
(実施例21)
(マウスにおけるR1Mut4の薬力学的研究)
C57マウスにおけるR1Mut4の薬力学的研究は、R1Mut4がFGFR1−IIIc−Fcとほぼ同等のin vivo安定性を有することを示している。2〜3カ月齢のC57マウス(Charles River Laboratory)に、10mg/kgのFGFR1−IIIc−FcまたはR1Mut4の用量を200ulの生理食塩水ビヒクル中で皮下注射した。FGFR1−IIIc−FcおよびR1Mut4はどちらも、実施例2に記載のようにCHO−S細胞におけるpcDNA3.1ベクター中での発現によって調製した。血清試料(200ul)を注射後4時間、3日目、および7日目に採取した。血清試料中のFGFR1−IIIc−FcおよびR1Mut4タンパク質の濃度を、実施例5に記載のようにウェスタンブロットによって分析し、結果を図31に示した。注射の4時間後、FGFR1−IIIc−FcおよびR1Mut4で治療したマウスは、右側パネルに示すCHO−S細胞から調製した既知の量のFGFR1−IIIc−Fcの標準物質との比較によって決定されるように、抗Fc抗体との反応性をほぼ同じ量で示した(約6.3ng以上)。3日目には、標準物質との比較によって決定されるように、すべての動物の血清中に存在するタンパク質の量は約3.1ng以上まで低下していた。7日目には、すべての動物の血清中に存在するタンパク質の量は、約1.6ng以上まで低下していた。これらの結果は、組換えFGFR1−IIIc−FcおよびR1Mut4タンパク質が類似のin vivo安定性を有していたことを実証している。
(実施例22)
(正常組織に対する癌組織中のFGFR1、FGFR3、およびFGFR4の過剰発現)
GeneLogic(メリーランド州Gaithersburg)の登録商標をもつ腫瘍学データベースに属する発現データの分析および分別により、対応する正常組織と比較してFGFR1、FGFR3、およびFGFR4を過剰発現していた癌が本発明で同定された。これらの癌が、本発明のFGFR融合タンパク質の治療標的である。GeneLogicデータベースは、Affymetrix U133(カリフォルニア州Santa
Clara)マイクロアレイチップを、3000個を超える悪性組織試料に由来するcRNAおよび4500個を超える正常組織試料に由来するcRNAとハイブリダイズさせることによって作製した。Affymetrix U133マイクロアレイチップは、FGFR1に対応するプローブ、FGFR3に対応するプローブ、およびFGFR4に対応するプローブを含む。
(実施例23)
(正常組織に対する癌組織中のFGF−1、FGF−2、FGF−4、およびFGF−5の過剰発現)
癌組織種および対応する正常組織種におけるFGF−1、FGF−2、FGF−4、およびFGF−5の発現に対するGeneLogic(メリーランド州Gaithersburg)データベースの分析を、本質的に実施例22に記載のように行った。Affymetrix U133マイクロアレイチップは、FGF−1、FGF−2、FGF−4、およびFGF−5に対応するプローブを含む。FGF−1、FGF−2、FGF−4、またはFGF−5を過剰発現している任意の所定の癌種のデータセットにおける試料の割合を、そのデータセット中の試料の合計数の割合として計算し、表6に示す。対応する正常組織と比較してFGF−1、FGF−2、FGF−4、およびFGF−5を過剰発現していた癌が、本発明のFGFR融合タンパク質の治療標的である。
(実施例24)
(正常組織に対する癌組織中のFGF−8、FGF−17、FGF−18、FGF−9、およびFGF−20の過剰発現)
癌組織種および対応する正常組織種におけるFGF−8、FGF−17、FGF−18、FGF−9、またはFGF−20の発現に対するGeneLogic(メリーランド州Gaithersburg)データベースの分析を、本質的に実施例22に記載のように行った。Affymetrix U133マイクロアレイチップは、FGF−8、FGF−17、FGF−18、FGF−9、およびFGF−20に対応するプローブを含む。FGF−8、FGF−17、FGF−18、FGF−9、またはFGF−20を過剰発現している任意の所定の癌種のデータセットにおける試料の割合を、そのデータセット中の試料の合計数の割合として計算し、表6に示す。対応する正常組織と比較してFGF−8、FGF−17、FGF−18、FGF−9、およびFGF−20を過剰発現していた癌が、本発明のFGFR融合タンパク質の治療標的である。
(実施例25)
(正常組織に対する癌組織におけるFGF−19、FGF−21、およびFGF−23の過剰発現)
癌組織種および対応する正常組織種におけるFGF−19、FGF−21、またはFGF−23の発現に対するGeneLogic(メリーランド州Gaithersburg)データベースの分析を、本質的に実施例22に記載のように行った。Affymetrix U133マイクロアレイチップは、FGF−19、FGF−21、およびFGF−23に対応するプローブを含む。FGF−19、FGF−21、またはFGF−23を過剰発現している任意の所定の癌種のデータセットにおける試料の割合を、そのデータセット中の試料の合計数の割合として計算し、表9に示す。対応する正常組織と比較してFGF−19、FGF−21、またはFGF−23を過剰発現していた癌が、本発明のFGFR融合タンパク質の治療標的である。
(実施例26)
(正常組織に対する癌組織中のFGFR1の過剰発現ならびにFGF−1、FGF−2、FGF−4、FGF−5、FGF−8、FGF−9、FGF−17、FGF−19、FGF−20、およびFGF−21の過剰発現)
FGF−1、FGF−2、FGF−4、FGF−5、FGF−8、FGF−9、FGF−17、FGF−19、FGF−20、およびFGF−21は、FGFR1を発現する癌細胞において増殖を誘導することができる。癌組織種および対応する正常組織種におけるFGF−1、FGF−2、FGF−4、FGF−5、FGF−8、FGF−9、FGF−17、FGF−19、FGF−20、およびFGF−21の発現に対するGeneLogic(メリーランド州Gaithersburg)データベースの分析を、本質的に実施例22に記載のように行った。Affymetrix U133マイクロアレイチップは、FGFR1、FGF−1、FGF−2、FGF−4、FGF−5、FGF−8、FGF−9、FGF−17、FGF−19、FGF−20、およびFGF−21に対応するプローブを含む。FGFR1、FGF−1、FGF−2、FGF−4、FGF−5、FGF−8、FGF−9、FGF−17、FGF−19、FGF−20、またはFGF−21を過剰発現している任意の所定の癌種のデータセットにおける試料の割合を、そのデータセット中の試料の合計数の割合として計算し、表10に示す。対応する正常組織と比較してFGFR1、FGF−1、FGF−2、FGF−4、FGF−5、FGF−8、FGF−9、FGF−17、FGF−19、FGF−20、およびFGF−21を過剰発現していた癌が、本発明のFGFR融合タンパク質の治療標的である。
(実施例27)
(正常組織に対する癌組織中のFGFR3の過剰発現ならびにFGF−1、FGF−2、FGF−4、FGF−5、FGF−8、FGF−9、FGF−17、FGF−18、FGF−19、およびFGF−20の過剰発現)
FGF−1、FGF−2、FGF−4、FGF−5、FGF−8、FGF−9、FGF−17、FGF−18、FGF−19、およびFGF−20は、FGFR3を発現する癌細胞において増殖を誘導することができる。癌組織種および対応する正常組織種におけるFGF−1、FGF−2、FGF−4、FGF−5、FGF−8、FGF−9、FGF−17、FGF−18、FGF−19、およびFGF−20の発現に対するGeneLogic(メリーランド州Gaithersburg)データベースの分析を、本質的に実施例22に記載のように行った。Affymetrix U133マイクロアレイチップは、FGFR3、FGF−1、FGF−2、FGF−4、FGF−5、FGF−8、FGF−9、FGF−17、FGF−18、FGF−19、およびFGF−20に対応するプローブを含む。FGFR3、FGF−1、FGF−2、FGF−4、FGF−5、FGF−8、FGF−9、FGF−17、FGF−18、FGF−19、およびFGF−20を過剰発現している任意の所定の癌種のデータセットにおける試料の割合を、そのデータセット中の試料の合計数の割合として計算し、表11に示す。対応する正常組織と比較してFGFR3、FGF−1、FGF−2、FGF−4、FGF−5、FGF−8、FGF−9、FGF−17、FGF−18、FGF−19、およびFGF−20を過剰発現していた癌が、本発明のFGFR融合タンパク質の治療標的である。
(実施例28)
(正常組織に対する癌組織中のFGFR4の過剰発現ならびにFGF−1、FGF−2、FGF−4、FGF−8、FGF−9、FGF−17、FGF−18、FGF−19、FGF−20、FGF−21、およびFGF−23の過剰発現)
FGF−1、FGF−2、FGF−4、FGF−8、FGF−9、FGF−17、FGF−18、FGF−19、FGF−20、FGF−21、およびFGF−23は、FGFR4を発現する癌細胞において増殖を誘導することができる。癌組織種および対応する正常組織種におけるFGF−1、FGF−2、FGF−4、FGF−5、FGF−8、FGF−9、FGF−17、FGF−18、FGF−19、およびFGF−20の発現に対するGeneLogic(メリーランド州Gaithersburg)データベースの分析を、本質的に実施例22に記載のように行った。Affymetrix U133マイクロアレイチップは、FGFR3、FGF−1、FGF−2、FGF−4、FGF−5、FGF−8、FGF−9、FGF−17、FGF−18、FGF−19、およびFGF−20に対応するプローブを含む。FGFR3、FGF−1、FGF−2、FGF−4、FGF−5、FGF−8、FGF−9、FGF−17、FGF−18、FGF−19、およびFGF−20を過剰発現している任意の所定の癌種のデータセットにおける試料の割合を、そのデータセット中の試料の合計数の割合として計算し、表11に示す。対応する正常組織と比較してFGFR3、FGF−1、FGF−2、FGF−4、FGF−5、FGF−8、FGF−9、FGF−17、FGF−18、FGF−19、およびFGF−20を過剰発現していた癌が、本発明のFGFR融合タンパク質の治療標的である。
FGFR融合タンパク質およびそれをコードしているポリヌクレオチド分子は、癌を含めた、増殖性疾患および血管形成に関与する疾患の治療に有用である。これらを用いて、このような疾患を診断、予防、および治療することができる。
配列表は、紙形式およびコンピューター可読形式の両方で提供される。これは、送付状に添付される。
Claims (3)
- FGFR1ポリペプチドの細胞外ドメインと融合パートナーとを含むFGFR1融合タンパク質であって、該細胞外ドメインは、配列番号130のアミノ酸22〜360からなる、FGFR1融合タンパク質。
- 前記融合パートナーがFcポリペプチドである、請求項1に記載のFGFR1融合タンパク質。
- 配列番号100のアミノ酸22〜592からなる、FGFR1融合ポリペプチド。
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