ES2884830T3 - Métodos que se refieren a la realización de pruebas para trastornos de almacenamiento lisosomal - Google Patents

Abstract

Procedimiento para detectar actividad enzimática in vitro, que comprende: poner en contacto una muestra que contiene una enzima diana con un sustrato y una o más sales de oleato, en el que dicha sal de oleato se selecciona del grupo que consiste en oleato de sodio, oleato de potasio, oleato de magnesio, oleato de calcio, oleato de zinc u oleato de litio, dicha etapa de poner en contacto en condiciones en las que la enzima diana es capaz de actuar sobre el sustrato para producir un producto enzimático y en el que dicha enzima diana es ácido a-galactosidasa A, ácido b-glucocerebrosidasa, galactocerebrosidasa, ácido a-glucosidasa, ácido esfingomilenasa, a-L-iduronidasa, o combinaciones de las mismas; y detectar dicho producto enzimático, en el que el procedimiento excluye la adición de ácido oleico en cualquier punto en la preparación para o realización del ensayo; en el que dicho sustrato y la sal de oleato se combinan y se secan antes de dicha puesta en contacto; y en el que la etapa de poner en contacto es en un tampón acuoso.

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos que se refieren a la realización de pruebas para trastornos de almacenamiento lisosomal

Referencia cruzada a solicitudes relacionadas

Esta solicitud depende de y reivindica prioridad a la solicitud de patente estadounidense n.°: 14/474.524 presentada el 2 de septiembre de 2014.

Campo

La presente descripción se refiere a reactivos analíticos para detectar actividad enzimática. Se proporciona la detección de actividad enzimática lisosomal que puede usarse para ensayos de selección para la detección de uno o más trastornos de almacenamiento lisosomal.

Antecedentes

Los trastornos de almacenamiento lisosomal son un grupo de trastornos hereditarios que se caracterizan por deficiencias en enzimas específicas del cuerpo, lo que da como resultado la incapacidad del cuerpo para descomponer sustancias metabólicas. Como ejemplo, la enfermedad de Fabry es un trastorno de almacenamiento lisosomal observado en una de cada 40.000 personas. Es provocada por una deficiencia en la enzima alfa-galactosidasa que da como resultado la incapacidad del cuerpo para descomponer sustancias grasas específicas llamadas globotriaosilceramidas. Un segundo ejemplo es la enfermedad de Gaucher, un trastorno de almacenamiento lisosomal provocado por la incapacidad de descomponer sustancias grasas o lípidos denominados glucosilceramidas (también denominados glucocerebrósidos). Los individuos con enfermedad de Gaucher no producen glucocerebrosidasa, una enzima necesaria para descomponer estas sustancias grasas. Estas sustancias grasas luego se acumulan en las células del hígado, el bazo y la médula ósea. Un tercer ejemplo es la enfermedad de Pompe, un trastorno de almacenamiento lisosomal provocado por una deficiencia en la enzima ácido alfa-glucosidasa, que es necesaria para descomponer determinados azúcares denominados glucógeno. Cuando falta la enzima ácido alfa-glucosidasa, el glucógeno se acumula en diversos tejidos y órganos del cuerpo.

Los trastornos de almacenamiento lisosomal son, en su mayor parte, trastornos de la infancia, aunque algunos se manifiestan en la edad adulta. En la mayoría de ellos, los pacientes son normales al nacer y tienen un deterioro neurológico progresivo que comienza en algún momento posterior. El fenotipo clínico depende del tipo y la gravedad del defecto bioquímico. Algunos de estos trastornos lisosomales, tales como la enfermedad de Pompe y la enfermedad de Krabbe, se manifiestan principalmente en la infancia. Se han realizado esfuerzos continuos en el desarrollo de métodos para detectar tales trastornos antes de la aparición de los síntomas clínicos, de modo que se puedan iniciar intervenciones terapéuticas.

La mayoría de las pruebas de detección para un trastorno de almacenamiento lisosomal (LSD) que se ofrecen en la actualidad se basan en el método de espectrometría de masas y los materiales descritos por Zhang et al. (Methods Mol Biol. 2010; 603: 339-350). Este método, para seis LSD (Pompe, Krabbe, Niemann-Pick A&B, Fabry, Gaucher y MPS-1), realiza los seis ensayos de actividad enzimática en seis recipientes separados usando seis condiciones distintas. Se han descrito ensayos múltiples para los mismos trastornos (Scott et al., J Pediatr. Agosto de 2013; 163(2):498-503; Spazil et al., Clin Chem. Marzo de 2013; 59(3):502-11). Los métodos múltiples requieren menos mano de obra y reactivos de laboratorio, pero generalmente es más difícil producir resultados de ensayo de calidad similar a los métodos no múltiples en los que las condiciones del análisis deben representar un compromiso que respalde la actividad adecuada de las enzimas diana mientras se suprime cualquier proceso de confusión. Se añaden diversos potenciadores y supresores de la actividad enzimática a los tampones múltiples para respaldar una condición optimizada que permita que cada una de las enzimas seleccionadas como diana actúe de manera medible sobre su sustrato artificial específico.

El ácido oleico se ha identificado como un potenciador de la enzima GALC, cuya baja actividad se asocia con la enfermedad de Krabbe (Zhang et al, ibídem; Zhang et al. Clin Chem. 2008; 54 (10): 1725-1728; Li et al., Clin Chem.

2004; 50(10): 1785-1796). Este ácido se ha añadido a los tampones para la detección de la enfermedad de Krabbe. Sin embargo, el ácido oleico es muy difícil de disolver en tampones acuosos y la concentración variable resultante en el tampón de ensayo ha conducido a resultados de ensayo con escasa reproducibilidad. Por este motivo, la mayoría de los protocolos publicados para la detección de la enfermedad de Krabbe omiten el ácido oleico, ya que los problemas de reproducibilidad superan cualquier posible ventaja de rendimiento de las actividades enzimáticas mejoradas.

Por tanto, existe la necesidad continua de mejorar los métodos y las composiciones para detectar trastornos lisosomales.

Sumario

La presente invención está definida por las reivindicaciones. El siguiente sumario se proporciona para facilitar la comprensión de algunas de las características innovadoras únicas de los procedimientos proporcionados y no pretende ser una descripción completa. Puede obtenerse una apreciación completa de los diversos aspectos de los procedimientos tomando la memoria descriptiva completa, las reivindicaciones, los dibujos y el resumen como un todo.

Se proporcionan composiciones y procedimientos mejorados para detectar reacciones enzimáticas usando sistemas de detección tal como la espectrometría de masas. Estas composiciones y procedimientos proporcionan una reactividad mejorada con una enzima diana, mejorando así la eficacia, reproducibilidad y precisión del ensayo.

Se proporcionan compuestos químicos para su inclusión en un ensayo útil para evaluar el nivel de actividad enzimática lisosomal en una muestra. Someter a prueba la actividad enzimática lisosomal es útil, por ejemplo, cuando se realizan pruebas de detección de trastornos metabólicos en recién nacidos, así como cuando se evalúa a un individuo que tiene un estado médico que afecta a la actividad enzimática o que se somete a un tratamiento médico tal como tratamiento sustitutivo enzimático, terapia génica o trasplante de médula ósea. El uso de una sal de oleato o un oleato de alquilo tal como se describe en el presente documento mejora la actividad de la enzima diana hacia sustratos sintéticos.

Un objeto de la descripción es proporcionar uno o más aditivos para una reacción adecuada para detectar la actividad de una enzima, de manera ilustrativa una enzima cuya deficiencia conduce a un trastorno de almacenamiento lisosomal. Un aditivo es opcionalmente una sal de oleato, opcionalmente oleato de sodio. Un aditivo es opcionalmente un oleato de alquilo, opcionalmente oleato de metilo. Se añaden opcionalmente uno o más aditivos a uno o más componentes de un ensayo para su almacenamiento antes de los procedimientos de ensayo, o se añaden opcionalmente al ensayo como material soluble. Como tal, se proporcionan métodos para la detección de la presencia, ausencia o nivel de una enzima, o para la detección de la presencia o ausencia de una deficiencia de enzima en un sujeto. Una enzima es opcionalmente una enzima para la que una deficiencia en la enzima conduce a un trastorno de almacenamiento lisosomal. El uso de la sal de oleato o el oleato de alquilo en un método para la detección de la presencia, ausencia o nivel de una enzima permite una mayor confianza en los resultados del ensayo a partir de la reactividad y reproducibilidad mejoradas logradas como resultado del aditivo. Un método para detectar actividad enzimática incluye poner en contacto una muestra que contiene una enzima diana con sustratos y un aditivo en condiciones en las que la enzima diana es capaz de actuar sobre el sustrato para producir un producto enzimático; y detectar el producto enzimático. Opcionalmente, dicha enzima diana es ácido p-glucocerebrosidasa, ácido galactocerebrósido p-galactosidasa o ácido p-glucocerebrosidasa.

La etapa de detectar es opcionalmente mediante espectrometría de masas, opcionalmente mediante monitorización de reacciones múltiples como en EM/EM. La etapa de detectar es opcionalmente mediante inmunoensayo, ensayo de fluorescencia de escisión de sustrato, HPLC, espectrometría de masas u otro método adecuado para detectar moléculas con un peso molecular inferior a 1000 Dalton.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 ilustra sustratos y patrones internos a modo de ejemplo usados en algunas realizaciones de un procedimiento;

la figura 2 ilustra la actividad enzimática obtenida con y sin la adición de oleato de sodio cuando se usan muestras de control con bajo contenido de enzimas;

la figura 3 ilustra la actividad enzimática obtenida con y sin la adición de oleato de sodio cuando se usan muestras de control enzimático medio en la que la columna 1 representa ABG, la columna 2 representa ASM, la columna 3 representa GALC, la columna 4 representa IDUA, la columna 5 representa GLA y la columna 6 representa GAA;

la figura 4 lustra la actividad enzimática obtenida con y sin la adición de oleato de sodio cuando se usan muestras de control enzimático alto en la que la columna 1 representa ABG, la columna 2 representa ASM, la columna 3 representa GALC, la columna 4 representa IDUA, la columna 5 representa GLA y la columna 6 representa GAA; y

la figura 5 ilustra la razón obtenida (DBS de control medio/DBS de control bajo) con y sin la adición de oleato de sodio en la que la columna 1 representa ABG, la columna 2 representa ASM, la columna 3 representa GALC, la columna 4 representa IDUA, la columna 5 representa GLA y la columna 6 representa GAA.

Descripción detallada

La siguiente descripción de realización/realizaciones particular(es) es meramente de naturaleza a modo de ejemplo y de ninguna manera pretende limitar el alcance de los procedimientos, su aplicación o usos, que pueden, por supuesto, variar. Las composiciones o procedimientos se describen en relación con las definiciones y terminología no limitativas incluidas en el presente documento. Estas definiciones y terminología no están diseñadas para funcionar como una limitación del alcance o la práctica del ensayo o sistema de ensayo, sino que se presentan únicamente con propósitos ilustrativos y descriptivos. Si bien los procedimientos o composiciones se describen como un orden de etapas individuales o usando materiales específicos, se aprecia que las etapas o materiales pueden ser intercambiables, de modo que la descripción puede incluir múltiples partes o etapas dispuestas de muchas formas, tal como lo apreciará fácilmente un experto en la técnica.

La terminología usada en el presente documento tiene el propósito de describir realizaciones particulares sólo y no pretende ser limitativa. Tal como se usa en el presente documento, las formas singulares “un/uno”, “una” y “el/la” pretenden incluir las formas plurales, incluyendo “al menos una”, a menos que el contenido indique claramente lo contrario. “O” significa “y/o”. Tal como se usa en el presente documento, el término “y/o” incluye todas y cada una de las combinaciones de uno o más de los elementos enumerados asociados. Se entenderá además que los términos “comprende” y/o “que comprende” o “incluye” y/o “que incluye” cuando se usan en esta memoria descriptiva, especifican la presencia de características, regiones, números enteros, etapas, operaciones, elementos y/o componentes declarados pero no excluyen la presencia o adición de una o más características, regiones, números enteros, etapas, operaciones, elementos, componentes y/o grupos de los mismos. El término “o una combinación de los mismos” significa una combinación que incluye al menos uno de los elementos anteriores.

A menos que se defina lo contrario, todos los términos (incluyendo los términos técnicos y científicos) usados en el presente documento tienen el mismo significado que el que entiende comúnmente un experto habitual en la técnica a la que pertenece esta divulgación. Se entenderá además que términos tales como los definidos en los diccionarios usados comúnmente, deben interpretarse como si tuvieran un significado que sea consistente con su significado en el contexto de la técnica relevante y la presente divulgación, y no se interpretarán de una manera idealizada o en un sentido demasiado formal a menos que se defina expresamente en el presente documento.

Las composiciones proporcionadas tienen utilidad como reactivos analíticos para detectar la actividad de la enzima hidrolasa, tal como las actividades enzimáticas lisosomales asociadas con los trastornos de almacenamiento lisosomal. Mediante la aplicación de una sal de ácido oleico (sal de oleato) o un oleato de alquilo, se encuentra inesperadamente que los sistemas de detección son más robustos y reproducibles, de modo que la detección de actividades enzimáticas asociadas con trastornos de almacenamiento lisosomal es más práctica y menos engorrosa.

Se proporcionan procedimientos para la detección de una o más enzimas hidrolasas. Los ejemplos ilustrativos de hidrolasas incluyen: ácido a -galactosidasa A (GLA), ácido p-glucocerebrosidasa (ABG), galactocerebrosidasa (GALC), ácido a -glucosidasa (GAA), ácido esfingomilenasa (ASM) y a -L-iduronidasa (IDUA). La acción de estas enzimas sobre un sustrato se usa para medir las actividades enzimáticas correspondientes en una muestra y, por tanto, los procedimientos pueden usarse para detectar los siguientes trastornos de almacenamiento lisosomal: Fabry (GLA); Gaucher (ABG); Krabbe (GALC); Pompe (GAA); Niemann-Pick (A o B) (ASM); y mucopolisacaridosis (IDUA).

La actividad de una enzima particular puede evaluarse por su capacidad o velocidad de actuar sobre un sustrato relacionado para producir productos enzimáticos. Al determinar la cantidad de un producto enzimático en una muestra, puede determinarse la actividad de la enzima diana. Para aplicaciones en las que se desea una evaluación cuantitativa del producto enzimático, puede incluirse en la muestra una cantidad conocida de patrón interno.

Un procedimiento para detectar la actividad de una enzima incluye: poner en contacto una muestra que contiene una enzima diana con un sustrato y una o más sales de oleato, dicha etapa de poner en contacto bajo condiciones en las que la enzima diana es capaz de actuar sobre el sustrato para producir un producto enzimático; y detectar el producto enzimático. Los inventores descubrieron sorprendentemente que, a diferencia del ácido oleico, el uso de una sal de ácido oleico produce una actividad enzimática mejorada, detección de cantidades de enzima inferiores y una mayor reproducibilidad. Esto es particularmente sorprendente dado que el ácido oleico tiene un pKa de 9,85 (Kanicky JR y Shah DO, J Colloid Interface Sci. 1 de diciembre de 2002; 256(1):201-7. Como tal, un procedimiento excluye opcionalmente la adición de ácido oleico en cualquier punto de la preparación o realización del ensayo.

Un procedimiento incluye combinar una o más sales de oleato o uno o más oleatos de alquilo con una enzima diana. Una sal de oleato incluye opcionalmente una sal monovalente o polivalente. En algunas realizaciones, una sal de oleato incluye una sal divalente. Los ejemplos ilustrativos de una sal de oleato incluyen, pero no se limitan a, oleato de sodio, oleato de potasio, oleato de litio, oleato de magnesio, oleato de calcio, oleato de zinc o cualquier combinación de dos o más de dichas sales de oleato. Opcionalmente, se incluyen 1, 2, 3, 4, 5, 6 o más sales de oleato. Opcionalmente, un procedimiento incluye combinar uno o más oleatos de alquilo con una enzima diana. Un oleato de alquilo es opcionalmente un oleato C¹-C⁴, donde el C³ o C⁴ es opcionalmente lineal o ramificado. El resto de la descripción se refiere al uso del término sal de oleato, pero se aprecia que, en cada caso, puede sustituirse o añadirse un oleato de alquilo a la sal de oleato.

Una sal de oleato se combina opcionalmente con un sustrato, un patrón interno o ambos antes de ponerse en contacto con una enzima. En algunas realizaciones, una sal de oleato se pone en contacto con un sustrato, un patrón interno, o ambos, para formar un componente de sustrato, y el componente de sustrato se somete luego a una etapa de secado. El secado se logra mediante uno o más métodos de secado reconocidos en la técnica. El secado se consigue opcionalmente por evaporación a vacío, por evaporación bajo nitrógeno u otro gas inerte, o por liofilización. Los métodos de secado de muestras se conocen bien en la técnica.

La sal de oleato y el sustrato, opcionalmente en forma de un componente de sustrato, se combinan opcionalmente con una enzima diana. Los ejemplos ilustrativos de una enzima diana incluyen, pero no se limitan aa -galactosidasa A, ácido p-glucocerebrosidasa, galactocerebrosidasa, ácido a -glucosidasa, ácido esfingomilenasa, a -L-iduronidasa o combinaciones de dos o más de las enzimas diana. Opcionalmente, se analizan 1, 2, 3, 4, 5, 6 o más enzimas diana de manera simultánea o secuencial. En algunas realizaciones, se usa un ensayo múltiple en el que se someten a ensayo dos o más enzimas simultáneamente. Opcionalmente, se analizan 2, 3, 4, 5, 6 o más enzimas simultáneamente. Opcionalmente, se analizan 1, 2, 3, 4, 5, 6 o más enzimas de manera individual o secuencial.

Las actividades de determinadas enzimas lisosomales en la sangre de un individuo pueden usarse para someter a prueba si ese individuo tiene un trastorno de almacenamiento lisosomal. Por tanto, los sustratos específicos para una o más enzimas diana se usan opcionalmente como sustrato en un procedimiento. Dichos sustratos son opcionalmente adecuados para detectar un estado médico, en particular, trastornos de almacenamiento lisosomal tales como enfermedad de Gaucher, enfermedad de Krabbe, enfermedad de Niemann-Pick, enfermedad de Pompe, enfermedad de Fabry o mucopolisacaridosis.

Si bien los procedimientos proporcionados no son tan limitados, los sustratos ilustrativos y los patrones internos adecuados para su inclusión en un procedimiento se describen en: solicitud de patente estadounidense n.°: 14/215.885; patente estadounidense n.°: 8.476.414; patente estadounidense n.°: 8.173.784; publicación estadounidense n.°: US 2012/0190043; publicación de la OMPI n.°: WO 2007/106816; Gelb et al., J Inherit. Metab. Dis., (2006) 29:397-404; Li et al., Clinical Chemistry, 50; 10:1785-1796 (2004); entre otros.

Un procedimiento incluye opcionalmente el uso de un patrón interno que se combina opcionalmente con un sustrato y una sal de oleato antes de ponerse en contacto con una o más enzimas. Un patrón interno funciona como un control experimental o patrón útil para evaluar la cantidad de producto enzimático en una muestra o recipiente de muestra. Para su uso en métodos de espectrometría de masas, un patrón interno correspondiente a un sustrato particular es opcionalmente estructuralmente idéntico a su producto enzimático (por ejemplo, porción de ácido graso), excepto que el patrón interno difiere en la razón masa/carga (m/z). Por tanto, los patrones internos incluyen opcionalmente formas modificadas de productos enzimáticos, por ejemplo, análogos de productos enzimáticos marcados con isótopos estables en los que uno o más átomos se reemplazan por isótopos atómicos correspondientes para crear una diferencia de masa detectable diferencialmente con el producto enzimático correspondiente. Cuando el patrón interno y el producto enzimático se analizan mediante espectrometría de masas, el espectro resultante revela una separación espacial del patrón interno y el producto enzimático, cada uno representado por su propio pico. La cantidad conocida de patrón interno se refleja por la magnitud del pico en su razón m/z conocida. La cantidad de producto enzimático puede evaluarse comparando la magnitud del pico en su m/z conocida, en relación con la magnitud del pico del patrón interno. Un ejemplo de marcaje isotópico para producir un patrón interno es el reemplazo de 1H con 2H (es decir, deuterio, D). Como resultado, una molécula de patrón interno “más pesada” con el 2H sustituido tiene una m/z diferente del producto enzimático, según se detecta en un espectro de masas. En una realización particular, se marca un patrón interno con deuterio para provocar un cambio de masa de 3 a 9 Dalton del producto escindido correspondiente.

Un sustrato puede usarse en una variedad de formatos físicos, por ejemplo, en disolución, en forma seca, así como unido o inmovilizado en soportes sólidos. Un soporte sólido puede componerse de un material natural o sintético, un material orgánico o inorgánico, tal como un polímero, resina, metal o vidrio, y combinaciones de los mismos. Un soporte sólido adecuado puede tener una variedad de formatos físicos, que pueden incluir, por ejemplo: una membrana; columna; una partícula hueca, sólida, semisólida, que contiene poros o cavidades, tal como una perla; un gel; una fibra, que incluye un material de fibra óptica; una matriz; y recipiente de muestra. Los ejemplos no limitativos de recipientes de muestra incluyen pocillos, tubos, capilares, viales y cualquier otro recipiente, ranura o hendidura capaz de contener una muestra. Un recipiente de muestra puede contenerse en una plataforma de muestras múltiples, tal como una microplaca, un portaobjetos, un dispositivo de microfluidos y similares. En la técnica se conocen muchas partículas adecuadas e incluyen ilustrativamente partículas codificadas de tipo Luminex®, partículas codificadas de fibra óptica, partículas magnéticas y partículas de vidrio. La interacción covalente de un sustrato y/o producto de escisión enzimática del mismo con un soporte sólido es útil para retener el sustrato y/o producto durante los procedimientos de lavado realizados en algunos formatos de ensayo, produciendo así una señal robusta y precisa de actividad enzimática.

Los procedimientos descritos en el presente documento se realizan opcionalmente en un formato múltiple de manera que se analizan simultáneamente una pluralidad de enzimas. Un ejemplo ilustrativo de un formato múltiple es la inclusión de varios sustratos diferentes, patrones internos, muestras, enzimas u otros, o combinaciones de los mismos, en una única placa de múltiples pocillos. Opcionalmente, un formato múltiple incluye la presencia de múltiples enzimas, muestras, sustratos, patrones internos, otros o combinaciones de los mismos en un sólo pocillo o recipiente de ensayo. Otro formato múltiple ilustrativo implica el uso de partículas codificadas física y/o químicamente. El uso de partículas codificadas en formatos múltiples se ha descrito, por ejemplo, en los documentos US 6.649.414 y US 6.939.720. Debido a que los códigos permiten que las partículas se distingan entre sí, puede estar presente una pluralidad de partículas distintas en una única mezcla de reacción, lo que permite analizar simultáneamente una pluralidad de diferentes muestras o diferentes enzimas. Los códigos de las partículas pueden corresponder, por ejemplo, a los orígenes de la muestra, las enzimas particulares que se van a someter a ensayo, los sustratos particulares presentes y similares, dependiendo del objetivo experimental del usuario.

Una muestra útil en los procedimientos proporcionados contiene o se sospecha que contiene una o más enzimas diana. Las enzimas diana pueden contenerse en muestras obtenidas de un individuo, así como de laboratorio o materiales sintéticos, tales como líneas celulares y fuentes de proteínas sintéticas. Las fuentes de muestra a modo de ejemplo incluyen ilustrativamente: homogeneizados de tejido; lisados de cultivos celulares; y líquidos biológicos que incluyen orina, sangre en forma líquida o seca, lágrimas, saliva y líquido cefalorraquídeo. Una muestra puede fraccionarse adicionalmente, si se desea, en una fracción que contenga tipos de células particulares. Por ejemplo, una muestra de sangre puede fraccionarse en suero o en fracciones que contienen tipos particulares de glóbulos, sanguíneos tales como glóbulos rojos o glóbulos blancos (leucocitos). Si se desea, una muestra puede ser una combinación de muestras de un sujeto, tal como una combinación de una muestra de tejido y fluido, y similares. En una realización específica, la muestra es sangre, que puede ser, por ejemplo, sangre completa o una fracción de sangre de la misma (por ejemplo, plasma o suero), o reconstituida a partir de una muestra de sangre seca.

Los métodos para obtener muestras que conserven la actividad o la integridad de las moléculas en la muestra se conocen bien por los expertos en la técnica. Tales métodos incluyen el uso de tampones y/o inhibidores apropiados, incluyendo inhibidores de nucleasa, proteasa y fosfatasa, que conservan o minimizan los cambios en las moléculas de la muestra. Tales inhibidores incluyen, por ejemplo, quelantes tales como ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), ácido etilenglicol bis(P-aminoetil éter)N,N,N1,N1-tetraacético (EGTA), inhibidores de proteasas tales como fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF), aprotinina, leupeptina, antipaína y similares, e inhibidores de fosfatasa tales como fosfato, fluoruro de sodio, vanadato y similares. Los expertos en la técnica conocen bien tampones y condiciones apropiados para aislar moléculas y pueden variarse dependiendo, por ejemplo, del tipo de molécula en la muestra que va a caracterizarse (véase, por ejemplo, Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology (suplemento 47), John Wiley & Sons, Nueva York (1999); Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988)); Harlow y Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1999); Tietz Textbook of Clinical Chemistry, 3a ed. Burtis y Ashwood, eds. W.B. Saunders, Filadelfia, (1999)). También puede procesarse una muestra para eliminar o minimizar la presencia de sustancias interferentes.

Las muestras en forma de gota de sangre seca se usan comúnmente para analizar sangre de recién nacidos y pacientes pediátricos. Para preparar estas muestras, la sangre se extrae y se retiene en papel de filtro. Para el análisis, la sangre seca se eluye opcionalmente de una porción del papel de filtro en una disolución acuosa, que contiene generalmente un tampón tal como solución salina tamponada con fosfato, HEPES, Tris, succinato u otro tampón, y opcionalmente uno o más inhibidores de proteasa. Los ejemplos específicos de condiciones inhibidoras de proteasa incluyen, por ejemplo, uno o más de los siguientes: clorhidrato de AEBSF en una concentración final de 5o a 400 |ig/ml, EDTA disódico deshidratado en una concentración final de 0,2 a 25 mg/ml, hemisulfato de leupeptina en una concentración final de 0,5 a 1 |ig/ml, y pepstatina A en una concentración final de 0,5 a 1 |ig/ml. Pueden usarse cócteles inhibidores de proteasa conocidos comúnmente usados en la técnica. El uso de una disolución de ensayo universal para extraer una única muestra de sangre seca, u otro tipo de muestra, para su posterior distribución en múltiples reacciones de ensayo, puede usarse para la detección automática y de alto rendimiento. Una sola extracción de una muestra seca evita la necesidad de obtener varios punzones de muestra de la misma muestra, o de recoger alícuotas de otras fuentes de muestra y, por consiguiente, reduce la variación provocada por la distribución no homogénea de la sangre en el papel de filtro y los errores en la transferencia de la muestra. Cuando se usan muestras secas, la eficiencia de extracción puede variar con las diferentes enzimas que van a analizarse. En estos y otros tipos de muestras, las enzimas diana pueden tener diferentes niveles de actividad cuando están contenidas en diferentes disoluciones de ensayo. Opcionalmente, se elige una composición de una disolución de ensayo universal de modo que cada enzima que va a someterse a prueba sea activa.

En algunas realizaciones, la mancha de sangre seca o un punzón derivado de ella se coloca directamente en un tampón de ensayo que incluye uno o más sustratos y una sal de oleato, y opcionalmente patrones internos, y se deja incubar durante un tiempo suficiente para permitir que las enzimas presentes en la muestra convertir el(los) sustrato(s) en producto(s) antes de la detección mediante uno o más métodos de detección.

Los sustratos y productos proporcionados pueden usarse en una variedad de formatos de ensayo. El sustrato puede detectarse en un ensayo cuando se desea observar el consumo de sustrato durante un ensayo enzimático, mientras que el producto puede detectarse en el ensayo cuando se desea observar su formación durante un ensayo enzimático. Tanto el sustrato como el producto pueden detectarse cuando se desea observar la reacción enzimática desde ambas perspectivas, por ejemplo, para confirmar que la cantidad de producto producido se correlaciona con la cantidad de sustrato consumido.

Por ejemplo, la cantidad de sustrato o producto se detecta opcionalmente usando procedimientos de espectrometría de masas en tándem establecidos. Un ensayo enzimático a modo de ejemplo que emplea espectrometría de masas se realiza opcionalmente de la siguiente manera. Se incuba una muestra con un sustrato y sal de oleato en un tampón de ensayo acuoso durante un periodo de tiempo que permite la formación de un producto enzimático. Durante el periodo de incubación, el sustrato es escindido por una enzima diana presente en una muestra de sangre para formar un producto respectivo. Luego, la reacción se extingue añadiendo un reactivo que precipita los componentes proteicos. Los reactivos a modo de ejemplo incluyen alcohol, acetonitrilo y ácido trifluoroacético diluido. Luego se transfiere una porción de la mezcla de incubación a un nuevo recipiente de ensayo. Opcionalmente, puede añadirse un reactivo de dilución tal como metanol, acetonitrilo, mezclas de agua-metanol o agua-acetonitrilo para diluir la porción transferida. La muestra así diluida reduce la cantidad de material competitivo endógeno para aumentar relativamente la sensibilidad del análisis de espectrometría de masas en tándem. Los expertos en la técnica seleccionan otros tipos de reactivos para que sean compatibles con los análisis mediante espectrometría de masas de muchas variedades u otros sistemas de detección.

En algunas realizaciones, la muestra diluida se inyecta directamente en el espectrómetro de masas en tándem o bien de manera manual o bien automática con la ayuda de inyectores automáticos y manipuladores de líquidos. Si se desea, la muestra puede derivatizarse antes del análisis. Los reactivos se seleccionan para que no sean hostiles al sistema EM/EM. Por ejemplo, los disolventes adecuados carecen de detergentes y agentes corrosivos, tales como cloroformo. El etanol puro y el metanol puro se usan a menudo simplemente porque se evaporan fácilmente en los procedimientos de secado mecánico.

El espectrómetro de masas en tándem puede configurarse para detectar simultáneamente el sustrato añadido, el producto enzimático resultante correspondiente y los patrones internos correspondientes. Tal detección se logra mediante barridos de iones originales, barridos de iones precursores o barridos de monitorización de reacciones múltiples.

En algunos aspectos, la cantidad de sustrato consumido o producto formado durante un ensayo enzimático se detecta basándose en una señal de fluorescencia del sustrato y/o producto. Tales ensayos basados en fluorescencia para trastornos de almacenamiento lisosomal se han notificado en la bibliografía (véase, por ejemplo, N. A. Chamoles et al. Clinical Chemistry, 2001; 47(12):2098-2102, y N. A. Chamoles et al. Clinical Chemistry, 2001; 47(4):780-781). Una descripción general de este enfoque es que un sustrato marcado de manera fluorescente (por ejemplo, un sustrato marcado con 4-metilumbeliferona) se introduce en una muestra de prueba que contiene la enzima y se incuba durante un tiempo suficiente, normalmente a temperatura ambiente o 37°C. Se añade una disolución de parada para detener el ensayo y ajustar el pH a 10. Las muestras se leen luego usando un fluorómetro. Las intensidades de fluorescencia registradas con las muestras de prueba se convierten en la cantidad de producto formado usando una curva de calibración de 4 MU.

La cantidad de sustrato consumido o producto formado durante un ensayo enzimático también puede detectarse usando anticuerpos y otras moléculas de unión específicas de la diana. Para los inmunoensayos, puede usarse un anticuerpo para detectar el sustrato, el producto o ambos. Los anticuerpos útiles en tales métodos pueden ser específicos, de modo que reconozcan sustratos individuales, o no específicos, de modo que reconozcan muchos o todos los sustratos. Un sustrato o producto incluye opcionalmente un marcador tal como biotina o avidina para permitir una detección específica.

El anticuerpo se produce de manera ilustrativa en animales incluyendo ratón, rata, conejo, caballo, burro u otro animal adecuado usado para la producción de anticuerpos. En algunas aplicaciones, es útil marcar un anticuerpo con un marcador detectable, tal como un marcador fluorescente. Cuando se usa un anticuerpo no marcado, la detección puede realizarse usando un anticuerpo secundario que sea específico para la especie IgG del anticuerpo primario que está marcado de manera ilustrativa con un marcador fluorescente tal como rodamina. Se aprecia en la técnica que otros sistemas de detección de anticuerpos funcionan de manera similar, tales como anticuerpos marcados con peroxidasa de rábano picante o anticuerpos marcados con fosfatasa alcalina.

Cuando se someten a prueba múltiples enzimas en una sola muestra proporcionando múltiples sustratos específicos de enzimas, pueden usarse anticuerpos que reconocen y distinguen entre los sustratos o productos de los mismos. Los complejos de anticuerpos unidos a sustratos específicos de enzimas, o productos de los mismos, pueden distinguirse entre sí usando muchos métodos. En un escenario, las muestras que contienen enzimas diana se ponen en contacto con sustratos unidos a partículas en una disolución de ensayo. En este ejemplo, cada partícula está unida a un sustrato particular y hay múltiples partículas que representan cada sustrato. Los anticuerpos que reconocen productos específicos se ponen en contacto con la disolución de ensayo. Los anticuerpos se unirán a los productos, si se producen durante el ensayo enzimático, para producir partículas que tengan anticuerpos unidos. Para distinguir diferentes productos contenidos en las partículas, los anticuerpos que tienen diferentes especificidades de producto pueden tener diferentes restos detectables, tales como diferentes marcadores fluorescentes. Como alternativa a la detección de productos enzimáticos, pueden usarse anticuerpos que reconocen el sustrato para detectar el sustrato que queda en las perlas después de la incubación con enzimas. En esta situación, cualquier producto permanecería unido a la perla, si ocurriera una reacción enzimática. En cualquier caso, el anticuerpo específico del sustrato seleccionado no reaccionaría de manera cruzada de significativamente con el producto unido a la perla.

En otro escenario, las muestras que contienen enzimas diana se ponen en contacto con sustratos unidos a partículas codificadas en una disolución de ensayo. Las partículas codificadas tienen una característica, tal como un código de barras o un perfil óptico, que les permite distinguirse entre sí. Por ejemplo, las partículas codificadas pueden tener diferentes códigos de barras correspondientes a diferentes sustratos de enzimas diana. En el ensayo, las enzimas diana actúan sobre los sustratos para producir productos. Un producto permanecería unido a la partícula, mientras que el otro producto (porción escindida) se liberaría en la disolución, o viceversa. Luego los anticuerpos que reconocen productos específicos se ponen en contacto con la disolución de ensayo. Debido a que la codificación de la partícula indica qué sustrato está unido a la partícula, los anticuerpos no necesitan ser específicos para productos particulares y, por tanto, puede usarse un tipo de anticuerpo para detectar productos derivados de múltiples sustratos diferentes. Tales anticuerpos no específicos se unirán a los productos, si se producen durante el ensayo enzimático, para producir partículas que tengan anticuerpos unidos. Las partículas que tienen anticuerpos unidos se distinguen luego de las que no tienen anticuerpos, por ejemplo, detectando un marcador en los anticuerpos o el comportamiento físico de las partículas. Los diferentes productos contenidos en las partículas unidas al anticuerpo pueden determinarse basándose en la codificación de cada partícula.

Como otro ejemplo de formato de inmunoensayo, se generan anticuerpos dirigidos a sustratos particulares. Después de la extinción de una reacción enzimática, la disolución de reacción se transfiere a una placa de microtitulación de alta unión por lo que una porción de un producto se unirá a una superficie. Los componentes de la disolución de ensayo y la enzima se eliminan mediante lavado. Luego el anticuerpo principalmente específico se incuba en cada pocillo de ensayo seguido de un lavado posterior para eliminar el anticuerpo no unido. Opcionalmente, se usa un anticuerpo secundario para la detección y cuantificación. Cuanto más producto se forma por unidad de tiempo de reacción inicial, mayor es la actividad de la enzima medida.

De manera ilustrativa, un anticuerpo no está marcado y se produce en animales incluyendo ratón, rata, conejo, caballo, burro, u otro animal adecuado usado para la producción de anticuerpos. Un anticuerpo secundario que es específico para las especies IgG del anticuerpo primario se marca de manera ilustrativa con un marcador fluorescente tal como rodamina y se usa posteriormente para la detección del sustrato restante. Se aprecia en la técnica que otros sistemas de detección de anticuerpos funcionan de manera similar tal como anticuerpos marcados de peroxidasa de rábano picante o anticuerpos marcados con fosfatasa alcalina.

En algunas realizaciones, un ensayo para enzimas diana se realiza en primer lugar obteniendo una muestra de manera ilustrativa incluyendo suero, plasma, sangre completa, urea, saliva, otros líquidos biológicos o lisados tisulares, enzima purificada recombinante o nativa en disolución, o enzima modificada química o funcionalmente en líquido biológico o medio líquido. Luego se extrae una porción de la muestra de papel de filtro y se deposita en un tubo de ensayo o pocillo de placa de microtitulación de no unión al que se añade una disolución de ensayo. La disolución de ensayo incluye uno o más tampones acuosos, un sustrato, un patrón, una sal de oleato, y opcionalmente uno o más inhibidores de proteasa. Luego se incuba la mezcla de muestras durante un periodo de tiempo determinado en el intervalo de 30 minutos a 20 horas a una temperatura particular que oscila desde 30°C hasta 41°C. Una vez que la incubación está completa, se termina la reacción enzimática mediante adición de una disolución de parada. Una disolución de parada es de manera ilustrativa glicina 0,4 M/NaOH pH 10,4 añadida a un volumen de reacción 6X. Leonard R, et al., J. Biol. Chem., 2006; 281:4867-75; Boot, RG, et al., J. Biol. Chem., 2006; 282:1305-12. La cantidad de formación de producto se determina transfiriendo un volumen conocido de muestra a un tubo de ensayo o placa de microtitulación de alta unión y se incuba durante de 5 minutos a 2 horas. El material no unido se elimina mediante lavado. La detección de los sustratos o productos intactos se realiza de manera ilustrativa usando un enfoque de enzima peroxidasa acoplado.

En un escenario adicional que usa sustratos que contienen azúcar, el nivel de producto de glucosa o galactosa liberado se mide en tiempo real mediante un enfoque de enzima acoplada. Un ejemplo no limitativo implica la liberación de glucosa a partir de un sustrato específico para la p-glucocerebrosidasa en el diagnóstico de la enfermedad de Gaucher. En este método de ensayo, se hace reaccionar la glucosa con glucosa oxidasa produciendo glucolactona y liberando peróxido de hidrógeno. El peróxido de hidrógeno liberado se detecta mediante reacción con peroxidasa para producir una molécula fluorescente que se mide en un fluorómetro convencional. Ejemplos de peroxidasas adecuadas son la peroxidasa de rábano picante o cualquier otra peroxidasa conocida en la técnica. El peróxido de hidrógeno liberado por la glucosa oxidasa interactúa con una molécula de sustrato detector. La peroxidasa cataliza la conversión de este sustrato en un producto fluorescente. Una molécula detectora adecuada para usar con los sustratos incluye Amplex Red que se oxida para producir el producto fluorescente resorufina. Amplex Red y kits para detectar glucosa libre están disponibles en Invitrogen Corp. El aumento del producto fluorescente rojo se detecta en un fluorómetro con una longitud de onda de excitación a 571 y una longitud de onda de emisión a 585 con el paso de banda establecido a 5 nm. Cuanto mayor sea la actividad glicosidasa, más rápidamente se producirá el producto rojo fluorescente.

En algunas realizaciones, se generan múltiples sustratos para diferentes enzimas lisosomales con estructura(s) única(s). Esto evita la inhibición del producto de una enzima que es particularmente importante si la actividad catalítica de una enzima hacia un sustrato es mucho mayor que la actividad catalítica de la otra enzima para su sustrato correspondiente. Esto es adicionalmente importante en condiciones en las que se analiza una única glicosidasa mutante en un panel de sustratos para 6 o más enzimas lisosomales. El producto formado por las otras enzimas lisosomales puede inhibir la función de la enzima de menor actividad, de modo que su actividad no se mide con precisión. Por tanto, se aprecia que la especificidad del sustrato y el producto para cada enzima son opcionalmente distintos.

El enfoque descrito para someter a ensayo enzimas usando sustrato y compuestos convencionales puede expandirse para someter a ensayo una pluralidad de enzimas simultáneamente en una sola reacción, obviando la necesidad de múltiples ensayos para ayudar a confirmar los diagnósticos de trastornos médicos. Los procedimientos también pueden usarse para medir varias enzimas simultáneamente al evaluar la tasa de flujo químico a través de una ruta bioquímica específica o para monitorizar rutas de señalización bioquímica. Debido a la alta sensibilidad de la detección por espectrometría de masas que puede emplearse usando los compuestos descritos en el presente documento, que sólo pueden requerir cantidades de submicrogramos de los reactivos de sustrato por ensayo, la síntesis de varios cientos de reactivos de sustrato en una escala de gramos baja se vuelve práctica y económica.

En diversas realizaciones, se miden simultáneamente la actividad de dos, tres, cuatro, cinco, seis o más enzimas lisosomales mediante el uso de sustratos tal como se proporcionan.

Como otro formato de ejemplo para su uso con los sustratos proporcionados, los sustratos pueden marcarse con el mismo fluoróforo, pero poseen características de masa o carga significativas que los diferencian entre sí. La cantidad de producto producido después de una reacción de escisión enzimática se detecta mediante cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) de fase inversa. Las reacciones se extinguen mediante la adición de alcohol, acetonitrilo o ácido trifluoroacético diluido. Una parte de la mezcla de incubación se transfiere a un nuevo recipiente de ensayo al que se le añade una disolución pura como metanol, acetonitrilo, mezclas de agua y metanol o agua y acetonitrilo. Los productos de reacción y el sustrato sin reaccionar se separan en una columna de HPLC C¹⁸ de 5 |im de tamaño de partícula y se detectan mediante un detector fluorescente o un conjunto de detectores. La cantidad de producto se calcula basándose en una curva de calibración generada usando cantidades crecientes del producto relevante.

Se aprecia en la técnica que, opcionalmente, se detectan simultáneamente múltiples sustratos para múltiples enzimas mediante un método cromatográfico. Si se usan sustratos con características de retención o masa suficientemente diferentes, cada producto puede resolverse, por ejemplo, en una columna de HPLC y puede cuantificarse en un único ensayo. Alternativamente, cada sustrato se marca con un fluoróforo diferente que tiene propiedades de excitación o emisión diferentes o iguales. La detección puede realizarse mediante una familia de detectores fluorescentes que pueden cuantificar simultáneamente productos individuales entre sí y su correspondiente sustrato marcado. Otros métodos de detección son igualmente adecuados y se conocen en la técnica.

Todos los reactivos, incluyendo los sustratos, los productos enzimáticos y los estándares internos, pueden purificarse opcionalmente mediante HPLC de fase inversa y caracterizarse mediante ESI-EM, o bien en un ensayo de HPLC-EM en línea o bien fuera de línea mediante la recogida de las fracciones apropiadas.

Un procedimiento incluye la etapa de poner en contacto en una disolución que incluye un tampón acuoso. Un tampón acuoso tiene opcionalmente un pH entre 4 y 5. Un pH es opcionalmente desde 4,5 hasta 5. Un pH es opcionalmente de 4,5 a 4,7. Un pH es opcionalmente de 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9 ó 5,0. Cualquier agente tampón adecuado que funcione para actuar como tampón en el intervalo de pH deseado es adecuado para su uso como tampón acuoso. Los ejemplos ilustrativos de tampones incluyen ácido succínico, acetato, citrato, PIPES u otros tampones que se usan opcionalmente.

En algunas realizaciones, se forma un componente de sustrato antes de la etapa de poner en contacto el sustrato con la enzima diana. Un componente de sustrato incluye opcionalmente un sustrato, una sal de oleato, opcionalmente un patrón interno y un tampón acuoso. Una combinación de sustrato seco, sal de oleato y opcionalmente patrón interno se resuspende opcionalmente en un tampón acuoso y se almacena durante un tiempo de almacenamiento antes de entrar en contacto con una muestra o enzima diana. El tiempo de almacenamiento es opcionalmente de desde 1 minuto hasta 8 semanas. Se ha demostrado que el componente de sustrato resultante es estable durante 8 semanas o más cuando se almacena a temperatura ambiente aislado de la luz.

Un componente de sustrato se pone en contacto opcionalmente con una muestra que puede contener o no una o más enzimas diana en condiciones en las que la enzima diana es capaz de actuar sobre el sustrato para producir un producto enzimático. La etapa de poner en contacto es opcionalmente durante un tiempo de reacción. El tiempo de reacción es opcionalmente de desde 1 minuto hasta 48 horas o más. Opcionalmente, el tiempo de reacción es de desde 10 hasta 20 horas. Se aprecia que cuando se detectan cantidades bajas de enzima, pueden usarse tiempos de reacción más largos. Después de un tiempo de reacción, una muestra se extingue opcionalmente para detener la reacción. Una disolución de parada es opcionalmente acetato de etilo/metanol 50:50 u otra disolución de inactivación adecuada.

Los siguientes ejemplos no limitativos ilustran diversos aspectos. Los ejemplos tienen fines ilustrativos y no son una limitación de ninguna práctica de los presentes procedimientos. Se entenderá que pueden realizarse variaciones y modificaciones sin apartarse del espíritu y alcance de la descripción. Los reactivos ilustrados en el presente documento están disponibles comercialmente o se sintetizan fácilmente mediante métodos bien conocidos a partir de precursores fácilmente disponibles comercialmente, y un experto en la técnica comprenderá fácilmente dónde pueden obtenerse tales reactivos.

Ejemplos

Ejemplo 1: Detección de actividad enzimática en una muestra.

Se disolvieron los sustratos artificiales (S) y los patrones internos deuterados (IS) (figura 1) así como el oleato de sodio (CarboSynth, 97%, 143-19-1) en metanol de calidad para CL-EM. Se transfirió una alícuota de esta disolución madre premezclada a un vial de vidrio de 40 ml y se secó en un concentrador SAVANT SPEEDVAC (Thermo Fisher) para producir un vial que contenía material estable en las cantidades indicadas en la tabla 1.

Tabla 1: Cantidad de sustrato, patrón interno y oleato de sodio usados para producir un cóctel de ensayo suficiente para analizar 960 muestras.

Cantidad por vial de 960 muestras

Sustrato mg

ABG-S 9,00

ASM-S 13,92

GAA-S 7,62

GALC-S 16,08

GLA-S 25,56

IDUA-S 4,96

IS mg

ABG-IS 0,26

ASM-IS 0,20

GAA-IS 0,40

GALC-IS 0,14

GLA-IS 0,39

IDUA-IS 0,21

Aditivo mg

Oleato de sodio 42,9

En una botella separada de 60 ml, se prepararon 40 ml de un tampón de ácido succínico 85 mM, pH 4,7, que contenía los aditivos enumerados en la tabla 2 para producir un tampón de ácido succínico de trabajo. Se logró la preparación del cóctel de ensayo añadiendo 33 ml del tampón de ácido succínico de trabajo 85 mM al vial de vidrio que contenía los componentes secos. Se sonicó el vial durante 10 minutos en un baño de agua (VWR-modelo 75D) seguido de un suave balanceo durante 20 minutos hasta que todo el material se disolvió por completo. Se envolvió el vial del cóctel de ensayo en papel de aluminio y se almacenó a temperatura ambiente protegido de la luz durante un máximo de ocho semanas.

Tabla 2: Concentraciones y proveedores de aditivos usados en tampón de ácido succínico 85 mM, pH 4,7.

Aditivo Concentración Proveedor Número de cat.

Acarbosa 8 |il Carbosynth OA00002

W-acetilglucosamina 50 mM Carbosynth MA04390

Mono hidrato de ácido D-sacárico-1,4-lactona 40 |iM Sigma S0375

Taurocolato de sodio 15 mg/ml Carbosynth FS10907

Cloruro de zinc 0,6 mM Sigma 229997

Se obtuvo la sangre mediante venopunción de humanos adultos que lo consintieron y se secó con papel de filtro para formar manchas de sangre secas. Se elaboran las gotas de sangre seca para los controles de CDC esencialmente tal como se describe en Jesus et al., Clinical Chemistry, 55:1 (2009) 158-164. Brevemente, se combinan diferentes razones de sangre con leucocitos reducidos obtenida mediante venopunción de humanos adultos que lo consienten con sangre del cordón umbilical sin procesar a diversos niveles para ajustar la cantidad de enzima diana. Tales muestras también pueden obtenerse de sangre de adultos inalterada o sangre de recién nacidos, opcionalmente obtenida de una punción en el talón. Se cargaron placas para la incubación con un disco de 3 mm de diámetro de muestra de sangre seca (DBS) con las muestras de ejemplar de DBS deseadas según el mapa de placa deseado usando un perforador DBS (PerkinElmer 1296-071) en una placa NUNC de polipropileno de 96 pocillos de 0,5 ml (Thermo, 267245). A cada pocillo, se le añadieron 30 |il de cóctel de ensayo y se sellaron las placas con papel de aluminio adhesivo (Starseal, E2796-9792). Las placas se incubaron durante 18 horas a 37°C con agitación de 400 rpm usando un agitador de incubadora TRINEST (PerkinElmer, 1296-0050). Después de 18 horas, se extinguieron las placas añadiendo una alícuota de 100 |il de una mezcla 50:50 de acetato de etilo/metanol (calidad para CL-EM o equivalente) a cada pocillo y luego mezclando diez veces con la pipeta. Se transfirió la disolución de incubación desde la placa de polipropileno de 0,5 ml hasta una placa de pocilios profundos de 1 ml (Thermo Nunc, 260252), asegurándose de transferir toda la mezcla de disolvente a la placa de pocillos profundos dejando atrás el DBS.

Se logró la limpieza de la muestra añadiendo en primer lugar 400 | l de acetato de etilo (calidad para CL-EM o equivalente) a la disolución de incubación seguido de 200 | l de agua (tipo 1 o mejor). Las dos capas se mezclaron por aspiración veinte veces hasta que se observó una emulsión. Se cubrió la placa de pocillos profundos de 1 ml con el papel de aluminio adhesivo y se centrifugó (Rotanta 460 R) durante 5 minutos a 690 x g. Se transfirió una alícuota de 75 | l de la fase orgánica que se separa en la parte superior de la capa acuosa a una placa NUNC de 0,5 ml (Thermo, 267245) y se secó durante 5-10 minutos usando aire comprimido. Se reconstituyeron las muestras añadiendo 150 | l de un disolvente de flujo que consistía en el 84% de acetonitrilo con ácido fórmico al 0,1% (JT Baker, 53673) y el 16% de agua con ácido fórmico al 0,1% (JT Baker, 52116). Se sellaron las placas con una lámina de aluminio no adhesiva y luego se agitaron a 400 rpm durante 10 minutos a temperatura ambiente. Se analizaron las muestras mediante FIA-EM/EM (Waters Acquity TQD) usando las transiciones descritas en la tabla 3, así como los parámetros de sintonización global y los ajustes de entrada indicados en la tabla 4.

Tabla 3: Transiciones de EM para patrones internos, IS y productos, P, detectados en el ensayo.

MRM Compuesto original (m/z) Compuesto derivado (m/z)

ABG-IS 391,4 271,3

ABG-P 384,3 264,3

ASM-IS 405,4 264,3

ASM-P 398,4 264,3

GAA-IS 503,4 403,3

GAA-P 498,3 398,3

GALC-IS 417,4 264,3

GALC-P 412,4 264,3

GLA-IS 489,3 389,3

GLA-P 484,3 384,2

IDUA-IS 431,3 322,2

IDUA-P 426,2 317,2

Tabla 4: Parámetros de ajuste global y configuraciones de entrada usados con el Acquity TQD.

Parámetros de ajuste global Configuración de entrada

Parámetro Confi uración Tiempo min Tasa de fluo mL/min Curva

Voltaje capilar 4 kV - 0,10 -Temp. de fuente 80°C 0,05 0,10 11 Temp. de desolvatación 170°C 0,10 0,03 11 Gas de desolvatación 1000 l/hora 0,65 0,50 11 Gas de cono 50 l/hora 0,90 0,10 11

1,00 0,10 11

Se calcularon las áreas máximas de los productos y los patrones internos usando el programa NeoLynx. Se calculó la actividad enzimática (Ae, |mol/l/h) usando la razón P/IS en la siguiente ecuación (Ec. 1), donde P/IS la razón de intensidades obtenidas a partir de EM/EM, [IS] es la concentración de IS usada, VIS es el volumen de IS usado, t es el tiempo de incubación y Vdbs es el volumen de sangre obtenido a partir de DBS usado en el ensayo. Para un punzón DBS de 3 mm, VDBS= 3 |l:

Una comparación entre dos ensayos que sólo difirieron por la adición o falta de oleato de sodio mostró que la actividad enzimática de las ceramidas (ABG, a Sm y GALC) mejoró cuando estaba presente oleato de sodio tal como se ilustra en la tabla 5 y las figuras 1-4.

Tabla 5: Actividad enzimática obtenida usando un cóctel de ensayo con y sin oleato de sodio con DBS de control del Centro de Control de Enfermedades, Programas de Estandarización y Garantía de Calidad de Laboratorio.

Actividad enzimática (|i mol/l/h) ABG ASM GALC IDUA GLA GAA DBS de bajo control del CDC (con oleato de sodio) 0,95 0,16 0,45 0,72 1,00 0,99 % de CV 10% 12% 8% 3% 3% 4% DBS de bajo control del CDC (sin oleato de sodio) 0,60 0,17 0,38 0,68 1,06 0,94 % de CV 19% 11% 9% 3% 12% 6% Ganancia de oleato de sodio 159% 95% 118% 107% 95% 105% DBS de medio control del CDC (con oleato de sodio) 5,44 1,29 3,22 5,86 6,57 7,08 % de CV 12% 13% 6% 7% 5% 6% DBS de medio control del CDC (sin oleato de sodio) 2,85 1,00 2,34 4,82 6,08 5,87 % de CV 13% 7% 6% 14% 9% 18% Ganancia de oleato de sodio 133% 116% 115% DBS de alto control del CDC (con oleato de sodio) 11,46 2,54 6,72 11,95 13,15 13,48 % de CV 2% 4% 3% 1% 2% 3% DBS de alto control del CDC (sin oleato de sodio) 7,05 2,18 5,35 10,77 12,68 12,29 % de CV 6% 6% 4% 4% 2% 3% Aumento de oleato de sodio 117% 111% 104% 110% DBS de medio/bajo control del CDC (con oleato de sodio) 5,8 8,0 7,1 8,1 6,5 7,2 DBS de medio/bajo control del CDC (sin oleato de sodio) 4,8 5,9 6,1 7,1 5,8 6,2 Ganancia de oleato de sodio 136% 117% 114% 114% 115%

Usando DBS de control del Centro de Control de Enfermedades (CDC), donde se realizaron controles altos usando muestras de sangre de cordón combinadas de presuntos recién nacidos sanos, los controles medios se elaboraron diluyendo la sangre del cordón umbilical con concentrado de glóbulos rojos para que la actividad de la enzima diana fuera del 50% de la de los controles altos, y los controles bajos se diluyeron adicionalmente para obtener una actividad enzimática diana del 5% de la del control alto. La adición de oleato de sodio amplía la brecha entre el DBS de control bajo y el DBS de control medio en aproximadamente un 25% para las ceramidas. Esto distingue mejor las muestras de lSd (baja actividad) de recién nacidos sanos en el ensayo de 6 plex.

Claims (15)

1. REIVINDICACIONES

   i. Procedimiento para detectar actividad enzimática in vitro, que comprende:

   poner en contacto una muestra que contiene una enzima diana con un sustrato y una o más sales de oleato, en el que dicha sal de oleato se selecciona del grupo que consiste en oleato de sodio, oleato de potasio, oleato de magnesio, oleato de calcio, oleato de zinc u oleato de litio, dicha etapa de poner en contacto en condiciones en las que la enzima diana es capaz de actuar sobre el sustrato para producir un producto enzimático y en el que dicha enzima diana es ácido a -galactosidasa A, ácido p-glucocerebrosidasa, galactocerebrosidasa, ácido a -glucosidasa, ácido esfingomilenasa, a -L-iduronidasa, o combinaciones de las mismas; y detectar dicho producto enzimático, en el que el procedimiento excluye la adición de ácido oleico en cualquier punto en la preparación para o realización del ensayo; en el que dicho sustrato y la sal de oleato se combinan y se secan antes de dicha puesta en contacto; y en el que la etapa de poner en contacto es en un tampón acuoso.
2. 2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicha sal de oleato comprende una sal monovalente.
3. 3. Procedimiento según la reivindicación 2, en el que dicha sal monovalente es sodio, potasio o litio.
4. 4. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicha sal de oleato comprende una sal divalente.
5. 5. Procedimiento según la reivindicación 4, en el que dicha sal divalente es magnesio, calcio o zinc.
6. 6. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que dicha etapa de detectar es mediante espectrometría de masas.
7. 7. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, que comprende además poner en contacto dicha muestra con un patrón interno.
8. 8. Procedimiento según la reivindicación 7, en el que dicho patrón interno comprende un 2H.
9. 9. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, que comprende además diagnosticar a un sujeto con un trastorno de almacenamiento lisosomal.
10. 10. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 5, en el que dicho tampón acuoso comprende ácido succínico.
11. 11. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 5, en el que dicho tampón acuoso tiene un pH de 4,3 a 5,0.
12. 12. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 5, en el que dicha etapa de poner en contacto comprende además añadir un patrón interno a dicho sustrato y dicha sal de oleato antes de secar.
13. 13. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 5, que comprende además combinar dicho componente de sustrato y dicho tampón acuoso antes de dicha etapa de poner en contacto.
14. 14. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 5, en el que dicha etapa de detectar es mediante espectrometría de masas.
15. 15. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, que comprende además diagnosticar a un sujeto a partir del que se deriva dicha muestra con la presencia o ausencia de un trastorno de almacenamiento lisosomal.