KR20170129620A - Lrp-1을 유효성분으로 포함하는 방사선 저항성 암 진단용 또는 방사선 치료 예후 예측용 바이오마커 조성물 - Google Patents

Lrp-1을 유효성분으로 포함하는 방사선 저항성 암 진단용 또는 방사선 치료 예후 예측용 바이오마커 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 LRP-1을 유효성분으로 포함하는 방사선 저항성 암 진단용 바이오마커 조성물 및 이를 이용한 방사선 저항성 암 진단 방법에 관한 것으로서, 방사선 저항성 대장암 조직을 특이적으로 표적하는 특정 펩타이드 서열이 실제 결합하는 결합 상대 단백질인 LRP-1에 대해 규명하고, 이를 기반으로 암에 대한 방사선 치료 저항성 관련 인자로서의 가능성을 제시하였다.

Description

LRP-1을 유효성분으로 포함하는 방사선 저항성 암 진단용 또는 방사선 치료 예후 예측용 바이오마커 조성물{Biomarker composition for diagnosing radiation resistant cancer or predicting prognosis of radiation therapy comprising LRP-1}
본 발명은 저밀도 지단백질 수용체-관련 단백질 1(Low density lipoprotein receptor-related protein 1; LRP-1)을 유효성분으로 포함하는 방사선 저항성 암 진단용 바이오마커 조성물 및 이를 이용한 방사선 저항성 암 진단 방법에 관한 것이다. 또한, LRP-1을 유효성분으로 포함하는 암 환자의 방사선 치료 예후 예측용 바이오마커 조성물 및 이를 이용한 암 환자의 방사선 치료 예후 예측 방법에 관한 것이다.
인간의 몸을 구성하고 있는 가장 작은 단위인 세포는 정상적일 때 세포 내 조절기능에 의해 분열하며 성장하고 죽어 없어지기도 하면서 세포 수 균형을 유지한다. 어떤 원인으로 세포가 손상을 받는 경우, 치료를 받아 회복하여 정상적인 세포로 역할을 하게 되지만, 회복이 안 된 경우는 스스로 죽게 된다. 그러나 여러 가지 이유로 인해 이러한 증식과 억제가 조절되지 않는 비정상적인 세포들이 과다하게 증식할 뿐만 아니라 주위 조직 및 장기에 침입하여 종괴 형성 및 정상 조직의 파괴를 초래하는 상태를 암(cancer)이라 정의한다. 암은 이렇듯 억제가 안 되는 세포의 증식으로, 정상적인 세포와 장기의 구조와 기능을 파괴하기에 그 진단과 치료의 중요성은 매우 크다.
한편, 암 발병환자 개개인의 유전적 차이로 인해 치료 반응성이 달라 환자별 치료 사례가 달라짐에 따라 치료 시 문제점이 있다. 이에 암 환자의 효과적인 치료를 위해 방사선 반응성에 따라 달라지는 암 미세환경 및 그에 따른 바이오마커 개발이 요구되고 있으며, 이를 통하여 환자 개인별 맞춤형 진단 및 치료를 구현할 수 있다.
PCT 공개특허 WO2014-100717 (2014.06.26)
본 발명은 LRP-1을 유효성분으로 포함하는 방사선 저항성 암 진단용 바이오마커 조성물, LRP-1의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 방사선 저항성 암 진단용 조성물, 이를 이용한 방사선 저항성 암 진단 방법, LRP-1 단백질 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 암세포에 대한 방사선 민감성 증진용 약학조성물 및 LRP-1 단백질의 발현 수준 측정을 통한 암세포에 대한 방사선 민감성 증진제 스크리닝 방법을 제공하고자 한다.
또한, 본 발명은 LRP-1을 유효성분으로 포함하는 암 환자의 방사선 치료 예후 예측용 바이오마커 조성물, LRP-1의 발현수준을 측정할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 암 환자의 방사선 치료 예후 예측용 조성물 및 이를 이용한 암 환자의 방사선 치료 예후 예측 방법을 제공하고자 한다.
상기 과제의 해결을 위해, 본 발명은 저밀도 지단백질 수용체-관련 단백질 1(Low density lipoprotein receptor-related protein 1; LRP-1) 또는 이를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 방사선 저항성 암 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 LRP-1의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 방사선 저항성 암 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 LRP-1의 발현 수준을 측정하여 방사선 저항성 암 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 LRP-1 단백질 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 암세포에 대한 방사선 민감성 증진용 약학조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 LRP-1 단백질의 발현 수준 측정을 통한 암세포에 대한 방사선 민감성 증진제 스크리닝 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 LRP-1 또는 이를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 암 환자의 방사선 치료 예후 예측용 바이오마커 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 LRP-1의 발현수준을 측정할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 암 환자의 방사선 치료 예후 예측용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 LRP-1의 발현 수준을 측정하여 암 환자의 방사선 치료 예후 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명은 LRP-1을 유효성분으로 포함하는 방사선 저항성 암 진단용 또는 방사선 치료 예후 예측용 바이오마커 조성물에 관한 것으로서, 방사선 저항성 대장암 조직을 특이적으로 표적하는 특정 펩타이드 서열이 실제 결합하는 결합 상대 단백질인 LRP-1에 대해 규명하고, 이를 기반으로 암에 대한 방사선 치료 저항성 관련 인자 또는 암 환자의 방사선 치료 예후 예측 인자로서의 가능성을 제시하였다.
도 1은 인간 유래 대장암 cDNA 라이브러리에서 바이오패닝 진행을 나타낸 결과이다. 총 3회 바이오패닝 과정을 진행하였고, 횟수가 증가함에 따라 파아지 수가 특이적으로 증가함을 확인하였다.
도 2는 환자 대장암 조직을 이식한 마우스 모델 구축에 대한 모식도를 나타낸 결과이다.
도 3은 스크리닝한 14개의 결합 상대 단백질 후보군 중 유의미한 mRNA 발현 차를 나타낸 7개의 후보군을 검증한 결과이다.
도 4는 방사선 조사 여부에 따른 mRNA 발현 차 확인에서 선별된 2개의 후보군에 대해 단백질 수준에서의 발현 차이를 확인한 결과이다. 2개 후보군 중 오직 LRP-1 만이 발현차를 확인하여 해당 결과만을 표기하였다. 방사선 저항성 및 민감성 각각 2 케이스에 대해 방사선 조사 여부에 따른 단백질 발현 여부를 확인하였다.
도 5는 방사선 저항성 및 민감성 대장암에서 LRP-1에 대한 조직학적 검증 결과이다.
도 6은 면역침강법을 이용해 LRP-1과 TPSFSKI 펩타이드의 결합을 규명한 결과이다. Lysate: 0 Gy/2 Gy 방사선 조사 대장암 조직 추출 단백질, IP(B5 phage): 0 Gy/2 Gy 방사선 조사 대장암 조직 추출 단백질에서 특정 펩타이드 파아지로 면역 침강, IP(wt phage): 0 Gy/2 Gy 방사선 조사 대장암 조직 추출 단백질에서 펩타이드 없는 파아지로 면역 침강, IP(w/o Ab): 0 Gy/2 Gy 방사선 조사 대장암 조직 추출 단백질에서 항체 없이 면역 침강, phage lysate: 방사선 저항성 대장암 조직에서 방사선 조사시 표적하는 펩타이드 파아지 추출 단백질, Antibody: LRP-1 항체.
도 7은 실제 환자 대장암 조직 4케이스 (방사선 저항성 2케이스, 방사선 민감성 2케이스)에서 LRP-1의 발현을 확인한 결과이다. 환자 암조직 이식 마우스 모델에서 적출한 암조직과 동일한 암조직 형태임을 확인함과 동시에, 방사선 저항성 케이스에서는 LRP-1이 과발현됨을 확인한 반면, 민감성 케이스에서는 발현하지 않음을 확인하였다.
도 8은 대장암 환자 중 방사선치료를 수행한 환자로서 치료 예후가 나쁜 환자 20명의 암조직을 제공받아 LRP-1의 발현 여부를 검증한 결과이다. 방사선치료 예후가 좋지 못한 환자의 암조직에서 명확하게 LRP-1이 과발현되었음을 확인하였다.
도 9는 in silico 분석을 통해 실제 대장암환자 중 방사선치료를 수행한 환자의 예후를 확인한 결과이다. LRP-1의 발현이 높을 경우, 방사선치료 예후가 좋지 않았음을 임상데이터를 통해 확인하였다.
본 발명은 저밀도 지단백질 수용체-관련 단백질 1(Low density lipoprotein receptor-related protein 1; LRP-1) 또는 이를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 방사선 저항성 암 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다.
본 발명의 "저밀도 지단백질 수용체-관련 단백질 1(Low density lipoprotein receptor-related protein 1; LRP-1)"은 NCBI accession no. NM_002332 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 바이오마커 조성물은 기존에 알려진 방사선 저항성 바이오마커를 추가적으로 더 포함할 수 있으며, 기존에 알려진 방사선 저항성 바이오마커는 CD133, CD144 및 CD24 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 LRP-1은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드(TPSFSKI)와 결합할 수 있으며, 상기 "TPSFSKI" 펩타이드는 방사선 저항성 대장암을 표적으로 하는 펩타이드로서, 본 발명자들이 출원한 한국특허출원 제10-2015-0106580호에 자세히 개시되어 있다.
본 명세서에서 용어 “진단”은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링하는 것)을 포함한다.
또한, 본 발명은 LRP-1의 발현수준을 측정할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 방사선 저항성 암 진단용 조성물을 제공한다.
상세하게는, 상기 LRP-1의 발현수준을 측정할 수 있는 제제는 상기 LRP-1 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브, 상기 LRP-1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 펩타이드, 앱타머 또는 화합물일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 방사선 저항성 암 진단용 키트를 제공한다.
본 명세서에서 용어 "프라이머"는 짧은 자유 3-말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사을 위한 시작 지점으로서 작용하는 짧은 핵산 서열을 말한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약(즉, DNA 폴리머라제 또는 역전사효소) 및 상이한 4 가지의 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 기술에 따라 적절히 선택될 수 있다.
본 명세서에서 용어 "프로브"는 mRNA외 특이적으로 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무, 발현양을 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single strand DNA) 프로브, 이중쇄DNA(double strand DNA)프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 적절한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당해 기술 분야에 공지된 기술에 따라 적절히 선택할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "항체"는 당해 기술분야에 공지된 용어로서 항원성 부위에 대하여 지시되는 특이적인 면역 글로불린을 의미한다. 본 발명에서의 항체는 본 발명의 LRP-1에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 당해 기술분야의 통상적인 방법에 따라 항체를 제조할 수 있다. 상기 항체의 형태는 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체를 포함하며, 모든 면역글로불린 항체가 포함된다. 상기 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2 개의 전체 길이의 중쇄를 갖는 완전한 형태를 의미한다. 또한, 상기 항체는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함된다.
또한, 본 발명의 키트는 마커 성분에 특이적으로 결합하는 항체, 기질과의 반응에 의해서 발색하는 표지체가 접합된 2차 항체 접합체(conjugate), 상기 표지체와 발색 반응할 발색 기질 용액, 세척액 및 효소반응 정지용액 등을 포함할 수 있으며, 사용되는 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.
본 명세서에서 용어 "펩타이드"는 표적 물질에 대한 결합력 높은 장점이 있으며, 열/화학 처리시에도 변성이 일어나지 않는다. 또한 분자 크기가 작기 때문에 다른 단백질에 붙여서 융합 단백질로의 이용이 가능하다. 구체적으로 고분자 단백질 체인에 붙여서 이용이 가능하므로 진단 키트 및 약물전달 물질로 이용될 수 있다.
본 명세서에서 용어 "앱타머(aptamer)"란, 그 자체로 안정된 삼차 구조를 가지면서 표적 분자에 높은 친화성과 특이성으로 결합할 수 있는 특징을 가진 특별한 종류의 단일가닥 핵산(DNA, RNA 또는 변형핵산)으로 구성된 폴리뉴클레오티드의 일종을 의미한다. 상술한 바와 같이, 앱타머는 항체와 동일하게 항원성 물질에 특이적으로 결합할 수 있으면서도, 단백질보다 안정성이 높고, 구조가 간단하며, 합성이 용이한 폴리뉴클레오티드로 구성되어 있으므로, 항체를 대체하여 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 (1) 암 환자에서 분리된 시료로부터 LRP-1 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 LRP-1 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; (2) 상기 LRP-1 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 LRP-1 단백질의 발현 수준을 대조군 시료와 비교하는 단계; 및 (3) 상기 LRP-1 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 LRP-1 단백질의 발현 수준이 대조군 시료보다 높을 경우 방사선 저항성 암이라고 판단하는 단계를 포함하는 방사선 저항성 암 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
상세하게는, 상기 mRNA 발현 수준을 측정하는 방법은 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(Competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR (Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅 (Northern blotting) 및 DNA 칩을 이용하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
상세하게는, 상기 단백질 발현 수준을 측정하는 방법은 웨스턴 블랏, ELISA(enzyme linked immunosorbent asay), 방사선면역분석(Radioimmunoassay; RIA), 방사면역확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케이트(rocket) 면역전기영동, 조직면역염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation assay), 보체고정분석법 (Complement Fixation Assay), FACS 및 단백질 칩을 이용하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 용어 "암 환자에서 분리된 시료"란 방사선 저항성 암 진단용 바이오 마커인 상기 LRP-1 유전자 또는 LRP-1 단백질의 발현 수준에 있어서 대조군과 차이가 나는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액, 또는 뇨와 같은 시료를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 “방사선 저항성 암 진단”은 암 환자의 방사선 치료 전략 및 방사선 치료 효과에 대한 예측을 위해 암세포가 방사선에 저항성인지 또는 민감성인지를 확인하기 위함이다.
또한, 본 발명은 LRP-1 단백질 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 암세포에 대한 방사선 민감성 증진용 약학조성물을 제공한다.
상세하게는, 상기 LRP-1 단백질 발현 억제제는 LRP-1 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오타이드, 작은 간섭 RNA(small interfering RNA; siRNA) 또는 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA; shRNA)일 수 있고, 상기 LRP-1 단백질 활성 억제제는 LRP-1 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 앱타머, 항체 또는 천연물일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 약학 조성물은 화학물질, 뉴클레오타이드, 안티센스, siRNA 올리고뉴클레오타이드 및 천연물 추출물을 유효성분으로 포함할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물 또는 복합 제제는 유효 성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등의 가용화제를 사용할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 투여를 위해서 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1 종 이상 포함하여 약학 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 약제 제제 형태는 과립제, 산제, 피복정, 정제, 캡슐제, 좌제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 및 활성 화합물의 서방출형 제제 등이 될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물의 유효성분의 유효량은 질환의 예방 또는 치료 요구되는 양을 의미한다. 따라서, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 이에 제한되는 것은 아니나, 예컨대, 성인의 경우, 1일 1회 내지 수회 투여시, 본 발명의 조성물은 1일 1회 내지 수회 투여시, 화합물일 경우 0.1ng/kg~10g/kg, 폴리펩타이드, 단백질 또는 항체일 경우 0.1ng/kg~10g/kg, 안티센스 뉴클레오타이드, siRNA, shRNAi, miRNA일 경우 0.01ng/kg~10g/kg의 용량으로 투여할 수 있다.
또한, 본 발명은 (1) 암세포에 시험물질을 접촉시키는 단계; (2) 상기 시험물질을 접촉한 암세포에서 LRP-1 단백질의 발현 또는 활성 정도를 측정하는 단계; 및 (3) 대조구 시료와 비교하여 상기 LRP-1 단백질의 발현 또는 활성 정도가 감소한 시험물질을 선별하는 단계를 포함하는 암세포에 대한 방사선 민감성 증진제 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 스크리닝 방법을 언급하면서 사용되는 용어 "시험물질"은 유전자의 발현량에 영향을 미치거나, 단백질의 발현 또는 활성에 영향을 미치는지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 후보 물질을 의미한다. 상기 시료는 화학물질, 뉴클레오타이드, 안티센스-RNA, siRNA(small interference RNA) 및 천연물 추출물을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 LRP-1 또는 이를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 암 환자의 방사선 치료 예후 예측용 바이오마커 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 용어 “예후 예측”은 질환의 경과 및 결과를 미리 예측하는 행위를 의미한다. 보다 구체적으로, 예후 예측이란 질환의 치료 후 경과는 환자의 생리적 또는 환경적 상태에 따라 달라질 수 있으며, 이러한 환자의 상태를 종합적으로 고려하여 치료 후 병의 경과를 예측하는 모든 행위를 의미하는 것으로 해석될 수 있다.
본 발명의 목적상 상기 예후 예측은 암 환자의 방사선 치료 후, 질환의 경과 및 완치여부를 미리 예상하여 암 환자의 무병생존율 또는 생존율을 예측하는 행위로 해석될 수 있다. 예를 들어, "예후가 좋다"라고 예측하는 것은 방사선 치료 후 암 환자의 무병생존율 또는 생존율이 높은 수준을 나타내어, 암 환자가 치료될 가능성이 높다는 것을 의미하고, "예후가 나쁘다"라고 예측하는 것은 방사선 치료 후 암 환자의 무병생존율 또는 생존율이 낮은 수준을 나타내어, 암 환자로부터 암이 재발하거나 또는 암으로 인하여 사망할 가능성이 높다는 것을 의미한다.
또한, 본 발명은 LRP-1의 발현수준을 측정할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는암 환자의 방사선 치료 예후 예측용 조성물을 제공한다.
상세하게는, 상기 LRP-1의 발현수준을 측정할 수 있는 제제는 상기 LRP-1 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브, 상기 LRP-1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 펩타이드, 앱타머 또는 화합물일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 암 환자의 방사선 치료 예후 예측용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 (1) 암 환자에서 분리된 시료로부터 LRP-1 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 LRP-1 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; (2) 상기 LRP-1 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 LRP-1 단백질의 발현 수준을 대조군 시료와 비교하는 단계; 및 (3) 상기 LRP-1 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 LRP-1 단백질의 발현 수준이 대조군 시료보다 높을 경우 방사선 치료 예후가 나쁘다고 판단하는 단계를 포함하는 암 환자의 방사선 치료 예후 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
상세하게는, 상기 mRNA 발현 수준을 측정하는 방법은 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(Competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR (Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅 (Northern blotting) 및 DNA 칩을 이용하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
상세하게는, 상기 단백질 발현 수준을 측정하는 방법은 웨스턴 블랏, ELISA(enzyme linked immunosorbent asay), 방사선면역분석(Radioimmunoassay; RIA), 방사면역확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케이트(rocket) 면역전기영동, 조직면역염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation assay), 보체고정분석법 (Complement Fixation Assay), FACS 및 단백질 칩을 이용하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 "암" 또는 "암세포"는 유방암, 자궁경부암, 신경교종, 뇌암, 흑색종, 폐암, 방광암, 전립선암, 백혈병, 신장암, 간암, 대장암, 췌장암, 위암, 담낭암, 난소암, 임파종, 골육종, 자궁암, 구강암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 피부암, 혈액암, 갑상선암, 부갑상선암 또는 요관암이거나, 이의 암세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
< 실시예 1> 인간 대장암 유래 cDNA 라이브러리 스크리닝
T7Select® Human colon tumor cDNA Library(Novagen)를 구입하여 방사선 저항성 대장암을 표적하는 특정 펩타이드 서열(TPSFSKI; 한국특허출원 제10-2015-0106580호)의 결합 상대 단백질을 스크리닝하였다. 구체적으로 3번의 바이오패닝 과정을 반복하여 결합 상대 단백질 후보군을 선택하도록 디자인하여, 보다 특이적으로 결합하는 후보군을 선별하였다. 총 3회의 바이오패닝 과정 종료 후, 서열분석 및 BLAST를 이용하여 가능성 있는 후보군 정보를 획득하였다. 상기 후보군 정보를 도 1에 나타내었다.
< 실시예 2> 환자 대장암 조직 이식 마우스 모델 구축
환자 대장암 조직 중 방사선 저항성 케이스 조직을 누드마우스에 계대배양하였다. 암조직은 넙적다리 피하에 조직 1개씩 이식하였다. 약 1개월 (4주) 까지 암 조직의 성장을 관찰하며 암 조직의 크기가 약 100 mm3 정도 성장하였을 때, 암 조직에만 국소적으로 2 Gy의 방사선을 조사하고, 24 시간 회복시간을 가진 후에 실험에 사용하였다. 방사선 조사군의 대조군으로 동일 마우스 모델에서 방사선 조사만 하지 않은 마우스 모델 (0 Gy)도 준비하였다. 또한 방사선 저항성 대장암 케이스 뿐만 아니라 방사선 민감성 대장암 케이스도 같은 방법으로 이식 및 계대배양 하였으며, 방사선 조사 역시 동일 조건에서 실시하여 준비하였다. 마우스 모델 구축관련한 모식도를 도 2에 나타내었다.
< 실시예 3> 결합 상대 단백질 후보군의 유의적 mRNA 발현 차 확인
결합 상대 단백질 후보군의 선별 및 검증을 위해 방사선 민감성, 저항성 대장암 케이스 및 방사선 조사 여부에 따른 유의적 mRNA 발현차를 확인하고자 Q-PCR 기법을 이용하였다. 스크리닝을 통해 얻은 14개의 결합 상대 단백질 후보군 유전자에 대한 프라이머를 제작하였다. 또한, 실시예 2에서 구축한 모델에서 암조직을 적출하여 동결보관 후, 각각 mRNA를 정제하고 cDNA를 합성하였다. 이를 이용하여 Quantitative PCR (Q-PCR)를 실시하였고, 14개 후보군 중 방사선 조사 여부에 따라 유의한 발현 차를 보인 7개의 후보군을 선별하였다. 해당 후보군에 대한 재현성을 확인한 결과, 그중 유의적 발현 차가 가장 큰 2개의 후보군을 증명하였고, 상기 결과를 도 3에 나타내었다.
< 실시예 4> 결합 상대 단백질 후보군의 방사선 조사 여부에 따른 단백질 발현 차 확인
mRNA 유의적 발현 차에 따라 검증된 2개 후보군에 대해 단백질 수준에서도 유의미한 발현 차를 증명하기 위해 western boltting 기법을 실시하였다. 동결보관 조직에서 단백질을 추출하고, 각 후보군의 항체를 이용하여 방사선 조사에 따른 단백질 발현 차를 확인하였다. 2개 후보군 중, 오직 LRP-1 만이 방사선 조사 여부에 따른 유의적 단백질 발현 차를 검증할 수 있었으며, 다른 후보군 하나는 방사선 조사 여부에 상관 없이 단백질 레벨을 확인할 수 없어 후보군에서 제외하였다. 또한 스크리닝 및 계속 검증단계에서 사용한 방사선 저항성 대장암 케이스 뿐만 아니라 추가적으로 방사선 민감성 대장암 2 케이스 및 방사선 저항성 대장암 1 케이스를 추가하여 단백질 발현 차를 확인하였다. LRP-1의 경우, 방사선 민감성 케이스에서는 방사선 조사 여부에 따른 유의적 발현차를 확인할 수 없었으며, 다른 방사선 저항성 대장암 케이스에서는 방사선 조사 여부에 따라 유의미한 발현 차를 보임을 재차 검증하였다. 상기 결과를 도 4에 나타내었다.
< 실시예 5> LRP -1의 조직학적 검증
mRNA 및 단백질 레벨에서 유의적 발현 차를 확인한 LRP-1에 대한 조직학적 검증을 위해 IHC 염색 기법을 실시하였다. 방사선 저항성 및 민감성 대장암 각 2 케이스를 방사선 조사 여부에 차이를 두어 조직 절편을 제작하였고, 해당 조직 절편에서 LRP-1 항체를 이용하여 염색한 후 존재 여부를 검증하였다. 상기 실시예 4에서 단백질 발현 차 검증과 상동함을 규명함으로써 LRP-1이 TPSFSKI 펩타이드의 결합 상대 단백질임을 뒷받침하였다. 이를 도 5에 나타내었다.
< 실시예 6> TPSFSKI 펩타이드 파아지와 LRP -1의 실제 결합 여부 규명
상기 실시예 3 내지 실시예 5에서 LRP-1이 TPSFSKI 펩타이드 서열의 결합 상대 단백질임을 간접적으로 검증함을 토대로, 실제 TPSFSKI 서열과 LRP-1이 결합하는지 직접적인 규명을 위해 면역침강법 (immunoprecipitation assay)을 실시하였다. 방사선 조사 여부에 따른 각 케이스 별 대장암 조직에서 각각 단백질을 추출하고, LRP-1 및 M13 항체와 IgG bead를 이용하여 면역침강법을 실시하였다. 면역 침강의 확인은 western boltting을 통해 확인하였으며, 이를 통해 LRP-1이 TPSFSKI 펩타이드의 결합 상대 단백질임을 직접적으로 규명하였다. 상기 결과를 도 6에 나타내었다.
< 실시예 7> 실제 환자 대장암 조직에서 LRP -1의 발현 여부 확인
상기 실시예 4 내지 실시예 6에서 활용한 암조직은 환자 대장암 조직 이식 마우스 모델에서 적출한 암조직이다. 상기 암조직의 원래 주인인 환자 대장암 조직에서 LRP-1의 발현 여부 및 케이스 별 발현 차이를 검증하였다. 관련 기관의 승인을 받아, 서울아산병원 병리과로부터 해당 환자의 실제 암조직 파라핀 절편 슬라이드를 제공 받았으며, 이에 대한 조직학적 검증을 IHC 염색 기법을 통해 실시하였다. 이를 통해 상기 실시예 4 및 도 5와 연관성 있는 결과를 얻었으며, 실제 임상에서도 LRP-1의 적용이 가능함을 검증하였다. 상기 결과를 도 7에 나타내었다.
< 실시예 8> 방사선 저항성 대장암 환자 암조직에서 LRP -1의 발현 여부 검증
실시예 7과 더불어 실제 방사선치료를 수행한 환자 중, 방사선치료 예후가 나쁜 환자 대장암 조직 20케이스에서 LRP-1의 발현 여부를 검증하였다. 검증 방법은 실시예 7과 동일하게 IHC 염색기법으로 검증하였으며, 그 결과 방사선치료 예후가 나쁜 대장암 환자 암조직에서 LRP-1이 과발현됨을 확인하였다. 뿐만 아니라 임상 데이터 분석을 통해 방사선치료를 수행한 대장암 환자에서 LRP-1 발현 여부에 따른 예후를 분석하였다. 그 결과, LRP-1의 발현이 높을 경우 예후가 매우 좋지 못함을 확인하였다. 상기 결과를 도 8과 도 9에 나타내었다.
이상으로 본 발명을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> University of Ulsan Foundation For Industry Cooperation THE ASAN FOUNDATION <120> Biomarker composition for diagnosing radiation resistant cancer comprising LRP-1 <130> ADP-2017-0209 <150> KR 10-2016-0060323 <151> 2016-05-17 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> human <400> 1 Thr Pro Ser Phe Ser Lys Ile 1 5

Claims (20)

  1. 저밀도 지단백질 수용체-관련 단백질 1(Low density lipoprotein receptor-related protein 1; LRP-1) 또는 이를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 방사선 저항성 암 진단용 바이오마커 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 바이오마커 조성물은 CD133, CD144 및 CD24로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방사선 저항성 암 진단용 바이오마커 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 LRP-1은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드와 결합하는 것을 특징으로 하는 방사선 저항성 암 진단용 바이오마커 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 대장암인 것을 특징으로 하는 방사선 저항성 암 진단용 바이오마커 조성물.
  5. LRP-1의 발현수준을 측정할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 방사선 저항성 암 진단용 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 LRP-1의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제는 상기 LRP-1 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브, 상기 LRP-1 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 펩타이드, 앱타머 또는 화합물인 것을 특징으로 하는 방사선 저항성 암 진단용 조성물.
  7. 제5항에 있어서, 상기 암은 대장암인 것을 특징으로 하는 방사선 저항성 암 진단용 조성물.
  8. 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 방사선 저항성 암 진단용 키트.
  9. (1) 암 환자에서 분리된 시료로부터 LRP-1 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 LRP-1 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계;
    (2) 상기 LRP-1 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 LRP-1 단백질의 발현 수준을 대조군 시료와 비교하는 단계; 및
    (3) 상기 LRP-1 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 LRP-1 단백질의 발현 수준이 대조군 시료보다 높을 경우 방사선 저항성 암이라고 판단하는 단계를 포함하는 방사선 저항성 암 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 암은 대장암인 것을 특징으로 하는 방사선 저항성 암 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
  11. LRP-1 단백질 발현 또는 활성 억제제를 유효성분으로 포함하는 암세포에 대한 방사선 민감성 증진용 약학조성물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 LRP-1 단백질 발현 억제제는 LRP-1 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오타이드, 작은 간섭 RNA(small interfering RNA; siRNA) 및 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA; shRNA)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 암세포에 대한 방사선 민감성 증진용 약학조성물.
  13. 제11항에 있어서, 상기 LRP-1 단백질 활성 억제제는 LRP-1 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 앱타머, 항체 및 천연물로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 암세포에 대한 방사선 민감성 증진용 약학조성물.
  14. 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암세포는 대장암세포인 것을 특징으로 하는 암세포에 대한 방사선 민감성 증진용 약학조성물.
  15. (1) 암세포에 시험물질을 접촉시키는 단계;
    (2) 상기 시험물질을 접촉한 암세포에서 LRP-1 단백질의 발현 또는 활성 정도를 측정하는 단계; 및
    (3) 대조구 시료와 비교하여 상기 LRP-1 단백질의 발현 또는 활성 정도가 감소한 시험물질을 선별하는 단계를 포함하는 암세포에 대한 방사선 민감성 증진제 스크리닝 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 암세포는 대장암세포인 것을 특징으로 하는 암세포에 대한 방사선 민감성 증진제 스크리닝 방법.
  17. LRP-1 또는 이를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 암 환자의 방사선 치료 예후 예측용 바이오마커 조성물.
  18. LRP-1의 발현수준을 측정할 수 있는 제제를 유효성분으로 포함하는 암 환자의 방사선 치료 예후 예측용 조성물.
  19. 제18항에 따른 조성물을 포함하는 암 환자의 방사선 치료 예후 예측용 키트.
  20. (1) 암 환자에서 분리된 시료로부터 LRP-1 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 LRP-1 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계;
    (2) 상기 LRP-1 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 LRP-1 단백질의 발현 수준을 대조군 시료와 비교하는 단계; 및
    (3) 상기 LRP-1 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 LRP-1 단백질의 발현 수준이 대조군 시료보다 높을 경우 방사선 치료 예후가 나쁘다고 판단하는 단계를 포함하는 암 환자의 방사선 치료 예후 예측에 필요한 정보를 제공하는 방법.
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