JP4759277B2 - 観察方法および観察補助具 - Google Patents

Description

この発明は、生体等の試料を生きたまま（in vivo）観察するための観察方法および観察補助具に関するものである。

近年、光学顕微鏡を用いて蛍光プローブによるイオン濃度、膜電位などの可視化が行われるようになっており、例えば、神経細胞などの生体機能観察、特に動的挙動の観察が行われるようになっている。
このような動的挙動を観察するものとしては、顕微鏡写真撮影装置が知られている（例えば、特許文献１参照。）。
特開２０００−２７５５３９号公報

しかしながら、このような従来の顕微鏡写真撮影装置は、試料としての生体の動的な挙動に合わせて写真を撮影するものであるが、カメラの焦点距離を一定に保ちながら、試料の動的な挙動の内の、ピントの合う静止状態を選択的に撮影するものであるため、得られる画像は細切れになり、特に、動いている状態の試料の様子を観察することができないという問題がある。

また、現実に生きたままの試料の動いている状態を観察しようとする場合、呼吸動作、拍動等の脈動によって、試料が３次元的に動くために、画像にブレが生じてしまう不都合がある。画像のブレは、特に、カメラの光軸に対して交差する方向に試料が動いてしまう場合に発生する。しかしながら、試料の動きに合わせてリアルタイムにカメラを含む観察光学系の光軸を移動させることは、装置を複雑化させてしまう不都合があるとともに、特に、試料の拡大観察を行う顕微鏡装置の場合には非現実的である。

この発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、試料の動きに合わせてリアルタイムに観察光学系を動作させることなく、画像に発生するブレを低減し、見やすい観察画像を得ることができる観察方法および観察補助具を提供することを目的としている。

上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、脈動する生体を観察するための観察方法であって、顕微鏡の観察範囲内に配される前記生体の表面に、外部から視覚可能な指標部材を固定し、該指標部材を含む前記生体の表面を所定時間間隔をあけて撮像し、取得された複数の画像を処理して前記指標部材の観察光学系の光軸方向から見た動作軌跡を計算し、前記光軸方向から見た複数の動作軌跡の内、前記生体の観察対象部位における該指標部材の前記光軸方向から見た動作軌跡が最も短くなるように、前記観察光学系の光軸を固定して観察を行う観察方法を提供する。

本発明によれば、試料の表面に指標部材を固定することにより、試料の各部が変位すると、その変位に伴って指標部材が変位させられる。指標部材は外部から視覚可能なので、観察範囲内に配される指標部材の動きを追うことで、試料の動作方向を容易に検出することが可能となる。この場合において、所定時間間隔をあけて指標部材を含む試料の表面を撮像することにより、取得された複数の画像から指標部材の動作軌跡を容易に計算することができる。そして、観察対象部位における動作軌跡が最も短くなる位置に観察光学系の光軸を固定することにより、観察対象部位が観察光学系の光軸に対して交差する方向に変位する量を抑制して、ブレを抑えた観察画像を得ることができる。

また、本発明の参考例として、脈動する生体を観察するための観察方法であって、顕微鏡の観察範囲内に配される前記生体の表面に、外部から視覚可能な指標部材を固定し、該指標部材を含む前記生体の表面を所定時間にわたって撮像し、取得された複数の画像を、前記指標部材が各画像間で一致するように画像自体を並進あるいは回転移動させる処理をして得られた補正画像に基づいて観察を行う観察方法を提供する。
本発明の参考例によれば、所定時間にわたって取得された複数の画像において、指標部材が一致するように事後的に処理することにより、指標部材が移動しないように複数の画像が連続する補正画像を得ることができる。したがって、この補正画像に基づいて観察を行うことにより、指標部材の近傍に配されている観察対象部位のブレも抑えることができ、観察を容易に行うことができる。

また、本発明は、脈動する生体を観察するための観察方法であって、顕微鏡の観察範囲内に配される前記生体の表面に、外部から視覚可能な指標部材を固定し、該指標部材を含む前記生体の表面を撮像する各時点において、得られる画像上の前記指標部材が観察光学系の光軸方向から見て一致するように観察光学系の光軸を変位させて観察を行う観察方法を提供する。
このようにすることで、指標部材の近傍に配されている観察対象部位のブレを抑えた画像を得ることができ、観察を容易に行うことが可能となる。

また、本発明は、上記いずれかの観察方法において前記指標部材として用いられる観察補助具であって、顕微鏡の観察範囲内に収容される外形寸法を有するとともに、外部から視覚可能な指標部と、該指標部を前記観察範囲内に配される試料に固定する固定部とを備える観察補助具を提供する。
本発明によれば、試料の表面に観察補助具を振りかけると、観察補助具の固定部によって外部から視覚可能な指標部が試料の表面に固定される。これにより、試料が変位すると、これに伴って、顕微鏡の観察範囲内において指標部が変位するので、指標部の変位方向を追うことによって、試料の変位方向を簡易に知ることができる。したがって、指標部の追跡によって試料の変位方向を予め検出することで、観察光学系の光軸に対して試料がずれない方向に光軸を配置することや、試料の変位にリアルタイムに追随してブレを抑えた観察画像を取得することが可能となる。

上記発明においては、前記指標部が、回転非対称な形状を有することが好ましい。
回転非対称な形状を有することにより、試料の回転変位をも容易に検出することができる。

また、上記発明においては、前記固定部が、試料の表面に接着される接着面からなることとしてもよい。
試料表面の水分による接着や、試料表面と接着面との化学反応等による接着によって、より堅固に指標部を試料に固定することができる。試料が激しく変位しても、指標部がずれることを防止して、指標部によって、より正確に試料の変位を表示させることができる。

また、上記発明においては、前記固定部が、前記指標部に一体的に固定され、該指標部より面積の大きなシート状の透明部材からなることとしてもよい。
透明部材が試料に密着することにより、指標部が接触する場合よりも接触面積を増大させることができ、試料表面との間の摩擦力や接着力を増大させて、指標部をより確実に試料表面に固定した状態に維持することができる。シート状の透明部材で構成することによって、軽量に、かつ、試料を覆って遮ることのないように指標部を配置することが可能となる。

また、上記発明においては、前記指標部が、３次元的な形状を有することとしてもよい。
このようにすることで、光軸に対する試料表面の倒れを検出するために、指標部の側面を利用することが可能となる。
また、上面部の面積、形状の変化を測定することによっても試料表面の移動方向を得ることが可能となる。

また、上記発明においては、前記指標部が、観察範囲内に複数配置されることとしてもよい。
複数の指標部の相対位置関係を監視することによっても、試料の変位方向を容易に知ることができる。この場合には、各指標部は回転対称の形状をしていてもよい。

本発明によれば、試料の表面の変位をより簡易かつ確実に表示させて、容易に検出できるようにすることで、観察光学系の光軸に交差する方向への試料の変位が最も少なくなるように光軸を配置したり、観察光学系の光軸に交差する方向への試料の変位が最も少なくなるように観察光学系を追従させたり、あるいは、得られた画像を事後的に画像処理する際に、指標部を目印にしてブレの補正を行うことができる。その結果、ブレを抑制した見やすい観察画像を得ることができるという効果を奏する。

以下、本発明の第１の実施形態に係る観察方法について、図１〜図８を参照して説明する。
本実施形態に係る観察方法は、図１および図２に示されるような予め定められた外形寸法を有する直方体状の観察補助具５０を、観察対象である生体Ａの組織表面に固定し、所定の時間間隔をあけて観察補助具５０を含む組織表面の観察範囲を撮像することにより複数の画像を取得し、取得された複数の画像を処理して、観察補助具５０の動作軌跡Ｑを計算し（図７参照。）、生体Ａの観察対象部位における動作軌跡Ｑが最も短くなる位置に測定ヘッド３の光軸Ｃ２を固定して観察を行うものである（図３および図４参照。）。

観察補助具５０は、金属、樹脂等からなり、外部から容易に視覚可能な色彩、例えば、原色あるいは蛍光色を有する本体５０ａを備えている。また、観察補助具５０は、観察範囲に対して十分に小さい形状を有し、観察範囲内の生体Ａの表面に固定されても、観察対象部位を覆い隠したり、観察の邪魔になったりしない程度の外径寸法を有している。

また、観察補助具５０の本体５０ａの表面には、切開して露出させられた生体Ａの組織表面の水分と化合して組織表面に観察補助具５０を密着状態に固定する吸水性の接着層５０ｂが、全面にわたってコーティングされている。これにより、観察補助具５０は、生体Ａと接触する接触面が固定部５０Ａを構成し、それ以外の表面が、観察のための指標となる指標部（指標部材）５０Ｂを構成するようになっている。

本実施形態に係る観察方法を実施する観察装置１は、例えば、図３および図４に示されるように、観察対象である生体Ａを載置するステージ２と、ステージ２に対向配置される測定ヘッド３と、レーザ光源４および光検出器５を備える光学ユニット６と、これら測定ヘッド３と光学ユニット６とを接続する光ファイバ７と、測定ヘッド３の姿勢を変更可能に支持する姿勢変更機構８と、姿勢変更機構８の動作を制御する制御装置９とを備えている。

前記ステージ２は、ベース１０に対して該ステージ２を鉛直軸線Ｃ１回りに回転させるステージ回転機構２ａを備えている。測定ヘッド３を固定し、ステージ回転機構２ａを作動させることで、生体Ａを全周にわたって異なる角度方向から観察することができるようになっている。

前記測定ヘッド３は、ステージ２に対向する先端に配置された対物光学系１１と、該対物光学系１１を取り付ける筐体１２内に配置されたコリメート光学系１３、光走査部１４、瞳投影光学系１５および結像光学系１６を備えている。コリメート光学系１３は光ファイバ７により伝播されてきたレーザ光を平行光に変換するようになっている。光走査部１４は図中には模式的に示しているが、例えば、２枚のガルバノミラーを直交する２軸回りにそれぞれ揺動させることでコリメート光学系１３からの平行光を２次元的に走査させることができるようになっている。

前記瞳投影光学系１５は光走査部１４により走査されたレーザ光を集光させて中間像を結像させるようになっている。前記結像光学系１６は、中間像を結像したレーザ光を集光させて平行光に変換するようになっている。
前記対物光学系１１は、ステージ２に搭載された生体Ａに近接して配置され、結像光学系１６からの平行光を集光して生体Ａの表面あるは生体Ａの内部組織に設定した焦点位置に再結像させるようになっている。

また、測定ヘッド３内には、瞳投影光学系１５から光走査部１４側に戻る戻り光の光路中に挿脱可能に配されるミラー１７と、該ミラー１７が光路中に挿入されたときに、該ミラー１７により対物光学系１１の光軸Ｃ２に沿って照明光を入射させる照明光学系１８と、ミラー１７により反射された生体Ａからの戻り光を撮像する撮像光学系１９とを備えている。

照明光学系１８は、ＬＥＤ等の光源１８ａと、光源１８ａから発せられた光を平行光にするコリメートレンズ１８ｂと、平行光に変換された光源１８ａからの光をミラー１７に入射させるハーフミラー１８ｃとを備えている。撮像光学系１９は、集光レンズ１９ａとＣＣＤカメラ１９ｂとを備えている。
さらに、測定ヘッド３には、生体Ａの対物光学系１１の光軸Ｃ２方向に沿う変位に応じて焦点位置を調節するようコリメート光学系１３を光軸方向に移動させるオートフォーカス機構２１が備えられている。

前記光学ユニット６はレーザ光源４から発せられたレーザ光を平行光に変換するコリメートレンズ２２と、該レーザ光を反射するとともに光学ユニット６に戻ってきた戻り光を透過させるダイクロイックミラー２３と、該ダイクロイックミラー２３によって反射されたレーザ光を光ファイバ７の端面７ａに集光させる集光レンズ２４と、ダイクロイックミラー２３を透過した戻り光を光検出器５に集光する集光レンズ２５とを備えている。光検出器５は、例えば、光電子増倍管である。光検出器５には、制御装置９内の画像処理装置（図示略）を介してモニタ２６が接続され、撮像された画像がモニタ２６に表示されるようになっている。

前記光ファイバ７は、前記光学ユニット６および測定ヘッド３に接続され、光学ユニット６から送られるレーザ光を伝播して測定ヘッド３内に入射させるとともに、測定ヘッド３から戻る戻り光を伝播して光学ユニット６内に入射させるようになっている
前記姿勢変更機構８は、例えば、水平軸線Ｃ３回りに回転可能な回転アーム２７と、該回転アーム２７の先端に取り付けられ回転アーム２７の長手方向に沿う方向およびそれに直交する方向にそれぞれ測定ヘッド３を移動させる２軸の直動機構２８とを備えている。

回転アーム２７は、モータ２９によって、鉛直面内において揺動可能に設けられている。直動機構２８は、例えば、モータ３０と、ボールネジ３１と、図示しないリニアガイドによって支持されボールネジ３１によって直線移動させられるスライダ３２とを備えている。

前記制御装置９は、前記ＣＣＤカメラ１９ｂに接続され、所定の時間間隔をあけて少なくとも２枚の画像を取得するようになっている。ＣＣＤカメラ１９ｂにより最初の画像が取得されると、制御装置９は、まず、取得された画像において観察補助具５０を抽出するようになっている。観察補助具５０は、外部から視覚可能な色彩を有しているので、その色彩あるいは輝度により容易に抽出することができる。

次いで、制御装置９は、抽出された観察補助具５０が、取得された複数の画像間において、どのように移動したのかを示す、観察補助具５０の動作軌跡を計算するようになっている。ＣＣＤカメラ１９ｂにより撮像する画像数が、例えば、２枚の場合には、その２枚の画像を重ねて、対応する観察補助具５０の中心どうしを結ぶことにより動作軌跡が計算される。そして、画像中における観察対象部位、例えば、画像の中心位置近傍における動作軌跡が最も短くなるように、姿勢変更機構８を作動させるようになっている。

また、本実施形態においては、観察補助具５０が予め定められた外形寸法を有しているので、取得した複数の画像を処理して抽出された観察補助具５０の大きさを比較することにより、生体Ａの表面が対物光学系１１の光軸Ｃ２方向に変位している変位量を検出することができるようになっている。なお、大きさの比較をさらに容易にするために、観察補助具５０の表面に目盛を設けておいてもよい。また、画像処理に代えて、実際に生体Ａの表面と対物光学系１１の距離とを測定する距離センサ（図示略）を設け、オートフォーカス機構２１を作動させることにしてもよい。

本実施形態に係る観察装置１により、マウス等の実験小動物のような生体Ａを生きたままで観察するには、まず、生体Ａの表皮を切開して露出させた組織表面に、複数片の観察補助具５０を振りかける。観察補助具５０の表面には、接着層５０ｂがコーティングされているので、観察補助具５０のいずれかの表面が組織表面に接触すると、当該接触面の接着層５０ｂが組織表面に配されている水分を吸水して組織表面に接着する。これにより、観察補助具５０は生体Ａの表面に対して固定され、生体Ａの変位に伴って変位するようになる。

この状態で、測定ヘッド３内において、光走査部１４と瞳投影光学系１５との間にミラー１７を挿入して、光源１８ａからの光を、コリメートレンズ１８ｂ、ハーフミラー１８ｃ、ミラー１７、瞳投影光学系１５、結像光学系１６および対物光学系１１を介して生体Ａに照射し、対物光学系１１、結像光学系１６、瞳投影光学系１５、ミラー１７、ハーフミラー１８ｃを介して戻る生体Ａからの戻り光を集光レンズ１９ａにより集光してＣＣＤカメラ１９ｂにより撮像する。

撮像は、例えば、時間間隔をあけて２回行われる。そして、制御装置９の作動により、ＣＣＤカメラ１９ｂによって撮像された２枚の画像中の対応する観察補助具５０が抽出され、その動作軌跡が計算される。

具体的には、撮像された２枚の画像Ｇにおいて所定値以上の輝度を有する観察補助具５０を、図５に示されるように抽出する。ここでは、説明の容易のために画像Ｇを視覚的に示すが、本実施形態においては、この過程の画像をモニタ２６に表示する必要は必ずしもなく、計算上において行えばよい。図中、符号Ｂは観察対象部位である。そして、２枚の画像Ｇを図６に示されるように重ね合わせ、対応する観察補助具５０，５０′の中心点どうしを図７に示されるように接続することにより、動作軌跡Ｑを算出することができる。

図７においては、観察対象部位Ｂ内における動作軌跡Ｑは、画像Ｇ中の最も短い動作軌跡ではなく、生体Ａは、観察対象部位Ｂにおいて対物光学系１１の光軸Ｃ２に対して交差する方向に移動していることになる。このまま観察作業を行うと、観察対象部位Ｂの画像においてブレが生ずることになるので、計算された複数の観察補助具の動作軌跡Ｑの内、観察対象部位Ｂにおける動作軌跡Ｑが最も短くなるように、姿勢変更機構８が作動させられる。

本実施形態においては姿勢変更機構８は、回転アーム２７と２軸の直動機構２８とから構成されているため、対物光学系１１の焦点位置を固定したままの状態で、回転アーム２７の回転面に平行な平面内において測定ヘッド３の光軸Ｃ２の角度を、任意に調節することができる。また、それ以外の方向に、測定ヘッド３の光軸Ｃ２の角度を変更したい場合には、ステージ回転機構２ａの作動により、ステージ２を鉛直軸線Ｃ１回りに回転させる。これにより、生体Ａに対して任意の３次元方向に光軸Ｃ２の姿勢を調節することが可能となる。

そして、これにより、図８に示されるように、観察対象部位Ｂにおける観察補助具が移動しないように測定ヘッド３の光軸Ｃ２の姿勢が調節され、３次元的に変位している生体Ａは、当該観察対象部位Ｂにおいては測定ヘッド３の光軸Ｃ２に沿う方向にのみ変位するようになる。
この状態で、測定ヘッド３内において、光走査部１４と瞳投影光学系１５との間からミラー１７を抜き出して、光学ユニット６を作動させ、レーザ光源４からレーザ光を出射すると、出射されたレーザ光が、コリメートレンズ２２、ダイクロイックミラー２３および集光レンズ２４を経て光ファイバ７の端面７ａに集光されて入射される。

光ファイバ７内に入射されたレーザ光は、光ファイバ７内を伝播させられて測定ヘッド３に伝達され、測定ヘッド３内のコリメート光学系１３、光走査部１４、瞳投影光学系１５、結像光学系１６および対物光学系１１を経て、生体Ａ内に設定された焦点位置に結像される。レーザ光が照射されることにより生体Ａの内部組織において発生した蛍光は、対物光学系１１、結像光学系１６、瞳投影光学系１５、光走査部１４およびコリメート光学系１３を介して光ファイバ７内を伝播して戻り、光学ユニット６の集光レンズ２４によって平行光に変換された後に、ダイクロイックミラー２３を通過させられて集光レンズ２５により光検出器５に入射される。光検出器５における検出信号は、制御装置９に送られ、画像処理されて蛍光画像としてモニタ２６に表示されることになる。

この場合において、本実施形態に係る観察装置１によれば、観察対象部位Ｂの観察に先立って、制御装置９により、観察対象部位Ｂが光軸Ｃ２方向にのみ変位するように、生体Ａに対して測定ヘッド３の光軸Ｃ２方向が設定されるので、観察中に光軸Ｃ２を固定したままの状態に維持することができ、ブレを抑えた蛍光画像を得ることができる。また、観察補助具５０の大小を画像処理により比較することで、生体Ａ表面の測定ヘッド３の光軸Ｃ２方向に沿う変位を検出し、それに応じてオートフォーカス機構２１を作動させるだけで、観察対象部位Ｂに対してピントを合わせた状態に維持することができる。したがって、鮮明な蛍光画像を得ることができるという利点がある。なお、共焦点効果を利用して生体Ａ内部を撮像する場合には、検出する表面位置と対物光学系１１の焦点位置とをずらしておくことにより、生体Ａ内部の所定の深さ位置に焦点位置を固定した状態で共焦点観察を行うことが可能となる。

このように、本実施形態に係る観察装置１によれば、例えば、マウスのような生体Ａの観察対象部位Ｂが、呼吸動作等の周期的な変位を伴う場合においても、観察に先立って、予めその観察対象部位Ｂの３次元的な変位方向に測定ヘッド３の光軸Ｃ２を沿わせて固定しておくので、生体Ａの変位による画像Ｇのブレを極力抑えることができる。そして、光軸Ｃ２方向に沿う観察対象部位Ｂの変位に対しては、抽出された観察補助具の大きさを比較した結果得られる光軸Ｃ２方向の変位量を補償するように、オートフォーカス機構２１を作動させることにより、常に焦点位置を観察対象部位Ｂに一致させた状態に維持することができる。その結果、ブレおよびボケのない鮮明な画像Ｇが得られることになる。

なお、上記実施形態においては、ＣＣＤカメラ１９ｂへの光路と光学ユニット６への光路とをミラー１７の挿脱により切り替える構造を例示したが、これに限定されるものではない。例えば、ＣＣＤカメラ１９ｂへの切替時に、倍率の小さな対物光学系に同時に切り替えることにより、測定ヘッド３の光軸Ｃ２合わせ作業時には、比較的広い範囲を撮像してその動作軌跡Ｑを確認し、光学ユニット６を用いた観察時には、倍率の大きな対物光学系１１に切り替えることで、狭い範囲に限定した観察対象部位Ｂの拡大観察を行うことができる。
また、上記実施形態では、光学ユニット６への光路とＣＣＤカメラ１９ｂへの光路をミラー１７の挿脱によって切り替える構造を例示したが、試料の動作が高速であり、より同時性処理が求められる場合には、光学ユニット６への光路とＣＣＤカメラ１９ｂへの光路を個別に設けてもよい。

また、上記実施形態においては、測定ヘッド３の光軸Ｃ２の姿勢を変更する機構として、回転アーム２７と２軸の直動機構２８とからなる姿勢変更機構８および鉛直軸線回りに回転可能なステージ２を採用したが、これに代えて、他の任意の軸構成を有するマニピュレータを採用することができる。
また、時間間隔をあけて撮像した２枚の画像を用いて動作軌跡Ｑを算出する場合を例に挙げて説明したが、これに代えて、３以上の画像、あるいは動画を用いて動作軌跡Ｑを算出することにしてもよい。

また、上記実施形態においては、それぞれが直方体状に形成された複数片の観察補助具５０を組織表面に振りかけることとしたが、これに代えて、単一の観察補助具５０を観察対象部位Ｂのみに配置することにしてもよい。観察補助具５０を回転非対称の直方体状に形成しているので、生体Ａが変位した結果、観察補助具５０が図９に示されるように、対物光学系１１の光軸Ｃ２回りに回転するように変位しても、画像処理によりその回転角度θを検出して、変位前後の画像Ｇにおいて観察補助具５０が一致するように画像Ｇを補正することができる。また、直方体状の観察補助具５０を採用することにより、観察補助具５０が生体Ａの組織表面から所定の寸法だけ立ち上がる側面を有することになるので、画像処理により当該側面を検出することとすれば、生体Ａの変位による観察補助具５０の倒れを検出できる。

また、直方体状の回転非対称の形状を有する観察補助具５０に代えて、図１０に示されるように、球体状の観察補助具５１を採用してもよい。この場合に、回転非対称の観察補助具５０とは異なり、単独では生体Ａの回転角度θを検出できないが、観察範囲内に複数片の観察補助具５１が配置されるようにすることにより、図１０に示されるように、２つの動作軌跡Ｑの中心線の交点Ｐと、各動作軌跡Ｑの両端とを結ぶ二等辺三角形の頂角を演算することにより、生体Ａの回転角度θを検出することが可能となる。さらに、球体状に構成することで、生体Ａの組織表面に無造作に振りかけることができ、取り扱いが容易であるという利点がある。

また、上記実施形態においては、金属または樹脂からなる観察補助具５０の本体５０ａ表面に接着層５０ｂをコーティングしてなるものを例示したが、これに代えて、接着層５０ｂを設けることなく、組織表面の水分によって組織表面に付着状態に維持されるようにしてもよい。
また、この場合に、組織表面との接触面積を大きくして、両者間の摩擦力を確保することにしてもよい。例えば、図１１に示されるように、組織表面に接触する面に指標部５０Ｂよりも面積が大きなシート状部材５３を取り付けた観察補助具５２を採用してもよい。この場合に、シート状部材５３は透明な材質により構成することで、視界を遮ることなく観察補助具５２と生体Ａの組織表面との摩擦力を高めることができる。また、この場合に、複数の指標部５０Ｂを透明なシート状部材５３に間隔をあけて固定配置することにしてもよい。この場合に、間隔寸法を正確に設定しておくことにより、当該間隔寸法の大小で、対物光学系１１の光軸Ｃ２方向に沿う焦点位置の遠近を検出することも可能となる。
また、量子ドット蛍光試薬を観察補助具として使用してもよい。

また、上記実施形態においては、姿勢変更機構８を自動的に制御する制御装置９を備える場合について説明したが、これに代えて、図１２に示されるように、姿勢変更機構８を手動により操縦するための操縦装置４１を備えた制御装置４２を備えていてもよい。操縦装置４１は、マウス、ジョイスティック等の任意の入力手段により構成される。

この場合に、制御装置４２は、内部に画像処理装置４３を備えている。画像処理装置４３は、図１３に示されるように、ＣＣＤカメラ１９ｂにより取得された生体Ａの画像情報Ｓ１を記憶する画像記憶部４４と、取得された画像情報Ｓ１を処理して複数の観察補助具５０を抽出して観察補助具情報Ｓ２を出力する補助具抽出部４５と、抽出された各観察補助具５０の動作軌跡Ｑを算出して、動作軌跡情報Ｓ３を出力する動作軌跡算出部４６と、ＣＣＤカメラ１９ｂにより取得された生体Ａの画像と、算出された各観察補助具５０の動作軌跡Ｑとを重ね合わせる画像合成部４７とを備えている。画像処理装置４３の画像合成部４７から出力された画像信号Ｓ４はモニタ２６に送られて表示されるようになっている。
操縦装置４１は、測定ヘッド３の光軸Ｃ２を所望の角度方向に移動させることができるようになっている。

このように構成することにより、ＣＣＤカメラ１９ｂにより撮像された画像Ｇとともに各部の動作軌跡Ｑがモニタ２６に表示される。観察者は、モニタ２６の画像を見ながら、操縦装置４１を操作することにより、モニタ２６の画像Ｇ上の動作軌跡Ｑの変化を確認できる。モニタ２６の画像Ｇ上に現れている観察対象部位Ｂにおける動作軌跡Ｑが長いときには、測定ヘッド３の光軸Ｃ２が生体Ａの表面の動作方向に対して傾斜していることになり、動作軌跡Ｑが短いときには、測定ヘッド３の光軸Ｃ２が生体Ａの表面の動作方向に近い方向に配されていることがわかる。

したがって、観察者は、操縦装置４１を操作してモニタ２６の画像Ｇ上の動作軌跡Ｑが短くなるように、測定ヘッド３の光軸Ｃ２の姿勢を調節することができる。
このようにして、測定ヘッド３の光軸Ｃ２が生体Ａの変位方向に沿う方向に配置された後に、光学ユニット６による観察に切り替えて、観察を行うことにより、ブレのない蛍光画像を撮像することができる。

また、上記実施形態においては、観察対象部位の観察に先立って、該観察対象部位における生体Ａの組織表面が、測定ヘッド１１の光軸Ｃ２に一致する方向に移動するように、測定ヘッドを設定して観察を行う観察方法について説明したが、これに代えて、光軸Ｃ２を適当な位置に固定して行う複数回の撮像工程の後に、取得された複数の画像Ｇにおいて、観察補助具５０が一致するように、画像自体を並進あるいは回転移動させる画像処理を行い、得られた補正画像に基づいて観察を行うことにしてもよい。また、画像処理や測定ヘッドの姿勢変更を、さらに高速に実施できる場合には、撮像された画像Ｇごとに観察補助具５０が一致するように、測定ヘッド１１の光軸Ｃ２をリアルタイムに移動させることにしてもよい。

本発明の一実施形態に係る観察補助具を説明する斜視図である。 図１の観察補助具を示す縦断面図である。 図１の観察補助具を用いた観察方法を実施するための観察装置の一例を示す正面図である。 図３の観察装置を示す側面図である。 図３の観察装置の測定ヘッドの姿勢変更手順の説明図であり、画像中に抽出された観察補助具を示す図である。 図３の観察装置の測定ヘッドの姿勢変更手順の説明図であり、２枚の画像における観察補助具の変位を示す図である。 図６の観察補助具の中心点どうしを接続した姿勢変更前の動作軌跡を示す図である。 姿勢変更後の動作軌跡を示す図である。 図１の観察補助具により、生体の回転変位を検出する場合について説明する図である。 球体状の観察補助具により、生体の回転変位を検出する場合について説明する図である。 図１の観察補助具の変形例を示す斜視図である。 本発明の第２の実施形態に係る観察装置を示す正面図である。 図７の観察装置の画像処理装置を説明するブロック図である。

符号の説明

Ａ 生体（試料）
Ｃ２ 光軸
Ｇ 画像
Ｑ 動作軌跡
１ 観察装置（顕微鏡）
３ 測定ヘッド（観察光学系）
１１ 対物光学系（観察光学系）
５０，５０′、５１，５１′，５２ 観察補助具
５０Ａ 固定部
５０Ｂ 指標部（指標部材）
５０ｂ 接着層（接着面）
５３ シート状部材（透明部材）

Claims (8)

1. 脈動する生体を観察するための観察方法であって、
   顕微鏡の観察範囲内に配される前記生体の表面に、外部から視覚可能な指標部材を固定し、
   該指標部材を含む前記生体の表面を所定時間間隔をあけて撮像し、
   取得された複数の画像を処理して前記指標部材の観察光学系の光軸方向から見た動作軌跡を計算し、
   前記光軸方向から見た複数の動作軌跡の内、前記生体の観察対象部位における該指標部材の前記光軸方向から見た動作軌跡が最も短くなるように、前記観察光学系の光軸を固定して観察を行う観察方法。
2. 脈動する生体を観察するための観察方法であって、
   顕微鏡の観察範囲内に配される前記生体の表面に、外部から視覚可能な指標部材を固定し、
   該指標部材を含む前記生体の表面を撮像する各時点において、得られる画像上の前記指標部材が観察光学系の光軸方向から見て一致するように観察光学系の光軸を変位させて観察を行う観察方法。
3. 請求項１または２に記載の観察方法において前記指標部材として用いられる観察補助具であって、
   顕微鏡の観察範囲内に収容される外形寸法を有するとともに、外部から視覚可能な指標
   部と、
   該指標部を前記観察範囲内に配される前記生体に固定する固定部と
   を備える観察補助具。
4. 前記指標部が、回転非対称な形状を有する請求項３に記載の観察補助具。
5. 前記固定部が、前記生体の表面に接着される接着面からなる請求項３または請求項４に記載の観察補助具。
6. 前記固定部が、前記指標部に一体的に固定され、該指標部より面積の大きなシート状の
   透明部材からなる請求項３または請求項４に記載の観察補助具。
7. 前記指標部が、３次元的な形状を有する請求項３から請求項６のいずれかに記載の観観察補助具。
8. 前記指標部が、観察範囲内に複数配置される請求項３から請求項７のいずれかに記載の
   観察補助具。

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