JP4719455B2 - 直接核酸増幅方法用生体試料処理液および直接核酸増幅方法 - Google Patents
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Description
R1−R2−(CH2CH2O)n−H
(ここで、R1は炭素数10〜22のアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、イソオクチル基;R2は−O−又は−(C6H4)−O−;nは8〜120の整数)
で表されるポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤がより好ましく、このようなものとしては、例えばポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレンミリスチリルエーテル、ポリオキシエチレンステアリルエーテル、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンイソオクチルフェニルエーテルなどが挙げられる。なお、生体試料処理液に含まれる界面活性剤の濃度は、使用する界面活性剤の種類に応じて好適な濃度を選択することが望ましい。例えば、生体試料処理液に含まれる非イオン性界面活性剤の濃度は0.1〜6%(v/v)が好ましく、1〜5%(v/v)がより好ましい。さらに、前記生体試料処理液は、界面活性剤と共に消泡剤を含有してもよい。
本例は、生体試料処理液に含有されるDMSOの効果について検討したものである。本例では、DMSOを含有する生体試料処理液を用いて生体試料から核酸増幅反応用試料を調製し、調製した核酸増幅反応用試料と核酸増幅反応用の試薬を用いてRT-LAMPを実施した。
グリシン緩衝液(pH3.0) 200mM
DMSO 0〜20%(v/v)
Brij35 5%(v/v)
KS-538 0.05%(v/v)
750mM トリス緩衝液(pH8.0) 1.00μL
10×Thermopol緩衝液
(ニューイングランドバイオラボラトリー社製) 2.50μL
10mM dNTPs 2.00μL
100mM MgSO4 0.75μL
100mM ジチオスレイトール 1.25μL
2% Tergitol(シグマアルドリッチジャパン株式会社製) 2.50μL
H2O 3.97μL
全量 13.97μL
10U/μL AMV逆転写酵素(プロメガ株式会社製) 0.14μL
8U/μL Bst DNAポリメラーゼ
(ニューイングランドバイオラボラトリー社製) 2.27μL
RNase inhibitor(プロメガ株式会社製) 0.63μL
全量 3.04μL
80pmol/μL forward inner primer(配列番号1) 1.00μL
80pmol/μL reverse inner primer(配列番号2) 1.00μL
5pmol/μL forward outer primer(配列番号3) 1.00μL
5pmol/μL reverse outer primer(配列番号4) 1.00μL
60pmol/μL forward loop primer(配列番号5) 1.00μL
60pmol/μL reverse loop primer(配列番号6) 1.00μL
全量 6.00μL
Molt-4細胞300mgに生体試料処理液4mLを添加し、株式会社マイクロテック・ニチオン製のホモジナイザーを用いて、25,000rpmで90秒間細胞を破砕して均質化した。そして、均質化した溶液を遠心分離(10,000×g、1分間)し、上清を得た。このようにして得られた上清を1倍希釈の核酸増幅反応用試料とし、さらに、生体試料処理液を用いて1倍希釈の試料を希釈して、2倍希釈、4倍希釈、8倍希釈、10倍希釈および16倍希釈と希釈倍率の異なる増幅反応用の試料を調製した。
標的核酸をβ-アクチンのRNAとし、RT-LAMP法による核酸増幅を実施した。まず、反応液13.97μL、酵素試薬3.04μL、プライマー試薬6.00μLを混合し、試薬混合液を調製した。そして、前記各核酸増幅反応用試料2μLに対して、試薬混合液を23μLずつ混合し、65℃で30分間反応させた。なお、増幅した核酸の検出には、テラメックス株式会社製 Loopampリアルタイム濁度測定装置(LA-200)を用いた。この装置は、予め設定した温度での核酸増幅反応を行い、同時に増幅副産物であるピロリン酸マグネシウムの白濁を検出することにより、核酸増幅反応をリアルタイムにモニターすることができる。本例では、温度を65℃に設定し、核酸増幅反応用試料と核酸増幅反応用の試薬とを混合してから30分間の吸光度を測定した。
本例は、様々な種類の組織を生体試料として、DMSOを含有する生体試料処理液を用いたRT-LAMPを実施した。
グリシン緩衝液(pH3.0) 200mM
DMSO 20%(v/v)
Brij35 5%(v/v)
KS-538 0.05%(v/v)
80pmol/μL forward inner primer(配列番号7) 1.00μL
80pmol/μL reverse inner primer(配列番号8) 1.00μL
5pmol/μL forward outer primer(配列番号9) 1.00μL
5pmol/μL reverse outer primer(配列番号10) 1.00μL
60pmol/μL forward loop primer(配列番号11) 1.00μL
60pmol/μL reverse loop primer(配列番号12) 1.00μL
全量 6.00μL
各組織300mgに生体試料処理液4mLをそれぞれ添加し、株式会社マイクロテック・ニチオン製のホモジナイザーを用いて、25,000rpmで90秒間細胞を破砕して均質化した。そして、均質化した各溶液を遠心分離(10,000×g、1分間)し、得られた各上清を生体試料処理液でそれぞれ10倍希釈し、それらを核酸増幅反応用試料として用いた。
本例では標的核酸をグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)のRNAとし、RT-LAMP法による核酸増幅を実施した。まず、反応液13.97μL、酵素試薬3.04μL、プライマー試薬6.00μLを混合し、試薬混合液を調製した。そして、前記各核酸増幅反応用試料2μLに対して、試薬混合液を23μLずつ混合し、65℃で30分間反応させた。なお、増幅した核酸の検出には、テラメックス株式会社製 Loopampリアルタイム濁度測定装置(LA-200)を用いた。本例では、温度を65℃に設定し、核酸増幅反応用試料と核酸増幅反応用の試薬とを混合してから30分間の吸光度を測定した。また、核酸増幅反応用試料の代わりにアプライドバイオシステム社製 Rodent Total RNAを用いた場合をポジティブコントロールとし、核酸増幅反応用試料の代わりに前記生体試料処理液を用いた場合をネガティブコントロールとした。
本例は、20%(v/v)DMSOを含有する生体試料処理液を用いて生体試料から核酸増幅反応用試料を調製し、調製した核酸増幅反応用試料と市販の試薬を用いてRT-PCRを実施した。
生体試料(A)〜(H)300mgに生体試料処理液4mLを添加し、株式会社マイクロテック・ニチオン製のホモジナイザーを用いて、25,000rpmで90秒間細胞を破砕して均質化した。そして、均質化した溶液を遠心分離(10,000×g、1分間)し、得られた上清を生体試料処理液で10倍希釈し、これを粗製mRNA試料(A)〜(H)とした。また、QIAGEN社製 Rneasy Mini Kitを用いて、前記上清からmRNAを抽出精製し、それを精製mRNA試料(A)〜(H)とした。なお、前記上清からmRNAを抽出精製して精製mRNA試料を調製するのに要する時間はおよそ60分である。
本例では、(1)で調製した粗製mRNA試料(A)〜(H)および精製mRNA試料(A)〜(H)を核酸増幅反応用試料としてRT-PCRを実施した。まず、Master Mix、RNase inhibitor Mix及び3種類のプライマーを含む反応液を調製し、調製した反応液と核酸増幅反応用試料とを混合し、PT-PCRを実施する。RT-PCR反応は、48℃で30分間逆転写反応を行い、95℃で10分間保持した後に、95℃で15秒間及び60℃で1分間の操作を40サイクル行った。なお、Master Mix、RNase inhibitor Mix及び3種類のプライマーを含む反応液は、核酸増幅反応用試料と混合した後、最終的な組成が1×Master Mix、1×RNase inhibitor Mix、300nM forward primer(配列番号13)、300nM reverse primer(配列番号14)、200nM Taq Man Probe(配列番号15)となるように調製した。
本例では、界面活性剤を含有する生体試料処理液を用いて生体試料から核酸増幅反応用試料を調製し、調製した核酸増幅反応用試料に含まれるRNAの量を測定した。
グリシン緩衝液(pH3.0) 200mM
DMSO 20%(v/v)
界面活性剤 1〜5%(v/v)
KS-538 0.05%(v/v)
各マウスリンパ節に生体試料処理液(I)(II)(III)又は(IV)を添加し、株式会社マイクロテック・ニチオン製のホモジナイザーを用いて、25,000rpmで90秒間細胞を破砕して均質化した。そして、均質化した各溶液を遠心分離(10,000×g、1分間)し、得られた各上清を核酸増幅反応用試料とした。なお、本例では、生体試料0.075mgに対して生体試料処理液約1μLの割合になるように各試料を調製した。
QIAGEN社製 Rneasy Mini Kitを用いて(1)で得られた核酸増幅反応用試料に含まれるRNAを抽出した。
上記の方法で得られたRNA抽出液を、前記生体試料処理液で10倍希釈し、その希釈試料の吸光度(Abs 280nm)を測定することによりRNA量を定量した。その結果を表2に示した。
Claims (16)
- ジメチルスルホキシドおよび界面活性剤を含有するpH2.5〜5.0の水溶液からなる生体試料処理液であって、生体から採取した組織を生体試料処理液中で破砕処理して得られた組織破砕液からRNAを含む核酸成分を抽出精製することなく核酸増幅反応用試料を調製し、核酸増幅反応用試料中の核酸成分における標的核酸配列をRT−LAMP法又はRT−PCR法により増幅する直接核酸増幅方法に用いられる直接核酸増幅方法用生体試料処理液。
- 1〜50%(v/v)ジメチルスルホキシドを含有する請求項1に記載の直接核酸増幅方法用生体試料処理液。
- 前記界面活性剤が非イオン性界面活性剤である請求項1または請求項2に記載の直接核酸増幅方法用生体試料処理液。
- 前記非イオン性界面活性剤がポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤である請求項3に記載の直接核酸増幅方法用生体試料処理液。
- 前記組織がリンパ節である請求項1〜4のいずれか一項に記載の直接核酸増幅方法用生体試料処理液。
- 前記生体が癌患者であり、前記標的核酸配列が腫瘍マーカーの核酸配列である請求項1〜5のいずれか一項に記載の直接核酸増幅方法用生体試料処理液。
- 前記核酸増幅反応用試料がデオキシリボヌクレオチド3リン酸、RNA逆転写酵素、DNAポリメラーゼ及び少なくとも1種類のプライマーを含有する請求項1〜6のいずれか一項に記載の直接核酸増幅方法用生体試料処理液。
- 前記核酸増幅反応用試料がRNaseインヒビターを含有する請求項1〜7のいずれか一項に記載の直接核酸増幅方法用生体試料処理液。
- 生体から採取した組織に含まれる核酸成分における標的核酸配列を、核酸成分の抽出精製を行うことなく増幅する直接核酸増幅方法であって、
ジメチルスルホキシドおよび界面活性剤を含有する酸性の水溶液からなる生体試料処理液中で生体から採取した組織を破砕処理する工程、および
得られた組織破砕液からRNAを含む核酸成分を抽出精製することなく核酸増幅反応用試料を調製し、核酸増幅反応用試料中の核酸成分における標的核酸配列をRT−LAMP法又はRT−PCR法により増幅する工程、を含む直接核酸増幅方法。 - 前記生体試料処理液に含まれるジメチルスルホキシドの濃度が1〜50%(v/v)である請求項9に記載の直接核酸増幅方法。
- 前記核酸増幅反応用試料が、デオキシリボヌクレオチド3リン酸、RNA逆転写酵素、DNAポリメラーゼ及び少なくとも1種類のプライマーを含有する請求項9又は請求項10に記載の直接核酸増幅方法。
- 前記核酸増幅反応用試料がRNaseインヒビターを含有する請求項9〜11のいずれか一項に記載の直接核酸増幅方法。
- 前記核酸増幅反応用試料が、前記組織破砕液を遠心分離して得られた上清を含有する請求項9〜12のいずれか一項に記載の直接核酸増幅方法。
- 前記生体試料処理液のpHが2.5〜5.0である請求項9〜13のいずれか一項に記載の直接核酸増幅方法。
- 前記組織がリンパ節である請求項9〜14のいずれか一項に記載の直接核酸増幅方法。
- 前記生体が癌患者であり、前記標的核酸配列が腫瘍マーカーの核酸配列である請求項9〜15のいずれか一項に記載の直接核酸増幅方法。
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