JP2008017832A - がんの転移の判定方法及び判定装置 - Google Patents

がんの転移の判定方法及び判定装置 Download PDF

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Abstract

【課題】生体から採取された組織又は細胞が属する組織へのがんの転移をより正確に判定することができる判定方法及び判定装置を提供する。
【解決手段】生体から採取された組織又は細胞中のがんマーカーの絶対量を測定する測定工程；及び
前記測定された絶対量と予め決められた閾値とを比較することにより前記組織又は前記細胞が属する組織へのがんの転移を判定する判定工程
を含むがんの転移の判定方法及び該方法に基づく判定装置により、上記の課題を解決する。
【選択図】図５

Description

本発明は、がんの転移の判定方法、例えば乳がんのリンパ節への転移の判定方法及び判定装置に関する。
特定の組織へのがん転移を検査するために、現在、ＬＡＭＰ（loop-mediated isothermal amplification method）法やＰＣＲ（polymerase chain reaction）法などを用いたがんの分子検査の研究が盛んに行われるようになっている。分子検査は、組織や細胞などに含まれるがんマーカー（例えば、がん細胞に特異的に発現するタンパク質のｍＲＮＡなど）を検出することにより行うことができる。例えば、乳がんのリンパ節転移を判定するためのがんマーカー（以下、単にマーカーともいう）としては、サイトケラチン１９（ＣＫ１９）や癌胎児性抗原（ＣＥＡ）のｍＲＮＡが有用であることが知られている。これらのがんマーカーは、正常なリンパ節での発現量とリンパ節に転移してきた乳がん細胞での発現量とに有意な差が認められる分子である。
がん転移を判定するのに用いられる検体は、切除生検などにより採取することができ、検体によって含まれる細胞数が異なることが多い。分子診検査によりがん転移を判定するため、がん細胞が組織のどの部分に存在しているかはわからないため、不均一な大きさの組織又は異なる数の細胞を含む検体を用いてそこに含まれるがんマーカーを検出する。
従来、がん転移の判定を行う場合、検体毎に含まれる細胞数が異なるため、解析対象とするがんマーカーの量を細胞あたりの量に換算して、組織又は細胞中のがんマーカーの存在量を閾値と比較することにより、判定を行なっている。具体的には、例えば、がんマーカーの量をハウスキーピング遺伝子(多くの組織や細胞に一定量発現していると言われている遺伝子)の発現量で除してハウスキーピング遺伝子の発現量あたりのがんマーカーの量に換算することなどによる標準化が行われている(非特許文献１)。
M. Inokuchi et al., British Journal of Cancer (2003) 89, 1750-1756
しかしながら、これらの従来の判定方法は、均一系(解析対象である検体中の細胞の全てが実質的に同種の細胞)であることが前提として考えられている（例えば、試料中の細胞がほとんどがん細胞である場合は均一系とみなすことが可能である）。
本発明者らは、がんの転移の判定方法において、がんマーカーの量をハウスキーピング遺伝子の発現量で除することにより標準化を行うと、判定結果が組織の大きさや細胞の数により左右されるために正確にがん転移の判定を行えないことがあるという課題を見出した。そこで、このような課題を解決して誤判定を最小限に抑えることを可能にするがんの転移の判定方法を開発して本発明を完成した。
本発明は、生体から採取された組織又は細胞中のがんマーカーの絶対量を測定する測定工程；及び
前記測定された絶対量と予め決められた閾値とを比較することにより前記組織又は前記細胞が属する組織へのがんの転移を判定する判定工程
を含む、がんの転移の判定方法である。
また本発明は、生体から採取された組織又は細胞中のがんマーカーの絶対量を反映する情報を測定する測定工程；及び
前記測定された絶対量を反映する情報を、前記がんマーカー以外の分子の絶対量による標準化を行わずに、予め決められた閾値と比較することにより前記組織又は前記細胞が属する組織へのがんの転移を判定する判定工程
を含む、がんの転移の判定方法でもある。
さらに本発明は、生体から採取された組織又は細胞中のがんマーカーの絶対量を測定する測定手段；及び
前記測定された絶対量と予め決められた閾値とを比較することにより前記組織又は前記細胞が属する組織へのがんの転移を判定する判定手段
を含む、がんの転移の判定装置である。
本発明のがんの転移の判定方法により、検体とする組織の大きさ又は細胞の量に依存せず、がんの転移の判定をより正確に行うことができる。
本発明のがんの転移の判定方法は、生体から採取された組織又は細胞を含む試料を検体として行われる。該組織としては、リンパ節組織や血液などが挙げられる。該細胞を含む試料としては、腹腔内灌注により得られる細胞を含む洗浄液若しくはその濃縮液、血球などが挙げられる。
本発明のがんの転移の判定方法は、上記の組織又は上記の細胞が属する組織へのがんの転移を判定することができる。本明細書において「細胞が属する組織」とは、生体から採取された細胞が由来する組織のことである。例えば、腹腔内灌注により得られる細胞は、洗浄によって胃から脱落した細胞であり、この場合「細胞が属する組織」とは、胃である。
本明細書において「がんマーカー」とは、がん細胞に発現する量が正常な細胞で発現する量よりも有意に多い分子マーカーを意味する。本発明の判定方法においては、がんマーカーがｍＲＮＡ、ＤＮＡなどの核酸であるのが好ましく、より好ましくはｍＲＮＡである。
がんマーカーがｍＲＮＡである場合、例えば、ＣＫ１８、ＣＫ１９、ＣＫ２０などのサイトケラチン(ＣＫ)、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＭＵＣ１ムチン、マンマグロビン(ＭＭ
Ｇ)などのタンパク質のｍＲＮＡが挙げられる。上記のがんマーカーは、好ましくはサイトケラチンのｍＲＮＡであり、より好ましくはＣＫ１９のｍＲＮＡである。
本発明の判定方法の測定工程においては、がんマーカーの絶対量又は該絶対量を反映する情報を測定する。本明細書において「がんマーカーの絶対量」とは、がんマーカーの量にのみ基づく値を意味し、測定におけるその他の要因、例えば組織又は細胞の量に基づく値を考慮に入れない値である。即ち、この値には、上述のハウスキーピング遺伝子等による標準化が行われない。また、がんマーカーの絶対量を反映する情報とは、がんマーカーの絶対量にのみ基づいて変化する値であり、以下に例示するようながんマーカーの測定方法に応じた種々の情報であり得る。該情報は、例えば蛍光強度、濁度、吸光度や、これらの値が所定の値に達するまでの時間又はＰＣＲサイクル数などであり得る。
以下、本明細書において、がんマーカーの絶対量及び該絶対量を反映する情報の両方をまとめて、がんマーカーの「測定値」ということがある。また、がんマーカーの絶対量及び該絶対量を反映する情報のいずれかを得ることを、「がんマーカーを測定する」ということがある。
本発明の判定方法では、上記の測定工程において、上記の組織又は細胞に処理液を添加し、組織又は細胞中のがんマーカーを溶液中に移行させることによって調製された測定用試料を用いることが好ましい。該処理液は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含有することが好ましい。核酸増幅法を用いてがんマーカーを測定する場合はＤＭＳＯの作用により、試料に含まれる阻害物質による核酸増幅反応の阻害を低減することができる。
上記のＤＭＳＯを含む処理液は、ＤＭＳＯを該処理液の約５〜３０容量％含むのが好ましく、約１０〜２５容量％含むのがより好ましい。
上記のＤＭＳＯを含む処理液は、ＤＭＳＯの他に必要に応じて緩衝剤、界面活性剤などを含むことができる。
該緩衝剤は、該処理液のｐＨを２．５〜５．０程度に保つことができるものであればよく、例えばグリシン−塩酸緩衝剤などが挙げられる。緩衝剤の濃度は、該処理液のｐＨを上記の範囲に保つことができるものであれば特に限定されない。
上記の界面活性剤は、当該分野で通常用いられる界面活性剤であれば特に限定されないが、非イオン性界面活性剤が好ましく、ポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤がより好ましい。特に、次のような一般式：
Ｒ１−Ｒ２−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n−Ｈ
（ここで、Ｒ１は、炭素数１０〜２２のアルキル基、アルケニル基、アルキニル基又はイソオクチル基であり；Ｒ２は、−Ｏ−又は−（Ｃ6Ｈ4）−Ｏ−であり；ｎは、８〜１２０の整数である）
で表されるポリオキシエチレン系非イオン性界面活性剤が好適であり、その例としては、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレンミリスチリルエーテル、ポリオキシエチレンステアリルエーテル、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンイソオクチルフェニルエーテルなどが挙げられる。具体的には、Ｂｒｉｊ３５(ポリオキシエチレン(３５)ラウリルエーテル)などが好適である。界面活性剤の濃度は、当該分野で通常用いられるものであれば特に限定されず、例えば処理液の０．１〜６容量％が好ましく、より好ましくは１〜５容量％である。
上記のような界面活性剤は上記の組織又は細胞の細胞膜を損傷する作用を有するため、このような界面活性剤を含有する処理液を用いることにより、細胞膜内に存在するがんマーカーを効率的に溶液中に移行させることができる。
上記のような処理液を用いることにより、市販の精製キットなどを用いて一般的に行われる核酸の抽出・精製を行うことなく、簡便かつ短時間で測定用試料を調製することができる。
上記の処理液と組織又は細胞との混合割合は、特に限定されないが、組織を用いる場合、組織１ｍｇに対して０．０００１〜０．００５ｍＬ程度の処理液を添加して混合することができる。上記の混合は、特に限定されないが、例えば室温で組織又は細胞と処理液とが充分に混合される程度の時間行うことができる。
上記のＤＭＳＯを含む処理液と組織又は細胞との混合の後に、組織又は細胞を破砕するのが好ましい。破砕する方法としては、ホモジナイザーによるホモジナイズ、凍結融解などが挙げられる。ホモジナイザーとしては、当該分野において通常用いられるものを用いることができ、例えばワーリングブレンダー、ポッター・エルベージェム型ホモジナイザー、ポリトロン型ホモジナイザー、ダウンス型ホモジナイザー、フレンチプレス、超音波破砕機などが挙げられる。破砕の条件は、用いる方法及び装置に応じて適宜設定され、当該分野において通常用いられるものであってよい。
上記の方法により破砕された破砕液は、遠心分離、フィルターろ過、カラムクロマトグラフィーなどの通常の精製方法を用いて粗精製することができる。検出するがんマーカーの種類に応じて、核酸抽出法などの方法によりさらに精製してもよい。
本発明の判定方法において、上記のがんマーカーの測定は、当該分野で通常用いられる方法に従って行うことができる。特に、ＬＡＭＰ（loop-mediated isothermal amplification method）法、ＰＣＲ（polymerase chain reaction）法などに基づく核酸増幅法が好ましい。がんマーカーがｍＲＮＡである場合には、核酸増幅反応の前に逆転写反応を含む核酸増幅法（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ法やＲＴ−ＬＡＭＰ法など）を用いることができる。がんマーカーがｍＲＮＡである場合には、具体的には、上記の測定用試料に、がんマーカーを検出し得るプライマ、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（以下、単にＤＮＡポリメラーゼともいう）を添加して反応液を調製して核酸増幅を行い、増幅されたｃＤＮＡを測定することができる。
逆転写反応及び核酸増幅反応は、鋳型であるマーカーに対応するｃＤＮＡの配列及びプライマの配列に応じて適宜条件を変更することができる。逆転写反応及び核酸増幅反応の条件は、例えばSambrook, J. et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkに記載されたものを用いることができる。
マーカーを検出するためのプライマとしては、マーカーに対応するｃＤＮＡを増幅することができるポリヌクレオチドであれば、その配列は特に限定されない。プライマの長さは５〜１００ヌクレオチドが好ましく、１０〜５０ヌクレオチドがより好ましい。プライマは、当該技術において公知の核酸合成方法により製造することができる。
上記のプライマは、当該技術において通常用いられる技術により修飾されていてもよい。上記プライマの標識は、放射活性元素又は非放射活性分子を用いて行うことができる。用いられる放射活性同位体としては、32P、33P、35S、3H又は125Iを挙げることができる。非放射活性物質は、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン又はジゴキシゲニンのようなリガンド、ハプテン、色素及び放射線発光性、化学発光性、生物発光性、蛍光又はリン光性の試薬のような発光性試薬から選択される。
逆転写活性を有する酵素及びＤＮＡポリメラーゼは、当該技術においてよく知られたものを用いることができる。逆転写活性を有する酵素としては、AMV (Avian Myeloblastosis Virus) 逆転写酵素、M-MLV (Molony Murine Leukemia Virus) 逆転写酵素などが挙げられる。また、ＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼなどを用いることができる。
上記の核酸増幅により生成した核酸増幅産物を測定することにより、がんマーカーを測定することができる。がんマーカーがｍＲＮＡの場合は、定量ＲＴ−ＰＣＲ（Quantitative Reverse Transcription-PCR）や定量ＲＴ−ＬＡＭＰ(Quantitative Reverse Transcription-LAMP)等が好ましく用いられる。これらの方法によると、核酸（ｃＤＮＡ）増幅に伴って反応液の光学的状態（濁度、吸光度、蛍光強度など）が変化するため、これをリアルタイムに測定することにより、がんマーカーの測定を行うことができる。
定量ＲＴ−ＰＣＲの具体例としては、核酸増幅反応前の反応液にＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎを予め添加しておき、増幅反応中にｃＤＮＡの増幅に伴って増加する蛍光強度をリアルタイムに測定するＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ法や、ＴａｑＭａｎ（ロシュダイアグノスティクス社の登録商標）法など、公知のものを用いることができる。がんマーカーの測定値は、反応液の蛍光強度が所定の値に達するまでのサイクル数に基づいて算出することができる。
また、定量ＲＴ−ＬＡＭＰを用いる場合、ｃＤＮＡの増幅に伴い副産物としてピロリン酸マグネシウムが多量に生成される。このピロリン酸マグネシウムは不溶性であるため、ピロリン酸マグネシウムの増加に伴って反応液が白濁する。よって、反応液の濁度（又は吸光度）をリアルタイムで光学的に測定することにより、がんマーカーを測定することができる。また、ＲＴ−ＬＡＭＰ法においても、上記ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ法を用いることができる。がんマーカーの測定値は、反応液の濁度、吸光度、蛍光強度などが所定の値に達するまでの時間に基づいて算出することができる。
本発明の判定方法の判定工程は、上記の測定工程で測定されたがんマーカーの測定値を予め決められた閾値と比較することを含む。本発明の判定方法において、該閾値と比較される上記の組織又は細胞中のがんマーカーの測定値は、従来のがんの転移判定方法で行われていたような組織又は細胞の量に基づく標準化の処理に付されない。
本明細書において「標準化」とは、上記の測定工程で得られたがんマーカーの測定値を、生体から採取された組織又は細胞の量に応じた値に換算することをいう。より具体的には、標準化とは、上記の測定工程で得られたがんマーカーの測定値を、組織又は細胞の量あるいは該量を反映する情報、好ましくは内部標準、より好ましくはハウスキーピング遺伝子のｍＲＮＡの量あるいは該量を反映する情報で除することであり得る。ここで、「ハウスキーピング遺伝子」とは、多くの組織や細胞に一定量発現していると一般に考えられている遺伝子であり、例えばβ−アクチン、ＧＡＰＤＨ(グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ)、β２−マイクログロブリン、ＨＰＲＴ１(ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ１)などの遺伝子が挙げられる。上記の「ハウスキーピング遺伝子のｍＲＮＡの量を反映する情報」とは、がんマーカーの測定を行うのと同様の方法でハウスキーピング遺伝子の測定を行ったときに得られる情報のことである。
従来のがんの転移判定方法では、上記のハウスキーピング遺伝子の量又は該量を反映する情報を求め、対象の組織又は細胞中に存在するがんマーカーの量又は該量を反映する情報をこの値で除した(標準化した)結果に基づいてがんの転移を判定していた。しかし、本発明の判定方法においては、このような標準化を行なわずに、測定に付された組織又は細胞中のがんマーカーの絶対量又は該絶対量を反映する情報を、予め決められた閾値と直接比較することによりがんの転移を判定する。このような判定方法により、より正確にがんの転移を判定することができる。
また、従来行われている組織診によるがん転移判定は、組織切片を作成し、染色等の処理を行って検鏡することにより行われる。しかし、検鏡による組織診では組織の一部しか検査できないため、がん細胞を含まない面で切片を作製するとがん細胞を見落とす可能性がある。一方、分子検査によるがん転移判定では、切除した組織試料全体（あるいは切片作製後の余剰の組織試料）を用いることができるため、一部の断面のみで検査する組織診とは違い見落としの可能性が低い。
分子検査では、検体が実質的にがん細胞のみを含む場合は、ハウスキーピング遺伝子がどのような細胞でも一定量発現していると仮定すると、標準化を行っても正確にがん転移の判定を行うことができる。しかしながら、検体に正常細胞が含まれる場合、標準化を行うと、正常細胞を多く含む検体ほどハウスキーピング遺伝子の発現量が大きくなるため、がん転移の可能性が過小評価されてしまう。
例えば、正常細胞を多く含む検体Ａ（がんマーカー絶対量が１であり、ハウスキーピング遺伝子の発現量が１０００である）と、検体Ａよりも正常細胞を少量含む検体Ｂ（がんマーカー絶対量が１であり、ハウスキーピング遺伝子の発現量が１０である）とを比較した場合、標準化を行うと、検体Ａのがんマーカーは、１０００分の１と算出され、検体Ｂのがんマーカーは１０分の１と算出される。検体Ａと検体Ｂに含まれるがんマーカーは等量であるにもかかわらず、標準化を行うと正常細胞が多量であった検体Ａのほうが、がん転移の可能性が低いという判定結果となってしまう。しかしながら、本発明の判定方法のように標準化を行わずに検討すると、検体Ａ及び検体Ｂのがんマーカーは等量であるため、がん転移の可能性も同等の結果として判定することができる。
なお、本発明では、検体のハウスキーピング遺伝子のｍＲＮＡの測定値は標準化には用いないが、正確に核酸増幅反応が行われたか否かを判定するためのコントロールとして用いることができる。ハウスキーピング遺伝子は殆どの種類の細胞で発現が認められるため、ハウスキーピング遺伝子のｍＲＮＡが検出される場合は、がんマーカーの核酸増幅反応も適切に行われたと考えられる。一方、ハウスキーピング遺伝子のｍＲＮＡが検出されない場合は、核酸増幅反応が正確に行われなかったことが考えられ、酵素の失活等の原因が疑われる。
本発明の判定方法において、上記の閾値は、がんマーカー及び核酸増幅法の種類に応じて適宜設定され得る値である。該閾値は、がんの転移が確認された組織又は細胞(陽性検体)に含まれるがんマーカーの量に対応する値以下であって、がんの転移がないことが確認された組織又は細胞(陰性検体)に含まれるマーカー量に対応する値よりも高い値に設定することができる。複数の陽性検体のマーカー量に対応する値と、複数の陰性検体のマーカー量に対応する値とを測定し、最も高確率に陽性検体と陰性検体とを区別できる値を閾値とすることが好ましい。閾値としては、例えば、定量ＲＴ−ＰＣＲを用いた場合、乳がんでは２３０〜２６０コピー、胃がんでは８〜６９０コピー、大腸がんでは７９〜１８０コピーが挙げられ、定量ＲＴ−ＬＡＭＰを用いた場合は、乳がんでは８６〜３６０コピー、胃がんでは１０〜２７０コピー、大腸がんでは１７０〜６４０コピーが挙げられる。
本発明の判定方法の判定工程では、上記のがんマーカーの絶対量と閾値との比較結果に基づいて上記の組織又は細胞中のがんの転移を判定する。すなわち、がんマーカーの絶対量が閾値よりも高い場合は転移が陽性であり、閾値よりも低い場合は陰性であると判定することができる。このような判定結果を得ることにより、術式、切除範囲、術後の治療方針などの決定の指標となり得る。
本発明のがんの転移の判定方法は、がんの種類を特に限定しないが、乳がん、胃がん、食道がん、大腸がん、前立腺がん等の転移判定に好適に用いられ、より好ましくは乳がん、大腸がん又は胃がん、特に好ましくは乳がんの転移判定により好適に用いることができる。
本発明の別の観点は、生体から採取された組織又は細胞中のがんマーカーの絶対量を測定する測定手段；及び
前記測定された絶対量と予め決められた閾値とを比較することにより前記組織又は前記細胞が属する組織へのがんの転移を判定する判定手段
を含む、がんの転移の判定装置である。
上記の測定手段は、がんマーカーの絶対量又は該絶対量を反映する情報を測定することができるものであれば特に限定されないが、ＬＡＭＰ法やＰＣＲ法により増幅された核酸を測定し得る核酸増幅測定装置が好ましい。該核酸増幅測定装置は、採取された組織又は細胞中のがんマーカーをプライマと核酸増幅酵素とにより増幅して得られる核酸増幅産物を測定する測定部を備える。
上記の判定手段は、上記の測定手段で測定されたがんマーカーの測定値を、予め決められた閾値と比較することによりがんの転移を判定する。また、この装置は、得られた判定結果を表示する表示部を備えていてもよい。
本発明のがんの転移の判定装置の一実施形態を、図１〜３に示す。図１は、本発明の一実施形態による判定装置の全体構成を示した斜視図である。図２は、図１に示した測定手段としての核酸増幅測定装置の全体構成を示した斜視図である。図３は、図２の核酸増幅測定装置の概略平面図である。
本発明のある実施形態の判定装置は、図１に示すように、核酸増幅測定装置１０１と、該核酸増幅測定装置と有線又は無線による通信ができるように接続された判定手段としてのパーソナルコンピュータ(ＰＣ)１０２とにより構成され得る。
核酸増幅測定装置１０１は、図２に示すように分注機構部１０と、試料セット部２０と、チップセット部３０と、チップ廃棄部４０と、５つの反応検出ブロック５０ａからなる反応検出部５０と、分注機構部１０をＸ軸方向及びＹ軸方向に移送するための移送部６０とを含んでいる。
また、分注機構部１０は、図２に示すように、移送部６０によりＸ軸方向及びＹ軸方向（水平方向）に移動されるアーム部１１と、アーム部１１に対してそれぞれ独立してＺ軸方向（垂直方向）に移動可能な２連（２本）のシリンジ部１２とを含んでいる。
また、図２及び図３に示すように、試料セット部２０には、装置の手前から順番に、１０個の試料容器セット孔２１ａ〜２１ｊと、１つの酵素試薬容器セット孔２１ｋ及び１つのプライマ試薬容器セット孔２１ｌとが設けられている。また、１０個の試料容器セット孔２１ａ〜２１ｊは、５行２列に配列するように設けられている。そして、試料容器セット孔２１ｃ及び２１ｄと、試料容器セット孔２１ｅ及び２１ｆと、試料容器セット孔２１ｇ及び２１ｈと、試料容器セット孔２１ｉ及び２１ｊとは、それぞれ、装置の奥側から順に、試料セット位置１、試料セット位置２、試料セット位置３及び試料セット位置４に設けられている。
また、本実施形態では、正面左側の試料容器セット孔２１ｃ、２１ｅ、２１ｇ及び２１ｉには、予め切除生体組織（リンパ節）を処理（ホモジナイズ、ろ過など）して作製された可溶化抽出液（測定用試料）が収容された試料容器２２がセットされるとともに、正面右側の試料容器セット孔２１ｄ、２１ｆ、２１ｈ及び２１ｊには、上記した試料を１０倍に希釈した希釈試料が収容された試料容器２３がセットされる。
また、試料容器セット孔２１ａには、増幅するべき核酸が正常に増幅することを確認するための陽性コントロールが収容された容器２４が載置されるとともに、試料容器セット孔２１ｂには、増幅するべきでない核酸が正常に増幅しないことを確認するための陰性コントロールを収容した容器２５がセットされる。
また、酵素試薬容器セット孔２１ｋ及びプライマ試薬容器セット孔２１ｌには、それぞれ、サイトケラチン１９のｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡ（以下、単にＣＫ１９ともいう）を増幅するための核酸増幅酵素試薬が収容された酵素試薬容器２６と、ＣＫ１９のプライマ試薬が収容されたプライマ試薬容器２７とがセットされている。
また、反応検出部５０の各反応検出ブロック５０ａは、図２及び図３に示すように、反応部５１と、２つの濁度検出部５２と、蓋閉機構部５３（図２参照）とから構成されている。各反応検出ブロック５０ａに設けられる反応部５１には、図３に示すように、検出セル５４をセットするための２つの検出セルセット孔５１ａが設けられている。各反応検出ブロック５０ａは、装置の奥側から順に、セルセット位置１、セルセット位置２、セルセット位置３、セルセット位置４及びセルセット位置５に配置されている。
また、濁度検出部５２は、反応部５１の一方の側面側に配置された基板５５ａに取り付けられた４６５ｎｍの波長を有する青色ＬＥＤからなるＬＥＤ光源部５２ａと、反応部５１の他方の側面側に配置された基板５５ｂに取り付けられたフォトダイオード受光部５２ｂとによって構成されている。各反応検出ブロック５０ａには、１つのＬＥＤ光源部５２ａと１つのフォトダイオード受光部５２ｂとからなる１組の濁度検出部５２が２組ずつ配置されている。
また、検出セル５４は、試料を収容するため２つのセル部５４ａと、２つのセル部５４ａを塞ぐ２つの蓋部５４ｂとを有している。
また、移送部６０は、図２に示すように、分注機構部１０をＹ軸方向に移送するための直動ガイド６１及びボールネジ６２と、ボールネジ６２を駆動するためのステッピングモータ６３と、分注機構部１０をＸ軸方向に移送するための直動ガイド６４及びボールネジ６５と、ボールネジ６５を駆動するためのステッピングモータ６６とを含んでいる。なお、分注機構部１０のＸ軸方向及びＹ軸方向への移送は、ステッピングモータ６３及び６６により、それぞれ、ボールネジ６２及び６５を回転させることにより行う。
パーソナルコンピュータ１０２は、図１に示すように、入力機器のキーボード１０２ａ及びマウス１０２ｂと、モニタからなる表示部１０２ｃと、試料の測定結果を分析するＣＰＵ１０２ｄとを含む。
次に、図１〜図３を参照して、本実施形態による判定装置１の動作について説明する。この実施形態では、上記したように、がん手術での切除リンパ節組織中に存在するがんマーカー（ｍＲＮＡ）をＬＡＭＰ法を用いて増幅させ、増幅に伴い発生するピロリン酸マグネシウムによる白濁による濁度の変化を測定することによりがんマーカーの量を測定し、これを閾値と比較して該リンパ節へのがんの転移を判定する装置について説明する。
まず、図２及び図３に示すように、予め切除組織を処理（ホモジナイズ、ろ過など）して作製された可溶化抽出液（以下、試料という）が収容された試料容器２２を試料容器セット孔２１ｃ〜２１ｊにセットする。また、陽性コントロールが収容された容器２４及び陰性コントロールが収容された容器２５を、それぞれ、試料容器セット孔２１ａ及び２１ｂ（図３参照）にセットする。また、酵素試薬容器セット孔２１ｋ（図３参照）及びプライマ試薬容器セット孔２１ｌに、それぞれ、ＣＫ１９の増幅のための核酸増幅酵素試薬が収容された酵素試薬容器２６と、ＣＫ１９の増幅のためのプライマ試薬が収容されたプライマ試薬容器２７とをセットする。また、チップセット部３０に、それぞれ３６本の使い捨て用のピペットチップ３１が収納された２つのラック３２を設置する。
核酸増幅測定装置１０１の動作がスタートすると、まず、図２に示した移送部６０により分注機構部１０のアーム部１１が初期位置からチップセット部３０に移動された後、チップセット部３０において、分注機構部１０の２つのシリンジ部１２が下方向に移動される。これにより、２つのシリンジ部１２のノズル部の先端が２つのピペットチップ３１の上部開口部内に圧入されるので、２つのシリンジ部１２のノズル部の先端にピペットチップ３１が自動的に装着される。そして、２つのシリンジ部１２が上方に移動された後、分注機構部１０のアーム部１１は、ＣＫ１９のプライマ試薬が収容されたプライマ試薬容器２７の上方に向かってＸ軸方向に移動される。そして、プライマ試薬容器２７の上方に位置する一方のシリンジ部１２が下方向に移動されてプライマ試薬が吸引された後、その一方のシリンジ部１２が上方向に移動される。その後、他方のシリンジ部１２が同じプライマ試薬容器２７の上方に位置するように、移送部６０により分注機構部１０のアーム部１１がＹ軸方向に移動される。そして、他方のシリンジ部１２が下方向に移動されて同じプライマ試薬容器２７からプライマ試薬が吸引された後、その他方のシリンジ部１２が上方向に移動される。このようにして、シリンジ部１２に装着される２つのピペットチップ３１によりプライマ試薬容器２７内のＣＫ１９のプライマ試薬が吸引される。
プライマ試薬の吸引後、２つのシリンジ部１２が上方に移動された後、分注機構部１０のアーム部１１は、移送部６０により最も奥側（装置正面奥側）であるセルセット位置１に位置する反応検出ブロック５０ａの上方に移動される。そして、最も奥側の反応検出ブロック５０ａにおいて、２つのシリンジ部１２が下方向に移動されることにより、２つのシリンジ部１２に装着された２つのピペットチップ３１が、それぞれ、検出セル５４の２つのセル部５４ａ内に挿入される。そして、シリンジ部１２を用いて、ＣＫ１９のプライマ試薬がそれぞれ２つのセル部５４ａに吐出される。
プライマ試薬の吐出後、２つのシリンジ部１２が上方に移動された後、分注機構部１０のアーム部１１は、移送部６０によりチップ廃棄部４０の上方に向かってＸ軸方向に移動される。そして、チップ廃棄部４０において、ピペットチップ３１の廃棄が行われる。具体的には、２つのシリンジ部１２が下方向に移動されることにより、チップ廃棄部４０の２つのチップ廃棄孔４０ａ（図３参照）内にピペットチップ３１が挿入される。この状態で、分注機構部１０のアーム部１１が移送部６０によりＹ軸方向に移動されることにより、ピペットチップ３１が溝部４０ｂの下に移動される。そして、２つのシリンジ部１２が上方向に移動されることにより、ピペットチップ３１の上面のつば部は、溝部４０ｂの両側の下面に当接してその下面から下方向の力を受けるので、ピペットチップ３１が２つのシリンジ部１２のノズル部から自動的に脱離される。これにより、ピペットチップ３１がチップ廃棄部４０に廃棄される。
次に、同様の動作により、酵素試薬容器２６から酵素試薬が上記のセル部５４ａに吐出され、さらに同様の動作により、試料容器２２及び試料容器２３から試料が上記のセル部５４ａに吐出される。
そして、上記のセル部５４ａ内へのプライマ試薬、酵素試薬、試料の吐出が行われた後、検出セル５４の蓋部５４ｂの蓋閉め動作が行われる。この蓋閉め動作が完了した後、検出セル５４内の液温を約２０℃から約６５℃に加温することにより、ＲＴ−ＬＡＭＰ反応によりがんマーカー（ｍＲＮＡ）に対応するｃＤＮＡを増幅する。そして、増幅に伴い生成されるピロリン酸マグネシウムによる白濁を比濁法により検出する。具体的には、図３に示したＬＥＤ光源部５２ａ及びフォトダイオード受光部５２ｂを用いて、増幅反応時の検出セル５４内の濁度を検出（モニタリング）することによって、濁度の検出を行う。
試料の濁度データは、核酸増幅測定装置１０１からパーソナルコンピュータ１０２へリアルタイムに送信される。パーソナルコンピュータ１０２のＣＰＵ１０２ｄは、試料の濁度データを予め決められた閾値と比較することによりがんの転移を判定する。
ここで、図４を参照して、パーソナルコンピュータ１０２のＣＰＵ１０２ｄの処理について説明する。まず、ステップＳ１において、ＣＰＵ１０２ｄは、核酸増幅測定装置１０１から試料の濁度データを受信する。次に、ステップＳ２において、ＣＰＵ１０２ｄは、該濁度データと予め設定された閾値とを比較することにより、がん転移が陽性であるか、陰性であるかを判定する。そして、ステップＳ３において、ＣＰＵ１０２ｄは、ステップＳ２において判定された結果を表示部１０２ｃに送信する。
本実施例は、がんマーカーとして、生体から採取されたリンパ節組織中のＣＫ１９のｍＲＮＡの絶対量を測定することによる、がんの転移の判定方法について説明する。
実施例１（定量ＲＴ−ＰＣＲによる乳がんの転移判定）
測定用試料の調製
乳がん由来のがん細胞の転移が組織学的に認められたリンパ節（陽性リンパ節）２４個及び乳がん由来のがん細胞の転移が組織学的に認められなかったリンパ節（陰性リンパ節）５２個を用いて、下記のようにして測定用試料を調製した。
まず、各リンパ節(約５０〜６００ｍｇ／個)に、ＤＭＳＯを含むｐＨ３．４の処理液(２００ｍＭグリシン−ＨＣｌ、５％ Ｂｒｉｊ３５(ポリオキシエチレン(３５)ラウリルエーテル、SIGMA社製)及び２０％ ＤＭＳＯ(和光純薬)を含む）４ｍＬを添加し、ブレンダーでホモジナイズした。得られたホモジネートを10,000×ｇ、室温で１分間遠心分離し、上清２００μＬからRNeasy Miniキット(キアゲン社製、カタログ番号74014)を用いてＲＮＡを抽出・精製して測定用試料を得た。
がんマーカーの測定
上記のようにして得られた陽性リンパ節及び陰性リンパ節からの測定用試料について、下記のプライマを用いて、リアルタイムＰＣＲ装置（ABI Prism(登録商標) 7000 Sequence Detection System、アプライドバイオシステムズ社）を用いてリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行ない、ＣＫ１９のｍＲＮＡの測定を行なった。
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、定量ＲＴ−ＰＣＲキットであるQuanti Tect SYBR Green RT-PCRキット(キアゲン社製、カタログ番号204245)を用い、その使用説明書に従って行なった。反応液の組成及び反応条件は、以下のとおりである。
ＣＫ１９を検出するためのプライマ：
フォワードプライマ：5'-CAGATCGAAGGCCTGAAGGA-3' （配列番号１）
リバースプライマ：5'- CTTGGCCCCTCAGCGTACT-3' （配列番号２）
反応液：
ＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ Ｈ2Ｏ １０．９９μＬ
２×マスターミックス １２．５０μＬ
１００μＭフォワードプライマ(最終濃度５００ｎＭ) ０．１３μＬ
１００μＭリバースプライマ(最終濃度５００ｎＭ) ０．１３μＬ
Quanti Tect RTミックス ０．２５μＬ
測定用試料 １．００μＬ
合計 ２５．００μＬ
反応条件
５０℃、３０分
９５℃、１５分
ＰＣＲ：以下の工程を４０サイクル；
９４℃、１５秒、
６０℃、１分。
反応液の蛍光強度がThreshold（上記のリアルタイムＰＣＲ装置に搭載されたＳＤＳソフトウェアで自動的に設定された値）を超えたときのＰＣＲサイクル数を求め、この値に基づいてｍＲＮＡコピー数を算出した。結果を図５に示す。図５の結果から、閾値を測定用試料当たり５００コピー（図５中の点線で示す）に設定することにより、組織診の結果に合致して乳がんの転移を判定することができることがわかる。
比較例１
ハウスキーピング遺伝子として、上記の測定用試料中のβ−アクチンのｍＲＮＡの量を測定した。測定は実施例１のＣＫ１９のｍＲＮＡの測定と同様にして行った。なお、ＰＣＲに用いたプライマは次のとおりであった。
β−アクチンを検出するためのプライマ：
フォワードプライマ：5'- CCACACTGTGCCCATCTACG-3' （配列番号３）
リバースプライマ：5'- AGGATCTTCATGAGGTAGTCAGTCAG-3' （配列番号４）
実施例１で得られたＣＫ１９のｍＲＮＡのコピー数を、ここで得られたβ−アクチンのｍＲＮＡのコピー数で除した（標準化を行った）結果を図６に示す。
図６の結果から、ＣＫ１９のｍＲＮＡのコピー数を、ハウスキーピング遺伝子であるβ-アクチンのｍＲＮＡのコピー数で除して標準化すると、閾値を０．０００１〜０．００１の間に設定しても、数個の陰性検体を転移陽性と判断してしまう可能性があることがわかる。
実施例２（定量ＲＴ−ＰＣＲによる大腸がんの転移判定）
測定用試料の調製において、大腸がん由来のがん細胞の転移が組織学的に認められたリンパ節（陽性リンパ節）３４個及び大腸がん由来のがん細胞の転移が組織学的に認められなかったリンパ節（陰性リンパ節）４０個を用いた以外は、実施例１と同様にＣＫ１９のｍＲＮＡの絶対量を測定した。
反応液の蛍光強度がThreshold（上記のリアルタイムＰＣＲ装置に搭載されたＳＤＳソフトウェアで自動的に設定された値）を超えたときのＰＣＲサイクル数を求め、この値に基づいてｍＲＮＡコピー数を算出した。結果を図７に示す。図７の結果から、閾値を測定用試料当たり１３０コピーに設定することにより、組織診の結果に合致して大腸がんの転移を判定することができることがわかる。
実施例３（定量ＲＴ−ＰＣＲによる胃がんの転移判定）
測定用試料の調製において、胃がん由来のがん細胞の転移が組織学的に認められたリンパ節（陽性リンパ節）７個及び胃がん由来のがん細胞の転移が組織学的に認められなかったリンパ節（陰性リンパ節）８個を用いた以外は、実施例１と同様にＣＫ１９のｍＲＮＡの絶対量を測定した。
反応液の蛍光強度がThreshold（上記のリアルタイムＰＣＲ装置に搭載されたＳＤＳソフトウェアで自動的に設定された値）を超えたときのＰＣＲサイクル数を求め、この値に基づいてｍＲＮＡコピー数を算出した。結果を図８に示す。図８の結果から、閾値を測定用試料当たり３５０コピーに設定することにより、組織診の結果に合致して胃がんの転移を判定することができることがわかる。
実施例１〜３の結果から、がんの種類によらず、定量ＲＴ−ＰＣＲによるＣＫ１９のｍＲＮＡの絶対量を測定結果から、がんの転移を判定することが可能であることが、明らかとなった。
実施例４（定量ＲＴ−ＬＡＭＰによる乳がんの転移判定）
測定用試料の調製
乳がん由来のがん細胞の転移が組織学的に認められたリンパ節（陽性リンパ節）１９個及び乳がん由来のがん細胞の転移が組織学的に認められなかったリンパ節（陰性リンパ節）４５個を用いて、下記のようにして測定用試料を調製した。
まず、各リンパ節(約５０〜６００ｍｇ／個)に、ＤＭＳＯを含むｐＨ３．４の処理液(２００ｍＭグリシン−ＨＣｌ、５％ Ｂｒｉｊ３５(ポリオキシエチレン(３５)ラウリルエーテル、SIGMA社製)及び２０％ ＤＭＳＯ(和光純薬)を含む）４ｍＬを添加し、ブレンダーでホモジナイズした。得られたホモジネートを10,000×ｇ、室温で１分間遠心分離し、上清２０μLに処理液１８０μLを加えた２００μLを測定用試料とした。
反応液の調製
以下の各成分を混合して13.97μlの反応液を調製した。
750mM トリス緩衝液（pH8.0） 1.00μl
10×Thermopol緩衝液
(ニューイングランドバイオラボラトリー社製) 2.50μl
10mM dNTPs 2.00μl
100mM MgSO4 0.75μl
100mM ジチオスレイトール 1.25μl
2％ Tergitol(シグマアルドリッチジャパン株式会社製) 2.50μl
H2O 3.97μl
酵素試薬の調製
以下の各成分を混合して3.04μlの酵素試薬を調製した。
10U/μl AMV逆転写酵素(プロメガ株式会社製) 0.14μl
8U/μl Bst DNAポリメラーゼ
(ニューイングランドバイオラボラトリー社製) 2.27μl
RNase inhibitor(プロメガ株式会社製) 0.63μl
プライマの調製
以下の各成分を混合して6.00μlのプライマ試薬を調製した。
80pmol/μl forward inner primer 1.00μl
（配列番号５：5'-GGAGTTCTCAATGGTGGCACCAACTACTACACGACCATCCA-3'）
80pmol/μl reverse inner primer 1.00μl
（配列番号６：5'-GTCCTGCAGATCGACAACGCCTCCGTCTCAAACTTGGTTCG-3'）
5pmol/μl forward outer primer 1.00μl
（配列番号７：5'-TGGTACCAGAAGCAGGGG-3'）
5pmol/μl reverse outer primer 1.00μl
（配列番号８：5'-GTTGATGTCGGCCTCCACG-3'）
60pmol/μl forward loop primer 1.00μl
（配列番号９：5'-AGAATCTTGTCCCGCAGG-3'）
60pmol/μl reverse loop primer 1.00μl
（配列番号１０：5'-CGTCTGGCTGCAGATGA-3'）
ＲＴ−ＬＡＭＰ反応液の調製
上記反応液、酵素試薬およびプライマ試薬からなるＲＴ−ＬＡＭＰ反応液を調製した。ＲＴ−ＬＡＭＰ反応液は、ＣＫ１９のｍＲＮＡを鋳型として、ＲＴ−ＬＡＭＰ法によりｃＤＮＡを増幅させるための反応液である。
ＲＴ−ＬＡＭＰ法による核酸増幅及びその測定
上記測定用試料２μlを、ＲＴ−ＬＡＭＰ反応液２３μlに添加して、リアルタイム濁度測定装置（テラメックス社製ＬＡ−２００）を用い、核酸増幅と同時に副産物として生成する不溶性のピロリン酸マグネシウムの白濁をリアルタイムで測定した。
ＲＴ−ＬＡＭＰ法により各測定用試料に含まれるｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡが増幅して濁度が０．１に達するまで時間（検出時間）を測定し、この値に基づいて、ＣＫ１９のｍＲＮＡの絶対量を算出した。結果を図９に示す。図９の結果から、閾値を測定用試料当たり２２０コピーに設定することにより、組織診の結果に合致して乳がんの転移を判定することができることがわかる。
実施例５（定量ＲＴ−ＰＣＲによる大腸がんの転移判定）
測定用試料の調製において、大腸がん由来のがん細胞の転移が組織学的に認められたリンパ節（陽性リンパ節）３４個及び大腸がん由来のがん細胞の転移が組織学的に認められなかったリンパ節（陰性リンパ節）４０個を用いた以外は、実施例４と同様にＣＫ１９のｍＲＮＡの絶対量を測定した。
ＲＴ−ＬＡＭＰ法により各測定用試料に含まれるｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡが増幅して濁度が０．１に達するまで時間（検出時間）を測定し、この値に基づいて、ＣＫ１９のｍＲＮＡの絶対量を算出した。結果を図１０に示す。図１０の結果から、閾値を測定用試料当たり４００コピーに設定することにより、組織診の結果に合致して大腸がんの転移を判定することができることがわかる。
実施例６（定量ＲＴ−ＰＣＲによる胃がんの転移判定）
測定用試料の調製において、胃がん由来のがん細胞の転移が組織学的に認められたリンパ節（陽性リンパ節）７個及び胃がん由来のがん細胞の転移が組織学的に認められなかったリンパ節（陰性リンパ節）８個を用いた以外は、実施例４と同様にＣＫ１９のｍＲＮＡの絶対量を測定した。
ＲＴ−ＬＡＭＰ法により各測定用試料に含まれるｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡが増幅して濁度が０．１に達するまで時間（検出時間）を測定し、この値に基づいて、ＣＫ１９のｍＲＮＡの絶対量を算出した。結果を図１１に示す。図１１の結果から、閾値を測定用試料当たり１４０コピーに設定することにより、組織診の結果に合致して胃がんの転移を判定することができることがわかる。
実施例４〜６の結果から、がんの種類によらず、定量ＲＴ−ＬＡＭＰによるＣＫ１９のｍＲＮＡの絶対量を測定結果から、がんの転移を判定することが可能であることが、明らかとなった。
以上より、標準化を行わず、がんマーカーの絶対量を用いてがん転移を判定することにより正確に判定結果を得られることがわかった。また、本発明の判定方法は、対象とするがんの種類及び用いる核酸増幅法の種類を問わず、有効な判定を行うことができることが明らかとなった。
本発明の一実施形態による判定装置の全体構成を示した斜視図である。 図１に示した判定装置の測定手段としての核酸増幅測定装置の全体構成を示した斜視図である。 図２の核酸増幅測定装置の概略平面図である。 本発明の一実施形態による判定装置の判定手段としてのパーソナルコンピュータのＣＰＵの転移判定フローである。 実施例１において算出された、乳がんのリンパ節組織中のＣＫ１９のｍＲＮＡのコピー数を示すグラフである。 比較例１において算出された、乳がんのリンパ節組織中のＣＫ１９のｍＲＮＡの標準化された値を示すグラフである。 実施例２において算出された、大腸がんのリンパ節組織中のＣＫ１９のｍＲＮＡのコピー数を示すグラフである。 実施例３において算出された、胃がんのリンパ節組織中のＣＫ１９のｍＲＮＡのコピー数を示すグラフである。 実施例４において算出された、乳がんのリンパ節組織中のＣＫ１９のｍＲＮＡのコピー数を示すグラフである。 実施例５において算出された、大腸がんのリンパ節組織中のＣＫ１９のｍＲＮＡのコピー数を示すグラフである。 実施例６において算出された、胃がんのリンパ節組織中のＣＫ１９のｍＲＮＡのコピー数を示すグラフである。
符号の説明
１ がんの転移判定装置
１０１ 核酸増幅測定装置
５１ 反応部
５２ 濁度検出部
１０２ パーソナルコンピュータ
１０２ｃ 表示部
１０２ｄ ＣＰＵ

Claims (10)

  1. 生体から採取された組織又は細胞中のがんマーカーの絶対量を測定する測定工程；及び前記測定された絶対量と予め決められた閾値とを比較することにより前記組織又は前記細胞が属する組織へのがんの転移を判定する判定工程
    を含む、がんの転移の判定方法。
  2. 生体から採取された組織又は細胞中のがんマーカーの絶対量を反映する情報を測定する測定工程；及び
    前記測定された絶対量を反映する情報を、前記がんマーカー以外の分子の絶対量による標準化を行わずに、予め決められた閾値と比較することにより前記組織又は前記細胞が属する組織へのがんの転移を判定する判定工程
    を含む、がんの転移の判定方法。
  3. 前記組織がリンパ節組織である請求項１又は２に記載の判定方法。
  4. 前記がんマーカーの測定が、前記組織又は細胞に処理液を添加し、前記組織又は細胞に含まれるがんマーカーを溶液中に移行させることによって調製された測定用試料を用いて行われ、
    前記測定用試料が核酸抽出処理を行うことなく調製されたものである請求項１〜３のいずれか１つに記載の判定方法。
  5. 前記処理液が、ジメチルスルホキシドを含む請求項４に記載の判定方法。
  6. 前記測定が、核酸増幅法により行われる請求項１〜５のいずれか１つに記載の判定方法。
  7. 前記がんマーカーがｍＲＮＡである請求項１〜６のいずれか１つに記載の判定方法。
  8. 前記ｍＲＮＡがサイトケラチンのｍＲＮＡである請求項７に記載の判定方法。
  9. 前記がんが乳がん、胃がん、食道がん、大腸がん及び前立腺がんから選択される請求項１〜８のいずれか１つに記載の判定方法。
  10. 生体から採取された組織又は細胞中のがんマーカーの絶対量を測定する測定手段；及び前記測定された絶対量と予め決められた閾値とを比較することにより前記組織又は前記細胞が属する組織へのがんの転移を判定する判定手段
    を含む、がんの転移の判定装置。
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