JP2020080807A - ノロウイルスの検出方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】簡便なノロウイルスの検出方法および該方法を実行するためのキットの提供。【解決手段】逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ、ＲＴ−ＰＣＲ）によるノロウイルスを検出する方法であって、検体を、検体処理液とＲＴ−ＰＣＲ反応液との混合液であって、ジメチルスルホキシドをさらに含む前記混合液と混合することにより、ノロウイルスを検出する方法、および該方法を実行するためのキット。【選択図】なし
Description
本発明は、逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（reverse transcription-polymerase chain reaction、ＲＴ−ＰＣＲ）によるノロウイルスを検出する方法、および該方法を実行するためのキットに関する。より具体的には、検体を、検体処理液とＲＴ−ＰＣＲ反応液との混合液であって、ジメチルスルホキシド（dimethyl sulfoxide、ＤＭＳＯ）をさらに含む前記混合液と混合することにより、ノロウイルスを検出する方法、および該方法を実行するためのキットに関する。
ノロウイルスはヒトカリシウイルス科に属するＲＮＡウイルスであり、約７０００塩基の１本鎖ＲＮＡをゲノムにもつ。このウイルスは、電子顕微鏡で観察される形態学的分類により小型球形ウイルス（Small Round Structured Virus, SRSV）とも呼ばれ、またノーウォーク様ウイルス（Norwalk-like virus）という属名で呼ばれてきたウイルスである。ノロウイルスに属するウイルスは、ジェノグループ（Genogroup）（ＧＩ）およびジェノグループＩＩ（ＧＩＩ）の２種の遺伝子群に分類され、さらにそれぞれ１４および１７またはそれ以上の遺伝子型（genotype）に分類される。
ノロウイルスがヒトに感染すると、嘔吐、下痢などの急性胃腸炎症状を起こす。本邦における年間の食中毒患者の約半数はノロウイルスに起因し、このうち約７割は１１月〜２月に発生しており、ノロウイルスは冬型の胃腸炎および食中毒の原因ウイルスとして知られている。ノロウイルスによる食中毒は、主に、調理者を通じた食品の汚染により発生する。ノロウイルスは感染力が強く、大規模な食中毒など集団発生を起こしやすい。ヒトへの感染経路は、主に経口感染である。感染者の糞便または吐物およびこれらに直接的または間接的に汚染された物品類、また、ノロウイルスにより汚染されたカキまたはその他の二枚貝類などの食品類が感染源の代表的なものとして挙げられる。このため、ノロウイルス感染患者や該ウイルスによる汚染物を特定することは、ウイルス感染の拡大を防止するために重要である。
ウイルスによる感染や汚染を検出するためのウイルス検査としては、ウイルス抗原を検出する免疫学的測定法やウイルス遺伝子増幅法が用いられる（特許文献１〜３、非特許文献１）。ノロウイルスを高感度に測定する手段としては、ノロウイルスのＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲで増幅し、増幅産物量を測定する方法があげられる。例えば、厚生労働省医薬食品局食品***監視安全課による通知（非特許文献２および３）に準拠して、ＲＴ−ＰＣＲ法によるノロウイルスの検出およびリアルタイムＰＣＲ法によるノロウイルスの定量的検出が広く行われている。
ＲＮＡウイルス粒子は、ＲＮＡゲノムとタンパク質からなるコアが、カプシドと呼ばれるタンパク質の殻に封入された基本構造を持つ。このため、遺伝子増幅法によりウイルスＲＮＡを検出するためには、ウイルス粒子よりＲＮＡを抽出する必要がある。検体として糞便中のノロウイルスを検出するには、例えば、糞便検体を蒸留水または生理食塩水に５〜１０％（ｗ／ｖ）の濃度で懸濁し、その遠心上清から、市販のウイルスＲＮＡ抽出キット（例えば、QIAamp（登録商標） Viral RNA Mini、QIAGEN社）を用いてＲＮＡを抽出・精製する（非特許文献２）。しかしながら、多段階のＲＮＡの抽出・精製操作の後にＲＴ−ＰＣＲを行う検出過程は煩雑である。このため、糞便懸濁液を検体処理液と混合し、短時間熱処理することにより殻タンパク質を除去し、内部のＲＮＡを遊離させて、遊離させたＲＮＡを直接ＲＴ−ＰＣＲに供する簡易な検出法が提案されている（非特許文献４）。一方、糞便懸濁液と検体処理液との混合物を熱処理するためには、該混合物の突沸や蒸散を防ぐために反応容器を蓋により密閉し、熱処理後に蓋を外してＲＴ−ＰＣＲ反応液を添加する手間を要する。この点を改善するため、検体をグアニジン塩などのカオトロピック剤と混合することにより、熱処理を行うことなくＲＴ−ＰＣＲによりウイルスを検出する方法が提案されている（特許文献４）。
Kageyama T, et al. Broadly reactive and highly sensitive assay for Norwalk-like viruses based on real-time quantitative reverse transcription-PCR. J Clin Microbiol. 2003 Apr;41(4):1548-57.
厚生労働省医薬食品局食品***監視安全課 食安監発第１１０５００１号（平成１５年１１月５日）別添「ノロウイルスの検出法について」、最終改正：食安監発０５１４００４号（平成１９年５月１４日）
厚生労働省医薬食品局食品***監視安全課 食安監発第１１０５００１号（平成１５年１１月５日）別添「ノロウイルスの検出法について」、最終改正：食安監発１０２２第１号（平成２５年１０月２２日）
Nishimura N, et al. Detection of noroviruses in fecal specimens by direct RT-PCR without RNA purification. J Virol Methods. 2010 Feb;163(2):282-286.
本発明の目的は、簡便なノロウイルスの検出方法を提供することにある。具体的には、検体を、検体処理液とＲＴ−ＰＣＲ反応液との混合液であって、ジメチルスルホキシド（dimethyl sulfoxide、ＤＭＳＯ）をさらに含む前記混合液と混合することにより、簡便にノロウイルスを検出する方法、および該方法を実行するためのキットを提供することにある。
本発明の目的は、以下の発明により達成される。
〔１〕
検体を、検体処理液と１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液との混合液であって、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）をさらに含む前記混合液と混合し、ＲＴ−ＰＣＲ反応により検体中のノロウイルスを検出する方法。
〔２〕
前記ノロウイルス遺伝子型が、ジェノグループＩ（ＧＩ）またはジェノグループＩＩ（ＧＩＩ）である、〔１〕に記載の方法。
〔３〕
前記検体が、生物試料、生物由来試料、環境試料および環境由来試料からなる群より選ばれる試料に由来する、〔１〕または〔２〕に記載の方法。
〔４〕
前記検体が、***物試料、***物由来試料、嘔吐物および嘔吐物由来試料からなる群より選ばれる試料に由来する、〔１〕または〔２〕に記載の方法。
〔５〕
前記検体が、〔４〕に記載の試料を、水、生理食塩水または緩衝液に懸濁した懸濁液である、〔１〕または〔２〕に記載の方法。
〔６〕
前記検体が、〔５〕に記載の懸濁液を遠心分離することにより得られた遠心上清である、〔１〕または〔２〕に記載の方法。
〔７〕
前記検体処理液が、ノロウイルス検出試薬キット（プローブ法）（島津製作所、製品番号241-09325シリーズ）に含まれるSample Treatment Reagentであり、前記１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液が、前記キットに含まれるNoV Reagent A、BおよびCの混合物であって、逆転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼを含む反応液である、〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の方法。
〔８〕
前記検体処理液と前記１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液との混合比が、体積比として３：４〜６である、〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載の方法。
〔９〕
前記ＤＭＳＯが、前記検体処理液と前記１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液との混合液に、１〜５％（ｖ／ｖ）の濃度で含まれる、〔１〕〜〔８〕のいずれかに記載の方法。
〔１０〕
前記検体と、ＤＭＳＯをさらに含む前記混合液との混合比が、体積比として１：２０〜３０である、〔１〕〜〔９〕のいずれかに記載の方法。
〔１１〕
前記逆転写酵素が、ＡＭＶ逆転写酵素、ＭＭＬＶ逆転写酵素、ＨＩＶ逆転写酵素およびこれらの変異体からなる群より選ばれる、〔７〕に記載の方法。
〔１２〕
前記ＤＮＡポリメラーゼが、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼおよびこれらの変異体からなる群より選ばれる、〔７〕に記載の方法。
〔１３〕
前記ＲＴ−ＰＣＲ反応が、リアルタイム測定によりモニターされる、〔１〕〜〔１２〕のいずれかに記載の方法。
〔１４〕
前記リアルタイム測定が、蛍光フィルターを用いてＲＴ−ＰＣＲ産物の増幅曲線を測定することにより、検体におけるノロウイルスの存在が陽性であること、または陰性であることを判定する結果を与える、〔１〕〜〔１３〕のいずれかに記載の方法。
〔１５〕
検体処理液ならびに逆転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼを含む１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液を含み、前記検体処理液と前記１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液との混合液に１〜５％（ｖ／ｖ）のＤＭＳＯを含むように構成された、ノルウイルスの検出キット。
〔１６〕
ノロウイルス遺伝子型が、ジェノグループＩ（ＧＩ）であること、またはジェノグループＩＩ（ＧＩＩ）であることを判定する、〔１５〕に記載のキット。
〔１７〕
さらにキットの操作手順書を含む、〔１５〕または〔１６〕に記載のキット。
〔１〕
検体を、検体処理液と１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液との混合液であって、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）をさらに含む前記混合液と混合し、ＲＴ−ＰＣＲ反応により検体中のノロウイルスを検出する方法。
〔２〕
前記ノロウイルス遺伝子型が、ジェノグループＩ（ＧＩ）またはジェノグループＩＩ（ＧＩＩ）である、〔１〕に記載の方法。
〔３〕
前記検体が、生物試料、生物由来試料、環境試料および環境由来試料からなる群より選ばれる試料に由来する、〔１〕または〔２〕に記載の方法。
〔４〕
前記検体が、***物試料、***物由来試料、嘔吐物および嘔吐物由来試料からなる群より選ばれる試料に由来する、〔１〕または〔２〕に記載の方法。
〔５〕
前記検体が、〔４〕に記載の試料を、水、生理食塩水または緩衝液に懸濁した懸濁液である、〔１〕または〔２〕に記載の方法。
〔６〕
前記検体が、〔５〕に記載の懸濁液を遠心分離することにより得られた遠心上清である、〔１〕または〔２〕に記載の方法。
〔７〕
前記検体処理液が、ノロウイルス検出試薬キット（プローブ法）（島津製作所、製品番号241-09325シリーズ）に含まれるSample Treatment Reagentであり、前記１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液が、前記キットに含まれるNoV Reagent A、BおよびCの混合物であって、逆転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼを含む反応液である、〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の方法。
〔８〕
前記検体処理液と前記１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液との混合比が、体積比として３：４〜６である、〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載の方法。
〔９〕
前記ＤＭＳＯが、前記検体処理液と前記１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液との混合液に、１〜５％（ｖ／ｖ）の濃度で含まれる、〔１〕〜〔８〕のいずれかに記載の方法。
〔１０〕
前記検体と、ＤＭＳＯをさらに含む前記混合液との混合比が、体積比として１：２０〜３０である、〔１〕〜〔９〕のいずれかに記載の方法。
〔１１〕
前記逆転写酵素が、ＡＭＶ逆転写酵素、ＭＭＬＶ逆転写酵素、ＨＩＶ逆転写酵素およびこれらの変異体からなる群より選ばれる、〔７〕に記載の方法。
〔１２〕
前記ＤＮＡポリメラーゼが、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼおよびこれらの変異体からなる群より選ばれる、〔７〕に記載の方法。
〔１３〕
前記ＲＴ−ＰＣＲ反応が、リアルタイム測定によりモニターされる、〔１〕〜〔１２〕のいずれかに記載の方法。
〔１４〕
前記リアルタイム測定が、蛍光フィルターを用いてＲＴ−ＰＣＲ産物の増幅曲線を測定することにより、検体におけるノロウイルスの存在が陽性であること、または陰性であることを判定する結果を与える、〔１〕〜〔１３〕のいずれかに記載の方法。
〔１５〕
検体処理液ならびに逆転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼを含む１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液を含み、前記検体処理液と前記１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液との混合液に１〜５％（ｖ／ｖ）のＤＭＳＯを含むように構成された、ノルウイルスの検出キット。
〔１６〕
ノロウイルス遺伝子型が、ジェノグループＩ（ＧＩ）であること、またはジェノグループＩＩ（ＧＩＩ）であることを判定する、〔１５〕に記載のキット。
〔１７〕
さらにキットの操作手順書を含む、〔１５〕または〔１６〕に記載のキット。
本発明によれば、ノロウイルスを含む糞便などの検体を、検体処理液と１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液との混合液であって、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）をさらに含む混合液に直接添加することにより、ノロウイルスからのＲＮＡ遊離、ＲＴ−ＰＣＲ反応およびＲＴ−ＰＣＲ産物の検出を同一容器内で連続的に行うことができるので、簡便にウイルス検出を行うことができる。さらに本発明の方法では、ノロウイルス粒子からＲＮＡを遊離させるために、従来必要であった熱処理が不要であり、より簡便性が向上する。
本発明は、検体中のノロウイルスを検出する方法を提供する。該方法は、検体を、検体処理液と１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液との混合液であって、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）をさらに含む前記混合液と混合し、ＲＴ−ＰＣＲ反応により検体中のノロウイルスを検出する方法である。
本発明において、検体中の検出対象となるノロウイルスは、ゲノムとしてＲＮＡを持つＲＮＡウイルスであり、脂質二重層からなる膜であるエンベロープを持たないウイルスである。エンベロープは主成分が脂質であるため、アルコールなどの有機溶媒や界面活性剤により容易に破壊されるが、このようなエンベロープを持たないノロウイルスなどのＲＮＡウイルスは、一般的に有機溶媒や界面活性剤に対して抵抗性を示す。
本発明における検体としては、生物試料、生物由来試料、環境試料および環境由来試料などが挙げられる。生物試料としては、貝類の中腸腺などを含む動植物組織および血液、唾液、鼻汁、組織分泌液などの体液が含まれる。特に貝類は、ノロウイルスによる食中毒の原因食品として最も重要視されている。生物由来試料としては、前記生体試料に対して、例えばソニケーションなどの処理をしたものが含まれる。環境試料としては、大気、土壌、塵埃、水などを含むあらゆる試料が挙げられる。環境由来試料としては、前記環境試料に対して、例えばソニケーションなどの処理をしたものが含まれる。
本発明の別の実施態様として、検体としては、***物試料、***物由来試料、嘔吐物試料および嘔吐物由来試料などが挙げられる。***物試料および嘔吐物試料は、蒸留水、生理食塩水または緩衝液に、５〜１０％（ｗ／ｖ）で懸濁して乳剤とし、この乳剤を検体としてもよい。前記緩衝液としては、特に限定されないが、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、ホウ酸緩衝液、ＨＥＰＥＳなどのグッド（Ｇｏｏｄ）緩衝液が挙げられる。前記乳剤は、例えば10000〜12000 rpmで２〜２０分間遠心分離を行い、得られた遠心上清を検体として用いることもできる。
***物由来試料および嘔吐物由来試料には、拭き取り試料が含まれる。拭き取り試料とは、ウイルス汚染の確認を目的として、手指、食器、まな板、包丁、調理設備、トイレ設備、住宅設備などを綿棒、カット綿などで拭き取ったものをリン酸緩衝液などに溶出させたものである。得られた溶出液は超遠心分離し、遠心沈渣を懸濁または溶解したものを検体として使用することができる（宗村佳子ら、食品衛生学雑誌、2017 年 58 巻 4 号 p.201-204）。
本発明において使用される検体処理液および１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液は、市販されるノロウイルス検出試薬キット（プローブ法）（島津製作所、製品番号241-09325シリーズ、241-09325-91または241-09325-92）に含まれる試薬を組み合わせることが好ましい。検体処理液としては、本キットに含まれるSample Treatment Reagentを用いることができる。１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液としては、本キットに含まれるNoV Reagent A、BおよびCの混合物を用いることができる。NoV Reagent Aは、マグネシウムイオン、カリウムイオンおよびトリスを含有する。NoV Reagent Bは、逆転写反応プライマーおよびＰＣＲプライマーを含む。NoV Reagent Cは、逆転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼを含む。１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応においては、逆転写酵素とＤＮＡポリメラーゼがあらかじめ混合されていることより、逆転写反応（１本鎖ｃＤＮＡ合成）およびＰＣＲを同一容器内で行うことができる。前記検体処理液と前記１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液との混合比は、体積比として３：４〜６が好ましく、３：５〜５.２がより好ましい。
前記１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液に含まれる逆転写酵素は、ウイルスＲＮＡを鋳型として、１本鎖の相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を生成する酵素であり、逆転写反応を触媒する限り特に限定されないが、トリ骨髄芽球症ウイルス（Avian Myeloblastosis Virus、AMV）、モロニーマウス白血病ウイルス（Moloney Murine Leukemia Virus、M-MLV）およびヒト免疫不全ウイルス（Human Immunodeficiency Virus、HIV）などのＲＮＡウイルス由来のＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼならびにこれらの変異体を使用することができる。
前記１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液に含まれるＤＮＡポリメラーゼは、好熱性細菌由来の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼであり、Ｔａｑ、Ｔｔｈ、ＫＯＤ、Ｐｆｕおよびこれらの変異体を使用することができるが、これらに限定されない。ＤＮＡポリメラーゼによる非特異的増幅を避けるため、ホットスタートDNAポリメラーゼを使用してもよい。ホットスタートＤＮＡポリメラーゼは、例えば抗ＤＮＡポリメラーゼ抗体が結合したＤＮＡポリメラーゼまたは酵素活性部位を熱感受性化学修飾したＤＮＡポリメラーゼであり、ＰＣＲにおいて、最初の変性ステップ（９０℃以上）を経た後にＤＮＡポリメラーゼが活性化される酵素である。
前記１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液には、逆転写反応およびＰＣＲが適切な条件で遂行されるためのすべての成分が含まれる。該成分として、少なくとも前記逆転写酵素、逆転写反応プライマー、前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、ＰＣＲプライマー、ｄＮＴＰミックス（deoxyribonucleotide 5’-triphosphate；ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰからなる混合物）および緩衝液が含まれる。前記反応液には、ＲＮＡ分解酵素阻害剤を添加することもできる。逆転写反応プライマーとしては、標的ＲＮＡの配列に特異的なプライマー、オリゴ（ｄＴ）プライマーまたはランダムプライマーを使用することができる。ＰＣＲプライマーとしては、逆転写反応により生成したｃＤＮＡの配列に特異的なプライマー対（フォワードおよびリバース）が使用される。ＰＣＲプライマーは、標的ＲＮＡの配列に特異的な前記逆転写反応プライマーと同一であってもよい。また、前記１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液には、増幅するＤＮＡ領域、すなわち標的配列の数に応じて２種類以上のＰＣＲプライマーを添加してもよい。前記成分を含んだ組成物として、市販のノロウイルス検出試薬キット（プローブ法）（島津製作所、製品番号241-09325シリーズ、241-09325-91または241-09325-92）に含まれるNoV Reagent A、BおよびCを、キット取扱説明書にしたがって混合した混合物を、１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液として使用することができる。
ノロウイルスＲＮＡを検出する場合、例えば、特許文献１および２、非特許文献３ならびに特開２０１８−７８８０６に記載のＰＣＲプライマーを使用することにより、ノロウイルス遺伝子型におけるジェノグループＩ（ＧＩ）およびジェノグループＩＩ（ＧＩＩ）を検出することができるが、これらに限定されない。前記ノロウイルス検出試薬キット（プローブ法）には、非特許文献３に記載のＰＣＲプライマーが含まれる。
本発明では、ノロウイルスからＲＮＡを遊離させるために、従来必要であった、例えば９０℃の熱処理を行う工程は必要ではない。本発明では、検体を、前記検体処理液と前記１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液との混合液に直接添加して、ＲＴ−ＰＣＲ反応によりノロウイルスを検出することができる。これは、前記混合液に、好ましくは１〜５％（ｖ／ｖ）の終濃度でＤＭＳＯを添加することにより可能となる。ＤＭＳＯは、終濃度が１〜５％（ｖ／ｖ）になる限りは、前記検体処理液もしくは前記１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液に添加してもよく、または前記混合液に添加してもよい。前記混合液におけるＤＭＳＯのより好ましい終濃度は、２％（ｖ／ｖ）である。
ノロウイルスからのＲＮＡ遊離を効率よく行い、また１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応によるノロウイルス検出を感度良く行うために、前記検体と、ＤＭＳＯを含む前記混合液との混合比は、体積比として１：２０〜３０が好ましく、１：２５がより好ましい。
ＲＴ−ＰＣＲにおける逆転写反応の反応温度条件、およびＰＣＲ条件（温度、時間およびサイクル数）の設定は、当業者であれば容易に行うことができる。
本発明では、ＲＴ−ＰＣＲ反応において、ＰＣＲ産物はリアルタイム測定によりモニターされる。該リアルタイム測定を行う場合、ＲＴ−ＰＣＲおよび該ＲＴ−ＰＣＲ産物を検出する工程は同一容器内で行われる。
ＰＣＲ産物のリアルタイム測定は、リアルタイムＰＣＲとも呼ばれる。リアルタイムＰＣＲ では、通常ＰＣＲ増幅産物を蛍光により検出する。蛍光検出方法には、インターカレーター性蛍光色素を用いる方法および蛍光標識プローブを用いる方法がある。インターカレーター性蛍光色素としては、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｉが使用されるが、これに限定されるわけではない。インターカレーター性蛍光色素は、ＰＣＲによって合成された二本鎖ＤＮＡに結合し、励起光の照射により蛍光を発する。この蛍光強度を測定することにより、ＰＣＲ増幅産物の生成量を測定することができる。
蛍光標識プローブとしては、TaqManプローブ、Molecular Beacon、サイクリングプローブなどが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。TaqManプローブは、5’末端が蛍光色素で、また3’末端がクエンチャー物質で修飾されたオリゴヌクレオチドである。TaqManプローブは、ＰＣＲのアニーリングステップで鋳型ＤＮＡに特異的にハイブリダイズするが、プローブ上にクエンチャーが存在するため、励起光を照射しても蛍光の発生は抑制される。その後の伸長反応ステップで、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼのもつ５‘→３’エキソヌクレアーゼ活性により、鋳型ＤＮＡにハイブリダイズしたTaqManプローブが分解されると、蛍光色素がプローブから遊離し、クエンチャーによる蛍光の発生の抑制が解除されて蛍光を発する。この蛍光強度を測定することにより、増幅産物の生成量を測定することができる。前記蛍光色素としては、ＦＡＭ、ＲＯＸ、Ｃｙ５が挙げられるが、これらに限定されない。前記クエンチャーとしては、TAMRA（登録商標）およびMGBが挙げられるが、これらに限定されない。２種類以上のＤＮＡ標的配列を区別して検出するためには、それぞれ異なる蛍光色素を結合させた２種類以上のオリゴヌクレオチドプローブ（例えばTaqManプローブ）を用いてＰＣＲを行う。
ＰＣＲ産物のリアルタイム測定において、使用する蛍光色素に対応した蛍光フィルターを用いてＲＴ−ＰＣＲ産物の増幅曲線をモニターする。ＰＣＲサイクル数に応じて蛍光強度が増加する場合には、検体における分析対象のＲＮＡウイルスの存在が陽性であると判定され、一方、ＰＣＲにおいて蛍光強度が増加しない場合は陰性であると判定される。
本発明の一実施態様において、検体処理液ならびに逆転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼを含む１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液を含み、前記検体処理液と前記１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液との混合液に、１〜５％（ｖ／ｖ）のＤＭＳＯを含むように構成された、ノロウイルスの検出キットが提供される。
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらよって限定されない。
〔ノロウイルスの検出におけるＤＭＳＯの効果〕
（１）検体
ノロウイルス感染患者の糞便を１００ｍｇ採取し、１ｍＬの蒸留水に懸濁して、約１０％（ｗ／ｖ）の糞便乳剤とした。該糞便乳剤を、微量遠心分離機により１００００ｒｐｍで５分間遠心分離し、得られた遠心上清を検体とした。
（２）反応混合液の調製
反応混合液は、ノロウイルス検出試薬キット（プローブ法）（島津製作所、製品番号241-09325シリーズ）に含まれる試薬を混合することにより調整した。１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液は、本キットのNoV Reagent A、NoV Reagent BおよびNoV Reagent Cから、それぞれ12.5μL、2.5μLおよび0.25μLを採取し、これらを混合することにより調製した。この１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液に、検体処理液として本キットのSample Treatment Reagentから9μLを採取し、添加した。得られた検体処理液と１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液との混合液に、ＤＭＳＯを終濃度が１、２、５または１０％（ｖ／ｖ）になるように添加し、混合して、反応混合液を調製した。
（３）検体と反応液との混合
（２）で調製した反応混合液25μLをＰＣＲ反応チューブに加え、ここに（１）で得られた検体を1μL添加し、リアルタイムＰＣＲ装置（GVP-9600、島津製作所）を用いて、直ちにＲＴ−ＰＣＲ反応をモニターした。反応混合液は、ＰＣＲプライマーとしてＣＯＧ１Ｆ／ＣＯＧ１ＲおよびＣＯＧ２Ｆ／ＣＯＧ２Ｒを、また蛍光標識プローブとしてＧ１Ａ、Ｇ１ＢおよびＧ２を含んだ。
（４）ＲＴ−ＰＣＲ条件
４５℃／５分間の逆転写反応後、９５℃／３分間の初期変性を行い、次いで９５℃／1秒間−５６℃／1０秒間のＰＣＲを４５サイクル行った。ＰＣＲにおける測光は、５６℃／１０秒間のステップで行った。
（５）結果と考察
測光結果を図１に示した。ＤＭＳＯ濃度により、Ct値および蛍光強度が影響を受けることが示された。Ct値は、リアルタイムＰＣＲにおいて、増幅曲線と閾値（Threshold）が交差するサイクル数のことである。ＤＭＳＯ無添加の場合（０％ＤＭＳＯ）と比較し、１、２および５％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯを添加した場合は、Ct値が小さく、また強い蛍光強度が得られた。この作用は、２％ＤＭＳＯの場合で最も強く認められた。反応混合液に１〜５％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯを添加することにより、ＤＭＳＯ無添加の場合と比較して、初発ＤＮＡ量が多いことが示され、ノロウイルスが検出されたことが分かる。
（１）検体
ノロウイルス感染患者の糞便を１００ｍｇ採取し、１ｍＬの蒸留水に懸濁して、約１０％（ｗ／ｖ）の糞便乳剤とした。該糞便乳剤を、微量遠心分離機により１００００ｒｐｍで５分間遠心分離し、得られた遠心上清を検体とした。
（２）反応混合液の調製
反応混合液は、ノロウイルス検出試薬キット（プローブ法）（島津製作所、製品番号241-09325シリーズ）に含まれる試薬を混合することにより調整した。１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液は、本キットのNoV Reagent A、NoV Reagent BおよびNoV Reagent Cから、それぞれ12.5μL、2.5μLおよび0.25μLを採取し、これらを混合することにより調製した。この１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液に、検体処理液として本キットのSample Treatment Reagentから9μLを採取し、添加した。得られた検体処理液と１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液との混合液に、ＤＭＳＯを終濃度が１、２、５または１０％（ｖ／ｖ）になるように添加し、混合して、反応混合液を調製した。
（３）検体と反応液との混合
（２）で調製した反応混合液25μLをＰＣＲ反応チューブに加え、ここに（１）で得られた検体を1μL添加し、リアルタイムＰＣＲ装置（GVP-9600、島津製作所）を用いて、直ちにＲＴ−ＰＣＲ反応をモニターした。反応混合液は、ＰＣＲプライマーとしてＣＯＧ１Ｆ／ＣＯＧ１ＲおよびＣＯＧ２Ｆ／ＣＯＧ２Ｒを、また蛍光標識プローブとしてＧ１Ａ、Ｇ１ＢおよびＧ２を含んだ。
（４）ＲＴ−ＰＣＲ条件
４５℃／５分間の逆転写反応後、９５℃／３分間の初期変性を行い、次いで９５℃／1秒間−５６℃／1０秒間のＰＣＲを４５サイクル行った。ＰＣＲにおける測光は、５６℃／１０秒間のステップで行った。
（５）結果と考察
測光結果を図１に示した。ＤＭＳＯ濃度により、Ct値および蛍光強度が影響を受けることが示された。Ct値は、リアルタイムＰＣＲにおいて、増幅曲線と閾値（Threshold）が交差するサイクル数のことである。ＤＭＳＯ無添加の場合（０％ＤＭＳＯ）と比較し、１、２および５％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯを添加した場合は、Ct値が小さく、また強い蛍光強度が得られた。この作用は、２％ＤＭＳＯの場合で最も強く認められた。反応混合液に１〜５％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯを添加することにより、ＤＭＳＯ無添加の場合と比較して、初発ＤＮＡ量が多いことが示され、ノロウイルスが検出されたことが分かる。
〔異なる糞便検体におけるＤＭＳＯの効果〕
（１）検体
ノロウイルス感染患者の糞便４種類について、実施例１と同様にして、それぞれの遠心上清を得て検体とした。
（２）反応混合液の調製
ＤＭＳＯ濃度を２％（ｖ／ｖ）および０％とした以外は、実施例１と同様にして行った。
（３）検体と反応液との混合およびＲＴ−ＰＣＲ
実施例１と同様にして行った。
（４）結果と考察
測光結果を図２に示した。測定したすべての糞便において、反応混合液に２％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯを添加することにより、ＤＭＳＯ無添加の場合と比較して、Ct値が小さく、また強い蛍光強度が得られることが示された。したがって、本発明の方法により、簡便にノロウイルスを検出することができ、ノロウイルス感染患者を特定できることが分かる。
（１）検体
ノロウイルス感染患者の糞便４種類について、実施例１と同様にして、それぞれの遠心上清を得て検体とした。
（２）反応混合液の調製
ＤＭＳＯ濃度を２％（ｖ／ｖ）および０％とした以外は、実施例１と同様にして行った。
（３）検体と反応液との混合およびＲＴ−ＰＣＲ
実施例１と同様にして行った。
（４）結果と考察
測光結果を図２に示した。測定したすべての糞便において、反応混合液に２％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯを添加することにより、ＤＭＳＯ無添加の場合と比較して、Ct値が小さく、また強い蛍光強度が得られることが示された。したがって、本発明の方法により、簡便にノロウイルスを検出することができ、ノロウイルス感染患者を特定できることが分かる。
Claims (17)
- 検体を、検体処理液と１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液との混合液であって、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）をさらに含む前記混合液と混合し、ＲＴ−ＰＣＲ反応により、検体中のノロウイルスを検出する方法。
- 前記ノロウイルス遺伝子型が、ジェノグループＩ（ＧＩ）またはジェノグループＩＩ（ＧＩＩ）である、請求項１に記載の方法。
- 前記検体が、生物試料、生物由来試料、環境試料および環境由来試料からなる群より選ばれる試料に由来する、請求項１または２に記載の方法。
- 前記検体が、***物試料、***物由来試料、嘔吐物および嘔吐物由来試料からなる群より選ばれる試料に由来する、請求項１または２に記載の方法。
- 前記検体が、請求項４に記載の試料を、水、生理食塩水または緩衝液に懸濁した懸濁液である、請求項１または２に記載の方法。
- 前記検体が、請求項５に記載の懸濁液を遠心分離することにより得られた遠心上清である、請求項１または２に記載の方法。
- 前記検体処理液が、ノロウイルス検出試薬キット（プローブ法）（島津製作所、製品番号241-09325シリーズ）に含まれるSample Treatment Reagentであり、前記１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液が、前記キットに含まれるNoV Reagent A、BおよびCの混合物であって、逆転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼを含む反応液である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
- 前記検体処理液と前記１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液との混合比が、体積比として３：４〜６である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
- 前記ＤＭＳＯが、前記検体処理液と前記１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液との混合液に、１〜５％（ｖ／ｖ）の濃度で含まれる、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
- 前記検体と、ＤＭＳＯをさらに含む前記混合液との混合比が、体積比として１：２０〜３０である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
- 前記逆転写酵素が、ＡＭＶ逆転写酵素、ＭＭＬＶ逆転写酵素、ＨＩＶ逆転写酵素およびこれらの変異体からなる群より選ばれる、請求項７に記載の方法。
- 前記ＤＮＡポリメラーゼが、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼおよびこれらの変異体からなる群より選ばれる、請求項７に記載の方法。
- 前記ＲＴ−ＰＣＲ反応が、リアルタイム測定によりモニターされる、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
- 前記リアルタイム測定が、蛍光フィルターを用いてＲＴ−ＰＣＲ産物の増幅曲線を測定することにより、検体におけるノロウイルスの存在が陽性であること、または陰性であることを判定する結果を与える、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
- 検体処理液ならびに逆転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼを含む１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液を含み、前記検体処理液と前記１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液との混合液に、１〜５％（ｖ／ｖ）のＤＭＳＯを含むように構成された、ノルウイルスの検出キット。
- ノロウイルス遺伝子型が、ジェノグループＩ（ＧＩ）であること、またはジェノグループＩＩ（ＧＩＩ）であることを判定する、請求項１５に記載のキット。
- さらにキットの操作手順書を含む、請求項１５または１６に記載のキット。
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