JP4691014B2 - ハイブリダイゼーションによるランダムアレイｄｎａ分析 - Google Patents

ハイブリダイゼーションによるランダムアレイｄｎａ分析 Download PDF

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Description

1. 関連出願の相互参照
本出願は、代理人整理番号CAL-2として「Random Array DNA Analysis by Hybridization」という表題で2003年2月26日に出願された米国仮出願第60/450,566号について優先権の利益を主張するものである。関連主題は、代理人整理番号30311/39054として「Single Target Molecule Analysis by Compiling Multiple Transient Interactions with Probe Molecules」という表題で2002年12月20日に出願された米国仮出願第60/435,539号について優先権の利益を主張している代理人整理番号CAL-3として「Single Target Molecule Analysis by Compiling Multiple Transient Interactions with Probe Molecules」という表題で2003年12月16日に出願された共有、同時係属の米国特許出願第10/738,108号に開示されている。これらの特許および他の特許すべてならびに本明細書中に引用されている特許出願は、参照により全体として本明細書に組み込まれる。
2. 背景
2.1 技術分野
本発明は、分子を分析するための方法およびそのような分析を行うための装置に関する。これらの方法および装置は、核酸の単一分子の信頼のおける分析を可能にする。そのような単一分子は、個々の成分を分離または濃縮することなく、細胞、組織、土壌、空気、水などの天然試料から得ることができる。本発明の特定の態様において、これらの方法および装置は、核酸配列分析または遺伝子発現を含む核酸定量化を行う際に有用である。
2.2 配列表
本明細書に記載のポリヌクレオチドの配列は、配列表に列挙され、2004年2月26日の午前11時26分18秒にIBM PC、Windows 2000オペレーティングシステムで作成された8.00kb (8.192バイト)の「CAL-2CIP PCT.txt」というラベルのファイルを含むコンパクトディスクで提供される。「CAL-2CIP PCT.txt」という表題の配列表は、参照により全体として本明細書に組み込まれる。配列表「CAL-2CIP PCT.txt」のコンピュータ可読フォーマット(「CRF」)および3枚の複製コピー(「コピー1」、「コピー2」および「コピー3」)が本明細書において提供される。本明細書によって、出願人は、それぞれ37 CFR §1.821(c)および(e)に従って提供される配列表のCRFならびにコピー1、2および3の内容が同一であることを述べる。
2.3 背景
3種類の確立されたDNA配列決定技術が存在する。現在使われている支配的な配列決定法は、サンガーのジデオキシ連鎖停止プロセス(参照により全体として本明細書に組み込まれているSanger他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463 (1977))に基づいており、手動システムから完全自動化キャピラリシークエンサーに渡るまで、様々なゲルに基づく分離装置に依存する。サンガー法は、技術的に難しく、約1kb以下の読み取り長に限定され、高い確度を得るためには多重読み取りが必要である。第二の方法であるパイロシークエンシングも、成長鎖への取り込みについて特定のDNA塩基をテストする連続したサイクルの間に作成されるピロリン酸の産生をモニターすることによって配列情報を作成するためにポリメラーゼを使用する(参照により全体として本明細書に組み込まれているRonaghi、Genome Res. 11:3 (2001))。この方法は、洗練されたマルチウエルプレートアッセイを提供するが、極めて短い10〜50塩基断片の局所配列決定用に過ぎない。この読み取り長制限は、配列に基づく診断にとって重大な制限である。
上記の技術は共に、鎖内の各塩基位置を直接の実験によって順番に決定する直接配列決定法である。ハイブリダイゼーションによる配列決定(SBH) (共に参照により全体として本明細書に組み込まれている米国特許第5,202,231号; Drmanac他、Genomics 4:114 (1989))は、標的DNAにおける塩基の順序を間接的に組み立てるために、相補的核酸の塩基特異的ハイブリダイゼーションの基本的な生命化学反応を使用している。SBHでは、知られている配列の重複プローブを試料DNA分子とハイブリダイズさせ、得られるハイブリダイゼーションパターンを用い、コンピュータアルゴリズムを用いて標的配列を作成する(すべてが参照により全体として本明細書に組み込まれている共有同時係属の米国特許出願第09/874,772号; Drmanac他、Science 260:1649-1652 (1993); Drmanac他、Nat. Biotech. 16:54-58 (1998); Encyclopedia of Analytical Chemistry中のDrmanac他、「Sequencing and Fingerprinting DNA by Hybridization with Oligonucleotide Probes」pp. 5232-5237 (2000); Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology: Chip Technology, Hoheisel, J. (編), Vol. 76中のDrmanac他、「Sequencing by Hybridization (SBH): Advantages, Achievements, and Opportunities」、pp. 75-98 (2002))。プローブまたはDNA標的は、高密度アレイの形態で配列することができる(例えば、参照により全体として本明細書に組み込まれているCutler他、Genome Res. 11:1913-1925 (2001)を参照)。SBHの利点には、実験の簡潔さ、長い読み取り長、高い確度、および単一アッセイにおける多重試料アッセイが含まれる。
最近、複雑な試料においてすべての潜在的病原体を迅速かつ正確に検出、分析、および同定することができる新たな生物兵器防衛技術が極めて必要とされている。一般に、現在の病原体検出技術は、そのような試料中の微量の病原体を正確に同定するための感度および選択性を欠き、操作するのに費用がかかり、かつ困難であることが多い。さらに、現在の実施では、3種類の配列決定技術すべてが大量の試料DNAを必要とする。通常、試料は、いくつか増幅方法のうちの１つ、主にPCRによって調製される。これらの方法、特にSBHは、個々の遺伝子または2〜5遺伝子の混合物について優れた配列に基づく診断を提供することができるものの、DNA増幅およびアレイ調製に関係する大きなコストを伴う。したがって、現在の配列決定法はすべて、複雑な生体試料における総合的な配列に基づく診断およびスクリーニングを、許容できるコストで提供するのに必要とされる速度および効率を欠いている。このことは、現在の技術的能力と新たな配列決定ニーズの間に大きな隔たりを生み出している。適当な診断プロセスが、生物体の間に組換え病原体が隠れている混合物を含む環境また臨床試料中に存在する可能性があるすべての重大な病原体についての同時調査を可能にすることが理想的である。
そのような総合的な病原体診断の必要条件には、数百種類の病原体について10〜100種類の重要な遺伝子または全ゲノムを同時に配列決定し、数千個の試料を処理する必要性が含まれる。最終的に、これには、連続的で系統的な調査を行う研究室にとって、1試料当たりDNA 10〜100 Mb、すなわち1日当たりDNA 100 Mb〜10 Gbを配列決定することが必要となる。現在の配列決定法は、このような総合的病原体診断および発症前調査に必要とされるよりも100倍を超える配列決定処理量の低さと、100倍を超えるコストの高さを有する。
現在のバイオセンサー技術は、抗体、核酸プローブ、アプタマー、酵素、バイオレセプター、および他の小分子リガンドを含む様々な分子認識戦略を使用している(参照により全体として本明細書に組み込まれているIqbal他、Biosensors and Bioelectronics 15:549-578 (2000))。分子認識要素は、レポーター分子またはタグと結合させて陽性検出事象を可能にしなければならない。
DNAハイブリダイゼーションと抗体に基づく技術は共に、病原体診断においてすでに広く使用されている。一般に、核酸に基づく技術は、抗体に基づく検出よりも特異的かつ敏感であるが、時間がかかり強さに劣ることがある(Iqbal他、2000、同上)。一般に、DNA増幅(PCRまたはクローニングによる)またはシグナル増幅は、信頼のおけるシグナル強度を得る必要があり、病原体特異的プローブを構築するためには正確な事前の配列知識が必要とされる。モノクローナル抗体の開発は、イムノアッセイの特異性および信頼性を高めたが、その技術は、比較的費用がかかり、偽陽性シグナルをもたらす傾向がある(共に参照により全体として本明細書に組み込まれているDoing他、J. Clin. Microbiol. 37:1582-1583 (1999); Marks、Clin. Chem. 48:2008-2016 (2002))。ファージディスプレイ、アプタマーおよび小分子リガンドなどの他の分子認識技術は、依然として開発の初期段階にあり、すべての病原体検出問題に対処するのに十分な程に多用途ではない。
現在の診断技術すべての主な欠点は、試料中のすべての潜在的病原体を検出および同定するための感度および汎用性を欠くことである。兵器設計者は、大部分の病原体特異的プロープまたはイムノアッセイを駄目にするための新たな生物戦争医薬を容易に設計することができる。効率的な配列に基づく診断法が緊急に必要なことは明らかである。
この目的で、出願人は、高効率ゲノム配列決定システム、ハイブリダイゼーションによるランダムDNAアレイに基づく配列決定(rSBH)を開発した。rSBHは、複雑な微生物群に存在するゲノムすべてのゲノム配列分析ならびに個々のヒトゲノム配列決定に有用なことがある。rSBHは、DNAクローニングまたはDNA分離の必要性をなくし、当技術分野において知られている方法を用いる配列決定のコストを軽減する。
4. 発明の概要
本発明は、任意の長いDNA断片、断片の混合物、全遺伝子、遺伝子の混合物、mRNAの混合物、染色体の長いセグメント、全染色体、染色体の混合物、全ゲノム、またはゲノムの混合物を迅速かつ正確に配列決定するためにDNAの単一分子を分析することができる新規な方法、組成物または混合物および装置を提供する。さらに、本発明は、標的核酸内の核酸配列を同定するため方法を提供する。連続した一時的ハイブリダイゼーションにより、蓄積されたデータから正確かつ広範な配列情報が得られる。例示的実施形態では、単一標的分子を、プローブまたはプローブの集団と一時的にハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションが１種または複数のプロープについて消滅した後、標的分子を、次のプローブまたはプローブの集団と一時的に再びハイブリダイズさせる。プローブまたはプローブの集団は、前の一時的ハイブリダイゼーションのプローブと同一であるか、あるいは異なっていてもよい。同一の単一標的分子の、同一タイプのプローブの１種または複数の分子との一連の連続的結合を蓄積することにより、信頼のおける測定値が得られる。したがって、プローブと連続して接触するため、単一標的分子は、標的分子内の配列を同定するのに十分な量のデータを提供することができる。データを蓄積することにより、全標的分子の核酸配列を決定することができる。
さらに、本発明によって、複雑な生体試料中に存在する病原体を単一生物体レベルで分析および検出し、病原性を制御する遺伝子すべてを同定するための方法、組成物および装置が提供される。
本発明は、
a)一連の連続的結合反応において標的分子を１種または複数のプローブ分子と接触させるステップと（各会合は、標的分子または１種または複数のプローブ分子に対する効果を生み出す）、
b)前記一連の連続的結合反応の効果を蓄積するステップとを含む標的分子を分析する方法を提供する。
さらに、本発明は、
a)一連の連続的ハイブリダイゼーション/解離反応において標的分子を１種または複数のプローブ分子と接触させるステップと（各会合は、標的分子または１種または複数のプローブ分子に対する効果を生み出す）、
b)前記一連の連続的ハイブリダイゼーション/解離反応の効果を蓄積するステップとを含む標的分子を分析する方法を提供する。
特定の実施形態において、前記一連の反応は、少なくとも5回、少なくとも10回、少なくとも25回、少なくとも50回、少なくとも100回、または少なくとも1000回の連続的ハイブリダイゼーション/解離または結合反応を含む。一実施形態において、この一連の反応は、少なくとも5回および50回未満の連続的ハイブリダイゼーション/解離または結合反応を含む。
本発明には、プローブ分子配列または構造が知られているか、あるいは決定可能である実施形態が含まれる。そのような実施形態の利点の１つは、それらが、知られている/決定可能な配列の１種または複数のプローブの蓄積された効果から標的中の配列を同定する際に有用であることである。さらに、重複している複数配列が標的分子内で同定された場合、そのような同定された重複配列を用い、標的分子を配列決定することができる。
さらに、本発明は、分析における効果の編集に、時間が関与する測定値(すなわち、検出されるタイムシグナルの長さ、事前に設定した時間中のシグナルの検出など)が含まれる標的分子を分析する方法を提供する。特定の実施形態において、効果は、１種または複数の標的分子または１種または複数のプローブ分子が蛍光シグナルを生じる時間を測定することによって蓄積される。
また、本発明によって、標的分子のプローブとのハイブリダイゼーションまたは結合でのみ生成されるシグナルを検出することにより効果を蓄積する方法が提供される。このような方法には、シグナルが生成される時間の量を決定することによって効果を蓄積する方法、および生成されるシグナルの量を決定することによって効果を蓄積する方法が含まれる。特定の実施形態において、１種または複数の標的分子は、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)供与体を含み、１種または複数のプローブ分子は、FRET受容体を含む。他の実施形態において、１種または複数の標的分子は、FRET受容体を含み、１種または複数のプローブ分子は、FRET供与体を含む。
また、本発明は、１種または複数のプロープに対する効果が、１種または複数のプロープの修飾（modification）である方法を提供する。特定の実施形態において、プローブは、ライゲーションされ、この方法は、ライゲーションされたプローブを検出することをさらに含む。プローブは、ナノタグで標識されていてもよい。
１種または複数のプローブに対するハイブリダイゼーションまたは結合の効果が修飾であり、完全マッチハイブリダイゼーションによって引き起こされる修飾が、ミスマッチハイブリダイゼーションによって引き起こされる修飾よりも頻繁に起きる実施形態において、完全マッチは、比較的多い修飾の発生を検出することによって判定可能である。
本発明の方法には、
a)標的分子は、核酸分子の断片化によって生成され、
b)断片化は、制限酵素による消化、超音波処理、水酸化ナトリウム処理、または低圧切断によって得られ、
c)標的分子は、検出可能に標識され、
d)標的分子および/またはプローブ分子は、蛍光標識、ナノタグ、化学発光標識、量子ドット、量子ビーズ、蛍光タンパク質、蛍光標識付きデンドリマー、マイクロトランスポンダー、電子供与体分子または分子構造体、および光反射粒子からなる群から選択される標識で検出可能に標識され、
e)標識は、電荷結合素子(CCD)で検出され、
f)同一の情報領域を有するプローブ分子は各々、同一の検出可能標識と結合され、
g)1種または複数のプローブ分子は、多重標識を含み、
h)プローブ分子は、プールに分けられ、各プールは、異なる情報領域を有する少なくとも2種類のプローブ分子を含み、各プール内のプローブ分子はすべて、他のすべてのプールに比べてそのプールに独特の同一標識と結合しており、
i)標的分子の配列は、標的分子とハイブリダイズする重複プローブ配列を順序付けることによって組み立てられ、
j)標的分子の配列は、重複プローブ配列を順序付け、取り込まれたプローブのハイブリダイゼーション効率から、組み立てられた配列のスコア/可能性/確率を判定することによって組み立てられ、
k)プローブは、各々独立して、情報領域におけるヌクレオチド長は4〜20であり、
l)プローブは、各々独立して、情報領域におけるヌクレオチド長は4〜100であり、
m)結合される分子の標的配列は、約20〜20,000塩基である長さを有し、
n) 1種または複数のプローブは、少なくとも1種類の修飾塩基または普遍塩基からなり、
o) 1種または複数のプローブは、末端位置における少なくとも1種類の普遍塩基からなり、
p)ハイブリダイゼーション条件は、標的分子と、標的分子の一部と完全に相補的であるプローブのみとの間のハイブリダイゼーションを可能にするのに効果的であり、
q)接触は、相互に異なる情報領域を有する少なくとも約10種、少なくとも約100種、少なくとも約1000種、または少なくとも約10,000種のプローブ分子を含み、ならびに／あるいは
r)1000、800、600、400、200、100、75、50、25、または10個未満の標的分子が使用される方法が含まれる。
一実施形態において、本発明の方法は、微生物バイオフィルムにおける微生物ゲノムおよびそれらの成分パーセントを分析するために使用することができる。バイオフィルム群は、レプトスピリラムフェリフィラム(Leptospirillum ferriphilum)ファイロタイプ、フェロスピリラム(Ferrospirillum)属、スルホバチラスサーモスルフィドオキシダンス(Sulfobacillus thermosulfidooxidans)ファイロタイプ、古細菌(フェロプラズマアシダルマヌス(Ferroplasma acidarmanus)、アプラズマ(Aplasma)、ゲネプラズマ(Geneplasma)ファイロタイプを含む)、および真核生物(プロテスト(protests)および真菌を含む)を含む微生物を含む。
さらに、本発明は、インベーダーオリゴヌクレオチドによるプライマーアニーリング用一本鎖DNAの生成に基づく、鎖置換酵素を用いる等温増幅の方法を提供する。
さらに、本発明は、rSBH全ゲノム(複雑なDNA試料)をサポートし、3 Gbp〜10 Gbpもの配列を処理することができるソフトウエアを提供する。
さらに、本発明は、複数の遺伝子または診断領域を同時に分析し、処理し、血液試料から病原体DNAを調製するための試薬およびキットを提供する。
さらに、本発明は、血液、組織、または環境試料からの複数の病原体遺伝子または診断領域を分析するためのプローブ、標的核酸、およびライゲーション(ligating)分子の混合物を含む組成物を提供する。
好ましい実施形態について間もなく記載する以下の本発明の詳細な説明により、本発明の多くの追加態様および利点が当業者に明らかになるであろう。
5. 図面の説明
本発明の詳細な説明は、以下のような添付の図と併せてより良く理解できるであろう。
図１は、アダプターライゲーションおよび伸長を示す。二本鎖ヘアピンアダプター(実線)は、ヘアピン末端における架橋塩基によってヘアピン型に維持される。BおよびFはそれぞれ、結合プライマーおよび固定プライマーを表し、それらの相補配列を小文字で表す。ゲノム配列は、細い線として示す。A)非リン酸化アダプターは、ゲノムDNAにライゲーションされ、遊離3' の鎖内ニックとなる(矢印)。B)3'末端からの伸長は、置換鎖およびアダプター配列の複製を生じる。
図２は、アダプター設計およびDNA断片との結合を示す(ここで、ゲノムDNAは、ベタ黒の帯によって表され、Fは、遊離プライマーを表し、Bは、結合プライマーを表し、fおよびbはそれぞれ、それらの相補体を表す)。
図３は、チップ表面上のアンプリオート産生を示す。A) アダプター捕捉ゲノムDNAの融解後、1本の鎖は、結合プライマーBとのハイブリダイゼーションによりスライドの表面上に捕捉される。プライマーBからのポリメラーゼ伸長は、二本鎖分子を生成する。B)鋳型鎖は、スライドの加熱および洗浄によって除去され、遊離プライマーFは、固定鎖に沿って導入され伸長される。C) Fによる連続鎖置換増幅は、隣接するプライマーBハイブリダイゼーション部位まで移動することができる鎖の生成をもたらす。D)置換鎖は、新たなプライマーB部位からの伸長のための鋳型の役割を果たす。
図４は、RNA中間体を用いるアンプリオート生成を示す。T7は、T7ファージRNAポリメラーゼプロモーターを表す。A)一本鎖アダプター領域は、結合プライマーBにハイブリダイズされて伸長され、二本鎖T7プロモーターの生成をもたらすDNAポリメラーゼによって第二の鎖を生成する。B) T7 RNAポリメラーゼは、RNAコピーを生成する(点線)。C)次いで、RNAは、隣接するプライマーBと結合し、cDNAは、逆転写酵素によって生成される。次いで、二本鎖RNAは、RNase Hによって破壊される。
図５は、インベーダー媒介性等温DNA増幅プロセスの概略図を示す。
図６は、ハイブリダイゼーションによるランダムアレイ配列決定(rSBH)プロセスを示す。上から下に: (a) CCDカメラを反応プラットフォーム上に配置し、レンズを用いて拡大し、CCDカメラの個々のピクセル上のプラットフォームからの1μm2 領域に焦点を合わせる。(b)アレイ(~3 mm×3 mm)は、仮想反応ウエルとしての役割を果たす100万以上の1μm2領域からなる(各々は、CCDカメラの個々のピクセルに対応している)。各ピクセルは、基板上の同一位置に対応している。一連の時間内反応において、1個のCCDピクセルは、いくつかの反応についてデータを組み合わせ、それによって仮想反応ウエルを作り出すことができる。DNA試料をランダムに消化し、1ピクセルにつき1断片の平均濃度で反応プラットフォーム上に配列する。(c)アレイに、いくつかの情報プローブプールのうち1つを用いるrSBHコンビナトリアルライゲーションを行う。各ピクセルからのシグナルを記録する。(d)第一のプールからのプローブを除去し、アレイに、異なるプールまたはプローブを用いる2回目のrSBHコンビナトリアルライゲーションを行う。(e)相補体が標的に相当する2種の隣接しかつ相補的プローブのライゲーションに起因する蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)シグナル生成の分子的詳細を示す書き込み。
図７は、rSBH反応を示す。内部全反射顕微鏡(TIRM)検出システムは、ガラス基板直上の領域でのみ励起増強が起きるエバネッセント場を作り出す。FRETシグナルは、プローブが配列された標的とハイブリダイズし、続いてライゲーションされ、エバネッセント場内にFRET対が位置する場合に生み出される。ライゲーションされないプローブは、溶液中に遊離していようと、標的と一過性にハイブリダイズしていようと、検出可能なシグナルを生み出さない。したがって、TIRMシステムのエバネッセント場は、未反応プローブからのバックグラウンドノイズを低減しながら、望ましい面内に双方の強いシグナルを提供した。
図８は、配列組立を示す。一般に、SBHプロセスでは、重複陽性プローブを用いて標的配列を組み立てる。このプロセスでは、各塩基を数回(すなわち、10量体プローブで10回)読み取り、たとえ一部のプローブが正確に記録されていない場合にも極めて高い確度を保証する。
図９は、rSBHプロセスのためのマイクロ流体装置の概略を示す。この装置は、DNA調製、ランダム単一分子DNAアレイの形成、コンビナトリアルプール混合、ならびに反応チャンバーの周期的装填および洗浄を一体化している。試料管をチップに結合する場合には、予め装填した試薬との一連の反応を行って断片DNAを単離し、1ピクセル当たり約1分子の密度でアレイ表面にランダムに結合する。次いで、マイクロ流体装置を用い、情報プローブプール(IPPs)の5'および3'セットからの2種類のプローブプールを反応溶液と混ぜる。プローブプールの一方のセットをFRET供与体で標識、他方をFRET受容体で標識する。次いで、DNAリガーゼを含有する混合プールを、単一分子DNA上の反応チャンバーに移す。検出可能なライゲーション事象は、アレイ表面上の狭い反射域内(約100nm)で、2種類のプローブ(各プールから1種類)が標的DNA分子の隣接する相補配列とハイブリダイズする場合に起きる。反射域内の5'および3'プローブのライゲーションは、超高感度CCDカメラによって検出および記録されるFRETシグナルをもたらす。ライゲーション事象を記録した後、各プールミックスを洗浄溶液によって除去し、マイクロ流体チップ上に予め装填したIPPの同一セットからのプールの第二の対を組み合わせ、反応チャンバーに導入する。IPPの2種類のセット内の可能なすべてのプールを組み合わせることにより、アレイ内の各標的分子を、2種類のプローブセット内に存在するプローブ配列のあらゆる可能な組合せの存在/非存在について記録する。
図１０は、TIRM装置のための基礎的光学系および光路を示す。(a)エバネッセント場を生み出すプリズムおよび光路の最上部に位置する従来型基板の描写。(b)および(c)は、レーザーからプリズムアセンブリまでの光路を制御するための検流計の使用を示している。
図１１は、rSBH構成要素の略図およびrSBH装置の構成要素を示すプロセスおよび実験プロセスの段階的記述を示す。試料は、装置とは独立して集めて調製する(ステップ1および2)。試料統合モジュール(構成要素A)により、得られる粗製試料調製物をrSBHアレイ形成(ステップ3)のためにさらに処理する。続いて、標的を反応カートリッジ内の基板モジュール上に配列する(構成要素B)。試料に対し、プローブモジュールによって送達されるSBHプローブを用いるSBHライゲーションアッセイ(ステップ4)を行う(構成要素C)。得られる生データを処理し、配列データの組立(ステップ5)および解釈分析(interpretive analysis) (ステップ6)を行う。
図１２は、4つのスポットされた標的についての完全マッチライゲーションシグナルを示す。4種類の異なる標的を、1から90μMの7種類の異なる濃度でスポットした。ライゲーションプローブ濃度(5'プローブ: 3'プローブ比は、1:1である)は、0.1から1 pmole/20μlまで変化させた。
図１３は、別の標的の捕捉プローブとしての役割を果たすスポットした標的の図解を示す。ライゲーションシグナルは、スライドが、Tg2-5'プローブおよびTgt2-3'プローブと直接ハイブリダイズ/ライゲーションされた場合(円)、およびスライドが、標的Tgt2-Tgt1-rcとプレハイブリダイズされ、次いでTgt2-5'プローブおよびTgt2-3'プローブとライゲーションされた場合(正方形) に測定された。
6. 好ましい実施形態の詳細な説明
本発明は、任意の長いDNA断片、断片の混合物、全遺伝子、遺伝子の混合物、mRNAの混合物、染色体の長いセグメント、全染色体、染色体の混合物、全ゲノム、またはゲノムの混合物を迅速かつ正確に配列決定するための単一分子DNA分析法および装置を提供する。本発明の方法は、単一生物体レベルで複雑な生体試料中に存在する病原体の検出および毒性制御遺伝子の同定を可能にする。本発明の方法は、ハイブリダイゼーション、特にハイブリダイゼーションによる配列決定(SBH)技術を、内部全反射顕微鏡法(TIRM)または蛍光、ナノ粒子、もしくは電気的方法を用いる他の敏感な光学的方法と組み合わせる。また、本発明は、超高感度電荷結合素子(CCD)カメラの個々のピクセルと関連付けられている仮想反応チャンバーを作り出す試料配列技術を提供する。蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブの完全/普遍セットの情報プールおよびコンビナトリアルライゲーションプロセスを用い、配列されたゲノムに繰り返し問い合わせて、それらの配列を解読する。生命情報科学アルゴリズム(すべてが参照により全体として本明細書に組み込まれている共有同時係属の米国特許出願第09/874,772号; Drmanac他、Science 260:1649-1652 (1993); Drmanac他、Nat. Biotech. 16:54-58 (1998); Encyclopedia of Analytical Chemistry中のDrmanac他、「Sequencing and Fingerprinting DNA by Hybridization with Oligonucleotide Probes」、pp. 5232-5237 (2000); Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology: Chip Technology, Hoheisel, J. (編), Vol. 76中のDrmanac他、「Sequencing by Hybridization (SBH): Advantages, Achievements, and Opportunities」、pp. 75-98 (2002))を用い、情報蛍光シグナルを組み立てられた配列データに変換する。装置は、診断用実験室または小さな移動実験室に位置する単一の小型装置を用い1時間当たり100メガ塩基 (30,000塩基/秒) 以上のDNAを配列決定することができる。微量の病原体DNAを、ランダム単一分子アレイの大容量により、本発明の方法を用いて複雑な生体試料内で検出、同定および配列決定することができる。したがって、ランダムアレイSBH (rSBH)は、DNA配列決定を可能にし、他の配列決定用途に加え、生物戦争医薬に対する防御において重要な役割を果たすために必要な技術を提供する。
本発明は、病原体、宿主、および環境DNAの複雑な生体混合物中の任意の病原体を迅速かつ正確に検出および同定し、個々のヒトDNAを含む任意のDNAを一般的に分析するための単一DNA分子分析法を提供する。本発明の方法は、単一生物体レベルで試料中に存在する病原体の検出およびすべての毒性制御遺伝子の同定を可能にする。本発明の方法は、直接に、または個々の配列された分子をin situにおいて約10倍もしくは100倍、または1000倍もしくは10,000倍に増幅した後に、普遍情報プローブプール (IPP)の小さなセットのコンビナトリアルハイブリダイゼーション/ライゲーションのプロセスを、ランダム単一分子アレイに適用する。
典型的なテストでは、試料から得られた数百万のランダムに配列された単一DNA分子を、長さが8〜10塩基の可能なプローブ配列すべての普遍ライブラリーに相当するIPPの対とハイブリダイズさせる。2種類のプローブが、標的DNA中の隣接する相補配列とハイブリダイズする場合、それらをライゲーションさせて標的分子についての陽性スコアを作成し、そのようなスコアが累積されたセットを蓄積し、重複プローブ配列から標的配列を組み立てる。
本発明の別の実施形態において、個々の標的のシグネチャ(signature)または配列を用い、全遺伝子またはゲノムのより長い配列を組み立てることができる。さらに、同一遺伝子由来の同一分子またはセグメントが何回アレイ中に生じるかを数えることにより、遺伝子発現または病原体DNAの定量化が得られ、そのようなデータを、得られた配列と組み合わせることができる。
SBHは、当業者に知られている多くの方法によって実施することができる十分に開発された技術である。具体的には、以下の文書において議論されているハイブリダイゼーションによる配列決定に関連する技法を、参照により全体として本明細書に組み込む。Bains およびSmith、J. Theor. Biol. 135:303-307 (1988); BeaucageおよびCaruthers、Tetrahedron Lett. 22:1859-1862 (1981); Broude他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3072-3076 (1994); Breslauer他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:3746-3750 (1986); Doty他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 46:461-466 (1990); Chee他、Science 274:610-614 (1996); Cheng他、Nat. Biotechnol. 16:541-546 (1998); Dianzani他、Genomics 11:48-53 (1991); DrmanacによるPCT国際特許出願第WO 95/09248号; DrmanacによるPCT国際特許出願第WO 96/17957号; DrmanacによるPCT国際特許出願第WO 98/31836号; Drmanac他によるPCT国際特許出願第WO 99/09217号; Drmanac他によるPCT国際特許出願第WO00/40758号; PCT国際特許出願第WO 56937号; Drmanac および Jinによる共有同時係属の米国特許出願第09/874,772号; DrmanacおよびCrkvenjakov、Scientia Yugoslaviea 16:99-107 (1990); Drmanac およびCrkvenjakov、Intl. J. Genome Res. 1:59-79 (1992); DrmanacおよびDrmanac、Meth. Enzymology 303:165-178 (1999); Drmanac他、米国特許第5,202,231号; Drmanac他、Nucl. Acids Res. 14:4691-4692 (1986); Drmanac他、Genomics 4:114-128 (1989); Drmanac他、J. Biomol. Struct. Dyn. 8:1085-1102 (1991); The First International Conference on Electrophoresis, Supercomputing and the Human GenomeにおけるDrmanac他、「Partial Sequencing by Hybridization: concept and Applications in Genome Analysis」、pp. 60-74、World Scientific、Singapore、Malaysia (1991); Drmanac他、Proceedings of the First Intl. Conf. Electrophoresis, Supercomputing and the Human Genome, Cantor 他. 編、World Scientific Pub. Co.、Singapore、47-59 (1991); Drmanac他、Nucl. Acids Res. 19:5839-5842 (1991); Drmanac他、Electrophoresis 13:566-573 (1992); Drmanac他、Science 260:1649-1652 (1993); Drmanac他、DNA and Cell Biol. 9:527-534 (1994); Drmanac他、Genomics 37:29-40 (1996); Drmanac他、Nature Biotechnology 16:54-58 (1998); Gunderson他、Genome Res. 8:1142-1153 (1998); Hacia他、Nature Genetics 14:441-447 (1996); Hacia他、Genome Res. 8:1245-1258 (1998); Hoheisel 他、Mol. Gen. 220:903-14:125-132 (1991); Hoheisel他、Cell 73:109-120 (1993); Holey他、Science 147:1462-1465 (1965); HousbyおよびSouthern、Nucl. Acids Res. 26:4259-4266 (1998); Hunkapillar他、Science 254:59-63 (1991); Khrapko、FEBS Lett. 256:118-122 (1989); Kozal他、Nature Medicine 7:753-759 (1996); The Second International Conference on Electrophoresis, Supercomputing and the Human Genomeにおける LabatおよびDrmanac, 「Simulations of Ordering and Sequence Reconstruction of Random DNA Clones Hybridized with a Small Number of Oligomer Probes」、pp. 555-565、World Scientific、Singapore、Malaysia (1992); Lehrach他、Genome Analysis: Genetic and Physical Mapping 1:39-81 (1990)、Cold Spring Harbor Laboratory Press; Lysov 他., Dokl. Akad. Nauk. SSSR 303:1508-1511 (1988); Lockhart他、Nat. Biotechnol. 14:167501680 (1996); MaxamおよびGilbert、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:560-564 (1977); Meier他、Nucl. Acids Res. 26:2216-2223 (1998); Michiels 他、CABIOS 3:203-210 (1987); Milosavljevic他、Genome Res. 6:132-141 (1996); Milosavljevic他、Genomics 37:77-86 (1996); Nikiforov他、Nucl. Acids Res. 22:4167-4175 (1994); Mathematical Foundations of Computer Science (1994)中のPevznerおよびLipschutz、「Towards DNA Sequencing Chips」; PoustkaおよびLehrach、Trends Genet. 2: 174-179 (1986); Privara 他、編、pp. 143-158, The Proceedings of the 19th International Symposium、MFCS '94、Kosice、Slovakia、Springer-Verlag、Berlin (1995); Saiki他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6230-6234 (1989); Sanger他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463-5467 (1977); Scholler 他., Nucl. Acids Res. 23:3842-3849 (1995); SouthernによるPCT国際出願第WO 89/10977号; Southernによる米国特許第5,700,637号; Southern他、Genomics 13:1008-1017 (1992); Strezoska他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10089-10093 (1991); Sugimoto他、Nucl. Acid Res. 24:4501-4505 (1996); Wallace他、Nucl. Acids Res. 6:3543-3557 (1979); Wang他、Science 280:1077-1082 (1998); Wetmur、Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 26:227-259 (1991)。
rSBHの利点
rSBHは、適切な距離で結合されている2個の標的DNA分子間の標的-標的ブロッキング相互作用を最小限に抑えるか、あるいは取り除く。1スポット当たりのDNA配列(200〜2000塩基)複雑度の低さは、相互にブロッキングを生じ得る逆反復配列の可能性を低下させる。パリンドロームおよびヘアピンアームは、平均して生成源DNAの20塩基ごとに1つの切れ目があるいくつかの断片中に分かれており、非相補的なプライマーDNAに結合している。偽陽性が最小限に抑えられるのは、重複断片が、様々な反復および/または強力ミスマッチ配列を有しているためである。プローブ-プローブライゲーション産物は、洗浄によって除去可能である。ライゲーションによって作成された11〜13量体プローブに関するハイブリダイゼーション/ライゲーション特異性と差次的完全マッチ/ミスマッチ安定性の組合せは、より正確なデータを生み出す可能性がある。rSBHは、短いDNAの分析を含む溶液中の3-プローブライゲーションを用いる効率的方法を提供する。パターン化されたプローブのプールを両プローブ構成要素上で効率的に使用し、より多くの情報データを提供することができる。別の利点は、極めて低量の起源DNAしか必要としないことである。標準的プローブ-スポットアレイ調製の必要性がなくなることにより、コストが低減される。rSBHは、様々なプライマーまたはアダプターのタグを付けられた1000試料までの多重配列決定を提供する。さらに、本発明は、100万までの個別試料のプールにおける単一変異体の検出を提供する。ヘテロ接合体は、2種類の変異体を数えることによって検出することができる。本発明は、標準的アレイに比べ、1表面当たり10〜100,000倍以上の情報を提供する。
6.1 ポリヌクレオチドの調製および標識化
本発明の実施は、様々なポリヌクレオチドを用いる。通常、ポリヌクレオチドの一部は、検出可能に標識される。本発明の実施において使用されるポリヌクレオチドの分子種には、標的核酸およびプローブが含まれる。
用語「プローブ」は、比較的短いポリヌクレオチド、好ましくはDNAを指す。プローブは、標的核酸よりも少なくとも1塩基短いことが好ましく、長さが25塩基以上少ないことがより好ましく、さらに長さが20塩基以上少ないことがより好ましい。プローブの最適な長さは、分析される標的核酸の長さによって決まることは言うまでもない。約100以下の塩基からなる標的核酸の新たな配列決定(参照配列を使用しない)では、プローブは、少なくとも7量体であることが好ましく、約100〜200塩基の標的核酸については、プローブは、少なくとも8量体であることが好ましく、約200〜400塩基の標的核酸については、プローブは、少なくとも9量体であることが好ましく、約400〜800塩基の標的核酸については、プローブは、少なくとも10量体であることが好ましく、約800〜1600塩基の標的核酸については、プローブは、少なくとも11量体であることが好ましく、約1600〜3200塩基の標的核酸については、プローブは、少なくとも12量体であることが好ましく、約3200〜6400塩基の標的核酸については、プローブは、少なくとも13量体であることが好ましく、約6400〜12,800塩基の標的核酸については、プローブは、少なくとも14量体であることが好ましい。標的核酸の長さがさらに2倍増加するごとに、最適なプローブ長は、1塩基追加される。
当業者は、ライゲーションされたプローブを利用するSBH応用の場合、上述のプローブ長は、ライゲーション後のものであることが分かるであろう。通常、プローブは一本鎖であるが、ある用途では二本鎖プローブを使用することがある。
通常、プローブは、天然に存在する塩基および自然のホスホジエステル主鎖から構成されるが、その必要はない。例えば、プローブは、7-デアザグアノシンまたは普遍「M」塩基などの1種または複数の修飾塩基、またはホスホロチオエートなどの1種または複数の修飾主鎖連結基で構成されてもよい。唯一の要件は、プローブが標的核酸とハイブリダイズすることができることである。本発明と併せて使用することができる多種多様な修飾塩基および主鎖連結基が知られており、それは当業者には明らかであろう。
上記のプローブ長は、プローブの情報量の長さを指し、必ずしもプローブの実際の物理的長さではない。SBHにおいて使用されるプローブは、プローブの情報量に寄与しない縮重末端を含むことが多い。例えば、SBH応用は、式NxByNzのプローブの混合物を使用することが多く、ここで、Nは、4塩基のいずれかを表し、ある混合物中のポリヌクレオチドによって異なり、Bは、4塩基のいずれかを表すが、ある混合物中の各ポリヌクレオチドと同一であり、x、y、およびzは、整数である。通常、xおよびzは、独立して0〜5の整数であり、yは、4〜20の整数である。知られている塩基Byの数がポリヌクレオチドの「情報量」を規定するのは、縮重末端は、プローブの情報量に寄与しないからである。このような固定化ポリヌクレオチドの混合物を含む線形アレイは、例えば、ハイブリダイゼーションによって配列決定する際に有用である。これらの縮重プローブ混合物におけるミスマッチのハイブリダイゼーション識別は、情報量の長さのみを指し、完全な物理的長さを指さない。
本発明において使用するためのプローブは、当技術分野において良く知られている技法、例えば、Applied Biosystems合成装置を使用する自動合成によって調製することができる。あるいは、プローブを、多孔性Teflonウエハーの積み重ねを使用するGenosys Biotechnologies Inc.法を使用して調製することができる。本発明の目的には、使用するオリゴヌクレオチドプローブの供給源は重要ではなく、当業者は、現在知られているか、あるいは今後開発される他の方法を用いて調製されたオリゴヌクレオチドも十分であることが分かっているであろう。
用語「標的核酸」は、配列情報が求められるポリヌクレオチド、またはポリヌクレオチドの一部、通常は、SBHアッセイにおいて配列決定されるポリヌクレオチドを指す。標的核酸は、プローブの長さに応じて、長さが任意の数のヌクレオチドであってよいが、通常は、長さがおよそ100、200、400、800、1600、3200、6400、またはそれ以上のヌクレオチドである。通常、試料は、100超、1000超、10,000超、100,000超、100万超、または1,000万超の標的を有する。標的核酸は、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、またはそれらの混合物で構成されてもよい。通常、標的核酸は、DNAである。標的核酸は、二本鎖であってもよいが、一本鎖であることが好ましい。さらに、標的核酸は、事実上すべての供給源から入手することができる。その長さに応じて、SBHアッセイを使用するのに先立って、上述の大きさの断片に切断されることが好ましい。プローブと同様、標的核酸は、1種または複数の修飾塩基または主鎖連結基で構成されていてもよい。
標的核酸は、増幅ステップなしに、cDNA、ゲノムDNA、染色体DNA、顕微解剖された染色体バンド、コスミドまたは酵母人工染色体(YAC)挿入配列、およびmRNAを含むRNAなどの任意の適切な供給源から得ることができる。例えば、参照により全体として本明細書に組み込まれているSambrook他Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, NY (1989)は、哺乳類細胞から高分子量DNAを単離するための3種類のプロトコルについて記載している(p. 9.14-9.23)。
次いで、ポリヌクレオチドは通常、例えば、Sambrook他(1989)の9.24〜9.28に記載されている制限酵素を用いること、超音波による切断、およびNaOH処理を含む当業者に知られている方法のいずれかにより断片化されるであろう。DNAを断片化するのに特に適している方法は、参照により全体として本明細書に組み込まれているFitzgerald他、Nucl. Acids Res. 20:3753-3762 (1992)によって記載されている2塩基認識エンドヌクレアーゼ、CviJIを利用している。
好ましい実施形態において、標的核酸は、相互にライゲーションできないように、例えば、酵素消化または物理的切断によって得られる断片化された核酸をホスファターゼ(すなわち、子ウシ腸内ホスファターゼ)で処理することによって調製される。あるいは、試料核酸のライゲーションできない断片を、試料核酸のサンガー-ジデオキシ配列決定反応において、5'末端にリン酸のないランダムなプライマー(すなわち、N5〜N9(Nは、A、G、T、またはCである))を用いることによって得ることができる。
ほとんどの場合、DNAを変性させ、ハイブリダイゼーションによる配列決定に使用可能である一本鎖片を得ることが重要である。これは、DNA溶液を80〜90℃で2〜5分間インキュベートすることによって行うことができる。次いで、溶液を2℃まで素早く冷却し、プローブと接触させる前にDNA断片が再生しないようにする。
プローブおよび/または標的核酸は、検出可能に標識することができる。検出可能なシグナルを生成し、基板上に固定化するか、あるいはポリヌクレオチドに結合することができる事実上すべての標識が本発明のアレイと併用することができる。生成されるシグナルは、定量しやすいことが好ましい。適当な標識には、例えば、放射性同位元素、蛍光体、発色団、化学発光部分などが含まれるが、これらに限定されるものではない。
検出の容易さから、蛍光体で標識されたポリヌクレオチドが好ましい。ポリヌクレオチドを標識するのに適している蛍光体は、例えば、the Molecular Probesカタログ(Molecular Probes, Inc.、Eugene、OR)、およびその中に引用されている参考文献に記載されている。ポリヌクレオチドに蛍光体標識を結合する方法は良く知られており、例えば、参照により全体として本明細書に組み込まれているGoodchild、Bioconjug. Chem. 1:165-187 (1990)中に見いだすことができる。好ましい蛍光体標識は、Cy5色素であり、Amersham Biosciencesから入手可能である。
あるいは、プローブまたは標的を、当技術分野において知られているその他の技法により、標識することができる。好ましい技法には、直接化学的標識法ならびにキナーゼ処理(kinasing)およびニックトランスレーションなどの酵素的標識法が含まれる。標識されたプローブは、合成されるよりむしろ、GENSETを含む様々な商用ソースから容易に入手できるであろう。
一般に、標識は、1個または複数の塩基の遊離末端を含むプローブまたは標的ポリヌクレオチドの任意の部分に結合することができる。好ましい実施形態において、標識は、ポリヌクレオチドの末端に結合される。標識は、ポリヌクレオチドによって固体支持体に結合される場合、共有同時係属の米国特許出願第09/825,408号(参照により全体として本明細書に組み込まれ)に記載のように、ミスマッチ特異的エンドヌクレアーゼによる切断によって固体支持体から放出するこができるように位置を決めなければならない。好ましくは標識の位置は、標識されたポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション、ライゲーション、切断または他のハイブリダイゼーション後の修飾を妨害してはならない。
本発明の実施形態のなかには、多重化、すなわち、複数の識別可能な標識(様々な蛍光体など)の使用を用いるものもある。多重化は、1つのハイブリダイゼーション反応における複数の配列の同時検出を可能にする。例えば、4色の多重は、4つの追加的要素により必要とされるハイブリダイゼーション数を低減する。
他の実施形態は、SBHプロトコルにおいて通常見られる重複性を低減し、それによって標的DNA配列を明確に決定するのに必要なハイブリダイゼーション反応数を低減するために、プローブの情報プールを使用する。プローブの情報プールおよびそれを使用する方法は、参照により全体として本明細書に組み込まれている共有、同時係属の米国特許出願第09/479,608号中に見いだすことができる。
6.2 ポリヌクレオチドの固体基板との結合
本発明の実施形態のなかには、ポリヌクレオチド、例えば標的DNA断片を固体基板に結合させる必要があるものもある。好ましい実施形態において、適切なDNA試料は、検出可能に標識され、1ピクセル当たり1断片の濃度で固体基板にランダムに結合される。
固体基板の性質および構成は、とりわけ、アレイのタイプおよび結合の方法(すなわち、共有結合性または非共有結合性)を含む様々な要素によって決まる。一般に、基板は、ポリヌクレオチドの固定化を可能にし、核酸をハイブリダイズおよび/または変性するために使用される条件下で融解せず、実質的に分解しない任意の材料で構成することができる。さらに、共有結合性の固定化が企図される場合、基板は、固定化されるポリヌクレオチドと共有結合を形成することができる反応基により活性化可能でなければならない。
本発明において基板として使用するのに適している多くの材料が、当技術分野で報告されている。好ましい実施形態において、基板は、スライドガラスなどの光学的に透明な物質でできている。他の例示的な適当な材料には、例えば、アクリル、 スチレン-メタクリル酸メチルコポリマー、エチレン/アクリル酸、アクリロニトリル-ブタジエン-スチレン(ABS)、ABS/ポリカーボネート、ABS/ポリサルホン、ABS/ポリ塩化ビニル、エチレンプロピレン、エチレン酢酸ビニル(EVA)、ニトロセルロース、ナイロン(ナイロン6、ナイロン6/6、ナイロン6/6-6、ナイロン6/10、ナイロン6/12、ナイロン11、およびナイロン12を含む)、ポリアクリロニトリル (PAN) 、ポリアクリレート、ポリカーボネート、ポリブチレンテレフタレート(PBT)、ポリエチレンテレフタレート(PET)、ポリエチレン(低密度、鎖状低密度、高密度、架橋および超高分子量グレードを含む)、ポリプロピレンホモポリマー、ポリプロピレンコポリマー、ポリスチレン(汎用および高衝撃グレードを含む)、ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)、フッ素化エチレン-プロピレン(FEP)、エチレン-テトラフルオロエチレン(ETFE)、ペルフルオロアルコキシエチレン(PFA)、ポリフッ化ビニル(PVF)、ポリフッ化ビニリデン(PVDF)、ポリクロロトリフルオロエチレン(PCTFE)、ポリエチレン-クロロトリフルオロエチレン(ECTFE)、ポリビニルアルコール(PVA)、 シリコンスチレン-アクリロニトリル(SAN)、スチレン無水マレイン酸(SMA)、金属酸化物およびガラスが含まれる。
一般に、ポリヌクレオチド断片は、適切な反応基を介して支持体と結合させることができる。そのような基は、当技術分野において良く知られており、例えば、アミノ(-NH2)、ヒドロキシル(-OH)、またはカルボキシル(-COOH)基が含まれる。支持体結合ポリヌクレオチド断片は、ガラスなどの任意の適当な支持体を使用する当業者に知られている方法のいずれかにより調製することができる。固定化は、例えば、受動吸着(参照により全体として本明細書に組み込まれているInouyeおよびHondo、J. Clin. Microbiol. 28:1469-1472 (1990))を用いること、紫外光(参照により全体として本明細書に組み込まれているDahlen他、Mol. Cell Probes 1:159-168 (1987))を用いることを含む多くの方法により、または塩基修飾DNAの共有結合(共に参照により全体として本明細書に組み込まれているKeller、他、Anal. Biochem. 170:441-451 (1988)、Keller他、Anal. Biochem. 177:392-395 (1989))により、もしくはプローブと支持体間のアミド基の形成(参照により全体として本明細書に組み込まれているZhang他、Nucl. Acids Res. 19:3929-3933 (1991))により行うことができる。
本発明と一緒に使用するのにさらに適している方法は、参照により本明細書に組み入れられているPCT特許出願WO 90/03382 (Southern他による)に記載の方法であることが企図されている。支持体と結合しているポリヌクレオチド断片を調製するこの方法は、支持体によって運ばれる脂肪族ヒドロキシル基に、共有結合性ホスホジエステル結合により、リン酸基を介してヌクレオシド3'試薬を結合することを含む。次いで、担持ヌクレオシド上でオリゴヌクレオチドを合成し、支持体からオリゴヌクレオチドを切断しない標準的条件下で、合成オリゴヌクレオチド鎖から保護基を除去する。適当な試薬には、ヌクレオシドホスホロアミダイトおよびヌクレオシド水素ホスホレート(phosphorate)が含まれる。
あるいは、参照により本明細書に組み入れられているFodor他、Science 251:767-773 (1991)によって記載されているように、アドレス可能レーザー活性化光脱保護を、ガラス表面上で直接、オリゴヌクレオチドの化学合成で用いることができる。
支持体に結合したポリヌクレオチド断片を調製するためのある特定の方法は、参照により本明細書に組み入れられているPease他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:5022-5026 (1994) によって記載されている光生成(light-generated)合成を利用する方法である。これらの著者は、固定化オリゴヌクレオチドプローブのアレイ、すなわちDNAチップを作成するために、最新の写真平板技術を使用した。光を用い、高密度な小型アレイ中でオリゴヌクレオチドプローブの合成を誘導するこれらの方法は、感光性の5'-保護N-アシル-デオキシヌクレオシドホスホロアミダイト、表面リンカー化学反応および多目的な組合せ合成戦略を利用している。このようにして、256個の空間的に規定されたオリゴヌクレオチドプローブのマトリクスを作成し、本明細書に記載のように、SBH配列決定で使用することができる。
好ましい実施形態において、本発明のDNA断片は、リンカー部分により固体基板に連結される。リンカーは、炭素、ケイ素、酸素、イオウ、リンなどの少なくとも2個の共有結合を生成することができる原子からなるか、あるいは糖-リン酸基、アミノ酸、ペプチド、ヌクレオシド、ヌクレオチド、糖、炭水化物、芳香環、炭化水素環、直鎖および分岐炭化水素などの少なくとも2個の共有結合を生成することができる分子からなることができる。本発明の特に好ましい実施形態において、リンカー部分は、アルキレングリコール部分からなる。好ましい実施形態において、検出可能な標識は、DNA断片(すなわち、標的DNA)と結合される。
6.3 固体支持体上の検出可能に標識された二本鎖の形成
本発明の好ましい一実施形態では、標識されたプローブを、相補的塩基対合相互作用により、それ自体がポリヌクレオチドアレイの一部として固体支持体に結合されている検出可能に標識された標的核酸と結合させ、それによって二重鎖を生成する。別の好ましい実施形態では、2種類のプローブが標的核酸と隣接してハイブリダイズする場合、標識されたプローブを、それ自体が空間的にアドレス可能なポリヌクレオチドアレイの一部として固体支持体に結合されている標的核酸と相補的塩基対合相互作用によって結合されている別のプローブと共有結合で結合、すなわちライゲーションさせる。
本明細書で使用するように、ヌクレオチド塩基は、それらが特定の条件下で安定な二重鎖すなわち結合対を形成する場合に「マッチする」、すなわち「相補的」である。ある塩基の別の塩基に対する特異性は、塩基上の水素結合供与体および受容体の利用能および配向性によって決定される。例えば、ハイブリダイゼーションアッセイにおいて一般に使用される条件下で、アデニン(「A」)は、チミン(「T」)とマッチするが、グアニン(「G」)またはシトシン(「C」)とはマッチしない。同様に、Gは、Cとマッチするが、AまたはTとマッチしない。イノシンもしくは普遍塩基 (「M」塩基、参照により全体として本明細書に組み込まれているNichols他、Nature 369:492-493 (1994))、または他の修飾塩基、例えば、メチル化塩基などのあまり特異的に相互作用しない他の塩基は、特定の条件下で安定な二重鎖を形成するこれらの塩基と相補的である。相互に相補的ではないヌクレオチド塩基は、「ミスマッチ」と呼ばれる。
一対のポリヌクレオチド、例えば、プローブおよび標的核酸は、特定の条件下で核酸が、相補的ヌクレオチド塩基の対合によって媒介される相互作用で相互にハイブリダイズし、それによって二重鎖を形成する場合に「相補的」または「マッチ」と呼ばれる。2種類のポリヌクレオチド間で形成される二重鎖は、1個または複数の塩基ミスマッチを含むことがある。そのような二重鎖は、「ミスマッチ二重鎖」またはヘテロ二重鎖と呼ばれる。ハイブリダイゼーション条件が厳密でなければないほど、ミスマッチが許され、比較的安定なミスマッチ二重鎖が形成される可能性が高い。
「完全に相補的な」または「完全にマッチした」ポリヌクレオチドと呼ばれるマッチしたポリヌクレオチドのサブセットは、相互に相補的な連続した塩基配列を含むポリヌクレオチドの対からなり、ミスマッチは存在しない(すなわち、形成された二重鎖がその特定の核酸配列に対して最大の結合エネルギーを有しており、周囲配列効果(surrounding sequence effects)は一切存在しない)。「完全相補的」および「完全マッチ」は、類縁体または修飾ヌクレオチドを有するポリヌクレオチドおよび二本鎖を包含することも意味する。類縁体または修飾ヌクレオチドにとっての「完全マッチ」は、その類縁体または修飾ヌクレオチド用に選択された「完全マッチ規則」に従って判断される(例えば、特定の類縁体または修飾ヌクレオチドに対して最大の結合エネルギーを有する結合対)。
NxByNz型の縮重末端のあるプローブのプールが使用される場合には、上述のように、完全マッチは、プローブの情報量領域、すなわちBy領域が完全にマッチしている任意の二重鎖を包含する。N領域におけるミスマッチとの区別は、ハイブリダイゼーション実験の結果に影響を及ぼさない。というのは、そのようなミスマッチは、実験に由来する情報を妨害しないからである。
本発明の特に好ましい実施形態では、溶液中に提供される少なくとも1セットの検出可能に標識されたオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズすることを可能にする条件下、標的DNA断片が固体基板上に提供されるポリヌクレオチドアレイが提供される。セット内とセット間の双方でプローブは、同一長であるか、あるいは異なる長さであってよい。適切なハイブリダイゼーション条件を決定するための指針は、参照により全体として本明細書に組み込まれているDrmanac他、(1990)、Khrapko他(1991)、Broude他、(1994) (すべて上に引用済み)およびWO 98/31836などの文献中に見いだすことができる。これらの論文は、SBHの初期ステップで使用するのに適しているハイブリダイゼーション温度、緩衝液、および洗浄ステップの範囲を教示している。プローブセットは、別々または同時に標的核酸に提供することができる。
標的核酸上の隣接部位とハイブリダイズするプローブは、相互に共有結合で結合、すなわちライゲーションされる。ライゲーションは、化学的ライゲーション試薬(例えば、水溶性カルボジイミドまたは臭化シアン)により、市販のT4 DNAリガーゼなどのリガーゼ酵素により、スタッキング相互作用により、または隣接プローブ間に化学結合形成を引き起こすその他の手段により実施することができる。ライゲーションの適切な条件を決定するための指針は、すべてが参照により全体として本明細書に組み込まれている共有の米国特許出願第09/458,900、第09/479,608号、および第10/738,108号などの文献中に見いだすことができる。
6.4 ランダムアレイSBH (rSBH)
本発明の方法は、コンビナトリアルライゲーションプロセスを単一分子アレイに拡張し、本発明の方法の感度および検出力を大きく高めるランダムアレイSBH(rSBH)を使用する。rSBHは、標識されたオリゴヌクレオチドの情報プールによるランダムに配列されたDNA断片の連続的呼び掛けに頼っている。本発明の方法において、配列決定される複雑なDNA混合物は、内部全反射顕微鏡(TIRM)プラットフォームの焦点面内の光学的に透明な表面上に表示され、超高感度メガピクセルCCDカメラを用いて連続的にモニターされる。DNA断片は、単一CCDピクセルに相当する領域の1平方ミクロン当たり約1〜3分子の濃度で配列される。TIRMを用い、研究される対象と結合された表面との間の限局的かつ密接な接触を可視化する。TIRMでは、内部反射した励起源からのエバネッセント場は、表面の、または表面に近い蛍光分子を選択的に励起し、極めて低いバックグラウンド散光および良好なシグナル対バックグラウンド対比をもたらす。バックグラウンドおよびその関連ノイズは、周囲条件下で単一蛍光分子を検出するのに十分なほど低くすることができる(すべてが参照により全体として本明細書に組み込まれているAbney他Biophys. J. 61:542-552 (1992); Ambrose他、Cytometry 36:224-231 (1999); Axelrod、Traffic 2:764-774 (2001); FangおよびTan、「Single Molecule Imaging and Interaction Study Using Evanescent Wave Excitation」、American Biotechnology Laboratory (ABL) Application Note、April 2000; KawanoおよびEnders、「Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy」American Biotechnology Laboratory Application (ABL) Application Note、December 1999; ReichertおよびTruskey、J. Cell Sci. 96 (Pt. 2):219-230 (1990)を参照)。
マイクロ流体技術を用い、供与体および受容体蛍光体で標識されたプローブプールの対を、DNAリガーゼと混合し、ランダムアレイに提供する。プローブが標的断片上の隣接部位とハイブリダイズする場合、それらを一緒にライゲーションさせ、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)シグナルを作成する。FRETは、光子の発光なしに供与体分子から受容体分子に励起が移動される2個の蛍光分子の電子的励起状態間の距離依存的(10〜100Å)相互作用である(すべてが参照により全体として本明細書に組み込まれているDidenko、Biotechniques 31:1106-1121 (2001); Ha、Methods 25:78-86 (2001); KlostermeierおよびMillar、Biopolymers 61:159-179 (2001-2002))。これらのシグナルは、CCDカメラによって検出され、その断片内のマッチする配列ストリングを示す。第一のプールからシグナルが検出されたら、プローブを除去し、連続サイクルを用いて異なるプローブの組合せをテストする。各DNA断片の全配列は、数百の独立したハイブリダイゼーション/ライゲーション事象によって生成される蛍光シグナルに基づいて蓄積される。
検出可能な一色のみで十分であろうが、複数の色は、組合せ論の多重化を高め、システムの効率を改善するであろう。当技術分野の現状は、4色を同時に使用できることを示唆している。従来の直接的蛍光戦略の他に、FRETベースのシステム、時間分解システムおよび時間分解FRETシグナル伝達システムも使用できるであろう(参照により全体として本明細書に組み込まれているDidenko、Biotechniques 31:1106-1121 (2001))。量子ドット機能強化型三重FRETシステムなどの新たな特注化学反応も使用することができる。弱いシグナルを克服することは、デンドリマー技術および関連するシグナル増幅技術を用いて克服することができる。
従来のハイブリダイゼーションプロセスとは異なり、本発明の方法は、2つのプールからの短いプローブを一緒にライゲーションさせ、はるかに多くの情報力のあるより長いプローブを作成するハイブリダイゼーションとライゲーションの相乗的相互作用に頼っている。例えば、1024個の5量体オリゴヌクレオチド2セットを組み合わせ、100万を超える可能な10量体配列ストリングを検出することができる。情報プローブプール(すべてのプローブが共通の標識を共有している)の使用は、プロセスを大幅に単純化し、数百万の可能性あるプローブ対合をほんの数百のプールの組合せで起こすことを可能にする。連続する塩基を読み取る多重重複プローブは、得られるハイブリダイゼーションパターンからの正確なDNA配列の決定を可能にする。上述のコンビナトリアルライゲーションおよび情報プール技術は、それらの使用を単一分子配列決定に拡張することにより拡大される。
6.5 構造化ランダムDNA調製
A. DNA単離および初期断片化
細胞を溶解し、基本的な十分に確立したプロトコル(共に参照により全体として本明細書に組み込まれているSambrook他、同上、1999; Current Protocols in Molecular Biology、Ausubel他、編John Wiley and Sons, Inc., NY, 1999)または市販のキット[例えば、QIAGEN (Valencia、CA)またはPromega (Madison、WI)から市販されているキット]を用いてDNAを単離する。重要な要件は、1) DNAがDNAプロセシング酵素および混入する塩を含まないこと; 2)全ゲノムが等しく表現されていること;および3) DNA断片の長さが、約5,000〜約100,000bpであることである。DNAの消化を必要としないのは、溶解および抽出中に生み出される剪断力が、望ましい範囲の断片を生じるからである。別の実施形態では、酵素的断片化により、より短い断片(1〜5kb)を作成することができる。10〜100コピーの入力ゲノム数は、全ゲノムの重複を保証し、アレイ上の標的の不十分な捕捉を容認するであろう。他の実施形態は、少量のDNAの場合に使用するための担体、環状合成二本鎖DNAを提供する。
B. DNA規格化
一部の実施形態において、環境試料の規格化は、優勢な種のDNA寄与を低減し、配列決定される別の種の1アレイ当たりの総数を最大限にするのに重要なことがある。rSBHは、わずか10個のゲノム等価体を必要とするため、徹底したDNA規格化またはサブトラクションプロセスを実施することができる。規格化は、産生中にcDNAライブラリーを規格化するために使用される一般に利用される方法を用いて行うことができる。試料から集められたDNAを、一方が他方の10倍の量となるように2分する。量の多い試料は、末端転移酵素およびddCTPによりビオチン化し、一本鎖DNAとしてストレプトアビジンカラムまたはストレプトアビジン被覆ビーズに結合する。あるいは、ビオチン化したランダムなプライマーを用い、ストレプトアビジンとの結合用の配列を作成することができる。全ゲノム増幅法 (Molecular Staging, Inc.、New Haven、CT)も応用することができる。次いで、規格化するべき試料を、結合された分子とハイブリダイズさせ、試料中で過剰表示される分子を、多数の結合部位により溶液から優先的に除去する。数回のハイブリダイゼーション/除去サイクルを同一試料に適用し、完全規格化を行うことができる。別の実施形態は、λエキソヌクレアーゼによる適時の消化によって一本鎖DNAの短い末端領域を作成することにより、DNAの変性なしに長い二本鎖DNA断片の効率的ハイブリダイゼーションを提供する。
他の実施形態は、DNA規格化とrSBHを組み合わせることによって分析するのが困難である低存在量メンバーの配列決定を提供する。ある試料の別の試料に対する規格化は、群構造の変化をモニターし、条件が変化している時に新たなメンバーを同定することを可能にする。
C. 二次的DNA断片化およびアダプター結合
本発明は、スライドガラス上に位置するチャンバー内の溶液中に懸濁される剪断力によって作成される長いDNA断片を提供する。DNAの濃度は、各断片が占める体積がほぼ50×50×50μm程度であるように調整される。反応チャンバーは、制限酵素、T4 DNAリガーゼ、鎖置換型ポリメラーゼ、および特別に設計されたアダプターの混合を含む。制限酵素によるDNAの部分消化により、均一なオーバーハング配列のある平均長が250bpの断片が得られる。T4 DNAリガーゼは、相補的粘着末端を介して非リン酸化二本鎖アダプターをゲノム断片の末端に連結し、各末端に1個のアダプターがあり、鎖の一本にはニックがあるゲノム挿入配列の安定構造をもたらすが、リガーゼは、ホスホジエステル結合の形成を触媒することはできなかった(図1)。T4 DNAリガーゼは、大部分の制限酵素緩衝液中で活性であるが、ゲノム分子の各末端におけるアダプターのライゲーションを促進するために、ATPおよびゲノムDNAに対してモル過剰のアダプターの添加を必要とする。非リン酸化アダプターを使用することは、アダプター-アダプターライゲーションを防ぐのに重要である。さらに、アダプターは、2個のプライマー結合部位を含み、高温における融解中にアダプターの解離を防ぐヘアピン末端における架橋塩基によってヘアピン構造に保たれる。VentまたはBstなどの鎖置換型ポリメラーゼによる3'末端からの伸長は、両末端にアダプター配列のあるDNA鎖の生成をもたらす。しかしながら、一方の末端で、アダプターは、DNA断片の他方の末端上で相補的配列の解離を防ぐのに有用であるヘアピン構造に維持されるであろう。
本発明は、ランダムアレイ形成に先立って各試料のDNA断片にタグを付けることにより、1アッセイで複数の高度に類似した試料(すなわち、患者からの個々のDNA)を配列決定するためのランダムDNAアレイを提供する。DNA断片の末端にプライマー配列を組み入れるために使用される一方の、または両方のアダプターは、タグカセットを有することができる。各試料に異なるタグカセットを使用することができる。アダプターを結合した後(好ましくは、ライゲーションにより)、全試料のDNAを混合し、単一のランダムアレイを作成する。断片の配列決定が完了した後、各試料に属する断片は、割り当てられたタグ配列によって認識される。タグ手法の使用は、約1,000万個までのDNA断片を有する高容量ランダムアレイ上の約10〜1000試料由来のわずかな標的DNA領域の効率的配列決定を可能にする。
D. DNA結合およびin situ増幅
次いで、アダプター結合ゲノムDNAは、アダプター配列と相補的であるオリゴヌクレオチド(プライマーB)とのハイブリダイゼーションにより、スライドガラス上に最初の5〜100kb断片由来の他の断片と共に配置される。アダプターライゲーションおよび DNA伸長後、溶液を加熱し、スライドの表面に結合された高濃度のプライマーオリゴヌクレオチドと接触した場合、リアニーリング段階でこれらの相補配列とハイブリダイズする分子を変性させる。他の実施例では、in situにおける増幅は起こらず、アダプターは支持体に結合され、DNA断片がライゲーションされる。1個の親分子から生じる大部分のDNA構造は、ほぼ50×50μm程度のスライドの1区画に局在化されるため、1個の親分子の制限消化から1000個の分子が作成される場合、各断片は、平均して1〜4μm2 の領域を占めるであろう。このような1〜4μm2の領域は、CCDカメラの単一ピクセルによって観察することができ、100万個のウエルのアレイ内の仮想反応ウエルに相当する。
スライド表面上の50μmを超えるDNA断片の側方拡散は、乱流を防ぐ50〜100μm厚のキャピラリーチャンバー内の短時間では重要ではなさそうである。さらに、高粘度緩衝液またはゲルを用いて拡散を最小限に抑えることができる。さらに他の実施形態において、限られた乱れは、単一の5〜100kbの分子に由来する数百個の短いDNA断片を50×50μmの表面に広げるのに必要とされる。SBHは、同一のピクセル位置においてわずかなDNA断片の混合物を分析することができるため、拡散は、必ずしも完全でなくてもよいことに注意されたい。元試料の断片長がより均一な(すなわち、5〜10kb、10〜20kb、 20〜40kb、40〜1000kb)少数分画を調製し、短い断片間の間隔を等しくすることができる。さらに、電場を用い、短いDNA断片を結合用の表面にプールすることができる。短い断片を局所的に混合した部分構造化アレイが完全構造化アレイとほぼ同様に効率的であるのは、任意の単一で長い断片由来の短い断片は、約10,000個の他の長い初期断片から作成される短い断片と混合されないからである。
本発明の他の実施形態は、2種類のプライマー配列をDNA断片と結合するライゲーションプロセスを提供する。この手法は、二本鎖DNA断片の変性によって生成される一本鎖DNAを標的にすることに基づいている。一本鎖DNAは、独特の5'および3'末端を有しているため、特定のプライマー配列を各末端に結合することができる。各々が2種類のオリゴヌクレオチドを含み、特異的に修飾された末端を有する2種類の特異的アダプターを設計する(図2を参照)(ここで、FおよびBは、非結合の溶液遊離プライマー(F)および表面結合(B)プライマー配列を表し、fおよびbは、これらのプライマー配列と相補的な配列を表す(すなわち、プライマーfは、プライマーFと相補的である))。DNA断片とのライゲーションに必要である唯一の3'-OH基は、プライマーF上にあり、他のオリゴヌクレオチドは、アダプター-アダプターライゲーションを防ぐためにジデオキシ3'末端(dd)を有することができる。プライマーb上に存在する5'-リン酸基(P)に加え、プライマーBも5'-P基を有し、アダプターライゲーション後にこのプライマーの分解用に使用し、ハイブリダイゼーション用のプライマーb配列を表面結合プライマー/捕捉プローブBに暴露することができる。ランダム断片化によって生成源DNAから作成される任意のDNA断片とのアダプターライゲーションを可能にするため、オリゴヌクレオチドfおよびBは、いくつかの(約3〜9、好ましくは5〜7)縮重塩基(N)を有する。
rSBH検出は、単一分子検出のために設計されるが、一部の実施形態は、in situにおいて各DNA断片を増幅する。本発明の方法は、本明細書において「アンプリオート(ampliot)」(アンプリコンのスポットと定義される)と表示される局在化アンプリコンのミクロンサイズのスポット内の等温指数増幅を提供する(図3)。増幅は、表面と結合しているプライマー(プライマーB)および溶液中の1種類の遊離プライマー(プライマーF)の使用によって行われる。まず、プライマーBは、元の標的配列をハイブリダイズして伸長され、標的配列をコピーする。非結合鎖は融解されて洗い流され、鎖置換性のあるDNAポリメラーゼ(Bst DNAポリメラーゼなど)、dNTS、およびプライマーFを含む新たな試薬成分が添加される。次いで、連続増幅反応を用いて新たな鎖を合成し、前に合成された相補体と置換する。
連続指数増幅反応は、捕捉アレイオリゴヌクレオチドに対する相補配列を含むため捕捉され、さらなる増幅用の鋳型として使用される置換鎖を生成する。この鎖置換のプロセスには、プライマーが、重合を連続的に開始できることが必要である。当技術分野では、ICAN(商標)技術(Takara BioEurope、Gennevilliers、France)およびSPIA技術(NuGEN、San Carlos、CA; 参照により全体として本明細書に組み込まれている米国特許第6,251,639号)などの報告されている戦略がいくつか存在する。RNA/DNA二重鎖においてRNAを分解するRNase Hの性質を利用し、一旦伸長が開始したら、別のプライマーをハイブリダイズさせ重合および鎖置換を開始させるプライマーを除去する。好ましい実施形態において、プライマーF部位は、二本鎖DNAが、選択されたDNAポリメラーゼに最適な温度において頻繁に変性しFプライマーの結合を可能にする能力を有するように、A/Tを多く含むようにアダプター中で設計される。熱サイクルを必要とすることなく、連続指数増幅によってアンプリオート中に約100〜1000個のコピーが作成される。
本発明のさらに他の実施形態は、アダプター中にT7プロモーターを組み入れ、中間体としてRNAを合成する(図4)。まず、ニックトランスレーションまたは鎖置換型ポリメラーゼを用い、スライド表面上に二本鎖DNAを作成する。新たに生成された鎖は、T7ポリメラーゼの鋳型としての役割を果たし、プライマーBからの伸長により必要な二本鎖プロモーターも形成する。プロモーターからの転写は、すぐ近くの表面結合プライマーとハイブリダイすることができ、逆転写酵素により逆転写することができるRNA鎖を生じる。この線形増幅プロセスは、100〜1000個の標的コピーを生成することができる。次いで、生成されたcDNAを、RNase H によるRNA/DNA 二重鎖におけるRNA鎖の分解により、またはアルカリおよび熱処理により、一本鎖DNAに変換することができる。RNA分子におけるプライマーB配列の分子内ハイブリダイゼーションを最小限に抑えるため、プライマーBの配列の半分は、T7プロモーター配列由来であってよく、作成される相補配列の量を約10塩基まで低減する。
両増幅法は等温であり、アンプリオート領域内にのみ限定される合成鎖の拡散を保証する。アンプリオートのサイズは約2μmであるが、増幅されたDNAシグナルは、CCDピルセル当たりの総表面バックグラウンドの25倍の増加を相殺することができるため、10μmまで可能である。さらに、プライマーB結合部位は、約10nmの間隔を置いて位置しており(10,000/μm2)、置換DNAの即時捕捉を提供する。緩衝液の乱れは、閉鎖キャピラリー反応チャンバーによりほぼ解消される。
本発明のさらに他の実施形態は、インベーダーオリゴヌクレオチドによるプライマーアニーリング用の一本鎖DNAの形成に基づく鎖置換型酵素を用いる等温増幅のための方法を提供する(図5参照)。二本鎖DNAは、2種類のプライマー、1種類のインベーダーオリゴヌクレオチドまたは他の試剤、およびクレノウ断片ポリメラーゼなどの鎖置換型ポリメラーゼを用い、一定の温度で増幅することができる。インベーダーオリゴヌクレオチドは、対応する1種または複数のプライマーに比べ、等しいかより高濃度である。当初、標的DNAは、プライマーよりも約100から1億倍低い濃度である。
インベーダーオリゴヌクレオチドを用いる等温増幅の方法は、
1)侵入プロセスにより、インベーダー (LNAもしくは PNAまたはより強固なDNAとの結合を提供する他の修飾から部分的に調製することができる)を標的DNAの5'末端配列の１つに結合させるステップと(インベーダーは、一本鎖または二本鎖オーバーハング(D)を有することができる。(TA)xの低い二重鎖安定性、またはアダプターを介して標的DNAの対応する末端に付加することができる同様の配列によって侵入を助けることができる)、
2)ポリメラーゼにより、プライマー1を利用可能な一本鎖DNA部位とハイブリダイスさせ、プライマー伸長を開始させ、1種類のDNA鎖を置換するステップと(インベーダーは、プライマー1と部分的に相補的である。プライマーの完全なブロッキングを避けるため、相補的部分のサイズおよび結合効率は、使用する温度および濃度において約9:1の結合/非結合平衡が得られるように設計される。遊離プライマー1の約10%は、標的DNAより過剰である)、
3)ポリメラーゼにより、プライマー2を一本鎖DNAの逆末端とハイブリダイズさせ、新たな二本鎖DNAを作成するステップと、
4)最初のおよび新たなdsDNA分子によるステップ1〜3の連続的開始のためステップ1〜3を繰り返すステップとを含む。
E. プローブおよびプールの設計
1種または複数の検出可能な色を使用してもよいが、複数の色は、ライゲーションサイクル数を低減し、システムの効率を改善すると思われる。当技術分野の現状は、4色を同時に使用できることを示唆している。本発明の好ましい実施形態は、FRETに基づいてシステム、時間分解システムおよび時間分解FRETシグナル伝達システムを利用する (Didenko、2001、同上)。量子ドット機能強化型三重FRETシステム、ならびにデンドリマー技術などの特注化学反応も企図されている。
好ましい実施形態では、FRETに基づく検出用の普遍プローブ2セットを使用する。共有の米国特許出願第09/479,608号および第10/608,298号(参照により全体として本明細書に組み込まれる)において以前に記載されているプローブ設計を用い、1024以下の個別合成により4096種の可能な6量体すべてが生成される。プローブは、実験における使用に先立って適性付与(matriculation)およびQC (品質管理)プロセシングのプロトコル(Callida Genomics, Inc.、Sunnyvale、CA)を受ける。プローブは、最小限の効率差を有するように設計され、完全マッチおよびミスマッチ標的との各プローブの実際の挙動は、QCアッセイにより判定され、高度なベースコーリングシステム(Callida Genomics, Inc.)によって使用される。
6.6 中核技術
本発明の方法は、次の3つの中核技術に頼っている。1)任意の生物体由来のDNAのハイブリダイゼーションおよび任意の可能な配列変化の検出による完全配列決定を可能にする普遍プローブ。これらのプローブは、知られている遺伝子配列を参照することなく、統計的原理を用いて設計される(参照により全体として本明細書に組み込まれている共有同時係属の米国特許出願第10/608,293号を参照); 2) 2種類の短いプローブの小さな普遍セットを組み合わせ、 DNAリガーゼによる「酵素的プルーフリーディング」によって提供される優れた特異性を持つ数千種類の長いプローブ配列のうち数十種類を生成させるコンビナトリアルライゲーション(米国特許出願第10/608,293号を参照); 3)配列決定に対する悪影響なしに、ハイブリダイゼーションプロセスを単純化する様々な配列の数百個の同一タグ付きプローブの混合物である情報プローブプール(IPP)(参照により全体として本明細書に組み込まれている米国特許出願第 09/479,608号を参照)。
本発明の方法は、IPPからの蛍光タグ付きプローブ対のハイブリダイゼーション/ライゲーション用の鋳型として、光学的に透明な表面上にランダムに配列された数百万個の単一分子DNA断片を使用する。先端光学による敏感なメガピクセルCCDカメラを用い、全アレイ上の数百万の個別ハイブリダイゼーション/ライゲーション事象を同時に検出する(図6)。DNA断片(長さ25〜1500bp)は、CCDピクセル当たり約1分子の密度(基板1平方ミクロン当たり1〜10分子)で配列される。各CCDピクセルは、1個(または数個)のDNA断片および数百個の標識プローブ分子を含む約0.3〜1μmの仮想反応セルを規定する。試料の混合物を分析し、含まれている各々の断片の配列を組み立てるSBHの能力は、ランダムアレイにとって極めて有益である。DNA密度は、90%を超える全ピクセルにおいて効率的に分析することができる1〜3個の断片を有するように調整される。各反応の容積は、約1〜10フェムトリットルである。3×3 mmのアレイは、1億個の断片または約1000億個のDNA塩基(30個のヒトゲノムに相当する)を保持する能力を有する。
6.7 コンビナトリアルSBH
上述のように、標準的SBHは、試料読み取り長の改善を含む競合するゲルに基づく配列決定技術を上回る顕著な利点を有する。しかしながら、最終的に、標準的SBHプロセスは、ますます長いDNA断片の配列に対する指数関数的に大きなプローブセットを使用する必要性によって限定される。
コンビナトリアルSBHは、標準的SBH技法の多くの制限を克服する。コンビナトリアルSBH (参照により全体として本明細書に組み込まれているDrmanac による米国特許第6,401,267号)では、DNAリガーゼの存在下で、短いプローブの2種類の完全な普遍セットを標的DNAに暴露する。通常、一方のプローブセットは、スライドガラスなどの固体支持体に結合され、蛍光体で標識された他方のセットは、溶液中に遊離している(図6および7)。結合および標識プローブは、正確に隣接した位置で標的とハイブリダイズし、ライゲーションされて、基板に共有結合で並べられている長い標識プローブが作成される。洗浄して標的および非結合プローブを除去した後、各アレイ位置における蛍光シグナルを、標準的アレイリーダーにより記録する。所与の位置における陽性シグナルは、組み合わされてシグナルを発生した2種類のプローブを補完する標的内の配列の存在を示している。コンビナトリアルSBHは、標準的SBH法を上回る多くの読み取り長、コストおよび材料の利点を有する。例えば、標準的SBHでは、長さ10〜100kbのDNA標的を正確に配列決定するために（変異発見の目的で）100万個以上の10量体プローブの完全セットが必要とされる。 対照的に、コンビナトリアルSBHによれば、10量体の同一セットは、1024個の5量体の2種類の小さなセットを組み合わせることによって作成される。実験の複雑性、コストおよび材料要件を大きく低減することにより、コンビナトリアルSBHは、DNA読み取り長および配列決定効率の劇的な改善を可能にする。
6.8 情報プローブプール
コンビナトリアルSBHの効率は、情報プローブプール(IPP)の使用によってさらに増幅される。IPPは、ハイブリダイゼーションプロセス中にプールされ、テストしなければならない組合せの数を最小限に抑える統計的に選択されたプローブのセットである。4〜64個の様々なプールを含むIPPのセットは、ある標的配列を明確に決定するように設計される。各プールセットは、プローブの普遍セットを含む。通常、プールのサイズは、16〜256プローブの範囲である。1個または複数のこれらのプローブから陽性シグナルが生じる場合、プール内の全プローブは、陽性スコアを受け取る。任意の独立したIPP対合からのスコアを用い、各塩基位置についての複合確率スコアを作成する。正確な配列データがほぼ確実なのは、10種類またはそれ以上の重複プローブの各々を異なるプール内で組み合わせ、各塩基位置についてのスコアを作成するからである。あるプローブについての擬陽性スコアは、異なるプールからの多くの正確な他のスコアによって容易に相殺される。さらに、相補DNA鎖を配列決定することが、プール関連の擬陽性プローブの影響を独立して最小限に抑えるのは、各相補鎖についての実際の陽性プローブが、偶然異なるプール内に入る傾向があるためである。より長いプローブのIPPは、実際により情報に富み、個々に記録されたより短いプローブよりも正確なデータを提供する。例えば、64種類の10量体の16,000個のプールが提供する擬陽性は、2kbのDNA断片についての16,000個の個別7量体より100倍も少ない。
IPPのセットを用い、配列されたDNA標的から配列情報を取得する。IPPは、ある長さのオリゴヌクレオチドの注意深く選択されたプールであり、各プールは通常、16〜128個の個別プローブを含む。その長さの可能性のあるすべてのオリゴは、IPPの各セットに少なくとも一度表示される。IPPの一方のセットは、供与体蛍光体で標識され、他方のセットは、受容体蛍光体で標識される。これらは共同して、供与体セットと受容体セットからのプローブ間のライゲーションが起きた場合にFRETシグナルを生じる。このようなライゲーション事象は、2種類の該プローブが標的上の隣接する相補部位と同時にハイブリダイズした場合にのみ起こり、その中の8〜10塩基長の相補配列が同定される。1ピクセル当たりの分析できるDNAの長さは、プローブ長、プールサイズ、およびテストされるプローブプールの対の数の関数であり、通常は20〜1500bpである。プールおよび/またはプローブの数を増やすことにより、数キロベースの標的DNAを配列決定することができる。1〜10kbのDNA断片の部分配列決定および/またはシグネチャ解析は、IPPの小さなサブセットまたは個々のプローブ対を用いて行うことができる。IPP対は、多重蛍光標識が使用されている場合、連続ハイブリダイゼーションサイクルで、または同時にテストすることができる。アレイに対するCCDカメラの固定位置は、個々の標的分子に対する連続ハイブリダイゼーションの正確な追跡を保証する。
IPPは、強いFRETシグナルおよび配列特異的ライゲーションを促進するように設計される。典型的なプローブ設計には、IPPの第一セット用の5'-Fx - N1-4 - B4-5 - OH-3'および第二セット用の5'-P - B4-5 - N1-4 - Fy-3'が含まれ、ここで、FxおよびFyは、供与体および受容体蛍光体であり、Bnは、特異的(情報(informatic))塩基であり、Nnは、縮重(ランダムに混合された)塩基である。縮重塩基の存在は、実験の複雑性を増すことなく、有効なプローブ長を増加させる。各プローブセットは、256〜1024個のプローブを合成し、次いでそれらを混合し、1セット当たり合計8〜64 個のIPPのために1プール当たり16個またはそれ以上のプローブのプールを作成することを必要とする。個々のプローブは、実験の感度、柔軟性、および重複性を最大限に高めるため、必要に応じて1個または複数のプール中に存在することができる。供与体セットからのプールを、DNAリガーゼの存在下で、受容体セットからのプールと共にアレイと順次ハイブリダイズさせる。供与体セットからの各プールが受容体プールと対合したら、8〜10塩基の情報配列の可能なすべての組合せを記録し、各ピクセルにおいて標的分子内の相補配列を同定する。この技法の力は、合成オリゴヌクレオチドプローブの2種類の小さなセットをコンビナトリアルに用い、数百万に達する可能性のあるより長い配列を作成し記録することである。
このプロセスの正確な生化学は、配列特異的ハイブリダイゼーションおよび鋳型して個々のDNA標的分子を用いる2種類の短いオリゴヌクレオチドの酵素的ライゲーションに頼っている。いつでも1ピクセルにつき単一の分子のみが呼び掛けられるが、高速の連続呼び掛けのために同一配列の数百個のプローブ分子を各標的に対して利用可能にし、測定値の統計的有意性を提供する。最適化された反応条件と組み合わされたライゲーションプロセスの酵素的効率は、同じ単一標的分子の高速多重呼び掛けを提供する。比較的高いプローブ濃度および高い反応温度の下で、個々のプローブは、迅速に(2秒以内)ハイブリダイズするが、それらをライゲーションさせないとさらに素早く(約0.5秒)解離する。あるいは、ライゲーションされたプローブが標的に対して最適化された温度で約4秒間ハイブリダイズされたままでいると、CCDカメラによって検出されるFRETシグナルを連続的に生じる。1秒当たり1〜10の画像フレームで60秒間各ピクセルをモニターすることにより、平均して10件の連続的ライゲーション事象がマッチする標的配列で起こり、60秒のうち約40秒間その位置に光シグナルが生じる。ミスマッチ標的の場合には、ライゲーション効率が約30倍低く、ライゲーション事象を生じることはめったになく、60秒の反応時間中に生じるシグナルは有るか無しかである。
主な検出の課題は、必要な過剰の標識プローブ分子から生じることがあるバックグラウンドシグナルの最小化である。CCDピクセルをできるだけ小さな基板領域に収集する他に、この問題に対する我々の主な解決法は、表面近接およびFRET技法の相乗的組合せに頼っている(図7)。あるプローブ上のレポーター標識の持続的励起は、光をあてられた表面(例えば、全内部反射によって作成される100nm幅のエバネッセント場内)に近接した同一標的分子上にプローブの対がアラインメントされた場合にのみ起こる。したがって、バックグラウンドシグナルは、供与体が、光があてられた表面からあまりに遠いか、あるいは受容体が、エネルギー移動を引き起こすには供与体からあまりに遠いことから、溶液中のハイブリダイズしていない過剰のプローブからは生じないであろう。さらに、プローブ分子に複数の色素分子でタグ付けし(分岐デンドリマーにより結合)通常のシステムバックグラウンド以上にプローブシグナルを増加させることができる。
すべてのIPPをテストした後、SBHアルゴリズムおよびソフトウエア(すべてが参照により全体として本明細書に組み込まれている共有同時係属の米国特許出願第09/874,772号; Drmanac他、Science 260:1649-1652 (1993); Drmanac他、Electrophoresis 13:566-573 (1992); Drmanac他、J. Biomol. Struct. Dyn. 8:1085-1102 (1991); Drmanac他、Genomics 4:114-128 (1989); Drmanac他による米国特許第5,202,231号および第5,525,464号)を用いて個々の分子の配列組立が行われる。これらの高度な統計的手順は、最も可能性が高いライゲーションデータとマッチする配列を規定する。CCDカメラによって測定される光強度は、あるプローブ対に対する完全マッチ配列が、そのピクセル/標的部位に存在する確率として処理される。異なるプールからのいくつかの陽性重複プローブが、正しい配列中の各塩基を独立に「読み取る」ため(図8)、これらのプローブを合わせた確率は、たとえわずかなプローブが失敗しても、正確な塩基決定を提供する。あるいは、不正確な配列に対応する多重独立プローブは、標的とハイブリダイズすることができず、その配列についての低い総合確率を与える。これが、たとえ不正確な配列に対応するわずかなプローブが陽性に見えても起きるのは、それらが、実際の配列とマッチする真の陽性プローブを有するIPP内に偶然存在するからである。
6.9 rSBHプロセス
本発明のrSBHプロセスの中核は、数百万のゲノムDNA断片を含む高密度ランダムアレイの作成および分析を含む。このようなランダムアレイは、基板表面上にプローブを配列するコストがかかり時間のかかるステップおよび数千種類の配列決定用鋳型を個別に調製する必要性をなくす。その代わりに、ランダムアレイは、単一アッセイにおいて10 Mb〜10 Gbを含む複雑なDNA混合物を分析するための高速かつ費用対効果の大きな方法を提供する。
本発明のrSBHプロセスは、1)配列特異的FRETシグナルを生成するための溶液中の2種類のIPPのコンビナトリアルプローブライゲーション; 2) 1アッセイでDNA混合物を分析するための正確性、長い読み取り長、およびコンビナトリアル法の能力; 3) TIRM、高感度低バックグラウンド蛍光検出プロセス;および4)単一光子感度の市販メガピクセルCCDカメラといった利点を組み合わせている。本発明の方法が単一標的分子上のライゲーション事象を検出する能力を提供するのは、持続性シグナルが、2種類のライゲーションしたプローブを結合標的とハイブリダイズさせ、供与体および受容体蛍光体をお互いの6〜8nm以内、およびアレイ表面上に作成される500nm幅のエバネッセント場内に移動させた場合にのみ生成されるからである。
通常、本発明の方法は、光学的に透明な表面上にランダムに配列され、IPPからの蛍光タグ付きプローブ対のハイブリダイゼーション/ライゲーション用鋳型としての役割を果たす数千〜数百万個の単一分子DNA断片を使用する(図6)。供与体および受容体蛍光体で標識されたプローブプールの対は、DNAリガーゼと混合され、ランダムアレイに提供される。プローブが標的断片上の隣接部位とハイブリダイズした場合には、それらを一緒にライゲーションしてFRETシグナルを生成させる。先端光学の敏感なメガピクセルCCDカメラを用い、全アレイ上の数百万の個別ハイブリダイゼーション/ライゲーション事象を同時に検出する。マッチする各々の配列がいくつかの独立したハイブリダイゼーション/ライゲーション事象を生じる可能性が高いのは、ライゲーションしたプローブ対は標的から最終的に拡散し、新たにハイブリダイズする供与体および受容体プローブによって置換されるからである。お互いの近くでハイブリダイズするライゲーションされない対は、FRETシグナルを一次的に生じることがあるが、有意なシグナルを生じるのに十分長くは標的と結合していない。
一旦、第一プールからのシグナルが検出されたら、プローブを除去し、連続ライゲーションサイクルを用いて異なるプローブの組合せをテストする。アレイに対するCCDカメラの固定位置は、256対のIPP (16×16 IPP)の連続テストの正確な追跡を保証し、2〜8時間を要する。各DNA断片の全配列は、数百の独立したハイブリダイゼーション/ライゲーション事象によって生じる蛍光シグナルに基づいて蓄積される。
DNA断片(長さ50〜1500bp)は、基板1平方ミクロン当たり約1分子の密度で配列される。各CCDピクセルは、1個(または数個)のDNA断片および数百の標識プローブ分子を含む約1×1〜3×3ミクロンの仮想反応セルを規定する。本発明の方法は、試料の混合物を分析し、ミックス中の各断片について配列を組み立てるSBHの能力を効果的に使用する。各反応の容積は、約1〜10フェムトリットルである。3×3 mmのアレイは、100万〜1,000万個の断片、または約10億〜100億個のDNA塩基を保持する能力を有し、上限は、3個のヒトゲノムに相当する。
ピクセル当たりの分析できるDNA断片の長さは、プローブ長、プールサイズ、およびテストされるプローブプールの対の数の関数であり、通常は50〜1500bpである。プールおよび/またはプローブの数を増やすことにより、数キロベースのDNA標的を配列決定することができる。1〜10kbのDNA断片の部分配列決定および/またはシグネチャ解析は、IPPの小さなサブセットを用いるか、あるいは個々のプローブ対を用いても行うことができる。
本発明のrSBH法は、ライゲーションプロセスの高い特異性を含むコンビナトリアルSBHのすべての利点を維持している。同時に、この方法は、プローブの代わりにDNA断片を結合することから生じるいくつかの重要なメリットを追加する。DNA結合は、通常のプローブアレイよりかなり容量の大きいランダムDNAアレイを使用する可能性を生み出し、溶液における2種類の標識プローブのライゲーションによるFRET検出を可能にする。さらに、溶液中に両プローブモジュールがあることは、従来のコンビナトリアルSBHでは不可能である両プローブセットへのIPP戦略の拡張を可能にする。
6.10 プロセスステップ
rSBH全試料分析は、単一マイクロ流体チップに組み入れることができる以下の処理ステップを有する(図9)。
1)病原体混合液カラム上に病原体DNAを収集するための効果的な方法を含む簡便な試料処理またはDNA単離(必要に応じて)、
2)適当な長さの標的を生成するためのランダムDNA断片化、
3)例えば、普遍アンカーとのライゲーションによるDNAの活性基板表面への直接末端結合、
4)試料中に存在するすべての非結合DNAおよび他の分子を除去するためのアレイの洗浄、
5)適切なプローブ濃度における2種類のIPPセット由来の第一IPP対およびT4リガーゼまたは他の(すなわち、耐熱性の) DNAリガーゼの導入、
6) 同時照明および1秒当たり1〜10フレームでのシグナルモニタリングを合わせた1分間未満のインキュベーション、
7)第一IPP対を除去するための洗浄と、続く第二IPP対の導入、および
8)全IPP対がテストされた後、コンピュータプログラムは、各断片についてシグネチャまたは配列を作成し、次いで、シグネチャまたは配列の包括的データベースとそれらを比較し、試料中に存在するDNAの性質を報告すること。
6.11 装置サイズおよび特性
本発明の方法と共に使用される装置は、参照により全体として本明細書に組み込まれている共有同時係属の米国特許出願第10/738,108号に記載の装置に基づいている。本発明の装置は、3つの主要構成要素、すなわち1) IPPを取り扱う(混合、導入、除去)ための操作サブシステム(このモジュールは、試料調製を「チップ上に」組み入れるように拡張できることが意図されている)、2)反応チャンバー-任意の基板を覆う温度制御付き流通式チャンバー、および3)照明/検出サブシステムからなる(図10)。これらのサブシステムは、一体となって働き、単一の蛍光体検出感度を提供する。
本発明の装置は、DNA結合および/またはin situ増幅がチャンバー内で行われる場合、アレイ基板用のスロットならびにプローブモジュール、および場合によってアレイ調製モジュールを連結するためのポート付きプラグイン反応チャンバーを操作する。
カートリッジは、32個までのFRET供与体プールおよび32個までの FRET受容体プール用の64個までの個別保存容器を含む(図11)。カートリッジは、単一マイクロ流体チャンネルおよび一体型真空/圧力作動マイクロバルブにより各々のプール保存容器に連結されている混合チャンバーを含む。
6.11.1 反応チャンバー
一旦、反応チャンバーに結合された基板は、ハイブリダイゼーションチャンバーの底部を形成する。このチャンバーは、ハイブリダイゼーション温度を制御し、チャンバーへのプローブプールの添加、エバネッセント場からのプローブプールの除去、チャンバー全体のプローブプールの再配分、および基板洗浄のためのポートを提供する。標識プローブプール溶液は、チャンバーに導入され、標的DNAとハイブリダイズするための時間(数秒)が与えられる。ハイブリダイゼーション事象に関与しないプローブは、ハイブリダイゼーション溶液中に電位を生じさせることにより、エバネッセント場から退去させられる。単一光子検出能力のある高感度CCDカメラを用い、反応チャンバーの最上部で窓を通して基板をモニターすることにより、FRETハイブリダイゼーション/ライゲーション事象(参照により全体として本明細書に組み込まれているHa, Methods 25:78-86 (2001))を検出する。基板の画像は、約30秒間、一定の間隔を置いて撮影する。次いで、チャンバーを洗い流してすべてのプローブを除去し、次のプローブプールを導入する。全プローブプールがアッセイされるまでこのプロセスを256〜512回繰り返す。
6.11.2 照明サブシステム
照明サブシステムは、TIRMバックグラウンド削減モデルに基づいている。TIRMは、2種類の光学的に異なる材料の境界に100〜500nm厚のエバネッセント場を生み出す(参照により全体として本明細書に組み込まれているTokunga他、Biochem. Biophys. Res. Commun. 235:47-53 (1997))。本発明の装置は、ビームのガウス分布がアッセイに対して及ぼすであろうあらゆる影響をなくす照明方法を用いている。レーザーおよび本発明の装置のサブシステム内の他のすべての構成要素は、光ケーブルに取り付けられている。検流計1および2に取り付けられた鏡を移動することにより、1 cmの走査線が作成される(図10)。次いで、検流計3により、プリズム1を介して走査線を基板に向ける。検流計3は、走査線が、その臨界角でガラス/水境界に交差するように調整される。ビームは、内部全反射を受け、基板上にエバネッセント場を生じる。エバネッセント場は、ガラス/水界面を越えて到達するビームエネルギーの数百ナノメートル(通常は100〜500nm)の拡大である。本発明のエバネッセント場を用い、ガラス/水境界に近い蛍光体を励起し、励起源からのバックグラウンドをほぼなくすことができる。
6.11.3 検出器サブシステム
本発明の装置は、ハイブリダイゼーションチャンバーの上につり下げられた光子計数能力のある高感度CCDカメラ(Andor Technology (Hartford、CT)製の512×512ピクセルDV887など)使用している。このカメラは、反応チャンバーの窓を通して基板をモニターする。カメラのレンズは、各ピクセルが3平方ミクロンの基板からの光を受け取るように、十分な倍率を提供する。別の実施形態において、カメラは、低ノイズ用途のために水冷であってよい。
高感度電子増倍型CCD (EMCCD)検出器は、高速単一蛍光体検出を可能にする。532nmで1ワットの励起レーザー(Cy3/Cy5 FRETの場合)を想定すると、レーザーから毎秒放射される光子数を計算し、検出器に毎秒到達する光子数を推定することができる。式e = hc/λ(式中、λは、波長を表す)を用いると、波長が532nmの光子は、3.73e-19ジュールのエネルギーを有する。レーザー出力が1ワット、すなわち毎秒1ジュールとすると、毎秒2.68e18個の光子がレーザーから放射されると予想される。1 cm2の基板領域全体にこのエネルギー量を拡張すると、各平方nmは、約1e-15ジュールのエネルギー、すなわち約26,800個の光子を受け取ることが予想される。蛍光体の量子収率を0.5と想定すると、毎秒約13,400個の光子の出力が予想される。高品質レンズを用いると、全出力の約25%、すなわち合計3350個の光子が集められ、CCDによって捕捉されるはずである。AndorのDV887 CCDは、Cy5が放射する場合、670〜700nmにおいて約0.45の量子効率を有する。これは、各ピクセルが記録する毎秒約1500個の光子を与える。毎秒10フレームで、各フレームは、150カウントを記録する。-75℃におけるカメラの暗電流は、約0.001電子/ピクセル/秒、平均して1秒に1回の1000ピクセルごとの1擬陽性カウントである。たとえ、毎秒1ピクセル当たり1つの擬陽性カウントが想定される場合でも、1フレームにつき1ピクセル当たり0.1で、1500:1のシグナル対ノイズ比が得られる。TIRM照明技法と組み合わせると、検出器バックグラウンドは、ほぼゼロである。
6.11.4 装置の小型化
別の実施形態において、本発明の方法は、小型装置で行うことができる。小数の在庫構成要素しか必要としない簡単な物理装置は、全プロセスを行うことができる。照明および検出構成要素は、システムの中核を形成する。この中核システムは、CCDカメラ、レーザーまたは他の光源、0〜3個の走査型検流計、基板用の石英または等価な支持体、および反応チャンバーだけからなる。これらの構成要素すべてを1立方フィートの装置に入れることが可能である。小型流体操作ロボットまたはマイクロ流体ラボオンチップ装置(図9)は、8〜64個のIPPの2つのライブラリーからのIPP対を評価することによってアッセイを行い、約0.5 ft3を占めることがある。64個の保存容器を有する高密度マルチウエルプレートまたはラボオンチップは、ライブラリーの超小型保存を可能にする。シングルボードのコンピュータまたはラップトップにより、装置を動かし、分析を行うことができる。このようなシステムは、容易に運搬可能であり、環境の現場調査を行い、または救急隊もしくはバイオハザード作業者に対応するためのほぼいずれの運搬具にも収まることができる。装置を医療パックに収めて乾電池で動かし、ほぼいずれの環境下でも現場における迅速で正確なスクリーニングを行うことも可能である。
このシステムの構成要素には、1)小型パーソナルコンピュータ(1フィート×1フィート×6インチ)、2)ロボット型またはラボオンチップ流体操作システム(1フィート×1フィート×2インチ)、3)レーザー(6インチ立方)、4)ヒートシンク付き走査型検流計(3インチ立方)、5)スライド/ハイブリダイゼーションチャンバーアセンブリ(3インチ×1インチ×2インチ)、6) CCDカメラ (4インチ×4インチ×7インチ)、および7)液体保存容器(約10〜1000 ml容量)が含まれる。
本発明の装置の別の実施形態は、その基板により行われるすべてのアッセイが病原体検出のためのものである、モジュール式のマイクロ流体ベースの基板を一体化する(図11)。この消耗基板は、一体化された「反応カートリッジ」の形態をしている。カートリッジの基板構成要素は、プローブプールモジュール、試料一体化モジュール、および反応基板モジュールを含む異なる3種類の使い捨て一体化モジュールを含むまなければならない。すべての機械機能は、このカートリッジ上で働き、アッセイ結果を生み出す。この基板には、反応カートリッジおよび関連モジュールが提供するクイックコネクトなどの統合流体工学が必要とされる。
基板の検出表面上で情報プローブプールを取り扱うため、基板にマイクロ流体工学を導入する。基板と無関係に初期のプローブ操作モジュールを開発し、「プラグアンドプレイ」手法を用いて標準的基板カートリッジに最終設計を加えることができるモジュール式手法を用いる。カートリッジは、32のFRET供与体プールおよび32までのFRET受容体プールのための64までの個別保存容器を含む(図11を参照)。多数のIPP、例えば、2×64、または2×128、または2×256または2×512または2×1024のIPPを1個または1セットのカートリッジ上に保存することができる。カートリッジは、それ自身のマイクロフルイディックチャンネルによって主チャンネルに連結される混合チャンバーおよび一体式真空/圧力作動マイクロバルブを有する。バルブが開かれた場合、真空を利用してプールを混合チャンバー内に移動する。次いで、バルブを閉じ、このプロセスを繰り返して第二のプールを加える。混合チャンバーは、プールを撹拌し、それらを反応チャンバーに押し込むのに使用される洗浄ポンプとつながっている。
6.12 ソフトウエア構成要素およびアルゴリズム
生データは、各ピクセルにおける各プール対(すなわち、IPP)について様々な時間/温度点で約3〜30の強度値を示す。各値は、10〜100個のCCD測定値(好ましくは、毎秒5〜10個)の統計処理によって得られる。各断片は、3〜30個の強度値512セットを有する。断片が100万個のアレイは、約100億の強度値を含む。シグナル正規化は、数百ピクセルの各グループに対して行うことができる。あるIPP対に関するすべてのデータポイントは、セットが予想される挙動を満たさない場合は捨てられるであろう。有用なデータのない各ピクセル(大部分は適切なDNAを有するであろう) (すなわち、不十分な陽性または陰性データポイント)は捨てられるであろう。他のピクセルにおける強度値の分布が決定され、ベースコーリングパラメータを調整するために使用されるであろう。
すべての個々の短い断片を、対応する参照配列に対するスコアシグネチャを用いてマッピングし、比較配列決定プロセスを用いて分析するか、あるいは新たなSBH機能を用いて配列組み立てすることができる。各々の約250塩基の断片は、プライマー配列から出発して約100万個の可能な10量体から組み立てられる。組立プロセスは、数百万のローカル配列候補変異体(local candidate sequence variant)について重複10量体から算出される複合10量体スコアの評価によって進行する。
他のアレイ位置からの断片のグループと著しく重複する配列を有するあるアレイ位置からの断片のグループは、長く連続したゲノム断片に相当する。これらのグループは、参照配列に対する短い断片配列のアラインメントによって、または空のピクセルに囲まれたピクセルを含むDNAの島としても認識することができる。短い断片をグループに割り付けることは、特に部分的構造化アレイにおいて、興味深いアルゴリズム的問題である。
グループ内の短い断片は、断片化された単一DNA分子に由来しており、重複しない。しかし、短い配列は、対応するグループ間で重複し、長い重複DNA断片を表し、ショットガン配列決定プロセスにおけるコスミドまたはBACクローンの配列組立と同一のプロセスによる長い断片の組立を可能にする。rSBHプロセスにおける長いゲノム断片は5〜100kbと異なり、5〜50のゲノム等価体に相当するため、マッピング情報は、すべての関連レベルで提供され、正確なコンティグ組立の指針となる。このプロセスは、個々のグループにおける長い断片に対する短い断片の割り付けおよび約30〜50%のランダムに行方不明の断片の省略および誤差を容認することができる。
本発明のrSBH法は、稀少生物の検出または細胞数もしくは各微生物の遺伝子発現の定量化を提供する。優占種が1×ゲノムカバー率を有する場合、0.1%レベルで発生する種は、約10個のゲノム断片によって表される。DNA規格化は、10,000個を超える細胞中の1個の細胞の検出感度をさらに改善することができる。DNA定量化は、1遺伝子または1生物体に相当するDNA断片の発生数を数えることによって行うことができる。クローニングステップがないことは、rSBHが従来の配列決定よりも定量的な各DNA配列タイプの発生率の推定値を提供することを意味している。定量化研究の場合、試料の250bpの断片への直接の断片化および標準的(非構造化)ランダムアレイの形成で十分である。部分規格化を用い、発生差を最小限に抑えるが保ち続けることができ、標準化曲線を用いて本来の頻度を計算することができる。100万個の断片のアレイは、数百の同遺伝子種およびそれらの遺伝子発現の定量化にとって十分である。
6.12.1 rSBHソフトウエア
本発明は、rSBH全ゲノム(複雑なDNA試料)配列決定を支援するためのソフトウエアを提供する。このソフトウエアは、全ヒトゲノム(約3 Gbp)または10 Gbpまでのゲノムの混合物の分析まで拡大することができる。いくつかのCPUに対する並列コンピューティングが企図されている。
rSBH装置は、10/秒までまたはより速い速度でティフ画像のセットを作成することができる。各画像は、プールされた標識プローブの対に対する標的のハイブリダイゼーションを示す。シグナル平均を提供するため、各ハイブリダイゼーションについて多重画像を作ることができる。標的を長さ約100〜500塩基の複数部分に断片化する。断片をランダム分布でガラス基板の表面に結合する。ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイズしていないプローブの洗浄後、表面をCCDカメラで画像化する。最終的に、画像の各ピクセルは、1個の断片を含むが、一部のピクセルは空である一方で他のピクセルが2個以上の断片を有することがある。この装置は、100〜1,000万個またはそれ以上の断片を画像化することができる。
装置の総実行時間は、ハイブリダイゼーション/洗浄/画像化サイクル(約1分)に、使用するプールセット数を乗じることによって決定される。1024個のプールセット(1024の画像を作る)では、実行は約17時間続き、2色は、これを半分に減らす。画像解析ソフトウエアは、ほぼリアルタイムに画像を処理し、ベースコーリング解析ソフトウエアにデータを送るであろう。
A. 並列処理
rSBH分析は、並列処理に適していることが理想的である。各「スポット」は異なる断片とハイブリダイズするため、分析間の通信の必要性なしにベースコーリング解析を各スポットにおいて並列に実行することができる。全分析における唯一の通信は、制御モジュール(GUI)と解析プログラムの間である。競合条件を避けるため、極めて少ないステップを設ける必要がある。実際のところ、CPU数は、並列処理数を限定する。100万個の断片の場合、100個のプロセッサがあるコンピュータは、各々が10,000個以上の断片を連続して分析する100の並列ベースコーリングプログラムに仕事を分けるであろう。
200個の断片のセットを1つのプロセッサで実行できるが、いくつかのCPUで実行することもできる。最適化されたベースコーリングプログラムは、変異または変異テスト(最新機能)がない場合、約100ミリ秒で終えることができる。この時間には、データ装填および正規化が含まれる。参照検索時間は、最長の参照で約100ミリ秒加わることがある(下記参照)。参照検索時間は、長さに対応し、短い長さについては無視できる。多重変異を分析することは、多重変異部位当たり約1分までの実行時間を増やすことがある。平均分析時間が1断片当たり1秒である場合、100個のCPUを用いて100万個の断片を10,000秒で分析することができる。同様に、1個のCPUを用いて200秒で、または10個のCPUを用いて20秒で、200個の断片を分析することができる。速度についてプログラムを最適化するには、1個のCPUにつきかなりの量のRAMが必要である。以下に述べるように、ソフトウエアは、CPU数および断片数に応じて、各CPUが約2GBから8GBを有する場合、メモリによって制限されない。現在、システム当たり32GB+のRAMを購入することが可能である。
B. データフロー
GUIおよび画像解析プログラムは1個のCPUで動くが、ベースコーリング解析プログラムは、いくつかの(N) CPUで動く。起動時、画像解析プログラムに数Nを提供し、CCDカメラがティフ画像を書き込むディレクトリをモニターする。各ティフファイルについて、各断片のスコアを導きだし、各分析CPUについて1つのN個のファイルにスコアをグループ化する。例えば、200個の断片と10個のCPUがある場合、画像解析プログラムは、最初の20個の断片スコアを第一のベースコーリング解析CPU用のファイルに、第二の20個の断片スコアを第二のベースコーリング解析CPU用の第二のファイルなどに書き込む。他の通信モード、例えば、ソケットまたはMPIを使用できることも企図されている。したがって、ファイルI/Oは、後で容易に交換できるように、1つのモジュールに局在させることができる。
時間とともに、継続して増え続けるティフファイル数のために多数の画像解析ファイルが作成される。本発明は、各ベースコーリング解析CPUについて別々の画像解析ディレクトリを提供する。ベースコーリング解析CPUは各々、それぞれの画像解析ディレクトリをモニターし、利用可能になるとデータを装填する。すべての画像データを保存するのに必要なRAM/CPUの量は、[2バイト×断片数×画像数÷N]である。これは、100万個の断片、1024枚の画像および1台のCPUについて約2GB/CPU、すなわち10台のCPUについて200KB/CPUである。
ベースコーリング解析プログラムに対する他の意味ある(RAMに関して)データ入力は、参照配列 (長さL)である。速度最適化のため、参照配列を10量体(および11量体、12量体)位置のベクトルに変換し、各断片についての上位スコアプローブの迅速な検索を提供する(下記参照)。あらゆるベースコーリング解析CPU上に参照配列位置データを保存することが最も速い。参照位置データを保存するのに必要なメモリの量は、2バイト×L、または2バイト×412のどちらか大きい方である。最大RAMは、2バイト×10GB = 20GBである。実際の参照配列自体も保存されなければならないが、これは、1バイト/塩基として保存するか、あるいは0.25バイト/塩基に圧縮することすら可能である。
各断片の分析は、呼び出された配列結果を生む。これらは、各CPUに関係する画像解析ディレクトリに書き込まれるファイル中に連結される。ベースコーリングが終了した場合、GUIは、呼び出された配列ファイルを処理する。GUIは、様々なCPUからすべてのファイルを装填し、位置によって断片を並べかえ、最終的で完全な呼び出された配列を作成する。各断片は、参照配列検索ステップの間に予め位置づけされているため、並べ換えは取るに足りないことであることに注意されたい。また、GUIは、呼び出された配列の可視化ツールを提供することができる。さらに、GUIは、最終配列の強度グラフを表示することができる。この場合、ベースコーリングプログラムは、強度ファイル(呼び出された配列データとして連結されている)を出力しなければならない。
現在のベースコーリングプログラムは、参照配列およびスポットスコア(例えば、HyChip(商標)から)に基づいてShort Reportファイルを出力する。これがrSBHにとって有用ではないのは、各断片のスポットが多くのハイブリダイゼーションスライドの中に分布されているからである。代わりに、HyChip Short Reportよりさらに抽象的な新たな「Short Report」を各ハイブリダイゼーションについて作成することができる。具体的に、新たなレポートは、各スライド上の完全マッチ数(N)および最高Nスコアの中央値を列挙することができる。マーカーまたはもしあれば空(empties)などの任意のコントロールスポットの中央値も与えることができる。この新たなレポートの利点は、絶えず更新されるGUIテーブル上で各画像についてリアルタイムに見ることができることである。このことは、最終結果を見るために1日待つ代わりに、rSBHシステムが有用なデータを生み出している場合、早い段階で(および実行中に)ユーザーに伝えるであろう。新たなレポートの高度な使用は、rSBH装置へのユーザーフィードバックを可能にする。例えば、誰か一人が失敗した場合、GUIからの実行を休止/停止するか、あるいはプールセットを繰り返す。また、GUIは、ハイブリダイゼーションおよび洗浄温度などの装置パラメータを、実行中リアルタイムに表示することができる。最終的に、製品は、装置を指令に統合し、ユーザーGUIのモジュールを制御することができる。
C. ベースコーリング
プールされたプローブは、各断片について同一であることから、rSBHベースコーリングプログラムは、すべての断片について1回だけ、プールされたプローブを読み取ることができる。ベースコーリングプログラムは、参照配列入力を必要とする。rSBHの場合、参照配列は、上位数百スコアのクラスタリングの分析から得られる。上位スコアの位置の単純ビン化アルゴリズムが最も効率的なのは、最大ビンカウントを見つけるためにビン化位置を通る単一パスが必要であるためである。最大ビンカウントの窓は、断片の位置を参照配列内に置く。250bpの断片および1024の測定値により、断片スコアの1/4は陽性(すなわち、完全マッチハイブリダイゼーションスコア)である。その場合、プールされたプローブの複雑性のため、10量体の1/4は、陽性スコアを示す。さらに、410より長い参照配列の場合、プローブは、参照配列における全10量体の1/4が陽性となるまで繰り返される。同じことは、11量体および12量体についてもあてはまり、すべての参照配列プローブのうち1/4は陽性である。1nsecで1個のプローブをビン化することができるプロセッサの場合、断片の参照配列を見つけるのに[L÷4÷109] 秒かかるであろう。極端なL=10,000,000,000の場合、1台のCPUを用いて2.5秒/断片である。100万個の断片および100台のCPUの場合、参照配列を見つける合計時間は、約25,000秒(6〜8時間)である。
上位Lスコアをビン化する代替策は、各断片に対して新規なタイプの配列組立を行い、上記の例において使用される250個未満までプローブ数を減らすことである。これは、新規なアルゴリズムが速い(例えば、1 msec未満)場合、断片検索プロセスを加速するであろう。速く新規なアルゴリズムは、重複プローブを有する上位250スコアのうち10以上の数セットを見いだすことを含むことができ、所要時間を大幅に短縮することができる。
D. ベースコーリングアルゴリズム
1.プローブプールファイルを読み取る
2.参照配列(長さRL)を読み取り、参照配列オブジェクト中に保存する
2a.参照配列位置データ構造を作成する
3.強度ファイルを読み取る(画像解析から作成されているためリアルタイムに)
3a.値をスコアデータ構造中に保存する
4.各断片の上位Lスコア(長さLの中央値の)について蓄積する
5.各断片についての分析ループ:
5a.上位Lスコアについて参照配列中に位置のリストを作成する
5b.長さ[RL÷(m×L)]のベクトルを作成し、上位スコア位置をその中にビン化する。これは、ビン長m×Lを与え、mは、断片のどちらかの側に余裕を提供するため約1.5でなければならない
5c.上位Lスコアの位置をビン化ベクトル中にビン化する
5d.最高総ビンカウントの領域を見つける。これは、(m-1)×Lの塩基位置内に断片参照配列を与える
5e. 断片参照配列を用い、ベースコーリングを行う
5f.呼び出された配列をファイル:呼び出された配列 (位置情報を含む)上で連結させる
6.各断片についての分析ループの終了。
6.13 追加実施形態
本発明の方法は、プローブおよびIPPが設計される複数の機構を可能にする。一実施形態において、プローブおよびIPPは、1プール当たりのプローブ数を変えることにより、より具体的には、1プール当たり4〜4096プローブで設計される。第二の実施形態において、プローブおよびIPPは、1セット当たりのプール数を変えることにより、より具体的には、1セット当たり4〜1024プールで設計される。プローブは、2〜8個の情報塩基を有し、合計4〜16個の塩基を提供することができる。さらに別の実施形態において、プローブは、ある位置における縮重合成でプールとして調製される。他の実施形態は、様々なプローブが1つのプール内で混合される2セットのIPPの2つの組立を有することを含む。
20〜数百プローブの小さなセットは、個々の核酸断片の独特なハイブリダイゼーションシグネチャを提供することができる。ハイブリダイゼーションパターンは、例えば、mRNA分子を数えるために、病原体またはその他の核酸を同定するための配列とマッチさせる。本発明の方法の一実施形態は、異なるランダムアレイ上の同一分子を認識するためにシグネチャを使用する。これは、異なるアレイ上で同一のプローブセットをハイブリダイズさせてシグネチャを作成した後、同一試料から調製された異なるアレイ上のテストプローブの異なるサブセットのハイブリダイゼーションと、続く個々の分子ごとのデータの組合せを可能にする。
本発明の方法の別の実施形態は、IPPまたは個々のプローブの単一セットのみを用い、コンビナトリアルライゲーションなしに単一分子DNA分析を行う。この実施形態において、FRETシグナルは、標的を供与体蛍光体で、プローブを受容体蛍光体で標識することにより、または標的を受容体蛍光体で、プローブを供与体蛍光体で標識することにより検出される。5'-Nx - B4-16 - Ny-3'の形態のプローブを、個別に、または特定の位置に縮重(混合)塩基を含むプールとして合成することができる。別の実施形態において、プローブ/プローブプールハイブリダイゼーションは、1種または複数の標識ヌクレオチド(通常、ヌクレオチドは、差次的に標識される)の組み入れによるハイブリダイズされたプローブのポリメラーゼに基づく伸長と組み合わされる。
本発明の方法の別の実施形態は、同一プローブ配列による標的分子の多重テストを行うためのプローブ除去を利用し、プローブ分子は、電場、磁場、または溶液流を用い、支持体表面からおよび支持体表面に向かって繰り返し除去することができる。このサイクルは、20〜30秒まで1〜10秒ごとに生じる。蛍光シグナルは、サイクルの各段階についてか、あるいはプローブ除去が開始された後にのみ、またはプローブ除去が完了した後にのみ記録される。除去は、温度サイクルと連動する。この実施形態において、プローブ除去は、FRET標識化を必要とせず、代わりに1つの標識からの直接蛍光に頼っている。あるいは、FRET反応は、標識プローブと、標的分子に結合されている色素分子の間で起きる。
プローブ配列の反復テストを含む本発明の方法の他の実施形態は、外部容器から反応チャンバーへの同一プローブ分子種の反復装填を利用する。まず、前のプローブ装填の迅速除去を、完全マッチハイブリッド(ライゲーションを用いた場合の2個のプローブのライゲーション産物)を除去しないが、遊離プローブを除去する洗浄用緩衝液で行う。第二の洗浄を用い、次のプローブ装填が導入される前にすべてのハイブリッドを融解する。
別の実施形態において、標的分子との各プローブ分子種の相互作用は、1回だけ測定される。このプロセスは、アレイ内の異なる場所における同一DNAセグメントの重複表示および/または1回限りのライゲーション事象の確度に依存している。
支持体上に試料を装填してアレイを形成する前に最終断片を調製することに加え、本発明の方法の別の実施形態では、2段階切断手順を用いる。まず、試料DNAをランダムに切断し、長めの断片(約2〜200kb以上)を作成する。これらの断片の混合物を、サイズが約10×10μm2のセルを含むグリッドの形態をした疎水性材料によってパターン化することができる支持体上に装填する。試料の濃度は、主に1個または数個の長い断片が各セル内に存在するように調整する。これらの断片をさらに、約20〜2000塩基の最終断片長までin situにおいてランダムに断片化し、支持体表面に結合する。最適なセルサイズは、セルごとに導入されるDNAの全長、最終断片の好ましい長さ、および最終断片の好ましい密度によって異なる。本発明のこの断片化法が長距離マッピング情報を提供するのは、あるセル内の短い断片はすべて、長い重複断片由来の1個または数個の長い断片に属するからである。この推論は、長いDNA配列の組立を単純化し、全染色体のハプロタイプ構造を提供することができる。
本発明の別の実施形態において、選択された標的DNAは、例えば、特定の遺伝子または生物体用の均等化された数のDNA分子を含むカラムを用い、複雑な試料から捕捉される。例えば、選択されたウイルスもしくは細菌ゲノムもしくはゲノムの一部を、結合された一本鎖DNA (ssDNA)の形態でこれらのカラム上に提示することができる。二本鎖DNA (dsDNA)および相補鎖が固定化DNAとのハイブリダイゼーションによって捕捉された場合には、試料DNAを融解する。過剰の相補DNAまたはその他の無関係なDNAを洗い流す。次いで、捕捉されたDNAを高温または化学変性によって除去する。このプロセスを用い、感染性因子の診断のためにヒトまたは他の複雑なDNAを除去することができる。また、小さめのアレイ上に低コピー数で存在する他の因子を検出するため、過剰に提示された因子の濃度を低減する方法を提供する。捕捉プロセスは、管、マルチウエルプレートのウエルまたはマイクロ流体チップの中で行うことができる。
具体的な遺伝子または他のゲノム断片の選択は、下流切断を伴う制限酵素によるDNAの切断およびマッチするアダプターのライゲーションによって行う(参照により全体として本明細書に組み込まれている共有、同時係属の米国特許出願第10/608,293号に記載)。アダプターによって捕捉されない断片は、破壊されるか、さもなければ除去される。別の実施形態は、1個または複数のミスマッチのある所与の配列にマッチするように設計された6〜60塩基、より好ましくは10〜40塩基、より好ましくは15〜30塩基のオリゴヌクレオチドを使用し、切断酵素と併せてミスマッチ認識を用いるDNAの切断を可能にする。2種のオリゴヌクレオチドを、約1〜20塩基シフトのある相補鎖を切断するために設計し、アダプターのライゲーションまたはベクターアームとのライゲーション用の粘着末端を作成することができる。このような2対のオリゴヌクレオチド切断鋳型をゲノム断片から所得および捕捉するか、あるいは特異的な1種または複数のアダプターによる捕捉のために末端修飾することができる。切断鋳型を合成するか、あるいは、短いオリゴヌクレオチドの1つまたは複数のライブラリーを設計し、任意のDNAに必要な切断鋳型の普遍ソースを提供する。以下のコンセンサス配列nnnbbbnn、nnbbbbnn、またはcggnnnbbbbnn、nnbbbnn、nnbbbnnncac (式中、nは、4種の塩基の混合物または普遍塩基を表し、bは、特定の塩基を表し、bbbbは、256種の可能な4量体配列のうち１つを表し、cggおよびcacは、このライブラリー内の全メンバーによって共有される特定の配列の例を表す)によって表される256種のオリゴヌクレオチドのライブラリーを用い、切断鋳型を作成することができる。切断鋳型を作成するため、nnnnnnnnnnnnnnnnnn、またはgccnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnngtgの組立鋳型を用い、対応するオリゴヌクレオチドライブラリーから選択される2または3種のメンバーをライゲーションすることができる。
様々な化学的結合手法の他に、ランダム切断により、または特異的切断により調製されたDNA断片を、アンカーの断片に結合されているアダプター、アダプター、プライマー、表面または双方に結合されている他の特異的バインダーを用い、表面に結合することができる。一実施形態は、長さが約1〜10塩基の粘着末端のあるランダムに結合されたアンカーを用い、ssDNA断片またはdsDNA断片をマッチする粘着末端とライゲーションさせる。粘着末端は、DNA断片に結合されているアダプターにより提供することができる。この手法は、結合断片の末端配列を同定するための様々な粘着末端を有するアンカーのある基板部分を得る可能性を提供する。別の実施形態は、DNA断片に結合されているアダプターと相補的であるプライマーを支持体に結合する。ssDNAがプライマーとハイブリダイズした後、ポリメラーゼを用いてプライマーを伸長させる。生成したdsDNAを融解し、支持体に結合していない鎖を除去し、以下に述べるように、DNA増幅に使用する。さらに別の実施形態は、DNA断片の3'または5'末端を認識し、高い親和性でそれらと結合する特異的バインダー(例えば、環状ペプチド)で表面をコーティングする。
片側または両側でアダプターと結合している短い断片の分析がパリンドロームおよびヘアピンによる読み取りに役立つのは、パリンドローム/ヘアピン内に切断が存在した場合、配列の残りと相補的でない新たなアダプター配列が結合されるからである。アダプターは、標的DNAのすべての塩基をすべての重複プローブに読み取らせる。
さらに別の実施形態において、検出確度および効率は、単一分子のランダムアレイ、と、続くin situにおける限局性増幅(参照により本明細書に組み込まれているDrmanacおよびCrkvenjakov、1990、同上)を用い、同一ピクセル領域内に結合されている10個まで、100個まで、1000個まで、10,000個までのレプリカ分子を作成することによって高められる。この場合、単一分子感度が必要ないのは、たとえ、FRETおよびTIRMが依然として使用できても、プローブの多重スコアが必要ないからである。増幅プロセスは、以下のステップ、すなわち1)1種類のプライマーでコーティングされた支持体を使用すること(約1000〜50,000プライマー分子/μm2)、2)溶液中でライゲーションされたアダプターおよび第二のプライマーにより修飾された試料DNA断片を使用することを含む。例えば、キャピラリーチャンバー(支持体からわずか10〜100μm離れたカバーグラス)を用いること、または標的および第二のプライマーをゲルに埋め込むことにより混合および拡散を最小限に抑えることが必要である。単一標的分子について増幅によって作成される分子の集団は、サイズが10〜100μm未満のスポット、すなわち「アンプリコン」を形成するであろう。また、ハイブリダイゼーションまたはライゲーション事象の増幅を用い、シグナルを増加させることができる。
好ましい実施形態が連続等温増幅(すなわち、様々なタイプの鎖置換)を使用するのは、大規模な拡散または乱れを引き起こすことがある高温を用いてdsDNAを変性させる必要がなく、置換鎖は、結合プライマー以外と結合する他の相補DNAを持たず、DNAの高い局所濃度を作り出すことができるからである。等温増幅を用いる別の実施形態は、低い融解温度を有するコア配列(すなわち、3〜13個のTA反復を有するTATATAT...配列を用い)およびこのコア配列と実質的にマッチするプライマーで少なくとも1種類のアダプター(標的DNAの一方の末端用)を設計することである。この反応で使用される鎖置換の能力があるポリメラーゼの最適温度において、TATATA...部位におけるdsDNAは、局所的に融解し、プライマーのハイブリダイゼーションおよび複製の新たなサイクルの開始を可能にする。コアの長さ(すなわち、安定性)は、30〜80℃の温度に適応するように調整することができる。この連続増幅反応(CAR)において、新たな鎖合成は、前の合成を行う酵素がプライミング部位から移動すると直ぐに開始することがあり、約数秒を要する。このプロセスを用い、ただ1つのプライマーが使用される場合、dsDNAから始まって高濃度のssDNAを生成する。1つのプライマーが表面と結合している増幅の場合、低温融解アダプターは非結合末端のためであり、対応するプライマーは溶液に遊離している。CARは、ポリメラーゼの他に、その他の酵素を必要としない。アダプターは、DNA断片とのライゲーション、または高温による融解を必要とすることがあるソースdsDNAに対する2回またはそれ以上の初期増幅サイクル用の標的特異的プライマーの尾部伸長によって導入される。
プローブ/プローブプールハイブリダイゼーションのみ、または塩基伸長もしくは試料DNA断片のランダムアレイに対する2プローブライゲーションとの組合せに基づく上述の核酸分析プロセスは、長いDNA(細菌人工染色体(BACs)または全ウイルス、全細菌もしくは他の複雑なゲノムを含む)またはDNAの混合物の配列決定;選択された遺伝子の診断用配列分析;新生児の全ゲノム配列決定;新しい作物および動物の遺伝子構造の正確な知識についての農業バイオテクノロジー調査;個々の細胞発現モニタリング;癌診断;DNAコンピューティング用配列決定;環境モニタリング;食品分析;および新たな細菌性およびウイルス性生物の発見を含む様々な用途に使用される。
本発明の方法は、バックグラウンドを検出閾値以下まで低減しながら、単一標識プローブから十分なシグナルを生み出す。特別な基板材料またはコーティング(金属化など)および先端光学を用い、1 cm2の表面からの数百万の単一分子の並列検出を妨げる高いシステムバックグラウンドを低減する。あるいは、試料と共に、またはDNA結合プロセス中に導入されるバックグラウンドは、アフィニティーカラム、修飾DNA結合化学反応(例えば、ライゲーション)、またはDNA特異性が限られている結合性分子(例えば、環状ペプチド)を含む試料の特別処理によって減少する。場合によっては、溶液中のライゲーションしないプローブ複合体または基板上の組立によって生じるバックグラウンドの低減は、電場パルシングによるハイブリダイズされていない/ライゲーションされていないプローブの周期的除去、特に、熱安定性が最適化されている組換えリガーゼおよび完全マッチ特異性、または第三の色素(例えば、量子ドット)が標的分子に結合されている三重FRETシステムを必要とする。
別の実施形態において、本発明の方法は、ランダムアレイ表面上で染色体またはゲノム由来のすべての断片を捕捉するため、電場による支持体上のDNA分子の濃度を必要とする。正確な組立を可能にする染色体断片化は、区画分けした基板および1〜10kbのより短い断片の連鎖グループを得るための個々の100kb〜1 Mbの初期DNA断片のin situ断片化を必要とする。
60秒/サイクル未満で1対のプローブプールによる標的の多重問いかけを可能にする高速なハイブリダイゼーション/ライゲーションを得ることは、最適化された緩衝液および/または積極的なプローブ操作の使用、場合により電磁場を使用することを必要とする。DNA安定性および照明(ナノ秒レーザーパルス)の正確な制御と両立する励起特性のある蛍光色素(またはデンドリマー)を用い、数時間の照明に耐えるシステム(配列される標的DNA分子を含む)の化学的および物理的安定性を高める。
高速なリアルタイム画像処理ならびに重複プローブからの個々の断片の組立および重複DNA断片からの全ゲノムの組立は、高速計算用のプログラム可能なロジックアレイまたはマルチプロセッサシステムを必要とする。
本発明の方法は、標識プローブによる相補DNA配列の特異的分子認識および可視蛍光シグナルを生じるDNAリガーゼに頼っている。天然に生じた配列認識および酵素的プルーフリーディングプロセスに頼ることにより、rSBHは、サイズが0.3nmに過ぎず、相互に数個の原子のみが異なる個々のDNA塩基を物理的に区別するという重要な技術的課題を解消する。また、本発明の方法は、染色体または他のDNAのランダムな断片化、および1平方ミクロン当たり約1個のDNA分子を含む小さく(1〜10 mm2)ランダムな単一分子アレイの形成を含む極めて簡単な試料調製および取扱を有する。本発明の方法は、数百万個の単一分子DNA断片上で高速データを同時に収集する。10種類の蛍光色および10メガピクセルCCDカメラを使用すると、単一rSBH装置は、1秒当たり105個の塩基を読み取ることができる。本発明の読み取り長は、1断片当たり約20〜20,000個の塩基まで調整可能であり、合計すると、1つのランダムアレイ上での単一実験につき1000億個までの塩基となる。個々の長い断片の初期断片化および単離されたランダムサブアレイに対応する短い断片のグループの結合により、rSBHプロセスの有効読み取り長は、1 Mbまでとなる。最大の配列決定確度は、テストされる各単一DNA分子について1塩基当たり100個の独立した測定値(すなわち、各々が、同一のDNA分子との平均10回連続のライゲーション事象によってテストされる10個の重複プローブ配列)を得ることによって保証される。
IPPを用いるコンビナトリアルSBHは、長さが数千塩基のPCR増幅試料に対して99.9%以上正確な配列データを提供する。この読み取り長は、現在使用されているゲルに基づく方法によって得られる読み取り長に比べて何倍も長く、単一アッセイにおいて全遺伝子配列決定を提供する。本発明の方法は、ハイブリダイゼーションに基づくDNA分析の並列処理、確度および単純性という利点を、単一分子DNA分析の小型化および低い材料コストという効率と組み合わせている。普遍プローブセット、コンビナトリアルライゲーションおよび情報プローブプールの応用は、ありとあらゆるDNA分子の効率的かつ正確な分析およびオリゴヌクレオチドプローブプールの小さな単一セットを用いるDNA分子中の任意の配列変化の検出を可能にする。本発明の方法は、集積システムを用い、良く知られている生化学反応および情報科学を超高密度ランダム単一分子アレイに適用し、現在のゲルおよびSBH配列決定法に比べて劇的に1,000〜10,000倍も高い配列決定処理量を得る。本発明の方法は、DNA増幅または数百万のクローンの操作なしに、細菌、ウイルス、ヒトおよび環境DNAを含む複雑な生体試料中に存在するすべての核酸分子の配列決定を可能にするであろう。最小限に抑えられた試料取扱および低い化学薬品消費ならびに完全統合されたプロセスは、1塩基当たりのコストを少なくとも1,000分の1以下に減少させるであろう。本発明の方法は、1日以内に単一アレイ上で全ヒトゲノムを配列決定することができる。
短いDNA断片のランダムアレイは、現在使用されている大部分の標準的DNAアレイより100倍も高い密度で調製することができる。このようなアレイとのプローブハイブリダイゼーションおよび先端光学は、超高速並列データ収集用のメガピクセルCCDカメラの使用を可能にする。アレイ内の各ピクセルは、様々なDNA分子のハイブリダイゼーションをモニターし、1秒当たり1〜10フレームの割合で数千万のデータポイントを提供する。ランダムアレイは、単一の3×3 mmの表面上に1000億以上の塩基対を含むことができ、各DNA断片は、10〜100ピクセルセルに提示される。SBHプロセス(いくつかの独立した重複プローブが各塩基を読み取る)によって提供される固有の重複性は、最高の最終配列確度を保証するのに役立つ。
1分子当たり1000塩基までの読み取りを可能にする本発明のライゲーション法の能力を十分に発揮するためには、複数のIPP試薬を同時に取り扱わなければならない。本発明のライゲーション法では、分析されるすべての標的分子を共有結合で修飾する必要性はない。SBHプローブは、標的と共有結合で結合されていないため、サイクルの間に容易に除去または光退色することができる。さらに、ポリメラーゼを含めることは、あるDNA分子において塩基を1回だけテストできることを保証する。本発明のハイブリダイゼーション/ライゲーションプロセスは、各プローブについての多重呼び掛けおよびいくつかの重複プローブによる各塩基の多重呼び掛けを可能にし、1塩基当たりの測定値数に100倍の増加を提供する。さらに、リガーゼは、ポリメラーゼより大きなタグ構造を利用することを可能にし(すなわち、複数の蛍光体またはQドット付きデンドリマー)、検出確度をさらに増加させる。
本発明の方法は、長い普遍プローブのより小さな不完全セットを用い、長いDNA分子の普遍シグネチャ分析を生み出すことができる。1ピクセル当たり10kbまでの単一分子を分析することができる。各々の長さが10,000bpの1000万個の断片のアレイは、1兆(1012)個のDNA塩基を含み、300個のヒトゲノムに相当する。このようなアレイを、単一の10メガピクセルCCDカメラによって分析する。情報シグネチャは、多重標識のレベルにもよるが10〜100分で得られる。10または100または1000倍小さなアレイの分析は、シグネチャまたは配列決定または定量化用途にとって極めて有用である。
一実施形態において、単一病原体細胞またはウイルスは、アレイにおいて10〜10,000個の断片により提示され、それによってDNA増幅の必要性はなくなる。本用途の単一分子シグネチャ手法は、病原体ゲノムのあらゆる領域の包括的調査を提供し、標準的プローブアレイ上で分析される数千のDNAアンプリオン(amplions)の多重増幅を上回る劇的な改良を意味する。DNA増幅は非線形過程であり、単一分子レベルでは信頼できない。1病原体当たり数個のセグメントを増幅する代わりに、病原体アフィニティーカラムを用い、望ましくないか、あるいは混入するDNAの濃度を減少させ、集めた全ゲノムを分析することができる。単一のウイルスまたは細菌細胞を数千のヒト細胞の中から収集することができ、10〜1000個のピクセル上に1〜10kbの断片によって提示し、正確な同定およびDNAの正確な分類を提供する。
別の実施形態において、本発明の方法を用い、生物戦争医薬を検出し、それらから守る。rSBHは、病原性および症状が発現する前に、単一生物体レベルで病原体の即時検出を可能にする構造マーカーを同定する。rSBHは、関与遺伝子を迅速に理解するための病原体の攻撃方法、病原性、および抗生物質感受性に関与する遺伝子のいずれかまたはすべての包括的分析ならびにそれらの遺伝子のいずれかまたはすべてを回避する方法を提供する。rSBHは、混合した病原体、宿主、および環境DNAを含有する複雑な生体試料を分析することができる。さらに、本発明の方法を用い、迅速で低コストな包括的検出法を用いて環境および/または職員をモニターし、携帯型にすることができる。
6.14 キット
本発明は、1個または複数のカートリッジに、場合により緩衝液および酵素と共にライゲーションミックスを含む、生成物として予め装填されたプローブを装填するため、IPPキットも提供する。
また、本発明は、例えば、血液試料から、炭疽菌(Bacillus anthracis)およびペスト菌(Yersina pestis)などの病原体用の病原体/遺伝子特異的試料調製キットおよびプロトコルを提供する。本発明は、本発明のrSBHアレイの形成をもたらす試料調製DNA生成物の基板中への組込を提供する。1ピクセル当たり個々の標的のアレイおよび場合により1ピクセル当たり10〜1000のコピーを与えるin situにおける増幅が得られる段階的方法について記載する。結果は、配列分析のためにrSBHを行う標的DNAのランダムアレイである。発展しつつある基板に対する本発明のモジュール式手法は、基板の早期版に簡単な試料適用部位を持たせるが、最終的開発は、「プラグアンドプレイ」アレイ調製モジュールを有することがある。
最小限の純度および品質仕様を満たすDNA試料は、rSBH試料配列技術による実際の試料集積用の出発材料としての機能を果たすであろう。試料集積は、粗製試料からの生成物の酵素的消化(制限酵素またはヌクレアーゼが消化する)から始まり、特異的(またはランダムな)粘着末端を作成し、長さがほぼ250bpの断片を提供する。この酵素混合液は、製品キットで提供することになると思われるいくつかの構成要素の１つである。
消化物を配列することは、表面上に配列されている相補体との粘着末端のライゲーションを含む。アレイ表面は、以下の通り、すなわち、1)アミノプロピルシラン単分子膜の形成; 2) 対称ジイソチオシアネートによる活性化;および3)アミノール化(aminolated)オリゴヌクレオチド(捕捉プローブ、プライマープローブおよびスペーサープローブを含む)の新規混合液の使用により元のガラス表面から修飾され、活性化されたアレイ表面は、プローブの不均一単分子膜で修飾される。
結合されたプローブはすべて、保存設計(conserved design)を共有し(>90%)、スペーサーおよび捕捉プローブが分離される均一な島の形成を防ぐ。捕捉プローブの、他のプローブすべてとの比は、各1平方ミクロン当たり1つの相補的ライゲーション部位(試料および捕捉プローブ用)に等しい平均密度を生じ、各平方ミクロンは、超高感度CCDの個々のピクセルによって観察される。次に、消化されたDNA試料を予め形成されたアレイ表面に加え、T4リガーゼで捕捉プローブとライゲーションさせることにより、1ピクセル当たり1個の標的からなる新規なrSBH反応部位が得られる。過剰の試料をアレイ表面から除去し、加熱および追加洗浄により、dsDNAは、ssDNAを生じる。ここで、捕捉プローブ設計にリン酸化戦略を用い、ただ1本の鎖が実際に共有結合でrSBHアレイとライゲーションされ、他の鎖は洗浄によって除去されることを保証する。
良く知られている技法を適応させる検出用の満足のいくシグナル(振幅および確度)を生み出すには、標的の限局性のin situにおける増幅が必要なことがある (すべてが参照により全体として本明細書に組み込まれているAndreadisおよびChrisey、Nucl. Acids Res. 28:E5 (2000); Abath他、Biotechniques 33:1210 (2002); Adessi他、Nucl. Acids Res. 28:E87 (2000))。等温鎖置換技法は、限局性の低コピー数増幅に最も適している。間隔を置いて捕捉プローブを配置するためには、スペーサープローブおよびプライマープローブ中にドープすることが必要である。これらのプローブは、いくつかの保存配列および構造を共有し、各々が、それらの名前によって説明される役割で機能することができる。したがって、捕捉プローブは標的DNAを捕捉し、スペーサープローブは、プローブの適切に間隔を置いて配置された単分子膜を形成するのに役立ち、必要ならば、プライマープローブは、in situにおける増幅のために存在する。すべての標的は、同一の配列されたプライマー配列に働きかけ、仕事を単純化する。一旦、試料がアレイにライゲーションされたら、配列されたDNAの遊離末端は、増幅用の普遍プライマーを獲得するであろう。In situ増幅は、標準的プロトコルおよび材料(すなわち、プライマー、ポリメラーゼ、緩衝液、NTPなど)を用いアレイ内の分子上で行われる。約50個のコピーが必要に過ぎないが、10〜1000個でも十分であろう。各標的は、配列分析に影響を及ぼすことなく、異なる効率で増幅することができる。
要約すれば、試料集積およびrSBHアレイ形成には、粗製試料調製物からの生成物のDNA消化、単離、および基板中への集積によりrSBHアレイを形成することが必要である。本発明は、消化、単離およびライゲーションステップの各々に関係する試薬およびキットを提供する。
7. 実施例
7.1 細菌ゲノムの配列決定
一般的な非病原性実験室菌株の全細菌ゲノムを配列決定する。特徴が十分に明らかにされており、配列がすでに知られている大腸菌(E. coli)菌株を選択する。単一の1日限りのアッセイで全ゲノムを配列決定する。このアッセイは、診断システムの完全操作を示すばかりでなく、粗製試料分離および調製用のシステムおよび普遍的要件の入力および出力を計画することに関連する重要な規格を規定する。
条痕板由来の単一コロニーまたは数ミリリットルの液体培養液により十分な材料が提供される。当技術分野において良く知られているプロトコルを用い、細胞を溶解してDNAを単離する(共に参照により全体として本明細書に組み込まれているSambrook他、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、NY (1989)またはAusubel他、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons、New York、NY (1989)を参照)。収率は重要ではなく、むしろDNAの品質が重要な要素である。本実施例で規定される試料規格は、他の試料すべてにあてはまる。最終分析については、10〜100コピーのゲノムコピー数を用いる。このアッセイの追加要件は、1) DNAは、DNAプロセシング酵素を含んでいないこと; 2)試料は、混入する塩を含んでいないこと; 3)全ゲノムは、等しく発現され、全DNAの大部分を構成していること; 4) DNA 断片は、長さが500〜50,000bpであること;および5)試料は、知られている濃度でDNAの無菌溶液として提供されること(例えば、1.0 μg/mlの1 μlで十分である)である。
10〜100コピーという入力コピー数は、全ゲノムの重複を保証し、アレイ上の不十分な標的の捕捉を容認する。10〜100個のコピーにより、十分な重複断片が得られ、ベースコーリングの優れた成功および高い確度を保証する。rSBH試料の量は、約1〜10 pgであり、その大部分を使って、試料の特徴を明らかにして定量する。分析用試料は、特徴が明らかにされた生成物の段階希釈によって得られる。
DNAは、タンパク質、特にヌクレアーゼ、プロテアーゼ、および他の酵素を含んでいてはならない。PClなどのフェノールに基づく抽出を用い、大部分のタンパク質を除去および不活性化する(Sambrook他、1989、同上; Ausubel他、1989、同上)。低張性溶解または界面活性剤に基づく溶解(EDTAおよびEGTAなどのヌクレアーゼ阻害剤混合液による)と、続くPCl抽出は、単一ステップの迅速かつ効率的な試料消化およびDNA単離である。相固定抽出(3'5'を通して利用可能)は、この仕事を単純化し、きれいなDNAを与える。この時にDNAの消化を必要としないのは、溶解および抽出中の剪断力が望ましい範囲の断片を生じるからである。フェノールの除去は、DNAの厳しい清澄化(すなわち、続くクロロホルム抽出、エタノール沈殿、およびサイズ排除)によって行う。フェノールは、紫外(UV)スペクトルのシグネチャを残し、これを用いて純度およびDNA定量化をテストする。
DNAは、混入する塩および有機物を含んでいてはならず、SBH適合性トリス緩衝液に懸濁されていなければならない。これは、サイズ排除クロマトグラフィーまたは微小透析によって行われる。
粗製DNA試料は、500bpから50,000bpまでさまざまである。500bp以下の断片は、単離および精製において回収することが困難であり、配列するプロセスにも影響を及ぼす。50,000bpより大きな断片は、溶かすことが困難であり、不可逆的に凝集することがある。
試料は、1μg/mlの少なくとも1 μlの無菌溶液として提供される。粗製DNAの必要総量は、約1 ng〜1 pgに過ぎず、これは、配列決定に繰り入れられる量の1%未満である。
最終試料調製については、DNAを消化し、コンビナトリアルな(combinatoric)アレイ表面上に分子を配列するのに使用される粘着末端を有する予想平均長約250bpの断片を得る。この分子を、1個の分子が、CCDカメラの単一ピクセルによって観察され、数百万のウエルのアレイ内の仮想反応ウエルに相当する平方ミクロンごとに見いだされるように、間隔を置いて配置する。これには自己組織化単分子膜(SAM)効果の排除が必要である。検出基板の表面上と化学的に結合されたコンビナトリアルアレイ単分子膜内に間隔を置いて配置されている特異的部位に試料をライゲーションさせる酵素駆動性プロトコルを用いる。捕捉アレイは、SAM化学反応により駆動されるが、末端の相補的オーバーハング内の小さな分散は、同様な配列の島を生じないはずである。したがって、基板を捕捉アレイと共に調製し、適切なオーバーハングの酵素的ライゲーションによって試料を基板表面に結合する。
あるいは、各標的をin situにおいて増幅し、「アンプリコン」をもたらすことが必要かもしれない。増幅は、初期の捕捉ライゲーションにおいて結合されない末端によって標的配列にライゲーションされる普遍プライマーアダプターを用いて行う。DNAポリメラーゼおよびNTPを用いて新たな鎖を合成し、元の相補体と置換し、捕捉アレイにおいて相補要素を有するために捕捉され、かつライゲーションされる置換鎖を提供する。線形増幅により約10コピーが生じると予想される。あるいは、指数増幅戦略を用い、1ミクロン当たり100〜1000コピーを得ることができる。
単一分子であれ限局性アンプリコンであれ、配列された試料に対し、専用プローブおよび集積マイクロ流体工学を用いるrSBHサイクルによる配列決定を行う。生命情報科学は、データ収集、保存、解析および配列アラインメントのために十分に統合されている。結果は、ベースコーリングおよび確度の統計的解析と共に、候補生物体のゲノム配列として報告される。
7.2 炭疽菌(B. anthracis)およびチフス菌(Y. pestis)細胞または血液試料からの試料調製
7.2.1 全ゲノム分析
粗製試料から特定の病原体を分離するには、粗製試料から細胞を単離または濃縮し、続いて溶解して特定のゲノムを得る必要がある。分画遠心分離、濾過、培養、またはアフィニティクロマトグラフィーなどの標準的生物化学および細胞生物学の実験室技法を用いて細胞を単離し、次いでゲノムを抽出する。通常、大部分の病原体は、ヒト細胞よりも少なくとも2桁小さく、大部分の生体分子構造よりも桁違いに大きいため、従来の物理的技法によるかなり容易な単離が可能である。市販の抗体またはウイルスのコートタンパク質などの特定の標的にすでに使用可能である他のアフィニティツールを用い、単離を合理化し、危険性を最小限に抑えることが好ましい。生物体を濃縮したら、標準的手順を用いてそれらを溶解し、DNAを単離する。
あるいは、可逆的アフィニティタグを有する特異的プライマー(不均一な粗製試料用)またはプライマーの普遍セット(単離された細胞タイプ用)を用いてゲノム増幅を行うことができる。試料に対し、溶解および、必要に応じて粗製DNA単離を行う。増幅混合液と一緒にプライマーを粗製試料に加え、可逆的タグ付けおよびアフィニティ捕捉により生成物を単離する。
7.2.2 ゲノムフットプリント解析
この方法は、興味のある生物体に対して特異的なフットプリント用(footprinting)遺伝子の特異的セットの増幅を含む。複数の遺伝領域を同時に調べることにより、同一病原体の異なる菌株を区別するか、あるいは多数の異なる病原体をスクリーニングすることができる。様々な生物脅威病原体を検出するのに使用することができるアッセイは、すべてが参照により全体として本明細書に組み込まれているRadnedge他、App. Env. Micro. 67:3759-3762 (2001); Wilson他、Molecular and Cellular Probes 16:119-127 (2002); Radnedge他、Microbiology 148:1687-1698 (2002); Radnedge他、Appl. Env. Micro. in press (2003)中に記載されている。興味のある病原体に対して特異的であるが、病原体の近縁種中には存在しないDNAの領域を同定する。次いで、環境試料中のDNA生成物の増幅についてチェックするためにプライマーを設計する。炭疽菌(B. anthracis)およびペスト菌(Y. pestis)をモデル生物体として用いる。規定量の病原体細胞をヒト血液と混ぜ、検出の感度を測定する。早期の症候性患者は、これらの病原体のどちらかについて血液1 ml当たり104個を超える細胞を有しているであろう。目的は、症候性段階になる前に病原体を検出することである。1 ml当たり101〜105個の細胞を有する血液試料を調べ、検出の確度を測定する。QiaAmp Tissue Kit 250 (Qiagen, Inc.、Valencia、CA)またはNucleoSpin Multi-8血液キット(Macherey-Nagel Inc.、Duren、Germany)を用い、ゲノムDNAを抽出する。病原体濃度は、対数期中間部の細胞を播種することにより、および血球計算器による顕微鏡計数により測定する。希釈した細胞10μlをヒト血液190μlに添加し、発症前の濃度に近づける。次いで、診断用標的および遺伝子の増幅のためにゲノムDNAを抽出して調製する。
7.3 バイオハザードのない炭疽菌(B. anthracis)およびチフス菌(Y. pestis)のDNA試料から100個の診断用標的を調製するためのアッセイ
標的は、潜在的抗生物質耐性、病原性遺伝子の変異および遺伝子組み換えを示唆するベクター配列の領域を同定するために選択する。一般に、このような標的、特に病原性および抗生物質耐性遺伝子は、特定の病原体に独特ではないが、付加的な定性的情報を提供する。標的とされたDNAを50種のプライマー対と共に増幅し、各病原体が関連する独特でかつ定性的な領域に呼び掛ける。生成物は、SBH分析用の1試料中にプールする。多重プライマー対を用い、標的配列の増幅を単純化することができる。
元の複雑なDNA混合物からアンプリコンを単離するための切断可能なタグを有するプライマーを使用する。タグは、ビオチン/ストレプトアビジンに基づき、プライマー内にはDTTによる切断可能なジスルフィド架橋または特異的に組換えされた制限部位のあることが好ましい。アンプリコンは、アフィニティタグによって単離し、精製されたDNA試料として遊離させる。サイズ排除によって生成物をさらに精製し、望ましくない塩および有機物をすべて除去し、次いで下流統合のために定量する。
7.4 微生物バイオフィルムからの配列決定試料
野外研究と組み合わせたrSBHおよびFISHを用い、バイオフィルム群ゲノムを調べる。rSBHを用い、2時点以上で異なる生息地からバイオフィルム群を配列決定し、同遺伝子種数を決定する。試料間のDNA規格化により分析を容易にし、群集構造の同遺伝子種レベルの差を浮き彫りにし、低存在同遺伝子種のゲノムの有意なカバー率を提供する。十分に確立したプロトコルに従い、各試料について16S rDNAクローンライブラリーを構築する。ファイロタイプを区別するためのFISHプローブおよびファイロタイプ内のわずかな変異体を区別するために標的とされるSNPを用いて分布のパターンを描き、SBHで定義される同遺伝子種と16S rDNAファイロタイプ分布を関連付ける。物理的および化学的に異なる生息地から試料を集め、pH、温度、イオン強度、酸化還元状態(すなわち、Fe2+/Fe3+比)、ならびに溶存有機炭素、銅、亜鉛、カドミウム、ヒ素および他のイオンの濃度を含む重要な環境パラメータを試料収集時に測定する。
7.5 ベースコーリング模擬試験
90%まで重複する250bp (平均長)の断片により、大腸菌(E. coli)の模擬データを作成した。最初の10,000個の断片は、標準的一塩基変化コーリングを用いて分析した。この量は、確度およびタイミングをチェックするには十分すぎるほどであった。参照配列検索は、完全な4 Mbp参照配列ゲノム中に10,000の断片位置を見いだすことに成功した。さらに、各々の断片に対してベースコーリングを正確に行った。各断片は、テストされる断片数とは無関係に、完全な4 Mbp参照配列に対してビン化し、検索のタイミングおよび確度を確認した。参照配列検索およびベースコーリングに必要な時間は、0.8秒/断片であった。ベースコーリングには、一塩基変化のための試験および確度を最適化するために使用される正規化が含まれていた。参照配列検索では、断片のどちらかの側に余裕を認め、分解時間を増やした。
7.6 個々のQドットの配列と画像化
0、8、160および400 pMストレプトアビジン結合Qドット(Qdot Inc、 Hayward、CA) 2マイクロリットルを、ビオチン修飾カバーガラス(Xenopore Inc.、Hawthorne、NJ)の表面上に2分間沈着させた。真空により液滴を除去した。同様に、DI水10μを塗布し除去した。この洗浄を4回繰り返した。カバーガラスを、処理面を下にして、きれいなスライドガラス上に置いた。水1μlを用い、スライドを表面に貼り付けた。少量の対物レンズ液浸油をカバーガラスの縁に置き、カバーガラスの周りをシールすることによって蒸発を抑えた。
Plan Fluar 100×油浸(1.45 na)対物レンズを介し、落射照明しながらZeiss axiovert 200を用いて基板を画像化した。標準的なクロマCy3フィルターセットを用い、Qドットからの655nmの発光を画像化した。クロマCy3発光フィルターの透過スペクトルは、655nm Qドットの発光フィルターと重なり合う。50 ms の露光時間を用いるRoper Scientific CoolSNAPHQ(商標)カメラ(Roper Scientific, Inc.、Tuscon、AZ)を用い、画像を記録した。画像から、高いQドット濃度がより見えやすいスポットを生じることは明らかであった。水をスポットした対照カバーグラスには、様々な汚染に起因するわずかに見えるスポットがあったに過ぎなかった。予想された色の安定した蛍光と共にQドットの群が見える他に、様々な強度および色の個々の点滅するスポットも見られた。これらの特徴は、それらの小さなスポットが単一Qドットであることを示していた。強度差は、焦点面からの遠い波長により、または個々の粒子間の活性の変動によって説明することができる。これらの結果の意義は、個々の分子がQドットで標識されている場合、進んだ顕微鏡検査で検出できるということである。TIRFシステムを用いるバックグラウンドのさらなる低下およびレーザーによるより効率的な励起は、単一蛍光分子のルーチン的で正確な検出を可能にすると期待される。
7.7 ライゲーションシグナルおよびスポットされた標的およびオリゴヌクレオチド
これらの実験は、1)スポットされた標的を、良好な完全マッチ特異性のある2種類のプローブのライゲーション用鋳型して用いることができること; 2)スポットされたオリゴヌクレオチドを、表面上に標的DNAを結合するためのプライマー(または、捕捉プローブに対する)として用いることができることを立証するために設計した。
A. スライドの整備
標的もしくはプライマーまたは捕捉プローブの役割を果たすことができる4種類の5'-NH2-修飾オリゴヌクレオチド(配列については表1を参照)を、7つの異なる濃度(1、5、10、25、50、75、90 pmole/ul)で1,4-フェニレンジイソチオシアネート誘導体化スライド上にスポットし、各濃度を6回繰り返した。長いTgt2-Tgt1-rcオリゴヌクレオチドは、全Tgt2配列およびTgt1と相補的な配列の一部を含む(下線を引いた部分は、逆平行配向で相補的である)。Tgt2-Tgt1-rcは、Tgt1によって捕捉することができるテスト標的として使用され、捕捉の有効性は、直接スポットされTgt1によって捕捉されるTgt2配列に対する2-プローブライゲーションを比較することによってテストすることができる。
Figure 0004691014
B. 実験1
ハイブリダイゼーション/ライゲーションは、室温で1時間、密閉チャンバー中で行った。反応溶液は、50 mM Tris、 0.025単位/μl T4リガーゼ(Epicentre、Madison、WI)、および0.1 mg/ml BSA、10 mM MgCl2、1 mM ATP、pH 7.8ならびに0.005〜0.5 pmole/μlの様々な量のライゲーションプローブプール(表2を参照)を含んでいた。反応後、スライドを45℃で30分間、3×SSPEによって洗浄し、次いでddH2Oで3回すすぎ、脱水した。次いで、600 mVに設定したPMT付きAxon GenePix4000Aでこれらのスライドをスキャンした。
Figure 0004691014
C. 実験2
4種類のNH2-修飾26〜30量体をスポットしたスライドを、50 mM Tris、および0.1 mg/ml BSA、10 mM MgCl2、pH 7.8 20μl中、室温で2時間、長い標的Tgt2-Tgt1-rc (表1) 1 pmoleにハイブリダイズさせた。スライドを、45℃で30分間6×SSPEで洗浄し、次いで、T4リガーゼ0.5単位/20μlの存在下、室温で1時間、ライゲーションプローブ(Tgt2-5'プローブおよびTgt2-3'プローブ、表2)と共にインキュベートした。反応後、上述のようにスライドを洗浄し、スキャンした。
D. 結果
1. ライゲーションシグナルは、反応溶液におけるスポットされた標的の濃度ならびに5'プローブおよび3'プローブの濃度に依存する
図12は、溶液におけるスポットされた標的およびライゲーションプローブに対するライゲーションシグナルの依存度を示している。スポットされた標的濃度が約75 pmole/μlであり、ライゲーションプローブ(プローブ-5'およびプローブ-3')が反応溶液20μl中に約1 pmoleであった場合に最高シグナルが得られた。これらの依存度は、観察されるシグナルは実際にライゲーション依存性シグナルであり、スポットされた標的をライゲーション用の鋳型として使用できることを示している。完全マッチライゲーションプローブと単一ミスマッチプローブとの区別は、約4〜20倍であった(表3)。
Figure 0004691014
2. 標的DNAを効率的に結合するためにスポットされたオリゴヌクレオチドをプライマー(または捕捉プローブ)として使用することができる
スライド上にスポットされたオリゴヌクレオチド1 (Tgt1)は、その3'側にTgt1の逆相補配列を、その5'側にTgt2配列を含み、標的Tgt2-Tgt1-rc用捕捉プローブとしての役割を果たした。Tgt2-Tgt1-rcのハイブリダイゼーション/捕捉後、ライゲーションプローブ(Tgt2-5'プローブおよびTgt2-3'プローブ)を、Tgt2標的のドット上と、Tgt1のドット上でハイブリダイズ/ライゲーションさせた。観察されたライゲーションシグナルを図13に示す。この条件において、スポットされた標的をプライマー(または捕捉プローブ)として用い、配列決定に使用される短いプローブのハイブリダイゼーション/ライゲーション用に使用可能な形態で標的DNAを結合できることは明らかである。
図１は、アダプターライゲーションおよび伸長を示す。二本鎖ヘアピンアダプター(実線)は、ヘアピン末端における架橋塩基によってヘアピン型に維持される。BおよびFはそれぞれ、結合プライマーおよび固定プライマーを表し、それらの相補配列を小文字で表す。ゲノム配列は、細い線として示す。A)非リン酸化アダプターは、ゲノムDNAにライゲーションされ、遊離3' の鎖内ニックとなる(矢印)。B)3'末端からの伸長は、置換鎖およびアダプター配列の複製を生じる。 図２は、アダプター設計およびDNA断片との結合を示す(ここで、ゲノムDNAは、ベタ黒の帯によって表され、Fは、遊離プライマーを表し、Bは、結合プライマーを表し、fおよびbはそれぞれ、それらの相補体を表す)。 図３は、チップ表面上のアンプリオート産生を示す。A) アダプター捕捉ゲノムDNAの融解後、1本の鎖は、結合プライマーBとのハイブリダイゼーションによりスライドの表面上に捕捉される。プライマーBからのポリメラーゼ伸長は、二本鎖分子を生成する。B)鋳型鎖は、スライドの加熱および洗浄によって除去され、遊離プライマーFは、固定鎖に沿って導入され伸長される。C) Fによる連続鎖置換増幅は、隣接するプライマーBハイブリダイゼーション部位まで移動することができる鎖の生成をもたらす。D)置換鎖は、新たなプライマーB部位からの伸長のための鋳型の役割を果たす。 図４は、RNA中間体を用いるアンプリオート生成を示す。T7は、T7ファージRNAポリメラーゼプロモーターを表す。A)一本鎖アダプター領域は、結合プライマーBにハイブリダイズされて伸長され、二本鎖T7プロモーターの生成をもたらすDNAポリメラーゼによって第二の鎖を生成する。B) T7 RNAポリメラーゼは、RNAコピーを生成する(点線)。C)次いで、RNAは、隣接するプライマーBと結合し、cDNAは、逆転写酵素によって生成される。次いで、二本鎖RNAは、RNase Hによって破壊される。 図５は、インベーダー媒介性等温DNA増幅プロセスの概略を示す。 図６は、ハイブリダイゼーションによるランダムアレイ配列決定(rSBH)プロセスを示す。上から下に: (a) CCDカメラを反応プラットフォーム上に配置し、レンズを用いて拡大し、CCDカメラの個々のピクセル上のプラットフォームからの1μm2 領域に焦点を合わせる。(b)アレイ(~3 mm×3 mm)は、仮想反応ウエルとしての役割を果たす100万以上の1μm2領域からなる(各々は、CCDカメラの個々のピクセルに対応している)。各ピクセルは、基板上の同一位置に対応している。一連の時間内反応において、1個のCCDピクセルは、いくつかの反応についてデータを組み合わせ、それによって仮想反応ウエルを作り出すことができる。DNA試料をランダムに消化し、1ピクセルにつき1断片の平均濃度で反応プラットフォーム上に配列する。(c)アレイに、いくつかの情報プローブプールのうち1つを用いるrSBHコンビナトリアルライゲーションを行う。各ピクセルからのシグナルを記録する。(d)第一のプールからのプローブを除去し、アレイに、異なるプールまたはプローブを用いる2回目のrSBHコンビナトリアルライゲーションを行う。(e)相補体が標的に相当する2種の隣接しかつ相補的プローブのライゲーションに起因する蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)シグナル生成の分子的詳細を示す書き込み。 図７は、rSBH反応を示す。内部全反射顕微鏡(TIRM)検出システムは、ガラス基板直上の領域でのみ励起増強が起きるエバネッセント場を作り出す。FRETシグナルは、プローブが配列された標的とハイブリダイズし、続いてライゲーションされ、エバネッセント場内にFRET対が位置する場合に生み出される。ライゲーションされないプローブは、溶液中に遊離していようと、標的と一過性にハイブリダイズしていようと、検出可能なシグナルを生み出さない。したがって、TIRMシステムのエバネッセント場は、未反応プローブからのバックグラウンドノイズを低減しながら、望ましい面内に双方の強いシグナルを提供した。 図８は、配列組立を示す。一般に、SBHプロセスでは、重複陽性プローブを用いて標的配列を組み立てる。このプロセスでは、各塩基を数回(すなわち、10量体プローブで10回)読み取り、たとえ一部のプローブが正確に記録されていない場合にも極めて高い確度を保証する。 図９は、rSBHプロセスのためのマイクロ流体装置の概略を示す。この装置は、DNA調製、ランダム単一分子DNAアレイの形成、コンビナトリアルプール混合、ならびに反応チャンバーの周期的装填および洗浄を一体化している。試料管をチップに結合する場合には、予め装填した試薬との一連の反応を行って断片DNAを単離し、1ピクセル当たり約1分子の密度でアレイ表面にランダムに結合する。次いで、マイクロ流体装置を用い、情報プローブプール(IPPs)の5'および3'セットからの2種類のプローブプールを反応溶液と混ぜる。プローブプールの一方のセットをFRET供与体で標識、他方をFRET受容体で標識する。次いで、DNAリガーゼを含有する混合プールを、単一分子DNA上の反応チャンバーに移す。検出可能なライゲーション事象は、アレイ表面上の狭い反射域内(約100nm)で、2種類のプローブ(各プールから1種類)が標的DNA分子の隣接する相補配列とハイブリダイズする場合に起きる。反射域内の5'および3'プローブのライゲーションは、超高感度CCDカメラによって検出および記録されるFRETシグナルをもたらす。ライゲーション事象を記録した後、各プールミックスを洗浄溶液によって除去し、マイクロ流体チップ上に予め装填したIPPの同一セットからのプールの第二の対を組み合わせ、反応チャンバーに導入する。IPPの2種類のセット内の可能なすべてのプールを組み合わせることにより、アレイ内の各標的分子を、2種類のプローブセット内に存在するプローブ配列のあらゆる可能な組合せの存在/非存在について記録する。 図１０は、TIRM装置のための基礎的光学系および光路を示す。(a)エバネッセント場を生み出すプリズムおよび光路の最上部に位置する従来型基板の描写。(b)および(c)は、レーザーからプリズムアセンブリまでの光路を制御するための検流計の使用を示している。 図１１は、rSBH構成要素の略図およびrSBH装置の構成要素を示すプロセスおよび実験プロセスの段階的記述を示す。試料は、装置とは独立して集めて調製する(ステップ1および2)。試料統合モジュール(構成要素A)により、得られる粗製試料調製物をrSBHアレイ形成(ステップ3)のためにさらに処理する。続いて、標的を反応カートリッジ内の基板モジュール上に配列する(構成要素B)。試料に対し、プローブモジュールによって送達されるSBHプローブを用いるSBHライゲーションアッセイ(ステップ4)を行う(構成要素C)。得られる生データを処理し、配列データの組立(ステップ5)および解釈分析(interpretive analysis) (ステップ6)を行う。 図１２は、4つのスポットされた標的についての完全マッチライゲーションシグナルを示す。4種類の異なる標的を、1から90μMの7種類の異なる濃度でスポットした。ライゲーションプローブ濃度(5'プローブ: 3'プローブ比は、1:1である)は、0.1から1 pmole/20μlまで変化させた。 図１３は、別の標的の捕捉プローブとしての役割を果たすスポットした標的の図解を示す。ライゲーションシグナルは、スライドが、Tg2-5'プローブおよびTgt2-3'プローブと直接ハイブリダイズ/ライゲーションされた場合(円)、およびスライドが、標的Tgt2-Tgt1-rcとプレハイブリダイズされ、次いでTgt2-5'プローブおよびTgt2-3'プローブとライゲーションされた場合(正方形) に測定された。

Claims (14)

  1. 標的核酸を配列決定する方法であって、
    (a) 前記標的核酸のランダムアレイを用意するステップ、
    (b) 前記アレイに、第１および第２のオリゴヌクレオチドプローブ集団をハイブリダイズするステップ、
    (c) 前記標的核酸の隣接位置にハイブリダイズしている前記第１および第２集団由来のオリゴヌクレオチドプローブをライゲーションさせて、ライゲーションされたプローブを生成させるステップ、
    (d) 前記ライゲーションされたプローブにより生じるシグナルを収集するステップ、
    (e) 前記シグナルを解析して前記標的核酸の少なくとも１つのヌクレオチドを同定するステップ、
    (f) ステップ(b) − (e)を反復して前記標的核酸の複数サイクルの配列情報を得、このことにより前記標的核酸の少なくとも１つのヌクレオチドを２以上のサイクルにおいて同定するステップ、
    (g) 前記複数サイクルの配列情報をアセンブリして、前記標的核酸の全部または一部の配列を得るステップ、
    を含む前記方法。
  2. ステップ(b) − (e)の反復がそれぞれ、それ以前のサイクルで用いた第１および第２のオリゴヌクレオチドプローブ集団と重複する第１および第２のオリゴヌクレオチドプローブ集団を用いる、請求項１記載の方法。
  3. ステップ(b) − (e)の反復がそれぞれ、それ以前のサイクルで用いた第１および第２のオリゴヌクレオチドプローブ集団と異なる第１および第２のオリゴヌクレオチドプローブ集団を用いる、請求項１または２記載の方法。
  4. 前記第１および第２のオリゴヌクレオチドプローブ集団の少なくとも１つが、前記複数のサイクルにわたり普遍プローブセットを一緒に含む、請求項３記載の方法。
  5. 前記第１および第２のオリゴヌクレオチドプローブ集団の少なくとも１つが、検出可能に標識化されている、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
  6. 分析ステップ(e)が前記標的核酸の少なくとも２ヌクレオチドを同定する、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
  7. 前記標的核酸が合わさるとゲノム全体に相当することとなる、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
  8. 前記標的核酸が合わさるとゲノムの10〜100コピーに相当することとなる、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
  9. 前記標的核酸が既知配列のアダプターを有する、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
  10. 前記アダプターは、前記標的核酸が由来するサンプルを特定するタグ配列をさらに有する、請求項９記載の方法。
  11. 前記標的核酸が複数のゲノムの配列に相当し、前記タグ配列は、ある標的配列がいずれのゲノムに由来するものであるかを特定する、請求項１０記載の方法。
  12. 前記標的核酸が互いに同一ではなく、前記ゲノムの異なる部分からの配列に相当することとなり、このことにより前記標的核酸が合わさると前記ゲノム全体に相当することとなる、請求項１〜１１のいずれか１項記載の方法。
  13. 異なる標的核酸からの配列情報を、前記ゲノムの全部または一部のアセンブリ化された配列へとアセンブリする、請求項１２記載の方法。
  14. 同じ集団内のプローブが互いにライゲーションすることができない、請求項１〜１３のいずれか１項記載の方法。
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