JP5180845B2 - Dnaアレイ上でのハイスループットゲノム配列決定 - Google Patents
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Description
本出願は引用によりその全体を本明細書に含める2006年2月24日出願の仮出願第60/776,415号からの優先権を主張する。
本出願は、部分的には国立衛生研究の助成金番号1 U01 AI057315-01により連邦政府の資金援助を受けた。
ゲノム DNAのラージスケール配列分析は、ヒトおよび多くの経済的に重要な植物および動物における健康および疾患の状態に関する多様な生物学的現象の理解に中心的である。例えば、Collins et al (2003)、Nature、422: 835-847; Service、Science、311: 1544-1546 (2006); Hirschhorn et al (2005)、Nature Reviews Genetics、6: 95-108; National Cancer Institute、Report of Working Group on Biomedical Technology、“Recommendation for a Human Cancer Genome Project,” (February、2005); Tringe et al (2005)、Nature Reviews Genetics、6: 805-814。低コストハイスループット配列決定および再配列決定の必要性により、多くの標的 DNA 断片を同時に並行して分析するいくつかの新しいアプローチが開発された。例えば、Margulies et al、Nature、437: 376-380 (2005); Shendure et al (2005)、Science、309: 1728-1732; Metzker (2005)、Genome Research、15: 1767-1776; Shendure et al (2004)、Nature Reviews Genetics、5: 335-344; Lapidus et al、米国特許出願公開 US 2006/0024711; Drmanac et al、米国特許出願公開 US 2005/0191656; Brenner et al、Nature Biotechnology、18: 630-634 (2000); 等。かかるアプローチは、平面アレイにおける標的ポリヌクレオチド密度の上昇および特定の配列検出化学の各サイクルにおいて増えていく量の配列情報を得るための様々な解決手段を反映している。これらの新しいアプローチのほとんどはシグナルが顕著に悪化する前に数十のヌクレオチドを決定することに制限されており、それゆえ全体の配列決定効率に制限を与えている。
したがって、一つの側面において、本発明はラージスケール DNA 配列決定に対する多くのアプローチによって生じる短い配列読み取り長に関連する問題、例えば、酵素サイクル当たり限定された配列情報しか得られない問題に取り組むものである。また、数十億の分子、例えばマイクロミリより小さいサイズおよび距離の分子を支持することが出来る操作された核酸分子のランダムアレイを調製するための方法および組成物も提供される。
図1A-1Gは、本発明およびその適用を図示する。
本発明の実施には、特に断りの無い限り、有機化学、ポリマー技術、分子生物学 (組換え技術を含む)、細胞生物学、生化学および免疫学の常套の技術および記載を用いることが出来、それらは当業者の技術範囲内である。かかる常套の技術には、ポリマーアレイ合成、ハイブリダイゼーション、ライゲーション、および標識を用いたハイブリダイゼーションの検出が含まれる。適切な技術の具体的説明は以下の例を参照することにより得られる。しかし、その他の同等の常套の手順ももちろん用いることが出来る。かかる常套の技術および記載は、標準的研究室マニュアル、例えば、 Genome Analysis: A Laboratory Manual Series (Vols. I-IV)、Using Antibodies: A Laboratory Manual、Cells: A Laboratory Manual、PCR Primer: A Laboratory Manual、and Molecular Cloning: A Laboratory Manual (すべてCold Spring Harbor Laboratory Press)、Stryer、L. (1995) Biochemistry (4th Ed.) Freeman、New York、Gait、“Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach” 1984、IRL Press、London、Nelson and Cox (2000)、Lehninger、Principles of Biochemistry 3rd Ed.、W. H. Freeman Pub.、New York、N.Y. およびBerg et al. (2002) Biochemistry、5th Ed.、W. H. Freeman Pub.、New York、N.Y.にみることができ、それらのすべてはあらゆる目的で引用によりその全体を本明細書に含める。
本発明は、標的配列(本明細書において「標的ポリヌクレオチド」とも称する)のヌクレオチド配列情報を標的ポリヌクレオチド中に散在したアダプターを用いて獲得するための方法および組成物に関する。配列情報は新規なものであってよく、例えば、未知核酸の配列決定であってよく、あるいは再配列決定、または遺伝子型同定であってもよい。本発明は好ましくは、標的ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの断片内の分散した位置に複数のアダプターを挿入する方法を含む。かかるアダプターは本明細書において「散在したアダプター」と称され、様々な配列決定化学、例えば、プライマー伸長、プローブライゲーション等によりヌクレオチドを同定する方法を用いて隣接配列を調べるためのプラットフォームとして役立ちうる。即ち、本発明のいくつかの態様の一つの特有の構成成分は既知アダプター配列の標的配列への挿入であり、アダプターにより近接する標的配列に途切れが生じる。アダプターの「上流」および「下流」の両方の配列決定により完全な標的配列の配列情報が達成されうる。
したがって、本発明は、サンプルからの標的配列を利用する組成物および方法を提供する。当業者に理解されるように、サンプル溶液はあらゆる数のものを含んでいてもよく、例えば、これらに限定されないが、体液 (例えば、これらに限定されないが、血液、尿、血清、リンパ液、唾液、肛門および膣分泌物、汗および***)および実質的にあらゆる生物の細胞、哺乳類サンプルが好ましく、ヒトサンプルが特に好ましい;環境サンプル (例えば、これらに限定されないが、空気、農業、水系および土壌サンプル); 細菌兵器病原体サンプル;研究用サンプル (即ち核酸の場合、サンプルは増幅反応の産物であってもよく、標的およびシグナル増幅、例えば、 PCR 増幅反応の両方が含まれる;精製サンプル、例えば、 精製ゲノム DNA、RNA調製物、生のサンプル(細菌、ウイルス、ゲノム DNAなど); が含まれ、当業者に理解されるように、実質的にあらゆる実験操作がサンプルに対して行われていてもよい。
有効なマッピングストラテジーが配列決定用途、例えば、複雑な二倍体ゲノムの配列決定、デノボ配列決定、およびゲノム混合物の配列決定に必要である。一つの態様において、階層的断片化手順がハプロタイプ情報の同定および二倍体ゲノムの親染色体のアセンブリのために提供される。かかる手順はタンパク質アレルの予測および短い読み取りをゲノム内の正しい位置にマッピングすることにも適用できる。かかる方法のさらなる用途は、複数の遺伝子の間に共有される DNA 配列の~100塩基内に起こる遺伝子ファミリー中の突然変異の正しい割当である。
一つの側面において、散在したアダプターが標的ポリヌクレオチドの近接領域内に間隔をもって挿入される。散在したアダプターは長さにおいておおいに変動し得、それは望まれる機能的要素の数およびタイプに部分的には依存する。かかる機能的要素としては、これらに限定されないが、アンカー配列、捕捉プローブ配列に相補的な配列(例えば、表面への付着のため)、タギング配列、二次構造配列、標識プローブの結合/ハイブリダイゼーションのための配列、機能付与配列、プライマー結合部位、ヌクレアーゼ、例えば、ニッキング酵素、制限エンドヌクレアーゼ等のための認識部位が挙げられる。
AAAAAAATTTTTTT
TTTTTTTAAAAAAA
本発明の一つの側面は、散在したアダプターを有する標的ポリヌクレオチドを作る方法を提供し、これを図 (1A-1B)に模式的に示す。この方法において、標的ポリヌクレオチド (1002)が散在したアダプターであってもなくてもよいアダプター (1000)と一緒にされ、一本鎖でも二本鎖でもよい環 (1005)を形成する(1004)。標的ポリヌクレオチドは一般により大きい DNA片、例えば、染色体またはその他のゲノム DNAの断片化によって得られる。
様々な標準的 DNA 環 形成手順を用いることが出来る。 一例はアダプターの平滑末端 ライゲーションである。このアプローチの問題点は複数の組み込まれるアダプターの配向およびライゲーションである。カセットの1つの鎖はライゲーションがブロックされた5’および3'末端の両方を有しうる。カセットの配向はどちらのDNA 鎖がRCRを開始させる遊離の3'末端を有するかを決定する。これにより各鎖が約 50%の場合にて複製されることになる。
本発明の一つの側面において、ポリヌクレオチドのコンカテマーを含む単一の分子、通常 ポリヌクレオチド分析物、即ち、標的配列は、常套の ローリングサークル複製 (RCR) 反応により作られる。RCR 反応の条件および試薬を選択するガイダンスは当業者に入手可能な多くの文献から得られ、以下に示すようなものは引用により本明細書に含まれる: Kool、米国特許 5,426,180; Lizardi、米国特許 5,854,033 および 6,143,495; Landegren、米国特許 5,871,921; 等。一般に、RCR 反応成分は、一本鎖DNA 環、DNA 環にアニーリングする一以上の プライマー、DNA 環にアニーリングしたプライマーの3'末端を伸長する鎖置換活性を有するDNA ポリメラーゼ、ヌクレオシド三リン酸および常套の ポリメラーゼ 反応 バッファーを含む。かかる成分はプライマーがDNA 環にアニーリングし、DNA ポリメラーゼにより伸長されてDNA 環相補鎖のコンカテマーを形成する条件下で一緒にされる。例示的なRCR 反応 プロトコールは以下の通り: 50 μL 反応混合物中、以下の成分を一緒にする: 2-50 pmol 環状 DNA、0.5 ユニット/μL ファージ φ29 DNA ポリメラーゼ、0.2 μg/μL BSA、3 mM dNTP、1X φ29 DNA ポリメラーゼ 反応 バッファー (Amersham)。RCR 反応は 30℃で12 時間行う。ある態様において、ポリメラーゼ 反応における環状 DNAの濃度は絡み合いおよびその他の分子間相互作用を避けるために 低く選択するとよい(およそ100-1000億環/ ml、または 10-100 環/pl)。
一つの態様において、エマルジョンPCRがアレイ上への配置のためのアンプリコンの作成に用いられる。図(1B)に図示するようにエマルジョン (1505)を壊した後、アダプター付加された配列のクローンを含むビーズが配列分析のために固体表面 (1522)上でアレイ とされる(1520)。かかるビーズのアレイは図1Fに示すようにランダムであり得、ビーズの位置はアレイ作成の前には決定されておらず、あるいはアレイはあらかじめ決められた結合部位 (1524)のパターンに、たとえビーズのかかる部位への分配がランダムに決定されるにしろ、従いうる。かかる分配の両方を本明細書において「ランダムアレイ」と称する。
本発明の一つの側面において、マスターアレイ上に合成された相補的ポリヌクレオチドがレプリカアレイに移される。かかる移動を達成するために、2つの表面はdsDNAを変性させ、新たに作られたDNA 鎖を遊離させるために加熱の存在下で接触されうる。別の態様において、移動はプライマーよりも約 5-50倍大きな電荷を有するレプリカのDNAのみを識別して移動させるよう電場を与えることにより達成される。さらに好ましい態様において、移動された鎖のハイブリダイズの後、逆電場が温度低下と組み合わされてプライマーをマスターアレイに戻す。移動が電場の付与により達成される態様において、多孔性ガラスが電場の付与のために好ましくは用いられる。
一つの態様において、表面 (図1C & D -- 1622) はコンカテマー中のアダプターオリゴヌクレオチドのセグメント、例えば、アンカー 結合部位 またはその他の要素との複合体、例えば、二本鎖の二本鎖を形成する捕捉オリゴヌクレオチドを結合して有し得る。別の態様において、捕捉オリゴヌクレオチドはオリゴヌクレオチドクランプまたは同様の構造を含み得、それは、アダプターオリゴヌクレオチドと三重鎖を形成する。例えば、 Gryaznov et al、米国特許 5,473,060。別の態様において、表面 (1622)はコンカテマー上の相補的官能基と反応する反応性官能基を有し得、例えば、cDNAのマイクロアレイへの結合に用いられるものと同じ技術により共有結合を形成する。例えば、Smirnov et al (2004)、Genes、Chromosomes & Cancer、40: 72-77; Beaucage (2001)、Current Medicinal Chemistry、8: 1213-1244、これらは引用により本明細書に含まれる。
一つの側面において、コンカテマー(1620 図1C & D)は共有結合および非共有結合を含む様々な技術によって表面 (1622)に固定され得る。一つの態様において、表面 (1622)は捕捉オリゴヌクレオチドを結合して有しており、捕捉オリゴヌクレオチドはコンカテマー中のアダプター オリゴヌクレオチドのセグメント、例えば、アンカー 結合部位またはその他の要素と複合体、例えば 二本鎖の二本鎖を形成する。別の態様において、捕捉オリゴヌクレオチドはオリゴヌクレオチド クランプまたは同様の構造を有し得、それはアダプターオリゴヌクレオチドと三重鎖を形成する。例えば、 Gryaznov et al、米国特許 5,473,060。別の態様において、表面 (1622)はコンカテマー上の相補的官能基と反応する反応性官能基を有し得、cDNAのマイクロアレイへの結合に用いられるのと同じ技術により共有結合を形成する。例えば、Smirnov et al (2004)、Genes、Chromosmes & Cancer、40: 72-77; Beaucage (2001)、Current Medicinal Chemistry、8: 1213-1244、これらは引用により本明細書に含まれる。長いDNA 分子、例えば数百またはそれ以上のヌクレオチドも疎水性表面、例えば、低濃度の様々な反応性官能基、例えば、 -OH基を有するクリーンなガラス表面に効率的に結合させることが出来る。
「プローブ」という用語は直接ハイブリダイゼーション、または2つのプローブのライゲーションまたはアンカーを備えるプローブ またはアンカープローブを備えるプローブにおいて用いられるオリゴヌクレオチドの広義の意味で用いられる。 プローブは数個のみの特異的塩基および多くの縮重塩基を有しうる: 例えば BNNNNNNN または BBNNNNNN または NNBBNNNN等である。アンカープローブはアンカー U5-10 配列に相補的 なアダプター配列に隣接する1-4 塩基を読み取るようU5-10B1-4として設計されうる。
一つの側面において、本発明は標的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定する方法を含み、該方法は以下の工程を含む: (a)標的ポリヌクレオチドの中に複数の散在したアダプターを作成する工程、各散在したアダプターは標的ポリヌクレオチドとの少なくとも一つの境界を有する;および(b)少なくとも二つの散在したアダプターの少なくとも一つの境界に隣接する少なくとも一つのヌクレオチドの実体を判定し、それにより標的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定する工程。以下により詳細に説明するように、標的配列は配列情報が望まれる位置を含み、一般にそれは本明細書において「検出位置」と称される。一般に、配列情報 (例えば、特定の検出位置でのヌクレオチドの同定) が複数の検出位置について望まれる。本明細書において用いる場合、「複数」とは少なくとも二つを意味する。しかし場合によっては、例えば 一ヌクレオチド多型 (SNP) 検出における場合などは、情報は特定の標的配列内の単一の検出位置についてのみ望まれうる。本明細書において用いる場合、ハイブリッドにおける検出位置塩基と塩基対形成する塩基は「調査位置」と称される。
本発明の好ましい側面において、標的ポリヌクレオチドの配列に関する情報は、コンビナトリアルプローブライゲーションを利用するハイブリダイゼーション 方法による配列決定を介して得られる。本発明のこの側面において、2つの完全な、短いプローブのユニバーサルセットがDNA リガーゼ の存在下で標的 DNA に曝される(R. Drmanac、米国特許 6,401,267、2002)。 典型的には1つのプローブセットは固体支持体、例えば、ガラス スライドに結合しており、フルオロフォアにより標識された他方のセットは、溶液中で可動性である。結合した標識化プローブが標的に正確に隣接する位置でハイブリダイズするとそれらはライゲーションされ、スライド表面に共有結合した長い標識化プローブが生成する。所与の位置でのポジティブ シグナルは標的内の配列の存在を示し、それはシグナルを生成するために一緒にされた2つのプローブを補完する。
一つの側面において、単一のハイブリダイゼーション/ライゲーションサイクルは、16 蛍光色の使用によりすべての16の可能なプローブを試験するのに用いることが出来る。かかる試験はより少ない蛍光色からの蛍光サインを作成する方法を用いて達成することも出来る。蛍光インサイチュ ハイブリダイゼーション (FISH) 染色体「ペインティング」において、蛍光プローブの組合せを用いてプローブのかかる組合せについての新しい蛍光サインを作ることが出来る。例えば、4のセットからの2つのプローブの組合せは10の可能なサイン蛍光シグナルを作ることが出来、5は15、6は21を作ることができ、以下同様である。それゆえ、単一のハイブリダイゼーションサイクルにおいて 16 プローブのうちどれがアンカープローブにハイブリダイズしたかを識別するのが可能であろう。
アンカープローブからの2を超えるヌクレオチドを読み取るために、本発明のいくつかの側面においてさらなるラウンドのプローブ-アンカー ライゲーションを使用し、次のサイクルの開始の前に標的からアンカー/標識 プローブを除去することができる。ライゲーションしたプローブ-アンカーは多数の当該技術分野に知られた方法を用いて除去でき、方法としては、加熱、またはアンカープローブにおける温度 または光切断可能な結合によるものが挙げられ、加熱 工程においてアンカーが断片化され不安定化される。配列決定すべき塩基はアダプターから3および4 塩基であるので、修飾をアンカープローブまたは標識化プローブに対して行う必要がある。アンカープローブの場合、それは本発明の一つの態様においてライゲーション末端に2 のさらなる縮重塩基を有するよう調製されうる。次のライゲーション効率の維持を保証するために、一つの態様において、アンカーは鋳型 DNA上の2つのより短いオリゴヌクレオチドのライゲーションを介して設計される。あるいは、配列決定プローブはライゲーション末端の2つの縮重塩基を用いて以下のように調製されうる: NNBBNNNN-タグ。本発明の別の側面において、アッセイは16 アンカープローブを用いてさらなる2 塩基を読み取るよう設計され得る。
一つの側面において、テイルがおよそ15から 20 塩基の長さでありフルオロフォアにより標識されたテイル にタグ配列が相補的である、構造 BBNNNNNN-テイルの16 プローブを含むプローブセットが調製される。テイルおよびタグは分析する DNAによる干渉を最小化するように設計される。一つの態様において、テイルおよびタグ配列はiso-cおよびiso-g ヌクレオチドから調製され、タグ配列が鋳型 DNAと相互作用するのを妨げる。
末端配列決定を特異的に標識されたヌクレオチドを用いる単一の塩基 伸長の多くの連続する サイクルにより1つのアンカー/プライマー末端から行うことが出来る。一つの態様において、プロセスは色素またはブロッカーが除去されて伸長を繰り返す工程を含む。複数のアダプターはこのプロセスの増加した柔軟性を提供する。一つの態様において、2-6またはそれより多い塩基が連続反応においてシフトしたプライマーを使用することにより単一の塩基 プライマー伸長により読み取られる。1つのアダプター上の複数の同時のシフトした0+1または1+1 プライマーフレームまたは複数のアダプター上の単一のフレームまたはその両方を利用できる。
本発明の一つの側面において、ハードウェア が配列決定方法のライゲーションおよびハイブリダイゼーション事象の検出を可能とするために提供される。一つの態様において、システム ハードウェアは3つの主な成分を含む;照明システム、反応 チャンバ、および検出システム。検出装置はいくつかの 特徴、 例えば、以下のものを含みうる: 調整可能な レーザー出力、電子的シャッター、オートフォーカス、および実行ソフトウェア。
一つの態様において、規則的パターンの捕捉セルは各獲得イメージへと位置 情報をコード化するよう解釈される。およそ 1000 セル/イメージが パターンから除かれて10 ビットコードを作り、それは各基体上の1024までの名付けられた位置を表しうる(図5)。
本明細書に記載する方法の商業化において、本発明のランダムアレイの構築およびそれを様々な用途に用いるための特定のキットが特に有用である。本発明のランダムアレイの適用のためのキットは、これらに限定されないが、標的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列の決定のためのキットを含む。キットは典型的には少なくとも一つの表面を有する支持体および本発明のランダムアレイの構築またはその適用の実施に必要または有用な一以上の試薬を含む。 かかる試薬には、限定するものではないが、核酸 プライマー、プローブ、アダプター、酵素等が含まれ、それぞれ容器、例えば、限定するものではないが、バイアル、チューブまたはボトルにパックされ、販売に好適なパッケージ、例えば、限定するものではないが、箱、シールされたパウチ、ブリスターパックおよび大型容器に梱包される。パッケージは典型的にはパッケージされた材料の使用を示す標識またはパッケージング挿入物を含む。本明細書において用いる場合、「パッケージ材料」はキットにおける試薬の分配のための梱包に使用されるあらゆるものを含み、限定するものではないが、容器、バイアル、チューブ、ボトル、パウチ、ブリスターパッケージング、標識、タグ、指示用シートおよびパッケージ挿入物が含まれる。
2つの合成標的を共増幅した。約100万分子をガラス表面上に捕捉し、標的の1つについてプローブした。イメージングおよび第一のプローブの光退色の後、第二の標的をプローブした。アンプリコン特異的プローブによる連続するハイブリダイゼーションは、アレイ上の各スポットが2つのアンプリコン配列のいずれか1つに特有に対応していることを示した。70℃への加熱によりプローブが除去され、再ハイブリダイズして同等に強いシグナルを生じることも確認された。
環形成および増幅プロセスを大腸菌 DNAを用いて確証した(図6)。捕捉プローブの結合部位およびRCR プライマーとしても作用するユニバーサルアダプターを、すべてのゲノム配列への結合のための縮重塩基を含むユニバーサル 鋳型 DNAを用いて標的分子の5’末端にライゲーションした。標的分子 の3'末端をターミナルトランスフェラーゼを用いてポリ-dA テイルの付加により改変した。改変した標的を次いでアダプターおよびオリゴ-dA テイルに相補的な架橋鋳型を用いて環状化した。
凝集したコンカテマーとのプローブライゲーションが起こる能力を試験した。反応はリガーゼを用いて20℃で10分行い、次いでチャンバを簡単に洗浄して過剰のプローブを除いた。6-merおよび標識化 5-merのライゲーションにより11-merと匹敵するシグナルレベルが生じた。ランダムアレイのイメージ分析を含むソフトウェアモジュールを、全ゲノム配列再構築のためのシュミレーションデータに対して試験した。
Bacillus anthracisおよびYersinia pestisの診断領域からのPCR 産物を一本鎖DNAに変換し、ユニバーサルアダプターに結合させた。これら2 サンプルを混合し、RCRを用いて共に複製し、チップ表面上にランダムアレイとして沈着させた。アンプリコン 特異的プローブによる連続的ハイブリダイゼーションは、アレイ上の各スポットが2つのアンプリコン配列のいずれか1つに特有に対応していること、および、プローブによりそれらが特異的に同定できることを示し(図7)、それによりRCR 反応によって生じたDNA 断片の約 100-1000 コピーを有するマイクロミリより小さいサイズの DNA ナノボールに存在するDNAを同定するための感受性および特異性が実証された。
縮重塩基を含む合成オリゴヌクレオチドの個々の分子を4の亜集団に分け、そのそれぞれは特定の位置にA、C、G またはT 塩基のいずれかを有する。この合成DNAから作成したDNBのアレイは塩基のそれぞれを有する約 25%のスポットを有しうる。4の連続する4 塩基のそれぞれに特異的なプローブの対のハイブリダイゼーションおよびライゲーションにより亜集団が同定された(図8)。
5’末端に8 縮重塩基を含む合成オリゴヌクレオチドを用いてランダムゲノム DNA末端をシュミレーションした。このオリゴヌクレオチドから作られたDNA-ナノボールはアダプター配列に直近して配置したこれら8 縮重塩基を有する。既知のアダプター配列に隣接する2の未知の塩基のプローブ-アンカー ライゲーション アプローチを用いた配列決定の実行可能性を示すために、アダプター配列の3'末端にハイブリダイズする特異的配列を有する12-mer オリゴヌクレオチドをアンカーとして用い、BBNNNNNNの形態の16 TAMRA-標識化オリゴヌクレオチドのセットを配列読み取りプローブとして用いた。
平均して5 um離れた捕捉プローブの配列されたアレイの線を調製した。線は5 μmのチップサイズに対して45度の角度の引っ張られたガラスキャピラリーを用いて作り、キャピラリーには水中の1 μlの5 μM 捕捉プローブを充填し、精密なガントリーロボットによりガラススライド上に線を引いた。 DNBはカバーグラスの表面に結合し、アダプターに特異的なプローブにより検出された。図10は領域に対する高密度結合を示し、ここで捕捉プローブが表面上に沈着されており、マイクロミリより小さい 結合部位を有する基体が調製されたらDNBを格子状に配置できることが示された。
長さ70 塩基の合成標的 DNAおよび長さ200-300 bp のPCR由来断片をプライマーの1つのリン酸化により二本鎖 産物から得、ラムダエキソヌクレアーゼによる処理によりリン酸化した鎖を除去した。一本鎖断片を環状化のためにアダプターとライゲーションした。重合、IIs型制限酵素消化および新しいアダプターとの再-ライゲーションを本明細書に記載するように行った。
Claims (8)
- 以下の工程を含む、ポリヌクレオチドの配列情報を決定する方法:
(a) 基体上にアレイ化された複数のコンカテマーを提供する工程; ここで、各コンカテマーは複数コピーのモノマー単位を含み、各モノマー単位は以下を含む:
i) 該ポリヌクレオチドの第一の標的配列;
ii) 該ポリヌクレオチドの第二の標的配列、ここで、該第一の標的配列と該第二の標的配列は該ポリヌクレオチドの近接するセグメントであったものである;
iii) 該第一の標的配列と該第二の標的配列の間に挿入された散在したアダプター、ここで、該散在したアダプターは該第一の標的配列に隣接する第一のプローブハイブリダイゼーション部位および該第二の標的配列に隣接する第二のプローブハイブリダイゼーション部位を含む; および、
(b) 該アレイ化されたコンカテマーの1以上において、該散在したアダプターに隣接する該第一の標的配列の1以上のヌクレオチドおよび該第二の標的配列の1以上のヌクレオチドを同定する工程;ここで、該第一の標的配列の1以上のヌクレオチドを同定する工程が以下の工程を含むか:
(i) 該散在したアダプター中の第一のプローブハイブリダイゼーション部位にアンカープローブをハイブリダイズさせる工程;
(ii) 該ハイブリダイズしたアンカープローブに隣接する標的配列に配列決定プローブをハイブリダイズさせる工程; 次いで
(iii) 該配列決定プローブと該アンカープローブをライゲーションする工程; および
(iv) 該ライゲーションしたプローブを検出し、該隣接する標的配列のヌクレオチドを同定する工程、または
該第二の標的配列の1以上のヌクレオチドを同定する工程が以下の工程を含む:
(i) 該散在したアダプター中の第二のプローブハイブリダイゼーション部位にアンカープローブをハイブリダイズさせる工程;
(ii) 該ハイブリダイズしたアンカープローブに隣接する標的配列に配列決定プローブをハイブリダイズさせる工程; 次いで
(iii) 該配列決定プローブと該アンカープローブをライゲーションする工程; および
(iv) 該ライゲーションしたプローブを検出し、該隣接する標的配列のヌクレオチドを同定する工程。 - 以下の工程を含む、ポリヌクレオチドの配列情報を決定する方法:
(a) 基体上にアレイ化された複数のコンカテマーを提供する工程; ここで、各コンカテマーは複数コピーのモノマー単位を含み、各モノマー単位は以下を含む:
i) 該ポリヌクレオチドの第一の標的配列;
ii) 該ポリヌクレオチドの第二の標的配列、ここで、該第一の標的配列と該第二の標的配列は該ポリヌクレオチドの近接するセグメントであったものである;
iii) 該第一の標的配列と該第二の標的配列の間に挿入された散在したアダプター、ここで、該散在したアダプターは該第一の標的配列に隣接する第一のプローブハイブリダイゼーション部位および該第二の標的配列に隣接する第二のプローブハイブリダイゼーション部位を含む; および、
(b) 該アレイ化されたコンカテマーの1以上において、該散在したアダプターに隣接する該第一の標的配列の1以上のヌクレオチドおよび該第二の標的配列の1以上のヌクレオチドを同定する工程;ここで、該第一の標的配列の1以上のヌクレオチドを同定する工程が以下の工程を含むか:
(i) 該散在したアダプター中の第一のプローブハイブリダイゼーション部位にアンカープローブをハイブリダイズさせる工程;
(ii) dNTPが第一の標的配列中の検出位置に完全に相補的であれば該 dNTP がアンカープローブに付加される条件下で、ポリメラーゼおよび標識を含む少なくとも1つのdNTPを添加する工程; および
(iii) 該検出位置においてアンカープローブに付加された標識されたdNTPと相補的な、第一の標的配列中のヌクレオチドを同定する工程、または
該第二の標的配列の1以上のヌクレオチドを同定する工程が以下の工程を含む:
(i) 該散在したアダプター中の第二のプローブハイブリダイゼーション部位にアンカープローブをハイブリダイズさせる工程;
(ii) dNTPが第二の標的配列中の検出位置に完全に相補的であれば該 dNTP がアンカープローブに付加される条件下で、ポリメラーゼおよび標識を含む少なくとも1つのdNTPを添加する工程; および
(iii) 該検出位置においてアンカープローブに付加された標識されたdNTPと相補的な、第二の標的配列中のヌクレオチドを同定する工程。 - 工程(i)から(iv)までを複数回繰り返して標的配列の複数のヌクレオチドを同定する、請求項1の方法。
- 配列決定プローブが、該プローブ上の検出可能な特定の標識と結合した少なくとも1つのユニークな塩基を有する調査配列を含むものである、請求項1の方法。
- 第二の標的配列の第二のヌクレオチドを同定する工程および第三の標的配列のヌクレオチドを同定する工程をさらに含み、かつ、各モノマー単位が以下をさらに含むものである、請求項1〜4いずれかの方法:
(a) ポリヌクレオチドの第三の標的配列;
(b) 第二の標的配列と第三の標的配列の間に挿入された第二の散在したアダプター、ここで、第二の散在したアダプターは第三のプローブハイブリダイゼーション部位および第四のプローブハイブリダイゼーション部位を含む。 - ポリヌクレオチドがゲノムDNAである、請求項1〜4いずれかの方法。
- コンカテマーが平均1ミクロンの最近隣距離で基体上にアレイ化されており、かつ、該アレイ上のコンカテマーの少なくとも70パーセントが光学的に分解可能なものである、請求項1〜4いずれかの方法。
- 該複数のコンカテマーが直線パターンで基体上に存在し;
該コンカテマーが基体上の別々の空間的に離れた領域に結合しており; かつ、
該空間的に離れた領域の実質的に全てが単一のコンカテマーによって占有されている、請求項1〜4いずれかの方法。
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