JP4681814B2 - 全反射蛍光顕微鏡 - Google Patents

Description

本発明は、全反射照明により発生するエバネッセント光を用いて蛍光観察を行なう全反射蛍光顕微鏡に関するものである。

最近、生体細胞の機能解析が盛んに行われるようになっているが、これら細胞の機能解析の中で、特に、細胞膜の機能を観察するものとして、細胞膜およびその近傍からの全反射蛍光画像を取得する全反射蛍光顕微鏡（ＴＩＲＦＭ：Ｔｏｔａｌ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）が注目されている。

この全反射蛍光顕微鏡は、スライドーガラスと標本の境界面で照明光を全反射させた時に、標本側に数１００ｎｍ以下のわずかな範囲に浸み出すエバネッセント光と呼ばれる光を利用して蛍光物質を励起する方法で、スライドーガラス近傍のわずかな範囲の蛍光だけが観察されるので、バックグランドが非常に暗く、コントラストの高い蛍光観察や微弱な蛍光の観察が可能である。

ところで、このような全反射蛍光顕微鏡を用いた生物研究の現場においては、境界面近傍のより浅い面内をコントラスト良く観察したい場合も有れば、或る程度の深さまで照明光を届かせて広範囲の観察をしたい場合も有る。このため、観察対象に応じてエバネッセント光の浸み出し深さが変えられるようになっているのが望ましい。

境界面からのエバネッセント光の浸み出し深さは、非特許文献１において開示されており、以下の公式が成り立つことが知られている。

ｄ＝λ／４π（ｎ_１ ^２ｓｉｎθ_１ ^２−ｎ_２ ^２）^１／２ （１）
ここで、ｄ：エバネッセント光の浸み出し深さ、λ：光の波長、ｎ_１：入射側屈折率、θ_１：入射角、ｎ_２：出射側屈折率、
従って、上式から明らかなように、全反射照明角度の境界面に対する照明光の入射角、すなわち境界面の垂線に対する照明光の傾射角が大きい程、エバネッセント光の浸み出し深さは浅くなる。

このような考え方を利用したものとして、特許文献１に開示されるように全反射照明が可能な開口数を有する対物レンズを用い、照明光を対物レンズ側へ反射するミラーを移動させることにより、対物レンズヘの入射位置を対物レンズの光軸から離れる方向へ移動させて、対物レンズから出射するレーザ光線の角度を変化させものや、特許文献２に開示されるように透過照明用コンデンサの先玉レンズの側面からレーザ光線を入射することで全反射照明を可能とし、境界面と観察光軸の交点を中心としてエバネッセント投光管を回転させることでレーザ光線の角度を変化させるようにしたものがある。

一方、このような全反射蛍光顕微鏡には、全反射照明光源として異なる波長のレーザ光源を用いた多波長全反射蛍光顕微鏡があり、一例として図４に示すものが知られている。図において、１０１は顕微鏡ステージで、このステージ１０１上には、観察用のスライドガラス１０２が載置され、このスライドガラス１０２上には、カバーガラス１０３に挟まれた標本１０４が載置されている。スライドガラス１０２の下方には、オイル１０５を介してコンデンサレンズ１０６が配置されている。コンデンサレンズ１０６の光軸上には、透過照明光源１０７が配置され、この透過照明光源１０７からの光をコレクタレンズ１０８を介してコンデンサレンズ１０６に導入し、標本１０４を透過照明できるようになっている。コンデンサレンズ１０６と透過照明光源１０７との間には、顕微鏡本体に固定されたベース１０９が配置されている。このベース１０９は、透過照明光源１０７の透過照明光路Ｔが通る孔部１０９ａを有している。ベース１０９には、レーザ光を導入する複数（２本）のレーザ光導入管１１２が設けられている。これらレーザ光導入管１１２は、集光レンズ１１１を有するもので、透過照明光路Ｔを中心に点対称の位置に配置されている。レーザ光導入管１１２には、ミラーユニット１１０が配置されている。これらミラーユニット１１０は、反射ミラー１１０ａを有したもので、レーザ光導入管１１２に対し透過照明光路Ｔと直交する方向に移動可能に支持され、マイクロメータ１１３の操作に応じたマイクロメータヘッド１１３ａの直動動作により微量な移動量を得られるようになっている。

レーザ光導入管１１２には、光ファイバ１１４を介して、光源ユニット１１５が接続されている。光源ユニット１１５は、レーザ光導入管１１２ごとに波長の異なるレーザ光を発生するもので、ＡＣ電源用コンセント１１６、電源１１７、レーザ光源１１８、シャッタ１１９ａを備えたインターロックボックス１１９、ＡＣアダプタ１２０および光量調整用のＮＤスライダ１２１を有している。また、光源ユニット１１５は、電源１１７の投入によりレーザ光源１１８よりレーザ光を発生し、インターロックボックス１１９、ＮＤスライダ１２１を介して光ファイバ１１４に出力し、レーザ光導入管１１２に導入して集光レンズ１１１により、反射ミラー１１０ａを介してコンデンサレンズ１０６の前側焦点位置近傍に集光させるようにしている。この場合、マイクロメータ１１３を操作してミラーユニット１１０に対しレーザ光導入管１１２を微小に移動させることで、全反射照明に伴うエバネッセント光の染み出し深さを設定できるようになっている。また、これらの動作は、所望するレーザ光の波長に応じて光源ユニット１１５を選択することにより、各レーザ光導入管１１２ごとに個別に行なうことができる。

一方、ステージ１０１の上方には、対物レンズ１２２が配置され、対物レンズ１２２から出射した観察光路には、結像レンズ１２３とダイクロイックミラー１２４が配置されている。ダイクロイックミラー１２４の反射光路には、フィルタ１２５を介して第１の撮像素子１２６が配置され、また、透過光路には、フィルタ１２７を介して第２の撮像素子１２８が配置されている。これら第１の撮像素子１２６および第２の撮像素子１２８は、各光源ユニット１１５のレーザ光源１１８からレーザ光導入管１１２に導入されたレーザ光により各別に生成されるエバネッセント光より発生される蛍光を撮像する。

さらに、ステージ１０１上には、レーザ光の直接光が外部に漏れないようにステージボックス１３８が設けられている。このステージボックス１３８はステージ１０１に固定される固定カバー１３８ａとオイル点着時や標本交換時に取外し可能なフタカバー１３８ｂから構成される。固定カバー１３８ａには、スイッチ１３９とレバー１４０が設けられている。フタカバー１３８ｂにはピン１４１が設けられており、フタカバー１３８ｂを固定カバー１３８ａに載せるとピン１４１がスイッチ１３９のレバー１４０を押した状態となって、ＯＮ状態となる。

スイッチ１３９には、ケーブル１４２を介してインターロックボックス１１９が接続されている。インターロックボックス１１９は、シャッタ１１９ａの他に、不図示のシャッタ開閉動作用のモータ、バネ、モータ駆動用の駆動回路などを有するもので、オイル点着時や標本交換時に、フタカバー１３８ｂを開けるとスイッチ１３９がＯＦＦとなって、ＯＦＦ信号がケーブル１４２を通してインターロックボックス１１９に送られて、シャッタ１１９ａを閉じる。一方、フタカバー１３８ｂを閉めるとスイッチ１３９がＯＮになって、ＯＮ信号がケーブル１４２を通してインターロックボックス１１９に送られて、シャッタ１１９ａが開き、レーザ光源１１８からのレーザ光が光ファイバ１１４を介してレーザ光導入管１１２に導入され、全反射照明が可能となる。

このように従来の多波長全反射蛍光顕微鏡では、複数のレーザ光導入管１１２を設けるようにしているが、顕微鏡自体の操作性、顕微鏡周りのスペース確保のため、レーザ光導入管１１２をなるべく小型化する必要があり、このため、レーザ光源１１８を始め、インターロックボックス１１９や照明光の光量調整のためのＮＤスライダ１２１を、レーザ光導入管１１２から離して配置し、顕微鏡本体から離れたところで操作するようになっている。
特開平９−４５９９２２号公報 特開２００１−１３４１３号公報 Ｄ．Ａｘｅｌｒｏｄの論文「Ｔｏｔａｌ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｔ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｕｒｆａｃｅｓ」

ところが、このように構成した全反射蛍光顕微鏡は、全反射照明光源としてレーザ光源を用いられることで、レーザ光導入管１１２ごとに光ファイバ１１４を介して光源ユニット１１５として、ＡＣ電源用コンセント１１６、電源１１７、レーザ光源１１８、シャッタ１１９ａを備えたインターロックボックス１１９、ＡＣアダプタ１２０および光量調整用のＮＤスライダ１２１などが設けられるため、これらが複数波長分設けられるとなると、顕微鏡本体を含めたシステム全体が極めて大掛かりなものとなり、大きな占有スペースを必要とし、価格的にも高価なものとなる。

また、全反射照明光源として、波長の異なる複数のレーザ光源１１８を用いた場合、仮に、これらのレーザ光源１１８を同期させてＯＮ／ＯＦＦしようとしても、各レーザ光源１１８のＯＮ／ＯＦＦをインターロックボックス１１９のシャッタ１１９ａの開閉動作により行なっているため、高速なＯＮ／ＯＦＦ操作ができないばかりか、シャッタ１１９ａの動作のばらつきなどに精度のよい切り替え動作もが難しい。また、各波長のレーザ光の調光についてもＮＤスライダ１２１を操作するようになるので、速やかな対応が難しい。

本発明は上記事情に鑑みてなされたもので、小型で価格的にも安価にでき、さらに操作性に優れた全反射照明光源を有する全反射蛍光顕微鏡を提供することを目的とする。

本発明の全反射蛍光顕微鏡は、光源からの照明光を標本に向けて出射するコンデンサレンズを有する第１の照明光学系と、前記標本に対して前記照明光学系と反対側に配置され、前記標本から発せられた観察光を集光する対物レンズを有する観察光学系とを備えた全反射蛍光顕微鏡本体と、前記全反射蛍光顕微鏡本体に設けられ、所定波長の光を発生する発光ダイオードと、該発光ダイオードからの光を標本に対し前記第１の照明光学系の前記コンデンサレンズの内部を通して全反射照明角度で入射させるための複数の発光ダイオードを有する複数の投光管と、前記投光管の発光ダイオードに接続され、少なくとも前記発光ダイオードのオンオフを制御可能にした制御手段とを具備している。

たとえば、前記複数の発光ダイオードは、それぞれ波長の異なる光を発する。

あるいは、前記複数の発光ダイオードは、それぞれ同一波長の光を発する。

前記複数の投光管は、前記コンデンサレンズの光軸と直交する方向に移動可能に設けられ、前記標本に対し入射される全反射照明角度を調整可能となっている。

前記複数の投光管は、前記発光ダイオードからの光を標本に対し全反射照明角度で入射させる集光光学系を有するものと、前記発光ダイオードからの光を前記標本に対し全反射照明角度から外して入射させる集光光学系を有するものを備えている。

本発明によれば、全反射照明用光源として発光ダイオードを用い、この発光ダイオードに接続された制御手段により発光ダイオードのオンオフを制御するようにしたので、全反射照明光源を大幅に小型化できるとともに、価格的にも安価にできる。また、発光ダイオードのオンオフを高速で行なうことができ、さらに、波長の異なる発光ダイオードの切り替えも精度よく行なうことができるので、操作性に優れた全反射照明用光源を実現できる。

以下、本発明の実施の形態を図面に従い説明する。

（第１の実施の形態）
図１は、本発明の第１の実施の形態にかかるコンデサ型全反射照明装置を有する全反射蛍光顕微鏡の概略構成を示している。図１において、１は顕微鏡ステージで、このステージ１上には、観察用のスライドガラス２が載置されている。このスライドガラス２上には、カバーガラス３に挟まれた標本４が載置されている。スライドガラス２の下方には、イマージョンオイル５を介してコンデンサレンズ６が配置されている。この場合、コンデンサレンズ６の開口数は、標本４の屈折率よりも大きくなるように設計されている。すなわち、イマージョンオイル５およびスライドガラス２の屈折率をｎ_１、標本４の屈折率をｎ_２とした場合、次の関係が成り立つようになってい。

ｎ_１ｓｉｎθ_１＞ｎ _２ （２）
ここで、ｓｉｎθ_１は、コンデンサレンズ６からイマージョンオイル５及びスライドガラス２を通して入射できる最大入射角に相当する。また、（２）式はスライドガラス２と標本４の境界面における光の屈折を示す既知の屈折の法則と等価であり、スライドガラス２からｓｉｎθ_１の角度で入射した光は境界面で全反射することを示している。一般に生物細胞の屈折率は１．３７〜１．３８程度であるため、コンデンサレンズ６の開口数は、これより大きい値、具体的には１．６５〜１．４５程度を有するものとする。

コンデンサレンズ６の光軸上には、透過照明光源７が配置され、この透過照明光源７からの光をコレクタレンズ８を介してコンデンサレンズ６に導入し、標本４を透過照明できるようにもしている。

コンデンサレンズ６と透過照明光源７との間には、全反射蛍光顕微鏡本体（不図示）に固定されたベース９が配置されている。このベース９は、透過照明光源７からの透過照明光路Ｔが通る孔部９ａを有している。ベース９には、複数（２本）の投光管１１が設けられている。

これら投光管１１は、発光ダイオード（以下、ＬＥＤと称する。）１２を有するとともに、このＬＥＤ１２から発する光の光路上には、後述する反射ミラー１０ａなどと集光光学系を構成する集光レンズ１３が配置されている。また、これら投光管１１は、透過照明光路Ｔを中心に点対称の位置に配置されている。この場合、これらの投光管１１に設けられるＬＥＤ１２は、異なる波長の光を発生するものが用いられ、ここでは、一方の投光管１１のＬＥＤ１２から発光される光の波長をλ_Ｌ１、他方の投光管１１のＬＥＤ１２から発光される光の波長をλ_Ｌ２としている。

投光管１１には、ミラーユニット１０が設けられている。ミラーユニット１０は、反射ミラー１０ａを有したもので、投光管１１に対し透過照明光路Ｔと直交する方向に移動可能に支持され、マイクロメータ１４での操作に応じたマイクロメータヘッド１４ａの直動動作により微量な移動量を得られるようになっている。この場合、マイクロメータ１４は、投光管１１側に取付けられ、常時、ばね１６の引張り力によりマイクロメータヘッド１４ａ先端がミラーユニット１０に当接するようにしている。そして、マイクロメータ１４を操作してマイクロメータヘッド１４ａを透過照明光路Ｔから離れる方向に移動させることにより、ミラーユニット１０をばね１６による引張り方向に移動させるようにしている。

この状態で、ＬＥＤ１２から発せられる発散光は、集光レンズ１３により収束光に変換され、反射ミラー１０ａを介してコンデンサレンズ６の前側焦点位置近傍に集光され、標本４に対し全反射照明角度で入射されるようになっている。

投光管１１には、ケーブル１７を介して後述の操作部２０とともに制御手段を構成するＬＥＤ駆動ユニット１８が接続されている。ＬＥＤ駆動ユニット１８には、ＡＣ電源用コンセント１９および操作部２０が接続されている。ＬＥＤ駆動ユニット１８は、ＬＥＤ１２の電源をＯＮ／ＯＦＦするスイッチ回路１８ａとＬＥＤ１２に供給する電流を制御する電流制御回路１８ｂを有している。操作部２０は、各種の操作スイッチを有するもので、検鏡者のスイッチ操作によりＬＥＤ１２のＯＮ／ＯＦＦ信号をスイッチ回路１８ａに出力したり、ＬＥＤ１２の出射パワーの調整のための制御信号を電流制御回路１８ｂに出力するように有している。

一方、ステージ１の上方には、対物レンズ２２が配置され、対物レンズ２２から出射した観察光路には、結像レンズ２３とダイクロイックミラー２４が配置されている。ダイクロイックミラー２４は、図２（ａ）に示すように波長λを基準に短波長側（ここでは、一方の投光管１１のＬＥＤ１２から発光される光の波長λ_Ｌ１）を反射し、長波長側（ここでは、他方の投光管１１のＬＥＤ１２から発光される光の波長をλ_Ｌ２）を透過する特性を持つものである。ダイクロイックミラー２４の反射光路上には、第１の吸収フィルタ２５が配置され、その延長上で結像レンズ２３の焦点位置には、第１の撮像素子２６が配置されている。第１の吸収フィルタ２５は、図２（ｂ）に示すように、一方の投光管１１のＬＥＤ１２から発光される光の波長λ_Ｌ１のみを透過するバンドパスフィルタが用いられる。また、ダイクロイックミラー２４の透過光路には、第２の吸収フィルタ２７が配置され、その延長上の結像レンズ２３の焦点位置には、第２の撮像素子２８が配置されている。第２の吸収フィルタ２７は、図２（ｃ）に示すように、他方の投光管１１のＬＥＤ１２から発光される光の波長λ_Ｌ２のみを透過するバンドパスフィルタが用いられる。

さらに、ステージ１上には、レーザ光の直接光が外部に漏れないようにステージボックス３０が設けられている。このステージボックス３０はステージ１に固定される固定カバー３１とオイル点着時や標本交換時に取外し可能なフタカバー３２から構成される。固定カバー３１には、スイッチ３３とレバー３４が設けられている。フタカバー３２には固定金具３５１にピン３５が設けられており、フタカバー３２を固定カバー３１に載せるとピン３５がスイッチ３３のレバー３４を押した状態となるようにしている。

スイッチ３３には、ケーブル３６を介してＬＥＤ駆動ユニット１８が接続されている。ＬＥＤ駆動ユニット１８は、オイル点着時や標本交換時に、フタカバー３２を開けるとスイッチ３３がＯＦＦとなって、ＯＦＦ信号がケーブル３６を通して与えられると、スイッチ回路１８ａによりＬＥＤ１２の電源を強制的にＯＦＦし、一方、フタカバー３２を閉めるとスイッチ３３がＯＮになって、ＯＮ信号がケーブル３６を通して与えられると、スイッチ回路１８ａによりＬＥＤ１２の電源をＯＮし、ＬＥＤ１２から発せられる光により全反射照明を可能としている。

次に、このように構成した第１の実施の形態の作用について述べる。

いま、操作部２０の指示によりＬＥＤ駆動ユニット１８より一方の投光管１１のＬＥＤ１２がＯＮされると、ＬＥＤ１２より発振された波長λ_Ｌ１の発散光の光が出力される。

このＬＥＤ１２は、集光レンズ１３を通って収束光に変換され、反射ミラー１０ａにより透過照明光路Ｔの外側近傍の位置でコンデンサレンズ６側に反射し、コンデンサレンズ６の前側焦点位置で集光される。また、コンデンサレンズ６を通った光は、斜め方向に進む平行光線として出射され、イマージョンオイル５とスライドガラス２を通って標本４との境界面に入射する。

ここで、標本４に対する全反射照明角度の境界面への入射角θ_Ｌ１が全反射の臨界角より大きければ、光ビームは境界面で全反射し、標本４側にエバネッセント光が浸み出す。これにより、標本４中に存在する特定の蛍光物質は、波長λ_Ｌ１のエバネッセント光により励起され、蛍光の最大輝度波長が第１の吸収フィルタ２５の透過波長帯に含まれるような蛍光を発する。この蛍光は、カバーガラス３を通って対物レンズ２２に入り、観察光路中のダイクロイックミラー２４および第１の吸収フィルタ２５を通って第１の撮像素子２６で撮像される。

この状態で、マイクロメータ１４を操作すると、このときの操作に応じて直動されるマイクロメータヘッド１４ａの移動量が微量に調整される。すると、投光管１１に対してミラーユニット１０は、透過照明光路Ｔより離れた方向に移動し、このミラーユニット１０の移動により、反射ミラー１０ａで反射した光のコンデンサレンズ６への入射位置が移動し、コンデンサレンズ６からの出射角度、つまりスライドガラス２と標本４との境界面への入射角θ_Ｌ１が変化する。

こうすることで、既に述べたように、全反射照明におけるエバネッセント光の浸み出し深さは、境界面への光の入射角によって変わるので、マイクロメータ１４を操作してミラーユニット１０とともに反射ミラー１０ａを所望する位置に移動させることで、エバネッセント光の浸み出し深さｄ_Ｌ１を任意に変化させることができる。

一方、操作部２０の指示により、他方の投光管１１のＬＥＤ１２をＯＮした場合についても同様で、この場合、ＬＥＤ１２より発振した波長λ_Ｌ２の光が集光レンズ１３を通って、反射ミラー１０ａで反射し、コンデンサレンズ６の前側焦点位置で集光し、イマージョンオイル５とスライドガラス２を通って標本４との境界面に入射する。ここでも、境界面への入射角θ_Ｌ２が全反射の臨界角より大きければ、光ビームは境界面で全反射し、標本４側にエバネッセント光が浸み出す。また、投光管１１に設けたマイクロメータ１４を操作し、スライドガラス２と標本４との境界面への入射角θ_Ｌ２を変えることで、エバネッセント光の浸み出し深さｄ_Ｌ２を任意に変化させることができる。

また、標本４中に存在する特定の蛍光物質は、波長λ_Ｌ２のエバネッセント光により励起され、蛍光の最大輝度波長が第２の吸収フィルタ２７の透過波長帯に含まれるような蛍光を発する。この蛍光は、カバーガラス３を通って対物レンズ２２に入り、観察光路中のダイクロイックミラー２４および第２の吸収フィルタ２７を通って第２の撮像素子２８で撮像される。

この場合、操作部２０のＯＮ／ＯＦ操作によりＬＥＤ駆動ユニット１８のスイッチ回路１８ａを駆動すると、このときのスイッチ操作に応じてスイッチ回路１８ａよりケーブル１７を介してＬＥＤ１２に送られる駆動電流がＯＮ／ＯＦＦされ、ＬＥＤ１２のＯＮ／ＯＦＦが制御される。また、操作部２０のスイッチ操作によりＬＥＤ駆動ユニット１８の電流制御回路１８ｂを制御し、ケーブル１７を介してＬＥＤ１２の駆動電流を可変することにより、ＬＥＤ１２からの出射パワーを調整することもできる。

次に、インタロック機能について述べる。

この場合、オイル点着や標本交換時にフタカバー３２を取り外すと、スイッチ３３は、レバー３４を押圧しているピン３５が除去されてＯＦＦし、このＯＦＦ信号がケーブル３６を通して、ＬＥＤ駆動ユニット１８に転送される。ＬＥＤ駆動ユニット１８は、このときのＯＦＦ信号に応じてスイッチ回路１８ａよりケーブル１７を介してＬＥＤ１２へ供給される駆動電流を遮断し、ＬＥＤ１２を直ちにＯＦＦさせる。一方、フタカバー３２を装着すると、スイッチ３３は、レバー３４がピン３５に押圧されてＯＮし、このＯＮ信号がケーブル３６を通してＬＥＤ駆動ユニット１８に転送される。すると、ＬＥＤ駆動ユニット１８は、このときのＯＮ信号に応じてスイッチ回路１８ａよりケーブル１７を介して駆動電流を出力し、ＬＥＤ１２をＯＮさせる。

従って、このようにすれば、全反射照明用光源としてＬＥＤ１２が用いられ、このＬＥＤ１２に接続されたＬＥＤ駆動ユニット１８により操作部２０での操作によりＬＥＤ１２のオンオフを制御を始め、調光を制御できるので、従来のレーザ光導入管ごとに光ファイバを介してレーザ光源、シャッタなどを備えたインターロックボックスやＮＤスライダを設けたものと比べ、全反射照明光源を大幅に小型化できるとともに、価格的にも安価にできる。また、ＬＥＤ１２のオンオフを高速で行なうことができ、さらに、波長の異なるＬＥＤ１２の切り替えも精度よく行なうことができるので、操作性に優れた全反射照明用光源を実現できる。

（第２の実施の形態）
次に、第２の実施の形態について説明する。

図３は、本発明の第２の実施にかかる全反射蛍光顕微鏡の要部の概略構成を示すもので、図１と同一部分には、同符号を付している。

この場合、コンデンサレンズ６と透過照明光源７との間には、顕微鏡本体（不図示）に固定されたベース４１が配置されている。このベース４１には、複数（２個）の投光管保持部４１ａが設けられている。これら投光管保持部４１ａは、透過照明光路Ｔを中心に点対称の位置に配置されている。

投光管保持部４１ａには、投光管４２が設けられている。投光管４２は、ＬＥＤ４３を有するとともに、このＬＥＤ４３から発する光の光路上に集光レンズ４４および反射ミラー４５が配置されている。また、投光管４２は、投光管保持部４１ａに対し透過照明光路Ｔと直交する方向に移動可能に支持され、マイクロメータ４６の操作に応じたマイクロメータヘッド４６ａの直動動作により微量な移動量を得られるようになっている。この場合、マイクロメータ４６は、投光管保持部４１ａに設けられ、常時、ばね４７の引張り力によりマイクロメータヘッド４６ａ先端が投光管４２に当接するようにしている。そして、マイクロメータ４６を操作してマイクロメータヘッド４６ａを透過照明光路Ｔから離れる方向に移動させることにより、投光管４２全体をばね４７による引張り方向に移動させるようにしている。この状態で、ＬＥＤ４３から発せられる発散光は、集光レンズ４４により収束光に変換され、反射ミラー４５を介してコンデンサレンズ６の前側焦点位置近傍に集光される。なお、この場合も、各投光管４２に設けられるＬＥＤ４３は、異なる波長の光を発生するものが用いられる。

このようにすれば、投光管保持部４１ａに対してＬＥＤ４３、集光レンズ４４、反射ミラー４５を一体に設けた投光管４２を透過照明光路Ｔと直交する方向に直動させるようにしたので、全反射照明の入射角の位置（例えばＮＡ１．３８〜ＮＡ１．６５）によって、集光レンズ４４からコンデンサレンズ６の前側焦点位置までの光路長を変化しないようにできる。つまり、全反射照明の入射角の位置を変化させた場合も、集光レンズ４４からコンデンサレンズ６の前側焦点位置までの光路長を一定に保持することができるので、安定した全反射照明を実現することができる。

（第３の実施の形態）
次に、第３の実施の形態について説明する。

ここで、第３の実施の形態に適用される全反射蛍光顕微鏡の概略構成については、図１と同様なので、同図を援用するものとする。

この場合、２本の投光管１１のＬＥＤ１２は、同一の波長λを発光するものが用いられる。また、各投光管１１に対応するミラーユニット１０の反射ミラー１０ａは、透過照明光路Ｔからの距離が常に等しくなるように位置調整されている。

このようにすれば、２本の投光管１１のＬＥＤ１２より同一の波長λの光が発せられ、これら同一の波長λの光により全反射照明を行なうことができるので、全反射照明の明るさを１本の投光管１１の場合に比べて、２倍にすることができ、また、この２倍の明るさの範囲で調光が可能な全反射照明を実現することもできる。

（第４の実施の形態）
次に、第４の実施の形態について説明する。

ここで、第４の実施の形態に適用される全反射蛍光顕微鏡の概略構成については、図１と同様なので、同図を援用するものとする。

この場合、２本の投光管１１のうち、一方の投光管１１は、全反射照明範囲での調整が可能となっており、他方の投光管１１は、反射ミラー１０ａを反射した照明光が臨界角より小さくなるように、ミラーユニット１０を透過照明光路Ｔに近付けた位置で固定されている。

このようにすれば、一方の投光管１１による照明では、全反射照明となるのに対し、他方の投光管１１による照明では、全反射照明とならず、落射蛍光照明となる。これにより、操作部２０からの指示によりＬＥＤ駆動ユニット１８より一方の投光管１１のＬＥＤ１２のみをＯＮすれば、全反射照明を行なうことができ、また、ＬＥＤ駆動ユニット１８より他方の投光管１１のＬＥＤ１２のみをＯＮすれば、通常の落射蛍光照明を行なうことができる。これにより、操作部２０での操作により、全反射照明と落射照明を高速で切換えることができる。

なお、本発明は、上記実施の形態に限定されるものでなく、実施段階では、その要旨を変更しない範囲で種々変形することが可能である。例えば、上述した実施の形態では、正立顕微鏡について述べたが、構成を上下反転して、倒立顕微鏡において構成することも可能である。

さらに、上記実施の形態には、種々の段階の発明が含まれており、開示されている複数の構成要件における適宜な組み合わせにより種々の発明が抽出できる。例えば、実施の形態に示されている全構成要件から幾つかの構成要件が削除されても、発明が解決しようとする課題の欄で述べた課題を解決でき、発明の効果の欄で述べられている効果が得られる場合には、この構成要件が削除された構成が発明として抽出できる。

本発明の第１の実施の形態にかかる全反射蛍光顕微鏡の概略構成を示す図。 第１の実施の形態に用いられるダイクロイックミラーの特性を示す図。 本発明の第２の実施の形態にかかる全反射蛍光顕微鏡の概略構成を示す図。 従来の全反射蛍光顕微鏡の一例の概略構成を示す図。

符号の説明

１…ステージ、２…スライドガラス、３…カバーガラス
４…標本、５…イマージョンオイル
６…コンデンサレンズ、７…透過照明光源
８…コレクタレンズ、９…ベース、９ａ…孔部
１０…ミラーユニット、１０ａ…反射ミラー
１１…投光管、１２…ＬＥＤ、１３…集光レンズ
１４…マイクロメータ、１４ａ…マイクロメータヘッド
１６…ばね、１７…ケーブル、１８…ＬＥＤ駆動ユニット
１８ａ…スイッチ回路、１８ｂ…電流制御回路
１９…ＡＣ電源用コンセント、２０…操作部
２２…対物レンズ、２３…結像レンズ、２４…ダイクロイックミラー
２５…第１の吸収フィルタ、２６…第１の撮像素子
２７…第２の吸収フィルタ、２８…第２の撮像素子
３０…ステージボックス、３１…固定カバー、３２…フタカバー
３３…スイッチ、３４…レバー、３５…ピン
３６…ケーブル、４１…ベース、４１ａ…投光管保持部
４２…投光管、４３…ＬＥＤ、４４…集光レンズ
４５…反射ミラー、４６…マイクロメータ、４６ａ…マイクロメータヘッド
４７…ばね

Claims (7)

1. 光源からの照明光を標本に向けて出射するコンデンサレンズを有する第１の照明光学系と、前記標本に対して前記照明光学系と反対側に配置され、前記標本から発せられた観察光を集光する対物レンズを有する観察光学系とを備えた全反射蛍光顕微鏡本体と、
   前記全反射蛍光顕微鏡本体に設けられ、所定波長の光を発生する発光ダイオードと、該発光ダイオードからの光を標本に対し前記第１の照明光学系の前記コンデンサレンズの内部を通して全反射照明角度で入射させるための複数の発光ダイオードを有する複数の投光管と、
   前記投光管の発光ダイオードに接続され、少なくとも前記発光ダイオードのオンオフを制御可能にした制御手段と
   を具備し、
   前記複数の投光管は、前記コンデンサレンズの光軸と直交する方向に移動可能に設けられ、前記標本に対し入射される全反射照明角度を調整可能とすることを特徴とする全反射蛍光顕微鏡。
2. 前記複数の発光ダイオードは、それぞれ波長の異なる光を発することを特徴とする請求項１記載の全反射蛍光顕微鏡。
3. 前記複数の発光ダイオードは、同一波長の光を発することを特徴とする請求項１記載の全反射蛍光顕微鏡。
4. 前記複数の投光管は、前記発光ダイオードからの光を標本に対し全反射照明角度で入射させる集光光学系を有するものと、前記発光ダイオードからの光を前記標本に対し全反射照明角度から外して入射させる集光光学系を有するものを備えたことを特徴とする請求項２または３記載の全反射蛍光顕微鏡。
5. 光源からの照明光を標本に向けて出射するコンデンサレンズを有する第１の照明光学系と、前記標本に対して前記照明光学系と反対側に配置され、前記標本から発せられた観察光を集光する対物レンズを有する観察光学系とを備えた全反射蛍光顕微鏡本体と、
   前記全反射蛍光顕微鏡本体に設けられ、所定波長の光を発生する発光ダイオードと、該発光ダイオードからの光を標本に対し前記第１の照明光学系の前記コンデンサレンズの内部を通して全反射照明角度で入射させるための複数の発光ダイオードを有する複数の投光管と、
   前記投光管の発光ダイオードに接続され、少なくとも前記発光ダイオードのオンオフを制御可能にした制御手段と
   を具備し、
   前記複数の投光管は、前記コンデンサレンズの光軸と直交する方向に移動可能に設けられ、前記標本に対し入射される全反射照明角度を調整可能とするとともに、前記発光ダイオードからの光を標本に対し全反射照明角度で入射させる集光光学系を有するものと、前記発光ダイオードからの光を前記標本に対し全反射照明角度から外して入射させる集光光学系を有するものを備えていることを特徴とする全反射蛍光顕微鏡。
6. 前記複数の発光ダイオードは、それぞれ波長の異なる光を発することを特徴とする請求項５記載の全反射蛍光顕微鏡。
7. 前記複数の発光ダイオードは、同一波長の光を発することを特徴とする請求項５記載の全反射蛍光顕微鏡。

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