JP4659764B2 - 抗酸化素材の製造方法 - Google Patents
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Description
また、抗酸化素材は、前記アグリコン化処理後にフラボノイドアグリコンとビタミンCとを混合する工程を経て製造することが好ましい。
実施形態の抗酸化素材は、柑橘類、例えばレモン由来のフラボノイドアグリコン(以下、アグリコンと記載する)と、ビタミンC(アスコルビン酸)とを有効成分として含有する。この抗酸化素材は、アグリコンとビタミンCとの相乗効果により、有用な作用、例えば極めて高い抗酸化作用および劣化防止作用を発揮する。前記アグリコンは、前記柑橘類由来のフラボノイド配糖体を含む原料をアグリコン化処理することによって得られる。
前記グリコシダーゼ処理は、前記原料にβ−グリコシダーゼを作用させ、該原料中に含まれるフラボノイド配糖体のグリコシド結合を切断する酵素反応を行う処理である。このとき、前記原料中のフラボノイド配糖体から、アグリコンと、前記酵素反応の副産物である糖とが生成される。このグリコシダーゼ処理は、該処理の効率を高めるために、果汁以外の柑橘類の果実の構成成分の抽出物(抽出液)、又は柑橘類の果汁にβ−グリコシダーゼを添加して前記酵素反応を行ことが好ましい。或いは、グリコシダーゼ処理として、酵素活性を有するβ−グリコシダーゼが固定化された担体と、前記果汁又は抽出物とを接触させることにより前記酵素反応が行われてもよい。前記柑橘類の果汁は、その濃縮液又は希釈液が用いられてもよい。
実施形態の抗酸化素材は、柑橘類由来のアグリコンとビタミンCとを有効成分として含有する。このため、この抗酸化素材は、前記有効成分が発揮する高い抗酸化作用により、多岐に渡る用途、例えば健康食品、医薬品、医薬部外品、化粧品、抗酸化剤、及び活性酸素消去剤に利用されることができる。このとき、前記アグリコンは、体内吸収性、特に経口摂取されたときの吸収性に優れているとともに高い抗酸化作用を発揮することから、容易に高い健康増進効果を発揮する。この抗酸化素材が医薬品、医薬部外品又は化粧品に含有されて用いられる場合には、1日当たりのアグリコン及びビタミンCの摂取量、投与量又は使用量は、好ましくは前記飲食品の場合の摂取量と同様である。また、この抗酸化素材は、油脂の酸化劣化、香料におけるフレーバーの劣化、及び色素の分解または退色を効果的に抑えることもできる。このため、この抗酸化素材は、油脂、香料又は色素を含有する飲食品中に添加されて該飲食品の保存性を容易に高めることができる。さらに、この抗酸化素材は、それ単独で熱劣化及び光劣化の両方を抑える作用があることから極めて有用かつ経済的である。
レモンの搾汁残渣を10倍量(重量)のメタノールに24時間浸漬することにより、レモンフラボノイド配糖体の抽出物を得た。得られた抽出物をエバポレーターにて減圧濃縮した後、アンバーライト樹脂(XAD16:オルガノ社製)に吸着させてペクチン、糖質等をできるだけ除去し、更に40%含水メタノールで溶出させた溶出液を濃縮および凍結乾燥することにより、レモンフラボノイド配糖体混合粉末(比較例1のレモン配糖体)を得た。この粉末中には、エリオシトリンが約30%、ジオスミンが約2〜5%含まれている。この比較例1のレモン配糖体を水に溶解し、下記分取用HPLCシステム1を用いて下記HPLC条件1にてエリオシトリンを精製した後、精製したエリオシトリンを濃縮および凍結乾燥することにより、エリオシトリン粉末(比較例2のエリオシトリン)を得た。
<分取用HPLCシステム1>
ポンプ:Shimadzu LC-8A、システムコントローラ:Shimadzu SCL-8A、オートインジェクタ:Shimadzu SIL-8A、検出器:Shimadzu SPD-8A,UV spectrophotometric detector、フラクションコレクタ:Shimadzu FCV-100B
<HPLC条件1>
カラム:YMC-Pack ODS-A(50i.d.×250mm)、溶出液:メタノール/水=50/50(v/v)、流速:100ml/min、検出波長:270nm
(エリオシトリン及びジオスミンのグリコシダーゼ処理)
比較例2のエリオシトリン、又は和光純薬工業社製のジオスミンを、終濃度が5mMとなるように20mM酢酸ナトリウム−塩酸バッファーに溶解した。更に、このバッファーを添加することによってpHを3.0に調整した配糖体溶液と、pHを5.0に調整した配糖体溶液とを作製した。前記ジオスミンは水に溶解し難いことから、予めジオスミンをジメチルスルホキシドに溶解させてから配糖体溶液を作製した。これらの配糖体溶液に100ppm又は10ppmのβ−グリコシダーゼ(第2のグリコシダーゼ)を添加し、この反応液を約30℃でスターラーにて攪拌しながらグリコシダーゼ処理を行った。前記β−グリコシダーゼは、本発明者らがペニシリウム・マルチカラー IAM 7153の菌株からpNPの発色をマーカーとして精製したβ−プリメベロシド分解酵素活性を有する酵素であり、173unit/gのβ−グリコシダーゼ活性を有する。1unitは、30℃及び1分間に1μmolのpNPPを加水分解してpNPを遊離させる酵素量である。前記第2のグリコシダーゼを添加してから0、0.5、1、2、4、5及び8時間後に反応液を数mlずつサンプリングし、95℃で10分間加熱して酵素を失活させたサンプルを急冷して冷凍保存した。得られたサンプルを下記分析用HPLCシステム2を用いてHPLC条件2にて分析し、グリコシダーゼ処理による各物質の濃度変化を確認した。結果を図1〜4に示す。
<分析用HPLCシステム2>
ポンプ:S himadzu LC-10AD、システムコントローラ:Shimadzu SCL-10A、オートインジェクタ:Shimadzu SIL-10A、検出器:Shimadzu SPD-10A,UV spectrophotometric detector、カラムオーブン:Shimadzu CTO-10A
<HPLC条件2>
カラム:YMC-Pack ODS-A (4.6i.d.×250mm)、溶出液:メタノール/水=40/60(v/v)、流速:1ml/min、検出波長:270nm
図1〜4より、エリオシトリン(図1,2)及びジオスミン(図3,4)ともに、第2のグリコシダーゼ添加直後から急速に濃度の減少が見られ、それぞれのアグリコンであるエリオディクティオール及びジオスメチンの生成が確認された。エリオシトリンのエリオディクティオールへの変換率は約50〜60%であり、ジオスミンのジオスメチンへの変換率は80%程度であり、高い変換率が得られた。この結果から、本酵素により極めてロスが少なく、且つ効率がよいアグリコン化が図られることが示された。また、第2のグリコシダーゼの至適pH域であるpH5.0に調整された溶液中でも、pH3.0に調整された溶液中でもほぼ同じ効率でアグリコン化が進むことも確認された。例えばレモン、ライム及びスダチの果汁と、フラボノイド配糖体の抽出液とのpHは3付近であることから、本酵素の酵素活性がレモン、ライム及びスダチの果汁、又はこれらから得られたフラボノイド配糖体の溶液中でもほとんど損なわれず、これらの溶液中でも本酵素が利用可能であることが確認された。また、第2のグリコシダーゼを10ppm添加した場合でも、時間をかければ十分にアグリコン化が進むことも明らかとなった。そして、処理時間も考慮し、以下の処理では基質1mMあたり10ppmのβ−グリコシダーゼを添加することを目安として検討を実施した。
(レモンフラボノイドのアグリコン化及びその精製)
比較例1のレモン配糖体を、エリオシトリンの終濃度が1mMとなるように20mM酢酸ナトリウム−塩酸バッファーに溶解した。更に、このバッファーを添加することによってpHを3.0に調整した配糖体溶液と、pHを5.0に調整した配糖体溶液とを作製した。これらの配糖体溶液に前記第2のグリコシダーゼを10ppm加え、この反応液を約30℃でスターラーにて攪拌しながらグリコシダーゼ処理を実施した。前記第2のグリコシダーゼを添加してから0、0.5、1、2、4、5及び8時間後に反応液を数mlずつサンプリングし、95℃で10分間加熱して酵素を失活させたサンプルを急冷して冷凍保存した。得られたサンプルを上記HPLC条件1にて分析し、グリコシダーゼ処理による各物質の濃度変化を確認した。結果を図5,6に示す。
(酵素の基質特異性の検討)
上記第2のグリコシダーゼの有用性を確認するために、市販酵素によるアグリコン化の試験を実施した。使用した酵素は、天野エンザイム社製のセルラーゼ系酵素(セルラーゼA「アマノ」3、セルラーゼT「アマノ」4)、ペクチナーゼ系酵素(ペクチナーゼG「アマノ」、ペクチナーゼPL「アマノ」)の4種及び上記第2のグリコシダーゼである。上記比較例1のレモン配糖体を、その濃度が50ppmとなるように溶解させた水溶液(pH3.0に調整)に各酵素を500ppm又は50ppm添加し、室温(25℃)で5時間酵素反応させた。これらの酵素反応後の各サンプルを95℃で10分間加熱して酵素を失活させた後、上記HPLC条件2にてエリオシトリン及びエリオディクティオールの濃度を定量してエリオシトリンの変換率を求めた。その結果、ペクチナーゼPL「アマノ」を500ppm添加したときのエリオシトリンからエリオディクティオールへの変換率は22%であり、第2のグリコシダーゼを500ppm、50ppm添加したときの同変換率はそれぞれ67%、74%であり、それ以外の試験における変換率はほぼ0%であった。従って、上記第2のグリコシダーゼの変換率は、市販酵素の変換率よりも著しく高いことが確認された。
(柑橘類果汁のグリコシダーゼ処理)
エリオシトリンの含有率が高いレモン果汁、ライム果汁、及びスダチ果汁に対し、上記第2のグリコシダーゼを添加してアグリコン化について検討した。上記3種の果汁として市販されている濃縮果汁を用い、それぞれBrix10に調整した。いずれの果汁のpHも3付近であった。これらの果汁に上記第2のグリコシダーゼを終濃度が10ppmになるように添加し、室温で5時間酵素反応させた。これらの酵素反応後の各サンプルを95℃で10分間加熱して酵素を失活させた後、上記HPLC条件2にてエリオシトリン及びエリオディクティオールの濃度を定量してエリオシトリンの変換率を求めた。その結果、レモン果汁、ライム果汁、及びスダチ果汁の変換率はそれぞれ、54%、49%、56%であり、それらの変換率が高いことが確認された。従って、これらの柑橘類の果汁におけるアグリコン化においても上記第2のグリコシダーゼが有用であることが確認された。
(ラジカル捕捉活性の測定)
下記表1に示される各サンプルについて、DPPH(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl)ラジカル捕捉活性を調べた。即ち、上記比較例1のレモン配糖体、比較例2のエリオシトリン、試験例1の酵素処理アグリコン、(株)フナコシより購入したエリオディクティオール、ネオエリオシトリン、ビタミンC又はα−トコフェロールをそれらの濃度が500ppmとなるように溶解させた水溶液100μlに0.1Mトリス緩衝液(pH7.4)1mlを加えた。α−トコフェロールの溶媒はメタノールである。また、前記各サンプル及びビタミンCをそれらの濃度が500ppmとなるように溶解させた水溶液100μlに、0.1Mトリス緩衝液1mlを加えた。続いて、これらに2mlのDPPH溶液(DPPHをその濃度が500μMとなるようにエタノールに溶解させたもの)を加えてよく混合した後、室温および暗所で20分間放置して反応させた。各反応液(10μl)中のDPPH量を、下記分析用HPLCシステム2を用いてHPLC条件3で測定することにより定量した。ラジカル捕捉活性の評価法は、予め試料(配糖体及びアグリコン)無添加試験区(コントロール)におけるDPPH残存量を100%とし、各試料を添加した反応液中のDPPH残存量を測定し、コントロール区のDPPH量に対する百分率(%)で表した。エリオディクティオール及びビタミンC添加区分のラジカル捕捉活性はほぼ100%であったことからサンプル量を半分にして再度試験を行った。即ち、エリオディクティオール及びビタミンCをそれぞれ500ppmとなるように溶解させた水溶液50μlに、0.1Mトリス緩衝液1mlを加えた後、上記のようにラジカル捕捉活性を測定し、得られた数値を2倍することによりデータを補正した。結果を表1に示す。
<分析用HPLCシステム2>
ポンプ:Shimadzu LC-10AD、システムコントローラ:Shimadzu SCL-10A、オートインジェクタ:Shimadzu SIL-10A、検出器:Shimadzu SPD-10A,UV spectrophotometric detector、カラムオーブン:Shimadzu CTO-10A
<HPLC条件3>
カラム:TSK-GEL octyl-80Ts (4.6i.d.×150mm)、溶出液:メタノール/水=30/70(v/v)、流速:1ml/min、検出波長:517nm
(過酸化脂質生成抑制効果の測定)
上記表1に示される各サンプルについて、リノール酸メチルを基質とした過酸化脂質生成抑制効果を調べた。即ち、上記(ラジカル捕捉活性の測定)で用いた各水溶液100μlと、リノール酸メチル89mg(100μl)とを内径14mmの小型試験管に加えて十分に混合した。同時に、前記水溶液の代わりに、該水溶液の溶媒100μlのみを加えたもの(コントロール)も調製した。これらの混合液の溶媒を、減圧デシケーター内で真空ポンプを用いて完全に除去した後、40℃の暗所に18時間放置した。次に、0.08%BHT(2,6ジtブチル4メチルフェノール)/ヘキサン溶液5mlを加え、リノール酸メチルより生成した過酸化物量を以下に示す分析用HPLCシステム2を用いてHPLC条件4により測定した。抗酸化活性の測定および評価法は、まず、コントロール試験区のリノール酸メチルより生成した過酸化脂質(13−ヒドロペルオキシド及び9−ヒドロペルオキシド)のHPLCピーク面積値の総和量を求め、その値を100%とした後、各試料を添加した試験区の過酸化脂質のHPLCピーク面積値の総和量を求め、それを前記コントロールの総和量に対する百分率(%)で表すことにより、リノール酸メチル酸化抑制率を求めた。結果を上記表1に示す。
<分析用HPLCシステム2>
ポンプ:Shimadzu LC-10AD、システムコントローラ:Shimadzu SCL-10A、オートインジェクタ:Shimadzu SIL-10A、検出器:Shimadzu SPD-10A,UV spectrophotometric detector、カラムオーブン:Shimadzu CTO-10A
<HPLC条件4>
カラム:Develosil SI 60-5 (4.6i.d.×250mm)、溶出液:n-hexane/1,4-dioxane/isopropylalchol = 98/1/1 (v/v/v)、流速:1ml/min、検出波長:235nm
上記表1より、レモン配糖体、酵素処理アグリコン、エリオシトリン及びエリオディクティオールは、主に油系の条件において高い抗酸化活性を有しているが、ビタミンCを混合した後に添加した区分では、レモン配糖体、酵素処理アグリコン、エリオシトリン及びエリオディクティオールの抗酸化活性が相乗的に発揮されたことが確認された。精製品であるエリオシトリン又はエリオディクティオールにビタミンCを添加した場合も、レモン配糖体又は酵素処理アグリコンにビタミンCを添加した場合とほぼ同じ割合での相乗効果が発揮された。よって、前記レモン配糖体および発酵処理アグリコンで確認された相乗効果はエリオシトリン又はエリオディクティオールとビタミンCとの相乗効果によるものであることが確認された。従って、これらのフラバノン類とビタミンCとを混合した抗酸化素材は、非常に高い抗酸化活性を有しており、酸化による劣化を抑制する抗酸化素材として有用であることが明らかとなった。
(リポソームを用いた生体膜酸化抑制効果の検証)
生体膜モデルである一枚膜のリポソーム(SUV:Small Unilamellar Vesicle)を用いて抗酸化力を評価した。SUVの調製は、まず、卵黄レシチン100mgに1mlのクロロホルムを加えて完全に溶解させた後に、ナスフラスコにてクロロホルムを完全に除去した。得られた脂質のフィルムに、比較例1のレモン配糖体、比較例2のエリオシトリン、試験例1の酵素処理アグリコン又はエリオディクティオール(フナコシ社製)を500ppm含有する10mMリン酸緩衝液(pH7.4)を10ml加えて膨化させ、よく振盪した後に超音波洗浄器にて完全に分散させた。コントロールとして脂質のフィルムを前記リン酸緩衝液10mlのみで膨化させたものも同様に試験した。次に、得られた多重層リポソームの溶液に窒素ガスを5分間バブリングした後に強力な超音波発生装置にて180W及び20分間の超音波処理を行い、小さな一枚膜のリポソーム(SUV)を調製した。
このようにして作製したSUVにラジカル発生剤であるAAPH(2,2’−アゾビス(2−アミノジプロパン))を加えることにより、該SUVに対する過酸化を強制的に促進させた。その結果、リポソーム中に一次生成物である過酸化物が生成され、さらには自動酸化の過程で二次生成物であるマロンジアルデヒド等が生成される。これにチオバルビツール酸(TBA)試薬を加えると、アルデヒド類の反応生成物である赤色物質(TBA陽性物質)が生成する。その呈色度を分光光度計にてλ=535nmで測定し、リポソーム膜酸化率(%)とした。
(活性酸素消去率の測定)
キサンチンオキシダーゼ0.5ml(5.6unit)、1mMキサンチン(和光純薬社製)0.3ml、0.25mMニトロブルーテトラゾリウム(和光純薬社製)0.3ml及び0.05M炭酸ナトリウム緩衝液(pH10.2)2.3mlを混合した。前記キサンチンオキシダーゼとして、和光純薬社製の試薬を0.05M炭酸ナトリウム緩衝液にて100倍希釈したものを用いた。この混合液に上記比較例1のレモン配糖体又は試験例1の酵素処理アグリコン0.1ml(濃度1000ppm)を加えてインキュベーションした。インキュベーション時間の経過と共に青色のホルマザンが産生されることから、インキュベーション開始3分後に分光光度計(HITACHI spectrophotometer U2000)を用いてλ=560nmにて吸光度を測定した。前記試料(配糖体及びアグリコン)無添加試験区をコントロールとした。また、ブランクテストとして前記キサンチンオキシダーゼの代わりに炭酸ナトリウム緩衝液を加えて同様の操作を行った。そして、各試料液を加えた際の吸光度から前記ブランクテストの吸光度を差し引いた値をコントロールの吸光度で除算することにより、活性酸素消去率(%)を求めた。その結果、活性酸素消去率は、比較例1のレモン配糖体では26.7%であったが、試験例1の酵素処理アグリコンでは74.8%であり、酵素処理アグリコンでは高い抗酸化活性が発揮されることが示された。α−トコフェロールの酸化率は238.2%であった。従って、レモンアグリコンは高い活性酸素消去能を有しており、生体内での活性酸素消去剤として有用であることが明らかとなった。
〔参考例2〕
(試料の調製2:微生物発酵処理によるアグリコンの作製)
レモンの搾汁残渣に、予め30℃および暗所でポテトデキストロース-ブロス培地にて1週間予備培養したアスペルギルス・サイトイ IAM 2210菌株を接種し、30℃の恒温条件で10日間微生物発酵処理を実施した。その後、前記菌株を含むレモンの搾汁残渣を10倍量(重量)のメタノールに24時間浸漬することにより、レモンアグリコンの抽出物を得た。得られた抽出物をエバポレーターにて減圧濃縮した後、アンバーライト樹脂(XAD16)に吸着させ、ペクチン、糖質等をできるだけ除去し、更に40%含水メタノールで溶出させた溶出液を濃縮および凍結乾燥することにより、レモンアグリコン発酵処理粉末(比較例3の発酵処理アグリコン)を得た。上記比較例1のレモン配糖体及び比較例3の発酵処理アグリコンに含まれるフラボノイド組成(含有量)を、それぞれ下記分析用HPLCシステム2を用いて下記HPLC条件5にて分析した。結果を表2に示す。表中の“trace”は下記HPLC条件5でほとんど検出できなかったことを示し、“nd”は検出不可能であったことを示す。
<分析用HPLCシステム2>
ポンプ:Shimadzu LC-10AD、システムコントローラ:Shimadzu SCL-10A、オートインジェクタ:Shimadzu SIL-10A、検出器:Shimadzu SPD-10A,UV spectrophotometric detector、カラムオーブン:Shimadzu CTO-10A
<HPLC条件5>
カラム:YMC-Pack ODS-A (4.6i.d.×250mm)、溶出液:メタノール/水=30/70(v/v)、流速:1ml/min、検出波長:270nm
下記表3に示される各菌株をポテトデキストロース-ブロス培地にて暗所および30℃で2週間予備培養処理し、胞子形成が開始される時期の培地を遠心分離してその培養上清を集めて酵素液サンプル1とした。また、暗所および30℃で4週間予備培養処理し、胞子形成が完了する時期の培地を遠心分離して培養上清と沈澱とに分けた。そして、前記培養上清を酵素液サンプル2とするとともに、前記沈澱に前記培養上清と同量の水を加えて懸濁させ、超音波処理することによって菌体を破壊した後、遠心分離により不溶解物を除去した菌体破砕物を酵素液サンプル3とした。
(香料劣化抑制効果試験)
ブドウ糖及びクエン酸を用いてBrix4.8、pH3.0に調整した水溶液にレモンエッセンス(高砂香料株式会社製)を0.1%添加してシロップ溶液を調製した。これに比較例1のレモン配糖体、比較例4の発酵処理アグリコン(表4中ではアグリコンと記載)、又はビタミンCを添加した添加区分と、添加しない無添加区分とを作製し、これらを87℃まで昇温して瞬間殺菌した後、無色透明のPETボトルに充填した。比較例1のレモン配糖体はエリオシトリン濃度が表4に示される添加濃度となるように添加し、比較例4の発酵処理アグリコンはエリオディクティオール濃度が表4に示される添加濃度となるように添加した。また、前記比較例4の発酵処理アグリコンの添加がシロップ溶液全体の風味に影響するか否かを調べたところ、エリオディクティオールが30ppm以下の添加では風味に大きな影響を及ぼすことはなかった。これらの各区分のサンプルを用いて、以下に記載する加温劣化試験及び紫外線劣化試験を行った。
各区分のサンプルを、60℃又は4℃(冷蔵)で4日間暗所にて静置保存した後、よく訓練されたパネラー12名により官能評価を行った。評価方法は、冷蔵保存したサンプルを5点満点とし、パネラーにそれぞれの区分の点数を評価させ、その平均点を求めた。4回の官能評価試験については全て同一のパネラーを用い、同一の日に実施した。結果を表4に示す。
各区分のサンプルを、スガ試験機株式会社製の紫外線ロングライフフェードメーターによる紫外線(UV)照射条件(6時間照射)又は暗所にて冷蔵保存した後、よく訓練されたパネラー12名により官能評価を行った。評価方法は、暗所保存したサンプルを5点満点とし、パネラーにそれぞれの区分の点数を評価させ、その平均点を求めた。4回の官能評価試験については全て同一のパネラーを用い、同一の日に実施した。結果を表4に示す。
(色素退色防止効果試験)
ブドウ糖及びクエン酸を用いてBrix4.8、pH3.0に調整した水溶液にアントシアニン色素(赤キャベツ色素)を0.1重量%添加したシロップ溶液を調製した。これに比較例4の発酵処理アグリコンをエリオディクティオール濃度で30ppm添加した添加区分と、該アグリコン及びビタミンCを添加した添加区分と、無添加区分とを作製し、これらを87℃まで昇温して瞬間殺菌した後、無色透明のPETボトルに充填した。次に、これらの各区分のサンプルに対し、8時間紫外線照射した後に冷蔵保存、又は45℃および暗所で2週間加温保存した後、分光光度計(HITACHI spectrophotometer U2000)にてλ=460nmの吸光度を測定して色素残存率(%)を求めた。結果を表5に示す。
Claims (3)
- フラボノイドアグリコンとビタミンCとを含有する抗酸化素材の製造方法であって、
前記フラボノイドアグリコンはエリオディクティオール及びジオスメチンであり、レモン搾汁残渣由来のエリオシトリン及びジオスミンを含有するレモンフラボノイド配糖体を含む原料をペニシリウム・マルチカラー由来のβ−グリコシダーゼによりアグリコン化処理することによってエリオディクティオール及びジオスメチンを製造することを特徴とする抗酸化素材の製造方法。 - 前記アグリコン化処理時のpHは2.5〜3.5であることを特徴とする請求項1に記載の抗酸化素材の製造方法。
- 前記アグリコン化処理後にフラボノイドアグリコンとビタミンCとを混合する工程を経て製造することを特徴とする請求項1又は2に記載の抗酸化素材の製造方法。
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