JP4647792B2 - 分析用デバイスおよびセンシングデバイスにおけるポリイオン性コーティング - Google Patents
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Description
(発明の背景)
本出願は、ポリマーコーティング材料の一般的な領域にあり、この材料は、分析用デバイスおよびセンシングデバイスにおいて使用される基板の表面に適用されて、サンプリング溶液中の他の分子の非特異的吸着を最小限にしながら標的検体の特異的認識を促進する。
【0002】
特にDNA/RNAおよびタンパク質のスクリーニングアッセイおよびライブラリーにおいて使用するための、生体親和性(bioaffinity)センサーおよび診断センサーの選択性および感度を改善する必要がある。診断センサーの設計への一般的なアプローチは、生理学的サンプルの特定の成分の特異的結合の測定を含む。代表的に、目的の生理学的サンプル(例えば、血液サンプル)は、全て診断センサーの表面と種々の程度で相互作用する多くの成分の複雑な混合物である。しかし、診断センサーの目的は、他の全ての無関係な相互作用を最小限にしながら、1つの成分の特異的相互作用のみを探索することである。血液と接触しているセンサーの場合、タンパク質、糖タンパク質および/または糖質、ならびに細胞は、しばしばセンサー表面上に非特異的に吸着する。このことは、生体親和性センサーにおける2つの非常に重要な性能の基準である、選択性および感度の両方を損なう。
【0003】
種々の材料および表面(例えば、バルクまたはコーティング材料としての、ガラス、シリコンウェーハ、金属または金属化表面およびおよび金属酸化物)は、分析用デバイスおよびセンサーデバイスにおいて使用される。材料の選択は、使用される特定のセンシング技術に密接に関連する。表面プラズモン共鳴が分析またはセンシング方法として使用される場合、チップは、金のような金属でコーティングされた基板からなる。分析用チップまたはセンサーチップが、特異的光学検出技術(例えば蛍光分光法、光学導波管技術またはこの2つの組合せ)と組合せて使用される場合、光学的に透過性の基板および/またはコーティングが、しばしば必要とされる。金属酸化物または金属酸化物コーティングは、それらの安定性、不活性および光学的透過性の点から、特にこのような場合に適切である。ポリマー材料は、従来側方流(lateral flow)アッセイまたはマルチウェルプレートアッセイにおける適用のために使用される。ガラスまたはケイ素ベースの材料は、しばしばキャピラリー電気泳動適用のために使用される。ポリマーおよびガラス型の材料の両方が、ファイバーオプティクスにおいて使用される。
【0004】
使用される分析技術またはセンシング技術と無関係に、これらの材料および表面は、所定の検出またはセンシング適用における制御された吸着現象に関して必要な特性を有していないので、チップの表面改変のための基本的な必要性が存在する。標的検体との特異的結合相互作用を導入しながら、金属酸化物ベースのセンサー表面上における非特異的相互作用または非特異的吸着を効率的に低減する、単純で、費用効率的な処理材料および方法に対する必要性が存在する。このような特異的認識、結合および検出は、しばしばキーロック型の化学的または生物学的相互作用(例えば、抗体−抗原相互作用)により達成される。
【0005】
インプラントにおける多機能性ポリマーの適用は、インプラントに対する生体応答を決定する生物学的相互作用を制御するために使用され得る。ここで、認識、特異性および非特異的吸着の抑制の同じ原理が関係する。一例は、生物学的応答における結合する細胞の選択であり、ここで体液由来のタンパク質の非特異的吸着の抑制は、細胞の非特異的付着を抑制し得、そして生体特異的認識リガンドの封入体(例えば、接着タンパク質)は、特異的細胞集団または小集団の付着を増強し得る。
【0006】
機能性ポリマーおよびコポリマーの使用は、表面特性または細胞−細胞相互作用を改変するために、生体材料(biomaterial)分野においてしばしば選択されるアプローチである。例えば、Hubbellらへの米国特許第5,573,934号および同第5,626,863号は、水溶性領域(例えば、ポリエチレングリコール)および生分解性領域(ポリラクチドおよびポリグリコリドのような種々の生分解性ポリマーを含む)を含み、アクリレートのような光重合性基で終結するヒドロゲル材料を開示する。これらの材料は、組織表面に適用され得、そして重合され得、たとえば、組織コーティングを形成する。これらの材料は、組織表面に塗布された後に材料上の光重合性基を重合させることにより組織表面に接着される。Hubbellらへの米国特許第5,462,990号および同第5,627,233は、細胞と組織との間の接着および免疫認識を阻害する際に使用するための多機能性ポリマー材料を開示する。これらの材料は、組織結合成分(ポリカチオン)および組織非結合成分(ポリアニオン)を含む。特に、Hubbellは、分子量が300より大きく、ABコポリマー、ABAコポリマーおよびブラシ型コポリマーを含む構造を有する種々のPEG/PLLコポリマーを開示する。これらのポリマーは、組織シーラントとしての使用のため、および外科的癒着を防止するために商業的に開発されている。HubbellらによるWO98/47948「Multifunctional Polymeric Tissue Coatings」は、別のクラスのポリマー、グラフト化ポリイオン性コポリマーを記載し、これらは、生体医療適用において細胞−表面および細胞−細胞および組織−表面相互作用を制御するために、生物学的サンプルおよび非生物学的サンプルに接着し得る。しかし、これらの材料は、デバイスすなわち移植用デバイス(特に、センシングまたは分析のために使用されるレセプターまたは他のリガンドに十分に癒着し得ない金属酸化物または他の表面を有するデバイス)をコーティングするために使用されていない。
【0007】
従って、本発明の目的は、特にデバイスおよびインプラントの表面上の細胞−表面相互作用および細胞−細胞相互作用を制御および改変するために使用され得る材料を提供することである。
【0008】
迅速で、安価で、かつ柔軟性の、これらの材料を基板に塗布するための方法を提供することが、本発明のさらなる目的である。
【0009】
本発明の別の目的は、生理学的サンプルおよび他の型のサンプルと接触した表面において典型的に起こる望ましくない非特異的相互作用を防止しながら、特異的結合相互作用を確立することが必要不可欠である適用のために、分析用デバイスおよびセンサーチップの荷電した表面に簡便に、迅速に、かつ費用効率的に、塗布され得る安定なポリマー材料を提供することである。分析用デバイスまたは診断デバイス、培養物表面、センサーチップ、およびインプラント。
【0010】
(発明の要旨)
特定の適用に最適化された分子アーキテクチャーおよび特性を有する、多機能性ポリイオン性コポリマーは、分析およびセンシングの目的のために、基板表面上で合成されるか/または基板表面に塗布される。これらのコーティングは、検体溶液中に存在する分子またはイオン性成分の非特異的相互作用、吸着または付着を抑制するために特に有用である。化学的、生化学的または生物学的基は、多機能性ポリマーに結合され得るか、一体化され得るか、または吸収され得、このポリマーは、検出される検体を含む材料中の標的分子を認識し得、標的分子と相互作用し得、そして標的分子に特異的に結合し得る。これらの多機能性ポリマーコーティングは、検体中の標的分子を検出、感知および定量するための種々の異なる確立された方法に適合し得る。これらの材料はまた、細胞付着に抵抗し、そして必要に応じて特定の型の細胞の付着を促進し得るか、または特定の細胞挙動を誘導し得る選択的インプラント表面としての使用のための基板表面上の生物学的相互作用を調節するために使用され得る。
【0011】
多機能性ポリマーコーティングは、代表的には、環境との相互作用を制御する側鎖(例えば、細胞癒着を低減するポリ(エチレングリコール)またはポリ(エチレンオキシド)ベースの側鎖)(本明細書中で「非相互作用性」側鎖またはポリマーといわれる)、および検体特異的側鎖を有する、ポリカチオン性またはポリアニオン性(本明細書中では合わせて「ポリイオン性」といわれる)の骨格に基づくブラシコポリマーを含む。ポリイオン性骨格の例は、ポリ(アミノ酸)、例えば、生理学的pHで正電荷を有するポリ(リシン)およびポリ(アルギニン)ならびに生理学的pHにおいて負電荷を有するポリ(グルタミン酸)およびポリ(アスパラギン酸)である。ポリ(エチレングリコール)(PEG)鎖は、高度に水溶性かつ高度に可撓性である。PEG鎖は、水中で非常に高い運動性を有し、そして構造において本質的に非イオン性である。これらのPEG鎖は、分子およびイオンの両方との弱い相互作用について周知であり、適切な形態(分子量、密度、配向性)で表面に結合される場合、これらは、表面ヘの癒着または吸着を低減する(例えば、血液または血清と接触する際のタンパク質耐性)。このようなPEOグラフト化骨格の正に荷電した(カチオン性)骨格または負に荷電した(アニオン性)骨格の選択は、水性環境に曝された場合に表面がしばしば正電荷または負電荷を有するという事実に関連する。特に、水性検体に曝された金属酸化物または金属酸化物コーティングは、選択された特定の酸化物の等電点(IEP)より上のpHでは自然発生的に負電荷を獲得し、そして等電点より下のpHでは正電荷を獲得する。例えば、7のpH(中性溶液)では、酸化ニオブ、酸化タンタルまたは酸化チタンは、負に荷電するが、pH7の酸化アルミニウムは、正に荷電する。他の場合(例えば、貴金属表面)、表面は静電相互作用を介した完全なポリマー吸着を可能にするほど(十分に)荷電されなくてもよい。このような場合、表面は正電荷または負電荷を導入するために処理され得る。例えば、カルボキシレート基は、金または銀上のカルボキシ末端長鎖アルカンチオールの自己集合により導入されて、4より上のpHで正電荷を誘起し得る。あるいは、9より下のpHで正に荷電されるアミノ基は、例えば、アミノ終結アルカンチオールの自己集合により、金または銀表面上に導入され得る。PEGグラフト化ポリイオン性コポリマーは、PEG鎖の末端(遊離末端)位置に、または末端位置の近傍に官能基を導入することによりさらに改変され得る。これらの基は、分析アッセイまたはセンシングアッセイにおいて捕捉部分として作用する癒着部位または認識実体(entities)のさらなる官能化および組込みを可能にする。
【0012】
未改変および改変コポリマーは、単独でか、連続的にか、または混合物として使用され得る。これらは、微小流体または接触プリンティング技術のような公知技術の適用により、非癒着領域および特異的癒着領域に表面をパターン付けするために使用され得る。
【0013】
主にコポリマー材料が金属または金属酸化物に塗布される分析用デバイスまたはセンシングデバイスの基板または表面を参照して記載されたが、ポリマー基板もまた、特にパターン付けが生体分析概念に関与しない場合、使用され得る。例えば、ELISA系および細胞培養系において使用される多くの表面は、ポリマーである。ポリスチレンは、その光学的清澄性、その加工性の容易さ、およびその低費用のために、非常に簡便なポリマーである。ポリスチレンは、容易に官能化されて負または正の電荷を表面に導入し得、適切な荷電した表面を形成し得る。例えば、ポリスチレンの空気または酸素のプラズマへの曝露は、アニオン性基を含む安定な改変された表面を生成することが周知であり、そしてアンモニアプラズマへの曝露は、代表的な操作pHでカチオン性基を含む安定な改変された表面を生成することが周知である。従って、このようなポリマーおよびまた、非細胞性アプローチおよび細胞性アプローチに基づく生体分析系の両方において、ポリマー構造に固有であるか、またはプラズマプロセスのような表面改変手順により導入される、アニオン性もしくはカチオン性のいずれかの基を有する、他の多くのポリマーを使用することは容易に可能である。このような非細胞性アプローチとしてはELISA系があげられ、ここで多機能性ポリマーは、ポリマー基板に吸着され、次いで抗体は、この多機能性ポリマーに化学的に結合される。同様に、細胞媒介系において、ポリマーは、吸着され得、次いで細胞相互作用生体分子(例えば、接着ペプチド)に結合されるか、またあるいは、細胞相互作用生体分子は、吸着の前に結合され得る。ELISA系および細胞培養系の両方において、単純で低費用のポリマー基板が、有利であり得る。
【0014】
金属基板およびポリマー基板の両方はまた、医療用インプラントの状況において有用であり得る。例えば、多くの重要なインプラント(整形外科用インプラントおよび心血管インプラントを含む)は、金属(例えば、チタンまたはステンレス鋼)から構築される。同様に、多くの重要なインプラントは、シリコーンゴムおよびポリエステルのようなポリマーから構築され、これらの両方は、表面電荷を導入するためにプラズマプロセスまたは他のプロセスにより処理され得る。ポリマー材料はまた、これらの材料をコーティングするために使用される場合有利であり得る。
【0015】
(発明の詳細な説明)
分析用適用およびセンシング適用のための、基板およびデバイス(「チップ」)の(反対に)荷電した表面に吸着するポリカチオン性およびポリアニオン性コポリマーが開示される。これらは、3つの機能に役立つ:(1)骨格中の荷電した部位が、基板および骨格上の反対に荷電した基の間の相互作用を介して基板表面にポリマーを結合させる;(2)ブラシのような稠密な構造を形成するグラフト化側鎖が、表面を非相互作用性にする(すなわち、検体からの分子またはイオンの表面上ヘの吸着を防止する)(本明細書中で「非相互作用性」、「非吸着性」または「非特異的吸着に抵抗性」という)ならびに(3)官能基が、低濃度の検体の特異的検出およびセンシングのための認識ユニットの組込みを可能にする(本明細書中で「官能性認識部位」という)。主にチップを参照して記載したが、これらの材料はまた、イムノアッセイおよびコンビナトリアルライブラリースクリーニング技術において使用されるポリマー材料(通常のポリマー(例えば、ポリスチレンまたはポリカーボネート))、または代表的に金属および/またはポリマー材料から形成されるインプラント(例えば、骨プロテーゼ、ネジ、rivit、および血管移植片)をコーティングするために使用され得る。
【0016】
表面または基板材料のコポリマーでの処理は、表面を完全にか、またはほとんど完全に(望まれない)非特異的吸着に対して抵抗性にする。適切な官能基、反応性基、または相互作用性基はまた、コポリマーに導入され得る。本明細書で使用される場合、これらの官能性または反応性または相互作用性コポリマーは、「改変されたコポリマー」という。これらの反応性基は、ポリマーのさらなる官能化(すなわち、抗体、抗原、酵素、オリゴヌクレオチド、一重鎖DNAまたはRNA部分のような特定の分子の吸着または結合)のために使用され得る。大量の非相互作用性物における表面で固定された後者の分子は、確立された分析技術またはセンシング技術を使用して標的分子を特異的に感知し得る。特異的認識ユニットまたは機能性分子を含む多機能性コポリマーは、本明細書中で「官能化(functionalized)ポリマー」といわれる。
【0017】
基板および表面の未改変、改変および/または官能化ポリイオン性コポリマーでの処理のための手順はまた、開示される。
【0018】
改変された官能化チップの好ましい分析またはセンシング検出の手順および適用は、以下に詳細に記載される。
【0019】
(1.非相互作用性ポリマーグラフト化ポリイオン性コポリマーの組成物)
ブロックコポリマーは、ポリマーブロックが1つ以上のほかのポリマーブロックと連結されるコポリマーとして定義される。これは、2つ以上のモノマーユニットがランダムな順序で連結してコポリマーを形成するランダムコポリマーと区別される。ブラシコポリマー(ボトルブラシのような)は、1つの組成の骨格および別の荒毛を有するコポリマーである。これらのコポリマーはまた、櫛コポリマーとして知られる。用語ブラシおよび櫛は、相互交換可能に使用される。樹枝状ポリマー(デンドリマーまたは星型ポリマーとしても知られる)は、コア分子を含み、このコア分子が3つ以上の反応性基を有するモノマーと連続的に反応して、その結果各連続的カップリング工程において、多数のポリマーの末端における反応性基の数が、通常指数関数的に増加する、ポリマーである。デンドロンは、デンドリマーのサブユニットであり、反応性基のみを含むコアで始まる連続的な反応から生じるコア形状構造である。本明細書で使用される場合、分子量とは、他に特定されない限り重量平均分子量をいう。
【0020】
好ましい非相互作用性ポリマーは、ポリ(エチレングリコール)すなわち「PEG」である。記載の容易さのために、グラフトコポリマーの一般的記載は、「非相互作用性ポリマー」よりもPEGという。
【0021】
コポリマーは、荷電したポリマー骨格(例えば、ポリ(アミノ酸))を有するブラシコポリマー(1つの組成の骨格および別の荒毛を有するボトルブラシのような)であり得る。第1の例は、ポリ−L−リシン(PLL)およびポリエチレングリコール(PEG)の荒毛を参照する。PLLの分子量は、1,000と1,000,000との間、好ましくは100,000より大きく、より好ましくは、300,000と800,000との間である。PEGの分子量は、500と2,000,000との間、より好ましくは1,000と100,000との間である。種種の表面結合ポリイオン性ポリマーは、PLLに置換され得、そして種々の非相互作用性ポリマーは、PEGに置換され得る。
【0022】
(A.非相互作用性ポリマー)
用語「非相互作用性」は、本明細書中において、分析用デバイスおよびセンサーデバイスをコーティングするためのこのような分子の適用の観点で使用され、そして表面吸着コポリマー内の非相互作用性のポリマーが、無機イオン、ペプチド、タンパク質、サッカリド、および生物学的起源もしくは非生物学的起源の代表的な検体に含まれる他の成分のような分子の(非特異的)吸着の量を減少させることを意味する。非相互作用性との用語の代わりは、非接着性、吸着耐性または非特異的吸着の観点では吸着反発性である。
【0023】
PEGは、非相互作用性ポリマーとして好ましい物質である。グラフト化比の選択(ポリマー性ポリイオン骨格内のモノマーの数に対するPEG鎖の数)は、重要である。なぜならこれは、デバイス表面に吸着される場合に、所望の非接着性の程度を決定するからである。5000のMWを有するPEGに関しては、最適なグラフト化比は、3〜10ごとに、好ましくは4〜7ごとに1つのPEG鎖の間であり、分析または感知の適用のためのリジンサブユニットであり、そして所望の特性に基づいて、調節され得る。しかし、最適なグラフト化比は、PEGのMW、ならびに特定の適用に依存する。例えば、PLL骨格上にグラフト化されるべきPEG鎖のMWが2000である場合には、PEGユニット対PLLユニットの比は、2と8との間、好ましくは3と5との間であるべきである。異なる構成のPLL−PEGでコーティングされるセンサー表面の特性は、実施例1において議論される。
【0024】
適切な非相互作用性のポリマーとしては、水溶液中に少なくとも1グラム/リットルの溶解度を有する、混合ポリアルキレンオキシドが挙げられ、例えば、いくつかのポロキサマー非イオン性界面活性剤、中性水溶性多糖類、ポリビニルアルコール、ポリ−N−ビニルピロリドン、非カチオン性ポリ(メタ)アクリレート、多くの中性多糖類(デキストラン、フィコールおよび誘導体化セルロースを含む)、ポリビニルアルコール、非カチオン性ポリアクリレート(例えば、ポリ(メタ)アクリル酸)、ならびにこれらのエステルアミドおよびヒドロキシアルキルアミド、ならびにこれらの組合せである。
【0025】
(B.ポリイオン性骨格ポリマー)
適切なポリカチオン性ブロックとしては、中性またはそれに近いpHで正味の正電荷を有する天然および非天然のポリアミノ酸、正に荷電した多糖類、ならびに正に荷電した合成ポリマーが挙げられる。代表的なポリカチオン性ブロックとしては、リジン、ヒスチジン、アルギニンおよびオルニチンからなる群から選択されるモノマーユニットが挙げられる。代表的な正に荷電した多糖類としては、キトサン、部分的に脱アセチルしたキチン、および中性多糖類のアミン含有誘導体が挙げられる。代表的な正に荷電した合成ポリマーとしては、ポリエチレンイミン、ポリアミノ(メタ)アクリレート、ポリアミノスチレン、ポリアミノエチレン、ポリ(アミノエチル)エチレン、ポリアミノエチルスチレン、およびこれらのN−アルキル誘導体が挙げられる。代表的なポリカチオン性材料としては、中性pHにおいて正味の正電荷を有する天然および非天然のポリアミノ酸、正に荷電した多糖類、ならびに正に荷電した合成ポリマーが挙げられる。適切なポリカチオン性材料の例としては、ポリマー骨格またはポリマー側鎖のいずれかにアミン基を有するポリアミンが挙げられ、例えば、ポリ−L−リジンおよび天然もしくは合成アミノ酸またはアミノ酸混合物の、他の正に荷電したポリアミノ酸であり、ポリ(D−リジン)、ポリ(オルニチン)、ポリ(アルギニン)、およびポリ(ヒスチジン)、ならびにポリ(アミノスチレン)、ポリ(アミノアクリレート)、ポリ(N−メチルアミノアクリレート)、ポリ(N−エチルアミノアクリレート)、ポリ(N,N−ジメチルアミノアクリレート)、ポリ(N,N−ジエチルアミノアクリレート、ポリ(アミノメタクリレート)、ポリ(N−メチルアミノメタクリレート)、ポリ(N−エチルアミノメタクリレート)、ポリ(N,N−ジメチルアミノメタクリレート)、ポリ(N,N−ジエチルアミノメタクリレート)、ポリ(エチレンイミン)、4級アミンのポリマー(例えば、ポリ(N,N,N−トリメチルアミノアクリレートクロリド)、ポリ(メチルアクリルアミドプロピルトリメチルアンモニウムクロリド))、およびキトサンのような天然または合成の多糖類のような非ペプチドポリアミンが挙げられる。ポリリジンが、好ましい材料である。
【0026】
一般に、ポリマーは、少なくとも5の電荷を有さなければならず、そしてポリイオン性材料の分子量は、少なくとも1000g/モルの分子量を有する、分析用デバイスまたはセンシングデバイスの表面に対する所望の程度の結合を得るに十分でなければならない。
【0027】
例えば、10,000より大きな分子量を有するポリエチレンイミンと反応するPEGは、本明細書中に記載されるPEG/PLLコポリマーとおおよそ同じ物理的性質を有する。ポリヒドロキシエチルメタクリレートは、適切な化学量論的比のトレシルクロリドまたはトシルクロリドのような試薬(活性化薬剤)と反応し得、これは、いくつかのヒドロキシ基を脱離基に変換させる。これらの脱離基は、ポリカチオン性ポリマー(例えば、10,000より大きな分子量を有するポリアミノエチルメタクリレート)と反応して、高分子量ポリマーを与え得る。適切な化学量論比は、ポリヒドロキシエチルメタクリレート1モルあたり1モルの活性化薬剤であり、そしてポリアミノエチルメタクリレートの反応性基の3〜9モルごと、好ましくは5〜7モルごとに、1モルの活性化ポリヒドロキシエチルメタクリレートである。適切なカチオン性ポリマーは、適切な非相互作用性ポリマーと組み合わせられる場合に、本明細書中に記載のPEG/PLLコポリマーとおおよそ同じ物理的性質を有する、ポリマーである。
【0028】
適切なポリアニオン性ブロックとしては、中性のpHにおいて正味の負の電荷を有する、天然および合成のポリアミノ酸が挙げられる。代表的なポリアニオン性ブロックは、ポリ(グルタミン酸)であり、これは、pH7において負の電荷を有する、カルボン酸側鎖を含む。グリコール酸は、ほんの1例である。これは、重合され得、かつ中性またはそれに近いpHにおいて負の電荷を有する側鎖官能基を含む、他の天然または非天然のモノマー(例えば、カルボン酸基がペンダント基として結合した任意のポリマー)で、置換され得る。適切な材料としては、アルギネート、カラゲーナン、フルセララン(furcellaran)、ペクチン、キサンタン、ヒアルロン酸、ヘパリン、ヘパランスルフェート、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、硫酸デキストラン、ポリ(メタ)アクリル酸、酸化セルロース、カルボキシメチルセルロースおよびクロスマルメロース(crosmarmelose)、ペンダントカルボキシル基を含む合成ポリマーおよびコポリマー(例えば、骨格にマレイン酸またはフマル酸を含むもの)が挙げられる。優先的に負の電荷のポリアミノ酸が、特に適切である。これらの材料の例としては、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸、ならびにこれらと他の天然および非天然のアミノ酸とのコポリマーが挙げられる。タンニンおよびリグニンのようなポリフェノール性材料もまた、使用され得る。好ましい材料としては、アルギネート、ペクチン、カルボキシメチルセルロース、ヘパリンおよびヒアルロン酸が挙げられる。
【0029】
一般に、ポリアニオン性材料の分子量は、正に荷電した分析用デバイスまたはセンサーデバイスの表面への強い接着を得るために、十分に高くなければならない。接着相互作用の良好なブロックを生じる、ポリカチオン性およびポリアニオン性の材料の長さは、慣用的な実験により決定され得る。「良好な」とは、手近な特定の状況の要件(例えば、どの長さの結合が要求されるか、および非相互作用性がいかに完全であるかが、特定の感知適用により要求される)により規定されなければならない用語であることが理解されるべきである。
【0030】
カルボキシレート末端基を除いて、スルフェート、スルホネート、ホスフェートまたは負に荷電した基以外の基は、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)またはニトリロトリス酢酸(NTA)のようなカチオンキレート化特性を有し、同様に使用され得る。用語「カチオンキレート化」とは、このような官能基がセンシングデバイスの表面に含まれるカチオン(好ましくは、Ti(IV)、Zr(IV)、Hf(IV)、V(V)、Ta(V)、Nb(V)、Hf(V)、Cr(III)、Cr(VI)、Mo(VI)またはW(VI)のような金属カチオン)と強く配位する能力をいう。
【0031】
コポリマー中のアミン基は、リジン残基の1級アミンであるが、他の基が使用され得る。例えば、ポリマーは、アルギニンまたはヒスチジンを使用して調製され、それぞれグアニジノまたはイミダゾリルのカチオン性基を生じ得る。同様に、1より多いPEG基が、例えば、少なくとも2つのカルボキシル基および少なくとも2つのアミノ基を有する低分子(例えば、ジペプチドGlu−Lys)を出発物質として使用することにより、提供され得る。
【0032】
全ての実施形態に対して、リジン1ブロックあたりのPEGブロックの分子量および数は、得られるコポリマーがPLLおよびPEGの両方の特性を有するように、決定される。PEGの割合が高すぎる場合には、このポリマーの、分析用またはセンシングの基板(チップ)に対する接着が減少する。PLLの割合が高すぎる場合には、PEGが検体以外のイオンおよび分子の非特異的吸着を減少させる能力が、不十分である。ポリマーは、分析用チップまたはセンサーチップとの分子相互作用を最小にするために十分なPEG特性を有さなければならない。PLLあたりのPEGが少なすぎるポリマーは、これらの相互作用を最小にするためには、あまり適切ではない。ポリマーはまた、チップ表面への十分な結合のために、十分なPLL特性を有さなければならない。不十分なPLL特性を有するポリマーは、十分に結合しない。ポリカチオン性ポリマーは、分析用基板またはセンシング基板への接着において効果的であるために十分な量および密度のカチオン性電荷を提供する、任意のポリカチオンであり得る。
【0033】
(C.PEG/ポリイオン性ポリマーデンドリマー)
PEG/ポリ(アミノ酸)デンドリマーは、1つ以上の直鎖PEGポリマー性ブロックがカチオン性デンドリマー(例えば、デンドリマーがPEGから扇状に広がるように、デンドリマー的に重合したポリリジン)の焦点に共有結合した、コポリマーである。好ましくは、PEGは、デンドリマーの中心点に結合し、これが、以下に詳細に記載するように、PEGから成長する。デンドリマー構築物の特定の有用性は、得られるコポリマーの質量、ポリマーブロック間の構造的関係、および置換の程度を正確に制御する能力である。例えば、示される実施例において、規定された数の正電荷について正確に1つのPEGが存在する。対照的に、予備形成したPEG分子をポリカチオン性骨格にグラフト化することにより、通常、この骨格上のランダムな位置のPEG基を生じる。
【0034】
デンドリマーは、好ましくは、16と128との間の反応性アミン基を含み、これは、第4世代と第7世代との間のデンドリマーに対応する。PEGの分子量は、500と2,000,000との間、好ましくは5,000と100,000との間である。
【0035】
デンドリマーPLLは、高い電荷密度を有するコンパクトな構造の形成を可能にする。これらのPEG/リジンデンドリマーは、このポリマーが約8以上の正電荷を有する(第3世代デンドロン)場合には、簡単なアニオン性表面上に吸着される際に、細胞が広がることを防止するために効果的である。
【0036】
他のリジンに基づかないデンドリマーもまた、調製され得、そして本明細書中に記載されるPEG/PLLデンドリマーの範囲内であることが意図される。例えば、デンドリマーは、アミン以外のポリカチオン性基(例えば、4級アンモニウム塩)を含み得る。さらに、合成のアミノ酸に基づかないカチオンが含まれ得る。オルニチンのようなカチオン性アミノ酸もまた、デンドリマーに組み込まれ得る。
【0037】
(D.検体特異的リガンド)
特異的な検出または認識を可能にする、分析用デバイスまたはセンシングデバイスのための第一の要件は、このデバイス表面の、非特異的吸着に対する耐性である。この要件は、上記および実施例1に記載されるコポリマーにより、満たされ得る。第二の要件は、検体の選択性分との特異的相互作用を可能にする、官能基(リガンドと呼ばれる)の導入である。このようなリガンドは、PEGグラフトポリイオン性ポリマーに導入され得る。優先的に、このようなリガンドは、PEG鎖の自由端において導入される。リガンドの型は、分析または感知の作業の必要性に従って、選択される。例は、以下である:
引き続く分析検出または感知検出のための認識ユニットとしての分子の物理化学吸着を誘導するリガンド。認識ユニットの例は、感知工程の間に分析されるべき複合体分子(標的分子と呼ばれる)(例えば、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、DNAまたはRNA(フラグメント))を特異的に結合する、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である。認識ユニットとセンシングデバイス表面との相互作用は、静電力および/またはファンデルワールス力を介する。リガンドの例は、疎水性部分(例えば、メチル基またはトリフルオロメチル基)、正に荷電した基(例えば、アミン(9未満のpHで正電荷を有する)、4級アミン(全pH範囲にわたって正に荷電する))、または負に荷電したリガンド(例えば、カルボキシレート(4より高いpHで負に荷電する))である。
【0038】
認識ユニットの官能基に共有結合し得るリガンド。例は、エステル、マレイミド、スクシニミジル、ビニルスルホン、共役C=C二重結合、エポキシ、アルデヒド、ケトン、シランまたはシロキサン官能基である。これらのリガンドは、認識ユニットの官能基と、特に、アクセス可能なアミン基、ヒドロキシ基またはチオール基と、反応し得る。
【0039】
細胞の表面のレセプターに結合し得るリガンド。直前の段落のアプローチにおいて、認識ユニットは、反応により、リガンドに直接結合し得る。例は、システイン含有ペプチドと、ビニルスルホンリガンドとの反応である。次いで、システイン残基のチオールとビニルスルホンリガンドとの間の特異的な反応は、このペプチドの、基板または次いで基板に吸着されるポリマーへの固定化を生じる。このカップリングは、自由溶液中で静止しているポリマーを用いてなされ得、従って、リガンドは限定的にペプチドになるか、またはシステイン反応性リガンドを有するポリマーが基盤に吸着された後になされ得る。両方のアプローチが、利点を有する。第一の、基板への吸着の前にポリマーにペプチドリガンドを結合させる場合において、材料は、より容易に特徴付けられ得る。後者の、ポリマーを基板上に吸着させた後にペプチドリガンドを結合される場合において、結合していないペプチドの分離は、非常に容易であり、すすぎのプロセスまでに減少される。細胞の表面のレセプターに結合するペプチドリガンドの場合が、例えば、細胞挙動の分析、または培養系もしくは移植の際の細胞挙動の治療的操作において特に興味深くあり得る。
【0040】
生物活性認識部分に特異的に結合し得るリガンド。このような認識ユニットの例としては、一般には抗体、抗原、タンパク質、酵素、オリゴヌクレオチド、c−DNAフラグメントおよび他の基または分子(但し、引き続く分析または感知のアッセイにおいて検体と特異的に相互作用し得るもの)が挙げられる。これらの表面結合認識ユニットは、特定の検体分子の特異的な認識および結合のために使用され得る、さらなる特異的相互作用部位を有さなければならない。例は、ポリカチオン性PLL−g−PEGの使用であり、ここで、PEG鎖の機能は、PEG鎖の末端位においてビオチンで官能基化されている。官能基化されたPLL−g−PEG−ビオチンは、分析用デバイスまたはセンシングデバイスの表面に吸着され、続いてビオチン部位にストレプトアビジンが吸着される。このようなセンシング表面は、分析または感知アッセイの間に、ビオチニル化標的分子に特異的に認識および結合し得る。あるいは、吸着されたビオチニル化PEGグラフト化ポリイオン性コポリマーは、ストレプトアビジン結合体化した検体と、直接反応し得る。詳細を、実施例2に与える。
【0041】
中間反応性二官能性分子(架橋剤と呼ばれる)と相互作用し得るリガンド。第一に、同種または(優先的には)異種官能性架橋剤の一端が、コポリマーのリガンドに結合される。第二工程において、この架橋剤の他方の(自由)端が、認識ユニットと反応する。
【0042】
カチオンとともに安定な錯体を形成し得るリガンド。第二工程において、カチオンが、適切な官能基を直接介して認識ユニットと、あるいは二官能性架橋剤のいずれかと、複合体を形成する(後者の場合には、手順4に続く)。リガンドの例としては、カルボキシレート、アミド、ホスフェート、ホスホネート、ニトリロ三酢酸、およびカチオンをキレートし得る他の公知の基が挙げられる。カチオンの例としては、Mg(II)、Ti(IV)、Co(III)、Co(VI)、Cu(II)、Zn(II)、Zr(IV)、Hf(IV)、V(V)、Nb(V)、Ta(V)、Cr(III)、Cr(VI)、Mo(VI)およびキレートするリガンドと安定な錯体を形成することが公知である他のカチオンが挙げられる。
【0043】
適切な認識ユニットの例としては、一般には抗体、タンパク質、酵素、レクチン、オリゴヌクレオチド、c−DNAフラグメントおよび他の基または分子(但し、引き続く分析または感知のアッセイにおいて、これらは検体と特異的に相互作用し得るもの)が挙げられる。細胞性応答の生物学的分析における、多くの興味深いリガンドは、ペプチドである。これらの場合において、ペプチドは、多機能ポリマー(例えば、非特異的吸着に抵抗するために使用されるポリマー鎖の末端)に、このポリマーが基板に吸着される前か後のいずれかに、結合され得る。ペプチドは、ペプチドに組み込まれたシステイン残基との反応を含む、多数の手段により、多機能ポリマーに結合し得る。システイン残基は、細胞接着に直接関与するのみである。それ自体で、システイン残基を含む細胞接着ペプチドは少なく、従って、ペプチドの結合の目的で組み込まれるシステイン残基は、結合のための独自のシステイン残基である。他のアプローチが可能であるが、好ましい方法は、ポリマー上のシステイン残基を介してペプチドを多機能ポリマーに結合させることである。他の生物活性特性もまた、組み込まれ得る。例えば、接着タンパク質、増殖因子タンパク質、サイトカインタンパク質、ケモカインタンパク質などである。官能基化表面は、細胞機能のいくつかのアフェクター(affecter)が測定される特性である、細胞を含む生物分析系において使用され得る。試験流体は、細胞の応答が探求される検体を含み得る。この細胞性応答は、検体の存在または活性の尺度として、使用され得る。あるいは、この細胞性応答自体が、探求される知識であり得る(例えば、細胞が特定の接着基板上に移動する場合には、増殖因子に対する特定の細胞型の移動応答)。このような科学的情報のコレクションは、特により高次の細胞性応答(例えば、接着、移動、および細胞間相互作用)が標的化される場合には、薬物候補の活性のスクリーニングにおいて重要な価値を有する。
【0044】
官能性表面は、細胞が後の治療的使用のために培養される、細胞を含む治療システムにおいて使用され得る。現在の治療システムにおいて、培養された細胞が、時々使用される。例は、膝における関節軟骨欠損への移植のための軟骨細胞の培養において、または脈管移植片への移植のための内皮細胞の培養においてである。これらの場合において、細胞の表現型のモジュレーションおよび操作が、最も重要な興味である。例えば、細胞をある表現型(例えば、増殖性の表現型)に刺激し、そして後に、これらを第二の表現型(例えば、分化した表現型)に刺激することが、時々興味深くあり得る。あるいは、これらを1つの特定の表現型に維持すること(例えば、軟骨細胞を軟骨細胞表現型に維持すること)が、これらの細胞を線維芽細胞により類似した細胞に分化させるよりむしろ、所望であり得る。表面および基板は、これにおいて有用であり得る。細胞外マトリックス相互作用が、細胞表現型を調節する際に重要な役割を果たすことは公知であり、そしてこのような相互作用は、本発明の多機能ポリマーの使用により容易に改変され得る。官能性表面は、細胞が関与する治療システムにおいて使用され得、ここで、細胞は、表面に接触させて培養および使用される。この状況の例として、バイオリアクターが、いくつかの体外治療システムにおいて使用される。例えば、培養された肝細胞が、急性肝不全の患者の血液を無毒化するために、使用される。このような場合において、反応器内の肝細胞を、機能的な、分化した状態に維持することが、望まれる。細胞とそれらの基質との間の接着相互作用は、これらの相互作用において重要な役割を果たすと考えられ、従って本発明の技術は、これらの応答を制御する手段を提供する。
【0045】
官能性表面は、官能性表面が移植物の成分である、細胞を含む治療システムにおいて使用され得る。移植物環境内の細胞と移植物の表面との間の相互作用は、移植物の生体適合性を決定する際に制御する役割を果たし得る。例えば、冠状動脈内に移植されるステントの表面では、血小板の存在は所望でなく、そしてステント内再狭窄をもたらし得る。そういうものとして、ステント表面への血小板の付着を防止することが、所望される。しかし、全ての細胞の付着が必ずしも悪いわけではない。例えば、内皮細胞は、再狭窄を予防する際に、非常にポジティブな役割を果たすと考えられる。そういうものとして、ステント基質を、タンパク質の非特異的な接着を防止し、かつ内皮細胞に結合し得るが血小板には結合し得ない接着リガンドを提供する、機能的コーティングで処理することが、所望される。ペプチドREDVは、フィブロネクチンの選択的スプライスされたドメインに基づいて、この配列が血小板に存在するレセプターには結合せず内皮細胞に存在するレセプターには結合することが報告された点で、1つのこのような可能な標的を提供する(J.Biol.Chem 1992、267 p.14019−26)。
【0046】
(D.表面および基板(「チップ」))
想定される用途に適切な分析デバイスまたはセンシングデバイスの基板および表面のタイプは、用途のタイプ、使用される分析技術またはセンシング技術のタイプ、ならびにポリイオン性コポリマーの結合に対する適合性の両方に依存する。
【0047】
分析またはセンシング作業の領域において使用される全てのタイプの基板または基板表面は、標的分子または検体の検出のための任意の技術と組み合わされ得る。
【0048】
金属、金属酸化物および/またはポリマー材料を含む、適切な基板または表面はまた、検体結合の検出についてのセクションと共に以下で議論される。他の基板または表面は、組織および細胞培養基板、ならびに免疫アッセイのための手段(これは典型的に、ポリスチレンまたはポリカーボネートの様なポリマーから形成される)を含む。他の支持体または基板は、金属(例えば、ステンレス鋼)、ナイロン、分解性および非分解性の生体適合性ポリマー(例えば、ポリ(乳酸−co−グリコリド))から形成される医用デバイスまたはプロテーゼを含む。例には、骨移植片およびプロテーゼ、血管移植片、ピン、ねじ、ならびにリベットが挙げられる。ステントに最も一般的な基板材料は金属である。歯科学および整形外科において使用される多くのこのような移植片において、金属移植片が使用される。他の場合において、ポリマー移植片がより有用であり得る。基板の表面電荷のみに基づいて、多官能性ポリマーはポリマー基板または無機基板のいずれかに吸着することが可能である。
【0049】
他の分析アッセイ台における使用のための基板および表面官能化はまた、技術の重要な用途である。生物分析アッセイにおける最も大きな領域の一つは、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)または結合免疫吸着アッセイ(LISA)の用途である。これらの用途において、結合エレメントまたは認識エレメントは典型的に、マルチウェルプレートに結合され、次いで認識エレメントを含まない表面領域を占めるタンパク質ベースの分子でブロックされる。この誘導体化表面は、次いで、検体を含む溶液に暴露される。次いで、この表面は、任意の従来の分光法または他の方法によりアッセイされ得る分子でタグ化された第2認識エレメントに暴露される。上記の記載は、典型的な「サンドイッチ」型アッセイについてであり、そしてこの基本様式は、様々な標準方法において改変され得る。例えば、抗原は、表面に直接結合され得、そしてこの抗原に対する免疫応答から、生物学的流体または組織中に存在する抗体のレベルをアッセイするために使用される。これは、ヒト疾患または病気を検出するため、またはさらに薬物または移植片の生体適合性の検出のための一般的な技術であり、ここで抗体産生の程度は、薬物レベルまたは用量の関数として測定される。
【0050】
アッセイに伴う重要な問題の一つは、非特異的結合を防ぐブロッキング工程である。この工程は、時間がかかりかつ不定であり、そして偽陽性を生成し得る。抗原または抗体により占領されていない部位をブロックするための従来の方法には、タンパク質(例えば、ウシ血清アルブミン(BSA))を用いるブロッキングが挙げられる。
【0051】
分析用の基板および基板表面の官能化、および重要な用途における細胞相互作用の制御(これは治療学における培地ベースのアッセイにおける用途を有する)は、細胞および組織培養、ならびに生物反応器に基づき、そして移植片に依存する。官能性表面は、細胞を含む生物分析システムにおいて使用され得、ここで細胞応答が測定された特徴である。細胞生物学の分野において、基板に対する細胞の応答は、重要な問題であり、そしてこの応答の分析は、重要な生物分析の課題である。例えば、細胞外マトリクス成分に対する細胞の応答は、細胞接着および移動において重要な問題であり、そして癌転移および創傷治癒のような問題において重要である。このように、生物分析表面および基板をこれらの重要な構成要素として含む、生物分析システムは、このような応答の測定において有用である。有用な基板はポリマー性または無機性である。ポリスチレンをアニオン性にするように改変された、改変ポリスチレンが、一般的な細胞培養基板である。例えば、基板単独では、細胞挙動の生物分析における制限された有用性を有する。これは、自発的に吸着するかまたは精製溶液から吸着されるタンパク質を介する細胞接着を支持する。これらのタンパク質は、細胞活性による再構築に供される。非特異的吸着に抵抗する能力、生体特異的吸着リガンドを提示する能力、および長時間の培養の間に安定に吸着されたままである能力のような有用性において、性質が、十分に規定された培養基板を提供する技術は、実に有用である。
【0052】
(II.非相互作用的ポリマーおよび検体特異的リガンドでグラフト化されたポリイオン性コポリマーの合成)
A.グラフトコポリマーの合成
PEGは、以下のように、ポリ(L−リジン)のリジン残基のα−アミンに結合され得る。ポリ(L−リジン)(PLL)は、一端が保護されたPEG(すなわち保護されたモノメトキシPEG)と反応し得る。この末端ヒドロキシルは、カルボニルジイミダゾール(CDI)を用いてすでに活性化されている。PLLおよび活性化PEGは、pH9に緩衝化された水溶液中で混合され得、そして室温で48時間反応される。1つのPLL鎖あたりのグラフト化されたPEG鎖の数は、添加されたPLL1モルあたりの添加された活性化PEGのモル比を調節することにより制御され得る。この反応は、完全に進行し得ない。すなわち、反応混合物中のPEG対PLLのモル比は、PEG−g−PLL生成物中の比と同一になり得ないが、PEG対PLLの比が高くなるにつれて、PEG−g−PLL生成物中のPEGの量が多くなる。
【0053】
カチオン性ドメインは、より高い反応性である傾向があり、そしてPEGをPLLに添加する程度を制御するための試みがなされなければならない。水の非存在下での反応の実行により、PETの不活性化が減少し、そしてより良い化学量論制御が可能となる。例えば、保護されていないポリ−L−リジンを、水に溶解し、次いでジメチルホルムアミド(DMF)に添加して、5%水溶液である溶液を作製し得る。ポリ−L−リジンを、次いで、化学量論量のCDIモノ活性化PEGを反応させ、その後、減圧下で溶媒をエバポレートして、PEG/PLLコポリマーを得る。あるいは、保護されていないポリ−L−リジンを水に溶解し、NaOHを添加することにより沈殿させ得る。この沈殿したポリマーを、次いで、無水DMFに添加し、次いで、化学量論量のCDIモノ活性化PEGと反応させて、(A)x−b−(B)yコポリマーを得る。この反応が水の非存在下で行われる場合、活性化基を含む副反応は減少され得(すなわち、不活性化が減少される)、そして長い反応時間において、ポリマー生成物中のPLL対PEGのモル比は、反応混合物中のモル比により近づく。
【0054】
PLLの溶液重合は、PEGからPLLへの置換の程度を越える厳密な制御を可能にする、異なるε保護基を含むモノマーを使用して実施され得る。様々なアミノ酸のN−カルボキシ無水物は、以下の実施例のように合成されて、コポリマーに重合され得る。N,N’−ジカルボベンゾキシ−L−リジン(Z,Z−リジン)は、五塩化リンと反応して、α,N−カルボベンゾキシ−α,N−カルボキシ−L−リジン無水物を生成し得る。α,N−カルボベンゾキシ−α,N−tert−ブチルオキシカルボニル−L−リジン(Z,boc−リジン)は、ナトリウムメトキシドと反応して、Z,boc−リジンのナトリウム塩を生成し得る。このZ,boc−リジンのナトリウム塩は、五塩化リンと反応して、α,N−tert−ブチルオキシカルボニル−α,N−カルボキシ−L−リジン無水物を生成し得る。Z,Z−リジン無水物は、Z,boc−リジン無水物に添加され得、そして2つのモノマーは、開始剤としてナトリウムメトキシドを添加することにより重合され得る。得られるポリマーは、ポリ(α,boc−リジン)−co−(α,Z−リジン)である。boc基は、トリフルオロ酢酸にこのポリマーを15分間かけて添加することにより除去され得る。
【0055】
塩形態は、ピリジンのような反応物との反応により遊離塩基に変換され得る。ポリマー上の遊離アミンは、次いで、DMF中でCDI PEGと反応し得る。Z基は、次いで、酢酸中のHBrにポリマーを15分間かけて添加することにより脱保護され得、(PEG)x−b−(PLL)yコポリマーを生成し、ここで、最終生成物中のPEG対PLLの比は、boc保護リジンの最初の比により制御され得る。
【0056】
ブラシ構造を有さない様々なポリマーを生成することが所望され得る。このことは、反応性基のみがアミンまたはカルボキシル末端となるように、PLLのεアミンを脱保護しないことにより容易にされ得る。例えば、DMF中における、CDI活性化PEGとポリα,N−カルボベンゾキシ−L−リジンとの反応により(A)x−(B)yコポリマーが生じる。TSUによる(A)x−(B)yコポリマーのカルボキシル末端の活性化、続くDMF中のモノアミノPEGとの反応により、(A)x−(B)y−(A)zコポリマーが生じる。
【0057】
(B.官能性グラフトコポリマーの合成)
PEGグラフト化ポリイオン性コポリマーの合成(このために、PEG側鎖の全てまたは一部が、末端または末端位付近で特定の基で官能化され得る)は、上記と同じ手順に従う。しかし、一端が保護されたPEG(例えば、メトキシ終結PEG)を使用すること以外は、官能性PEGが使用される。官能性PEGのみが使用されるか、または(好ましくは)、官能性PEGおよび非官能性PEGの混合物が使用される。PEG鎖の末端における官能基は、分析アッセイの必要性およびコンセプトに従って選択される。官能性PEG対非官能性PEGの比は、分析アッセイまたはセンサーアッセイの要件に再び依存する。これは、所定のタイプの用途について最適化されるべきである。この比の最適化の例は、実施例2に示される。
【0058】
特定の合成の詳細は、PEG−ビオチン−ストレプトアビジンビオチン化型のアッセイにおいて使用されるビオチン化PEG/PLLの場合について、実施例2に記載される。しかし、代替の関連のアプローチが、実施例3に記載される。
【0059】
PEG以外の荷電していない親水性側鎖は、それらが、処理表面に対して非相互作用または吸着抵抗性の特性を与えない限り、使用され得る。
【0060】
(III.グラフトコポリマーでの表面改変のための方法)
(A.チップ表面または基板を改変するための方法)
蛍光検出を用いるかまたは用いない光学的波導管技術を使用する、生体親和性感知に使用することが意図されるチップ表面の改変のための6種の代表的な一般プロトコールが、記載される。
【0061】
(プロトコールA:)
1)導波管層として酸化金属層が堆積されたガラス側面を含む、チップ表面の前処理:a)有機溶媒中での超音波洗浄;b)酸素雰囲気下での表面のプラズマ処理。
2)水溶液を含まないカチオン性PLL−g−(PEG)X(PEG−ビオチン)1-Xの単層の自発的吸着。1−xは、PEG鎖の総数と比較して官能化したPEG鎖の官能性を示す。
3)リンス。
4)アクセス可能な表面ビオチンリガンドに特異的に結合する、ストレプトアビジン水溶液でのチップ表面の曝露。
5)弱く(非特異的に)結合したストレプトアビジンを除去するための表面のリンス。
6)表面免疫化ストレプトアビジン部位へのビオチン結合標的分子を含む検体溶液の特異的吸着。
7)弱い結合の(非特的に吸着した)分子を除去するための表面のリンス。
8)光学的導波管技術を使用する特異的結合標的分子の検出。これは、例えば、結合する条件が一致するまで、結合試薬を変えることで達成される。次いで、電気的および磁気的モード(TEおよびTM)の測定を介した有効指数の決定により、(特異的に)吸着したビオチン結合標的分子の質量を定量的に決定することを可能にする。8)の変わりに、ビオチン結合認識分子(抗体)は、ストレプトアビジン官能化チップ表面に吸着される。この標的分子は、チップ表面で特異的に免疫化され、次いで、追跡分子(標的分子に対して蛍光的に標識した抗体)との反応により免疫化される。次いで、導波管の表面で発生するエバネッセント場を使用して、追跡分子の蛍光を励起する。この蛍光は、液体フローセルと反対側に位置する蛍光検出器を使用して検出され、これにより、実際に唯一、表面に結合した標識化分子が、「バルクな」蛍光から最小の寄与で蛍光励起される表面に結合する利点を組み合わせて、蛍光技術の非常に高い検出感度の使用に役立つ。
【0062】
(プロトコールB)
1)導波管層として酸化金属層が堆積されたガラス側面を含む、チップ表面の前処理:a)有機溶媒中での超音波洗浄;b)酸素雰囲気下での表面のプラズマ処理。
2)水溶液を含まないカチオン性PLL−g−(PEG)X(PEG−ビニルスルホン)1-Xの単層の自発的吸着。1−xは、PEG鎖の総数と比較して官能化したPEG鎖の官能性を示す。
3)求核性添加物を介して、ビニルスルホニル官能基に付加するチオール基を含む、単鎖c−DNAフラグメントの結合。
4)弱い結合の(非特的に吸着した)c−DNAを除去するための表面のリンス。
5)c−DNA認識リガンドに蛍光タグを用いて予め標識した相補的DNA鎖(標的分子)の特異的吸着。
6)弱い結合の(非特的に吸着した)分子を除去するための表面のリンス。導波管のエバネッセント場で励起された蛍光の強度の検出に基づく、特異的に結合したDNAフラグメントの検出。
【0063】
(プロトコールC)
1)有機溶媒を使用する金コーティングチップの洗浄。
2)チオール基と金基板との相互作用により、処理した自己構築単層(SAM)を形成するためのアルコール溶液を含まないω−アミノ−末端アルカンチオールの自己構築。このSAMは、末端アミノ基が部分的にプロトン化された結果として、pHが9未満(例えば、中性のpH)で水性環境で接触させた場合、正の電荷を獲得する。
3)正に荷電したAu−SAM上のポリアニオン性(負電荷)ポロマーポリ(グルタミン酸)−g−(PEG)X(PEG−スクシンイミド)1-Xの自発的吸着。
4)ポリマー吸着チップの表面でアクセス可能なスクシンイミド基と抗原の1級アミン基との反応。
5)弱い結合の(非特的に吸着した)抗原を除去するための表面のリンス。Surface Plasmon Resonance(SPR)技術によりインサイチュでモニターされる検体溶液中での表面結合抗原と対応する抗体との特異的反応。
【0064】
(プロトコールD)
1)導波管層として酸化金属層が堆積されたガラス側面を含む、チップ表面の前処理:a)有機溶媒中での超音波洗浄;b)酸素雰囲気下での表面のプラズマ処理。
2)スタンプ表面にミクロンサイズのパターンを有するポリマースタンプを使用した、PLL−g−PEGの水性溶液での導波管チップ表面のマイクロ流体パターン化。この処理により、(マイクロ流体チャネルネットワークに沿って)PLL−g−PEGで処理した領域および(スタンプにより表面を保護した場合)処理されなかった領域からなる、パターン(例えば、直線パターン)化した表面を提供する。
3)カチオン性PLL−g−(PEG)X(PEG−ビニルスルホン)1-Xの水性溶液中でのパターン化導波管チップ表面の処理。この工程は、工程2)の未コーティング領域を、官能化PLL−g−(PEG)X(PEG−ビニルスルホン)1-Xで満たし、非官能化および官能化PLL−g−PEGを有するパターンを生じさせる。
4)リンス
5)インクジェット技術、プリンティングまたは流体パターン化のような局在化認識分子の堆積を可能にする技術を使用した、吸着官能化PPL−g−PEGを有する異なる領域の異なる認識分子の吸着または結合。
6)リンス。
複数の蛍光標識化検体を含む溶液の適用、ならびに光学的導波管のエバネッセント場によって励起された蛍光の2次元分解検出によって、空間的に分離した異なる認識部位での異なる検体分子の特異的結合の2次元分解平行検出。
【0065】
(プロトコールE)
1)導波管層として酸化金属層が堆積されたガラス側面を含む、チップ表面の前処理:a)有機溶媒中での超音波洗浄;b)酸素雰囲気下での表面のプラズマ処理。
2)水溶液を含まないPLL−g−(PEG)X(PEG−R’−OPO3)1-Xの単層の自発的吸着。1−xは、PEG鎖の総数と比較した官能化したPEG鎖の官能性を示す。R’は、改変したPEG−g−PLLの合成の場合に、PEG鎖の末端位置でホスフェート基を結合するために使用される架橋基である。
3)リンス。
4)硝酸ジルコニウム(IV)のような可溶性ジルコニウムZr(IV)塩の水性溶媒を用いたチップ表面の曝露。ジルコニウム(IV)カチオンは、改変PEG−g−PLLポリマーの表面アクセス可能なリン酸基に結合する。
5)リン酸配位ジルコニウム(IV)カチオンでなく、弱い結合を除去するための表面のリンス。
6)リン酸またはホスホン酸結合抗体分子のジルコニウム(IV)部位への特異的な吸着。この抗体のリン酸またはホスホン酸基は、錯体の形成を介して免疫化したジルコニウム(IV)カチオンに配位結合する。
7)弱い結合の(非特的に吸着した)分子を除去するための表面のリンス。
8)異なるタンパク質の未知の混合物を含む溶液への官能化チップの曝露。導波管のエバネッセント場で励起される蛍光の強度を検出する際に、チップ表面で表面アクセス可能な免疫化抗体と特異的に相互作用するタンパク質分子の検出。
【0066】
(プロトコールF)
1)神経細胞ベースセンサとしての使用のために適切な電子回路が作製される適切な基板(例えば、シリコン)を含む、チップ表面の前処理。
2)センサ表面の電子ネットワークに適合性である、スタンプ表面にミクロンサイズのパターンを有するポリマースタンプを使用した、PLL−g−PEGの水性溶液でのチップ表面のマイクロ流体パターン化。この処理により、(マイクロ流体チャネルネットワークに沿って)PLL−g−PEGで処理した領域および(スタンプにより表面を保護した場合に)処理された領域からなる表面を提供する。
3)カチオン性PLL−g−(PEG)X(PEG−ペプチド)1-Xの水性溶液中でのパターン化導波管チップ表面の処理。この工程は、工程2)の未コーティング領域を、官能化PLL−g−(PEG)X(PEG−ビニルスルホン)1-Xで満たし、非官能化および官能化PLL−g−PEGを有するパターンを生じさせる。このオリゴペプチドは、例えば、YIGSR(これは、神経細胞の結合および移動を誘導するタンパク質ラミニンにおいて特異的配列であることが公知でる)である。
4)神経細胞を含む細胞培養溶液へのパターン化した表面の曝露。タンパク質接着領域および細胞接着領域での神経細胞の結合および拡散。
【0067】
潜在的な毒性を試験するために、神経細胞または未知の成分に対して毒性である、気体成分または液体成分のような環境的に適切な化合物を(結合した神経細胞の電気的なシグナルをモニターすることを介して)感知するための、リビング細胞ベースセンシングの使用。
【0068】
(B.非チップ基板の調製および使用のための一般的プロトコール)
この基板は、種々の方法で改変され得る。非改変および改変コポリマーは、純粋形態または混合物のいずれかで適切な表面上に吸着され得る。最適な選択は、リガンド分子のタイプおよび濃度、標的レセプター、および基板の特性に依存する。このコポリマーが適用され得る基板の例としては、ELISAまたはLISAプレートのような生体分析学的デバイス、ニトロセルロース、ナイロンまはたPVDG膜のような側方フローアッセイ基板、ポリマー微粒子または無機粒子、電気泳動のためのキャピラリー、光ファイバー、あるいは「ラボチップ(lab on a chip」デバイスが挙げられる。
【0069】
本明細書に記載される物質は、特にこれらの適用に適している。ここで、このポリイオン性コポリマーは、非相互作用特性を有する所望の適用に耐える表面および特異的な相互作用特性の表面の製造後の改変を容易にかつ効果的にさせる。多官能性ポリマーの吸着ドメインは、ポリマーの吸着前に基板と反対の電荷を有し、安定でかつ強力な吸着に導くべきである。非特異的吸着に耐えるコポリマーのドメインの考慮から、上記のドメインと同じである。非イオン性水溶性ポリマー(例えば、ポリ(エチレングリコール))は、特に好ましい。これらの鎖の末端に、反応基または直接的な結合基のいずれかが、配置され得、結合デバイス表面を提供する。あるいは、生物学的な認識エレメントは使用され得ず、非特異的結合に耐えるが、生物特異的結合を促進しない表面に導く。あるいはこの表面は、反応部分および遊離表面領域でパターン化され得、これは、非特異的結合に耐える非生物学的エレメントを有するポリマーあるいは第2プロトコールのポリマーのいずれかで連続して充填され得る、反応性部分を用いて誘導体化されない。
【0070】
表面処理の観点から、2つの基本的な方法が存在する:
1)表面が官能化されるバッチプロセスのタイプ。流体マニホルドにおいて、1種または数種の検体および試薬は、表面に局所的に適用される。生体親和性反応(インキュベーション工程)の完成またはほぼ完成した状態を待った後、表面は、緩衝溶液中で洗浄される。
2)官能化されるべき表面が、ガス状細胞または液状細胞の一部あるいはフロースルーシステムである連続プロセス。表面のコンディショニングは、液体細胞またはフロースルー細胞内の連続または連続的モニタープロセスで実施され、次いで、検体溶液中の特異的標識分子との特異的相互作用および吸着または結合に起因するシグナルのインサイチュでのモニタリングで実施される。後に、オリジナルの表面を再度修復/再生およびコンディショニングして、その直後に次の生体親和性アッセイを行う。これは、複数回繰り返され得る。
【0071】
(B.スクリーニングおよび検出以外の生物工学的デバイスのために使用されることを意図した表面の改変のための一般的プロトコール)
(プロトコールA)
1)得られる原料に固有でない場合に、荷電した表面を作製するための表面の前処理。
2)水溶液を含まないカチオン性PLL−g−(PEG)X(PEG−Y)1-Xの単層の自発的吸着。1−xは、PEG鎖の総数と比較した、反応性分子Yで官能化したPEG鎖の官能性を示す。
3)リンス。
4)表面リガンドに特異的に結合する、反応分子の水溶液での表面の曝露。
5)弱く(非特異的に)結合した反応分子を除去するための表面のリンス。
分析技術のための標準技術に従った引き続く方法論。
【0072】
(プロトコールB)
1)得られる原料に固有でない場合に、荷電した表面を作製するための表面の処理。
2)分子Yを有するリガンド反応基を有する溶液中でのカチオン性PLL−g−(PEG)X(PEG−Y)1-Xの反応。1−xは、PEG鎖の総数と比較した、分子Yで官能化したPEG鎖の官能性を示す。
3)水溶液を含まない誘導体化カチオン性PLL−g−(PEG)X(PEG−リガンド)1-Xの単層の自発的吸着。
4)リンス。
5)分析技術のための標準プロトコールに従った引き続く方法論。
【0073】
(プロトコールC)
1)得られる原料に固有でない場合に、荷電した表面を作製するための表面の処理。
2)水溶液を含まない誘導体化カチオン性PLL−g−(PEG)の単層の自発的吸着。
3)リンス
4)分析技術のための標準プロトコールに従った引き続く方法論。
【0074】
(プロトコールD)
1)目的の反応性部分で表面の処理。
2)リンス。
3)水溶液を含まない誘導体化または非誘導体化カチオン性PLL−g−(PEG)の単層の自発的吸着(プロトコールA、BまたはCによる)。
4)リンス
5)分析技術のための標準プロトコールに従った引き続く方法論。
【0075】
これらの材料および技術の種々の適用の例を示す。
【0076】
例えば、生理学的なpHで負に荷電された、マイクロウエルプレートとして使用されるポリスチレンが、提供され得る。この材料は、一般的に、アッセイのための広範のタンパク質溶液の吸着を支持する。負に荷電した表面を有するマイクロウエルプレートは、市販されている。
【0077】
この負に荷電した96マイクロウエルプレートは、PLL−g−(PEG)x(PEG−VS)1-X(VSは、ビニルスルホン官能性を示す)に曝露され、そしてプロトコールAでのようにIgGまたはIgGフラグメントに結合される。従ってマイクロウエルにおいて示されるIgGの量は、量xにより容易に制御され得る(x=0は、大量の曝露されたIgGに導き、そしてこの量x=1は、全く曝露されてないリガンドに導く)。次いで、溶液中に含まれる抗原の量は、従来のELISAモデルにより分析され得る。例えば、標準的な「サンドイッチ」アッセイのための引き続く工程は、以下である:抗原溶液へのIgG誘導体化マイクロウエルプレートの2時間から一晩の間のインキュベーション、PBSまたは他の緩衝溶液での3回のリンス、西洋わさびペルオキシダーゼ標識IgGでのインキュベーション、さらに、非特異的結合されたHRP標識IgGを除去するための緩衝溶液でのリンス、次いで吸着沈殿物を産生するペルオキシダーゼによる結合抗原の検出。
【0078】
IgGの量はまた、IgGの化学量論的な制限量を添加することによって容易に変えられ得、次いで所望される場合、システインまたはβメルカプトエタノールに曝露することにより他の反応基を不動態化する。
【0079】
IgGの量はまた、このようなシステインまたはβメルカプトエタノールのような別の反応物と同時にリガンドを添加することによって、容易に変化され得る。
IgGと反応するVS基の官能性は、2種の試薬のモル比と2種の試薬の相対的反応性によって決定される。
【0080】
2種以上の生体認識エレメントが、平行してまたは連続してのいずれかでVS部位に添加され得る。
【0081】
重要なことは、コーティングのPEG成分は、予め適用された阻害剤として作用し、マイクロウエルプレートまたは他の分析学的タイプの方法に一般的に必要とされる引き続く阻害工程の必要性を排除することである。このことは、長い時間でアッセイするために必要とされる時間を減少させ、そしてウシ血清アルブミンのような従来の阻害剤を使用してしばしば観測される、不完全な阻害または可変阻害から生じるアッセイ効率の不確定性を減少させ得る点で、重要である。
【0082】
生体認識エレメントをマイクロウエルプレート表面に直接的に吸着させること、次いで引き続いて誘導体化または非誘導体化PLL−g−PEGで遊離表面領域をコートすること、プロトコールAまたはBまたはCを続いて実施することがまた、可能である。あるいは、生体認識エレメントが結合形態で活性でない場合、このエレメントは、誘導体化PLL−g−PEGの反応性リガンドとの反応を可能にするペプチドまたは他の標識で誘導体化され得る。例えば、タグを含むチオールは、(PEG)x(PEG−VS)1-Xのビニルスルホニル基で反応する。抗原または抗体の結合部位をを制御する能力は、より高い表面活性を提供し得る。
【0083】
別の例において、ナイロン6,6を一般的に形成する側方フローアッセイ基板は、グラフトコポリマーで改変される。他の生体分析学的アッセイでのように、膜表面への非特異的吸着を制限することは、非常に興味深い。側方フローアッセイの1つの使用は、抗原への曝露に対する応答を生じる生物学的溶液中で、抗体濃度を検出するための使用である。pH3〜10で安定である負に荷電した表面を有するナイロン6,6は、市販されている。次いで、この表面を、検出領域でPLL−g−(PEG)x(PEG−VS)1-Xへ曝露し、そしてリンスする。次いで、残りの材料を、反応基を有さないPLL−g−PEGに適切に曝露し、検出領域の外部領域への吸着および検出領域内の任意のコーティングされてない領域への吸着を阻害する。次いで、検出領域でのPLL−g−(PEG)x(PEG−VS)1-Xは、プロトコールAでのように、抗原に結合される。抗原への抗体に対するアッセイは、溶液を流すことによって実施され、抗体が結合抗原へ結合する結果として生じる基板を介して分析される。次いで、結合抗体/抗原複合体の量は、標識抗IgGへの複合体の曝露によって決定され、そして分光学的に定量される。
【0084】
あるいは、側方フローアッセイ表面は、プロトコールBでのような予め誘導体化されたPLL−g−PEGでコーティングされるか、複数の抗原または抗体で誘導体化され得る。存在する抗原または抗体の量は、結合反応およびその後の検出を最適化するために変えられ得る。
【0085】
(C.細胞ベースシステムでの使用のための基板の調製および使用についての一般的プロトコール)
分析学的または治療学的表面および基板は、以下に記載されるように複数の方法によりおよび複数の目的のために形成され得る。多官能コポリマーの選択の一般的な見込みから、同じ原理を、上記のようなクリップベースデバイスに適用した。多官能性ポリマーの吸着ドメインは、ポリマーの吸着の前に基板に反対の電荷を持たせ、安定的な吸着および強力な吸着に導くべきである。非特異的吸着に耐えるコポリマーのドメインについての考慮から、上記のドメインと同じである。非イオン性水溶性ポリマー(例えば、ポリ(エチレングリコール))は、特に好ましい。これらの鎖の末端に、反応基(以下のプロトコールAでのような)または直接的な結合基(以下のプロトコールDでのような)のいずれかが、配置され得、細胞表面への結合を提供する。あるいは、生体認識エレメントは使用され得ず、非特異的結合に耐えるが、生物特異的結合(以下のプロトコールCでのような)を促進しない表面に導く。
【0086】
(プロトコールA)
生体分析学的材料または生体医療学的材料上の多官能性ポリマーの吸着は、以下のように達成され得る。
1)負電荷の表面が示される(例えば、基板ポリマー層の操作pHでの負の表面電荷または金属基板上の酸化金属コーティングの表面電荷)条件下での洗浄する工程を含むポリマーまたは金属表面の前処理。このような洗浄は、リンスにより、洗剤での洗浄、ついで洗剤を除去するためのリンスにより、または金属のような安定な物質を反応プラズマ中で洗浄することにより達成され得る。いくつかのポリマーは、本質的に表面電荷を導入するために血漿処理により同様に前処理され得る。例えば、いわゆる組織培養ポリエステルは、空気または酸素プラズマ中でポリスチレンを処理することによってしばしば生成され、これにより、基板を洗浄し、かつ中性pHで負に荷電された表面に改変を導入する。例えばステンレス鋼、チタンおよびタンタルのような、ほとんどの金属表面は、金属酸化物上層の特性に起因して、中性pHで負に荷電される。このプロトコールの確認につて、この基板が負に荷電したことを確認した。
2)水溶液を含まないカチオン性PLL−g−(PEG)X(PEG−VS)1-Xの単層の自発的吸着。1−xは、PEG鎖の総数と比較して相対的に官能化したPEG鎖の官能性を示す。VSは、ビニルスルホン官能基を示し、これは、中性または塩基性pHでチオールと反応する。複数の他の反応基(例えば、マレイミド、アクリレートおよびキニーネ)が使用され得る。唯一の条件は、これらの基が、吸着pHでアミン(例えば、リジン上)で高い反応性でないことである。しかし、この骨格上での正に荷電した部位が非反応基で置換される場合、アミン反応基が使用され得、PLLでなくポリ(アルギニン)の使用によって得られ得る。
3)リンス。
4)中性または塩基性pH(例えば、pH7.5〜9)の水溶液中のシステイン残基を含むペプチドへの物質表面の曝露。この反応速度は、溶液のpHに依存し、中性pHよりも塩基性pHでより速くなる。
5)リンス。
【0087】
(プロトコールB)
正に荷電した基板上の多官能性ポリマー(例えば、アミノコーティングまたはアミノ改変ポリマーあるいはアルミニウム上の酸化アルミニウム)の吸着は、上述にように正確に得られ得る。ただし、ポリグルタミン酸またはポリアスパラギン酸あるいはPLL用のポリアクリル酸のようなアニオン性ポリマーを代用する。
【0088】
(プロトコールC)
特定の認識エレメントを欠く多官能性ポリマーの吸着は、非特異的相互作用を単に阻害すること、および特異的相互作用を促進しないことが所望される場合に、使用される。このことは、x=1の場合にポリマーを使用して、プロトコールAまたはBにおいて得られるように正確に達成され得る。
【0089】
(プロトコールD)
生物学的認識エレメントは、下記にような基板への吸着の前に、多官能性ポリマーに結合され得る。
【0090】
生体分析学的材料または生体医療学的材料上での多官能性ポリマーの吸着は、以下のように達成され得る。
1)負電荷の表面が示される(例えば、基板ポリマー層の操作pHでの負の表面電荷または金属基板上の酸化金属コーティングの表面電荷)条件下での洗浄する工程を含むポリマーまたは金属表面の前処理。このような洗浄は、リンスにより、洗剤での洗浄、ついで洗剤を除去するためのリンスにより、または金属のような安定な物質を反応プラズマ中で洗浄することにより達成され得る。いくつかのポリマーは、本質的に表面電荷を導入するためにプラズマ処理により同様に前処理され得る。例えば、いわゆる組織培養ポリエステルは、空気または酸素プラズマ中でポリスチレンを処理することによってしばしば生成され、これにより、基板を洗浄し、かつ中性pHで負に荷電された表面に改変を導入する。例えばステンレス鋼、チタンおよびタンタルのような、ほとんどの金属表面は、金属酸化物上層の特性に起因して、中性pHで負に荷電される。このプロトコールの確認のために、この基板が負に荷電したことを確認した。
2)水溶液を含まないカチオン性PLL−g−(PEG)X(PEG−RE)1-Xの単層の自発的吸着。1−Xは、PEG鎖の総数と比較して相対的に官能化したPEG鎖の官能性を示す。REは、ペプチドまたはタンパク質またはサッカリドまたはポリサッカリドのような認識エレメント官能性を示す。
3)リンス。
【0091】
例えば、これらの技術は、代表的にポリスチレンを形成する細胞培養基板で有用である。このポリスチレンは、改変表面でありまたはあり得、生理学的pHで負に荷電させる。一般に、この材料は、細胞培養媒体からの広範のタンパク質の吸着を支持し、この媒体には、血清含有媒体由来のフィブロネクチンおよびビトロネクチンが挙げられる(細胞およびその基板との間の生体特異的相互作用の研究を阻害する状態)。
【0092】
組織培養ポリスチレンは、PLL−g−(PEG)X(PEG−RE)1-Xに曝露され、そしてプロトコールAでのように吸着ペプチドGCGRGDSPKに結合される。従って、培養基板上に示されるペプチドの量は、量xにより容易に制御され得る(x=0は、大量の曝露されたペプチドに導き、そしてこの量x=1は、全く曝露されてないペプチドに導く)。生体分析学的基板上での細胞の挙動(例えば、接着、伝播、増殖、移動、または高次の官能性指示薬(例えば、成長因子、サイトカインおよびケモカイン、マトリクスタンパク質の発現など)が、測定され得る。
【0093】
グラフトペプチドの量はまた、ペプチドGCGRGDSPKの化学量論的に制限された量を添加することによって、次いで、所望であれば、システインまたはβメルカプトエタノールへの曝露によって他の反応基を不動態化することによって容易に変えられ得る。
【0094】
グラフトペプチドの量は、別の反応物(例えば、システインまたはβメルカプトエタノール)と同時に、ペプチドGCGRGDSPKを添加することにより容易に変えられ得る。ペプチド生体認識エレメントと反応するVS基の官能性は、2種の試薬のモル比および2種の試薬の相対的反応性により決定される。
【0095】
2種以上の生体認識エレメントが、平行してまたは連続してのいずれかでVS部位に添加され得る。
【0096】
非ペプチド生体認識エレメントがまた、VS基(例えば、チオール含有糖またはポリサッカリド)に添加され得る。タンパク質は、VS基に、例えば、1以上の遊離システイン残基を含むタンパク質に曝露することによって容易に加えられ得る。
【0097】
別の実施形態において、治療学的バイオリアクター中の細胞フェノタイプは、細胞培養基板へのグラフトコポリマーの適用によって操作され得る。治療的薬剤としての細胞の使用が、広範に調査されている。1例としては、肝不全を有する患者の肝臓指示デバイスのような体外バイオリアクターにおける肝細胞の使用である。このようなアプローチの問題は、この例および他の例の両方において、不要な細胞の部分集合の過成長を阻害する工程ならびに細胞の適切なフェノタイプを維持する工程を包含する。このことは、以下のように最小化され得る。
【0098】
アニオン性マイクロキャリアビーズは、PLL−g−(PEG)x(PEG−VS)1-Xへの曝露により、次いでプロトコールAでのようにチオール含有ガラクトース部分での移植により処理される。肝細胞は、アシアロ糖タンパク質レセプターを介してガラクトースに結合し、このレセプターは、ほとんどの他の細胞(バイオリアクターにおける治療学的な使用に意図される幹細胞の治療学的調製物に存在し得る線維芽細胞)に存在しない。アシアロ糖タンパク質レセプターに結合するガラクトースを介した基板への肝細胞の接着が、例えば、コラーゲンへの接着よりもより効果的に幹細胞フェノタイプを維持し得る。
【0099】
肝細胞は、マイクロキャリア上に幡種され、そして通常のようにスピナーフラスコ中での接着を可能にする。次いで、マイクロキャリアは、バイオリアクター(例えば、中空繊維バイオリアクターのシェル空間内)に配置され、ヒトの血漿は、血漿からトキシンを除去するために血液細胞分離器を介して、患者から灌流される。
【0100】
さらに別の例において、ステンレス鋼から作製される肝状動脈ステントは、非特異的タンパク質吸着、次いでこの表面への血液血漿接着を阻害するために、プロトコールCでのようにPLL−g−PEGに曝露される。このステントは、展開キャリア上に取り付ける前、または後のいずれかにコーティングされ得、そして最終のリンス手順の後に乾燥され得るか、またはされ得ない。従って、製造の容易性または操作性のいずれかでコーティングされ得る。この処理したステントは、通常、冠状動脈疾患の処置において冠状動脈内に展開される。
【0101】
ステンレス鋼から製造される冠状動脈ステントは、PLL−g−(PEG)x(PEG−VS)1-Xに次いでプロトコールAでのように内皮細胞特異的ペプチドGCGREDVGに曝露される。この処理したステントは、通常のように冠状動脈中に展開される。この場合において、PEG成分は、血漿タンパク質(線維芽細胞を含む)の吸着、ならびにステント中の対応する血栓症およびそれにより生じ得る再狭窄を減少させるために役に立つ。生物学的認識エレメントGDGREDVGは、ステント上での展開および内皮細胞移動後に、ステント表面により天然の生物学的被覆を提供するための、内皮細胞の結合および過成長を促進するのに役に立つ。
【0102】
このステントはまた、既に生物学的認識エレメントで移植された、多官能性ポリマーで処理され得る。ステンレス鋼から製造される、冠状動脈ステントは、プロトコールYYDでのようにPLL−g−(PEG)X(PEG−GCGREDVG)1-Xにx=0.75で曝露される。
【0103】
(IV.検体結合の検出および/または定量のための手段)
好ましい技術は、光学的波導管技術の使用である。ここで、エバネッセント場は、官能化PEG−グラフトポリイオン性コポリマーの吸着層での認識ユニットと特異的に相互作用する検体を感知し得る。この技術の利点は、この表面に近い検体分子(すなわち、この表面に吸着または結合した分子)のみを感知し、そして溶液の大部分において検体分子を分析しないという事実である。第2の利点は、この技術の高い感度であり、代表的には、有効な屈折率の変化に基づくセンサ(例えば、格子状銅センサ)のための吸着検体の1ng/cm2のオーダーである。この検出感度は、蛍光標識化標的分子が使用されそしてエバネッセント場によって励起される蛍光シグナルが使用される場合、さらに増強され得る。結果として、光学的に透明な導波管層を有する光学的導波管を備える、基板、チップまたはデバイスが好ましい。この文脈中で「光学的処理」とは、疑問の検体分子に対して、少なくとも適切な励起光源、そして必要に応じて、この励起により発生する蛍光またはより一般的な発光(代表的には、可視光または近赤外光)の波長における透明性を意味する。
【0104】
光学的導波管は、自己支持単層または複層システムとして設計され得る。クラッディングを有さない、ガラスプレートあるいはガラスまたは透明ポリマー繊維は、自己支持単層システムの例である。しかし、感度を増強する目的のために、第1の光学的に透明な第1層(a)よりも低い屈折率を有する支持第2層(b)に堆積された層(a)を含む、光学的に薄いフィルム導波管を備える、基板、クリップまたはデバイスが好ましい。基板、チップまたはデバイスが、特にそれ自体で部分的に透明または非透明あるいは蛍光である、支持物質(第2層(b))の場合、層(a)より低い屈折率および5nm〜10000nm、好ましくは10nm〜1000nmの厚さを有する別の光学的に透明な層(b’)(層(a)に隣接する層(a)と(b)との間に配置される)を含む場合が、好ましい。
【0105】
しかし、一般に、蛍光検出ありまたはなしの光学的導波管を使用すると、基板(層(b))は、光学的に透過性(例えば、ガラスまたは透過性ポリマー)であることが好ましく、これらを使用しなければならない。透過性基板に堆積される適切な導波管層は、高屈折指数透過性材料である。例としては、チタン、シリコン、タンタル、ニオブ、ハフニウム、ジルコニウム、またはこれらの混合物の酸化物が挙げられる。さらなる可能性は、ポリイオン性ポリマー骨格を結合させることに特に適したさらなる薄いコーティングを用いて導波管層をコーティングすることである。このさらなるコーティングが透過性であり、かつ導波管プロセスのオプティクスに有害な影響を及ぼさないほど十分に薄くなければならないことのみが必要条件である。他の例は、窒化金属、オキシニトリド、カーバイドまたはホウ化物である。
【0106】
このような無機層は、一般に、物理蒸着または化学蒸着によりまたは湿潤科学技術(例えば、ゾル−ゲル技術)により適切な基板(例えば、ガラスまたはポリマー)上に堆積される。基板、チップまたはデバイスとしては、光学的に透過性な層(a)へ励起光をインカップリングするための1つ以上の光学的カップリング要素が挙げられる。これらの光学的カップリング要素は、プリズムカップラー、オーバーラッピングエバネッセント場と連結した光学的導波管を備えるエバネッセントカップラー、導波管層(a)に隣接して配置された焦点レンズ(好ましくは、円筒形レンズ)を備える端面(end face)カップラー、および格子カップラーの群から選択され得る。好ましい格子カップラーは、任意のプロフィールの浮き彫り格子(relief coupler)(例えば、矩形、三角形または正弦プロフィール)および光学的に透過性の層(a)における屈折指数の周期的変調を有する位相格子または体積格子の群から選択される回折格子である。生成およびその再現性の容易性のために、矩形プロフィールを有する屈折浮き彫り格子が最も好ましい光学的カップリング要素である。
【0107】
金属酸化物の大部分(および他の金属化合物)は、中性pHでまたは中性pH付近で正電荷または負電荷を有する。特に、酸化チタン、酸化タンタルおよび酸化ニオブは、7未満の等電点(IEP)を有し、中性pHの水性環境と接触させると負電荷を自発的に獲得し、従って、ポリカチオン性ポリマーとの組合わせで使用するために適切である。別の可能性は、例えば、カルボキシレート、スルホネートまたはホスフェートのような官能基の導入によって、あるいはアミンのような官能基の導入によって導波管表面に正電荷または負電荷を人工的に負荷することである。このような前処理に適切な公知の種々の技術が存在する。例としては、アミノ末端化シラン(例えば、アミノプロピルトリエトキシシラン(APTES)または水性環境との接触の際に正電荷または負電荷を有する他のシラン)でのシラン化(silanization)が挙げられる。
【0108】
さらなる検知技術は、表面プラスモン共鳴(SPR)技術であり、この技術は、金属薄膜において生成されたエバネッセント場を使用する。金属薄膜が不動態化酸化物フィルムを自発的に形成するか、または人工的に酸化され得る場合、水性媒体と接触して正電荷または負電荷を有する酸化物薄膜は、適切な電荷のポリイオン性ポリマーを直接結合するために再び使用され得る。SPRにおいてしばしば使用される不活性金属表面(例えば、金)は、一般に酸化物フィルムに変換されないので、この表面は、正電荷または負電荷を生成するために、化学的技術または電気化学的技術により最初に処理されなければならない。好ましい前処理技術は、金および銀表面に規則正しい単層を形成することが周知のアルカリチオールの自己アセンブル単層の使用である。ω位で官能基を有する二官能性チオール(これは、水性環境と接触すると正電荷または負電荷を獲得する)を使用する場合、このような前処理された金属表面は、自発的に形成された電荷を有する酸化金属表面について上記で議論されたのと同じまたは類似の方法でポリイオン性コポリマーと組合わせて再び使用され得る。例としては、末端アミノ、四級アンモニウム、カルボキシレートまたはホスフェート基を有するチオールが挙げられる。
【0109】
使用される基板および表面の型とは独立して、表面の洗浄はこの技術の重要な局面である。制御された表面の清潔さは、正に荷電したデバイス表面または負に荷電したデバイス表面へのポリイオン性コポリマーの吸着または結合の最適な程度を確実にするために必要である。上記で議論された金属酸化物の場合には、いくつかの洗浄手順が試験され、そして分析領域およびセンシング領域におけるポリイオン性コポリマーの意図した使用のために最適化されている。これらは、有機溶媒洗浄、酸処理、UV/オゾン処理、グロー放電、プラズマ洗浄および組合わせが挙げられる(実施例1および2を参照のこと)。プラズマ洗浄は、酸素、水蒸気、窒素またはアルゴン気体中、減圧下で行われ得る。酸化物表面の洗浄は、天然炭化水素濃度を減少し、かつ酸化物表面で利用可能な水酸基の数を増やすために重要である。水酸基は、水性環境と接触させる際に電荷の形成に必須であることが公知である。水蒸気中でのプラズマ処理は、表面での水酸基の数を増加させることが目的である場合には好ましい。
【0110】
別の励起および検出方法は、一般に公知であり、そして励起源(エバネッセント場励起を介しない)との直接相互作用による蛍光励起、化学発光、吸着および放射性同位体標識が挙げられる。全ての分光法的場合において、使用される波長は、吸収分子または放射分子(emitting molecular)ならびに基板に依存し、そして例えば、赤外線付近から可視領域のスペクトルの範囲であり得る。吸着および蛍光は、ラテラルフローアッセイ(lateral flow assay)、光ファイバーベースのアッセイまたはマルチウェルプレートベースのアッセイのようなアッセイにおいて一般に使用され得る。ここで、透過モードまたは反射モードのいずれかが使用される。細胞アッセイにおいて、技術としては、蛍光ベース顕微鏡および二光子(two photon)技術が挙げられる。
【0111】
(V.パターン化した表面の製作)
二次元パターン化した表面は、現在の分析およびセンサーデバイス(例えば、今日、または将来にはDNA、RNAまたはタンパク質マイクロアレイおよびイムノアッセイ技術において使用されるバイオチップ)の重要な局面である。この技術は、局所的スケールでの特定の表面官能性および認識部位固定化を介して、複雑な組成の1つの検体中の多くの異なる標的分子の並行検出を可能にする。3つの基本的先行必要条件は、幾何的にパターン化された表面を再現可能に製作することを可能にする表面技術、局所化したスケールで認識ユニットを固定化する技術、および個々のアッセイの局所的スケールと適合した検出技術である。
【0112】
PEGグラフト化したポリイオン性コポリマーは、ミリメーターからミクロンスケールでパターン化した表面を製作するために適している。好ましい方法は、確立されたミクロ液体(microfluid)パターン化技術を使用することである。代表的な適用は、3次元構造表面(例えば、一方向または二方向における多くのチャネル)を有するポリマースタンプを包含する。このスタンプは、分析チップ表面またはセンサチップ表面との近い接触を生じて、スタンプとチップ表面との間にチャネルのアレイを形成する。非官能性PEGグラフト化ポリカチオン性コポリマー溶液は、毛細管現象またはポンプを用いた強制流(forced flow)のいずれかによりスタンプ/チップ液体チャネルネットワークに導入される。チャネルに沿ってチップ表面上に本発明に従うポリイオン性コポリマーAを吸着させた後、このチャネルは、純水でリンスされ、そしてスタンプおよびチップが分離される。次の工程において、表面全体が浸漬されて、別のポリイオン性コポリマーB(例えば、官能性ポリイオン性コポリマー)を結合し得る。生成物は、ラインA/B/A/Bなどのアレイを有する表面である。このようなアレイのラインは、mmスケールからミクロンまたはサブミクロン範囲の幅を有し得る。あるいは、液体パターン化は、異なるスタンプパターンまたは同じパターンであるが、異なる角度(例えば、第1のパターンに適切な角度で)で1回を超えて適用されて、矩形または角形(square)アレイを形成し得る。その後の工程において、反応性官能基を有するラインBは、適切な認識分子(例えば、タンパク質または単鎖DNAもしくはRNAフラグメントに対する抗体)と反応され得る。これは、精密インクジェット技術、スタンピング、または異なるパターンもしくは異なって配向されたパターンを用いて再びミクロ液体パターン化により行われ得る。
【0113】
ポリイオン性コポリマーを用いて特定のパターンの形成を可能にする別の技術は、ミクロコンタクトプリンティング(micro contact printing)(μcP)である。三次元構造表面を有するポリマースタンプは、ポリイオン性コポリマーで含浸され、そして平坦なチップ表面にスタンピングプロセスで転写される。
【0114】
第3の別の技術は、例えば、リトグラフ技術により製作されたパターン化センサチップ表面で開始することである。このパターンは、正に荷電した表面および負に荷電した表面の領域を有する。例は、多量の酸化アルミニウム中で酸化ニオブから作られた角形の島を有する表面である。この表面が中性pHまたは中性pH付近で本発明に従うポリアニオン性コポリマーの水溶液との接触を生じる場合、正に荷電した酸化アルミニウム表面(および負に荷電した酸化ニオブのパターンではない)のみが、負に荷電したポリマーによりコーティングされる。反対の状況は、ポリカチオン性コポリマーに適用される。
【0115】
第4の技術は、ポリマーが鉛筆または毛細管のような用具を用いたスポッティング技術を介して局所的に適用される機械的パターン化である。
【0116】
これらの技術は、大量の非改変ポリマー中の改変ポリマーまたは官能性ポリマーにより形成されるパターン:島の両方の型を作製するために使用され得、その逆も同様であり得る。また、局所的に吸着したポリマーは、表面の空の空間を埋めるために、他の型の分子と組合わされ得る。
【0117】
(VI.適用)
本明細書中に記載される材料は、分析または検知目的で、基板またはデバイス(一般的意味において「チップ」とよばれる)の領域での種々の適用を有する。特にそれらは、分析またはセンサ適用において使用することが意図されるチップの表面処理に適切である。ここでこの目的は、生物学的または医学的に関連した分子(例えば、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、DNAまたはRNAのフラグメント)の特異的検出、あるいは一般的に任意の型の抗原−抗体または鍵と鍵穴型のアッセイである。特に、検体が種々の分子またはイオン性種を含む場合、および目的が多くの成分から1つの分子もしくはイオンを特異的に検出すること、または多くの成分からいくつかの分子もしくはイオンを特異的に検出することのいずれかである場合、本発明は、チップ表面に必要な特性を生成するための適切な基礎を提供する:1)非特異的吸着に逆らう能力、および2)特定の濃度の認識実体(分析操作または検知操作の間に検体中の標的分子またはイオンと特異的に相互作用する)を制御された方法で導入する能力。適切な分析またはセンサ検出方法と組合わせた場合、本発明は、任意の型の分析アッセイまたは検知アッセイにおいて(特に、生体親和性型のアッセイにおいて)高特異性かつ高検出感度の両方を有するチップを生成する可能性を提供する。
【0118】
本明細書中に記載の材料は、チップベースの適用ではない基板またはデバイスの領域で種々の適用をさらに有する。特に、生物学的または医学的に関連する分子(例えば、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、DNAまたはRNAのフラグメント)の特異的検出、あるいは一般的に任意の型の抗原−抗体または鍵と鍵穴型のアッセイが目的である分析適用または検知適用における使用について。特に検体が種々の分子またはイオン性種を含む場合、および目的が多くの成分から1つの分子もしくはイオンを特異的に検出すること、または多くの成分からいくつかの分子もしくはイオンを特異的に検出することのいずれかである場合、本明細書中に記載される材料および方法は、チップ表面に必要な特性を生成するための適切な基礎を提供する:1)非特異的吸着に逆らう能力、および2)特定の濃度の認識実体(分析操作または検知操作の間に検体中の標的分子またはイオンと特異的に相互作用する)を制御された方法で導入する能力。適切な分析またはセンサ検出方法と組合わせた場合、本発明は、任意の型の分析アッセイまたは検知アッセイにおいて(特に、生体親和性型のアッセイにおいて)高特異性かつ高検出感度の両方を有するアッセイ表面を生成する可能性を提供する。
【0119】
インビトロまたはインビボに拘わらず、細胞と相互作用する基材および表面において、細胞とその基材との間の相互作用が、その挙動を制御する際に重要な役割を果たす。他の生体分析系におけるように、非特異的相互作用の防止および特異的リガンドの提示という2つの論点は、関連している。この場合、重要な非特異的吸着は、生物学的液体中に存在する接着促進タンパク質およびポリサッカリドならびに他の生体ポリマー材料である。例えば、血漿または血清中に存在する接着タンパク質の数は非常に多く、そしてそのために、生体特異的相互作用の非存在下で生体特異的応答を得ることは困難である。多官能性ポリマーは、生物学的液体中のこれらの成分の非特異的吸着を抑制するために使用され得る。さらに非特異的リガンドまたはリガンド群は、多官能性ポリマーに、好ましくは、非特異的相互作用を防止する鎖の末端にまたはその末端付近に組み込まれ得る。このようなリガンドは、細胞表面レセプターのより限定されたセットに対して、他の方法で自発的かつ非特異的吸着成分で達成されるよりも結合し得る。このことは、生体分析細胞培養系において、体外治療系およびインプラントデバイスにおいて有用であり得る。
【0120】
この方法は、定性的、定量的または半定量的な分析または検知アッセイの任意の型に対してチップに適用され得る。チップと組合わされる特に適切な検出技術としては、以下が挙げられる:
1)光学的導波管技術(ここで、エバネッセント場を使用して、チップ表面に吸着した標的分子と相互作用させ、かつその標的分子の量を検出する)。この技術は、光学カップリング要素、好ましくは、回折格子またはホログラフィー構造を介した導波管層に、白色光または単色光をインカップリングすることに依存する。この光は、総内部反射により導波管層内に伝わる。代表的には、50〜200nmによる導波管の面から延びるエバネッセント波は、表面に近い分子(例えば、吸着したか、そうでなければ固定化した分子)と相互作用する。格子カップラーセンサの構成において、代表的には、電子モードおよび磁気モードに対するインカップリング角度α(TE)および/またはα(TM)が測定され、この角度は、いわゆる有効屈折指数の得られた変化に起因して、インカップリング格子上の/インカップリング格子からの分子吸着または脱着の際に変化する。有効屈折指数N(TE)、N(TM)は、インカップリング条件に基づいて、観察されたカップリング角度について計算される。N(TE)、N(TM)が計算され、そして導波管層(nF、dF)、基板(nS)、被覆媒体(covering medium)(nC)の光学的パラメーターが公知であると仮定すると、屈折指数(nA)および追加層の厚さ(dA)が計算され得る。吸着層における屈折指数が、吸着した材料の濃度に線形的に依存するモデルを使用すると、吸着した材料の面積当たりの質量が計算され得る。
【0121】
2)蛍光の強度を測定することにより、蛍光標識した標的分子が定量的に分析される蛍光分光法または蛍光顕微鏡。
【0122】
3)1)および2)の組合わせ。ここでエバネッセント光学場を使用して、改変されたチップ表面上に吸着した標的またはトレーサー分子の蛍光タグを励起する。蛍光は、液体フローセルと反対の側に設置した蛍光検出器を用いて検出され得る。この技術は、実際に、表面に結合した標識分子のみが、蛍光励起される(バルク蛍光からの寄与が最小である)という利点と組合わせた蛍光技術の非常に高い検出感度を考慮すると特に適切である。エバネッセント場で励起した蛍光検出に基づくこの分析技術とチップの表面処理との組合わせにより、最大の分析感度および選択性を有する検出をわずか数百の分子のレベルに下げることが可能である。
【0123】
従って、好ましい検出技術は、液体サンプルにおける1つ以上の検体の標的分子の特異的検出である。ここで検体特異的捕捉分子または認識分子は、光学的導波管を含むチップのポリイオン性コポリマー処理表面で固定化される。蛍光標識検体または検体アナログまたはトレーサー分子は、この表面での接触を生じ、励起光が導波管層(a)に発射され、そして蛍光標識からの、そして光学的導波管のエバネッセント場において生成された蛍光が検出される。スペクトル的に選択性の光学構成要素(例えば、光学的放射経路における干渉フィルターまたはバンドパスフィルター(例えば、ロングパスフィルター)またはそれらの組合わせ)は感度を改善し、そしてバックグラウンドの光または散乱した励起光の識別を回旋するために役立つ。
【0124】
4)金属薄膜共鳴条件(すなわち、金属薄膜における表面プラスモンの励起(escitation)に対する共鳴入射角)において表面プラスモンの相互作用が、有効屈折指数の得られた変化に起因して、金属フィルムへの/金属フィルムからの分子吸着または脱着の際に変化する表面プラスモン共鳴技術(SPR)。
【0125】
5)特定の特徴的波長での吸着を用いて、改変表面に吸着または結合した標的分子の量を定量する紫外線または可視光(UV/VIS)分光法。
【0126】
6)赤外領域における原子または分子振動の励起を用いて、表面改変チップに予め吸着または結合させた標的分子を検出および定量するフーリエ変換赤外分光法(FTIR)のような赤外技術。表面または境界感受性形態のIR分光法(例えば、減衰全反射法(ATR−FTIR)または赤外線反射吸着分光法(IRAS))は、特に適した技術である。
【0127】
7)改変チップ表面に吸着または結合した分子における特異的振動レベルを検出するラマン分光法(RS)。表面または境界感受性型のRSは、特に適しており、例えば、表面増強ラマン分光法(SERS)が挙げられる。
【0128】
8)例えば、特定の標的分子もしくはその分子の一部の還元または酸化に対する電流または電荷を所定の電圧差で測定する電気化学的技術。
チップベースのデバイスはまた、標準的蛍光または吸着技術を用いてアッセイされ得る。ここで、励起は、エバネッセント場相互作用とは対称的に、基材表面を反射しない(reflect off)光による。
【0129】
他の分析デバイス表面または生体分析デバイス表面は、定性的、半定量的または定量的な分析アッセイまたは検知アッセイのために使用され得る。非「チップ」ベースの基板としてはまた、光ファイバー基板が挙げられる。光ファイバーの場合において、「チップ」基板について記載されるような技術は、適用可能である。エバネッセント場励起も支持せず、チップでもない非「チップ」ベースの他の基板については、適切な技術が以下に記載される。
【0130】
1)蛍光の強度を測定することにより、蛍光標識標的分子が定量的に分析される蛍光分光法または蛍光顕微鏡。蛍光は、透過、またはより好ましくは、反射ベースの検出方法のいずれかにために配置された標準的検出器を用いて検出される。実際に表面に結合した標識分子のみが、蛍光励起される(バルク蛍光からの寄与が最小である)という利点と組合わせた、高放出および高励起断面を有する発蛍光団に対する蛍光技術の非常に高い検出感度を鑑みると、この技術は特に適切である。感度は、従来の方法によりさらに改善され得る。この方法としては、例えば、励起源から検出器への散乱を排除するためのフィルターの使用または高感度検出器(例えば、冷却電荷結合デバイス(CCD))の使用が挙げられる。
【0131】
2)特定の特徴的波長における吸着を用いて、反射または透過技術により、本発明に従って改変された表面に吸着あるいは結合した標的分子の量を提供する吸着分光法。ラテラルフローアッセイのような単純なアッセイフォーマットについては、アッセイ領域における呈色変化の視覚的観察による検出。吸着は、赤外付近から可視領域のスペクトルまでの波長範囲を包含し得る。このシグナルは、タグ化分子により、または酵素結合イムノソルベントアッセイ(ELISA)の場合には呈色沈澱物を生成する酵素反応を介してのいずれかにより生成され得る。後者の場合、検体の量は、沈澱物の吸着に相関され得る。
【0132】
3)赤外領域における原子または分子振動の励起を用いて、改変チップ表面に予め吸着または結合させた標的分子を検出および定量するフーリエ変換赤外分光法(FTIR)のような赤外技術。表面または境界感受性形態のIR分光法(例えば、赤外線反射吸着分光法(IRAS))は、特に適した技術である。
【0133】
4)例えば、特定の標的分子もしくはその分子の一部の還元または酸化に対する電流または電荷を所定の電圧差で測定する電気化学的技術。
【0134】
分析チップまたはセンサチップは、種々の方法で使用され得る。
【0135】
非改変または改変コポリマーは、純粋な形態でまたは混合物としてのいずれかで適切な表面に吸着され得る。最適な選択は、標的分子の型および濃度、ならびに検出技術の型に依存する。さらに、この技術は、連続的にまたは同時にかのいずれかで、複数の検体が1つのチップ上で測定されるアッセイにおいて使用されるチップの改変に特に適切である。
【0136】
実施例は、タンパク質認識のための多目的のDNAおよびRNAの生体親和性分析「ゲノムチップ(Genomics Chips)」、および抗体−抗原認識のセットに基づく分析ならびに解析「タンパク質チップ(Proteomics Chips)」のためのマイクロアレイである。このような技術は、医用、診断DNA/RNA、またはタンパク質センサーにおける用途のための、またはゲノムまたはタンパク質(proteomics)における拡張したライブラリーを確立する目的のための、特に小型化されたチップ上の複数の成分の分析について有用である。これらのチップを作製するためのこれらの材料の適合性は、ポリイオン性コポリマーが、このチップ表面の、非相互作用的特性を有する領域および特異的相互作用の領域への容易かつ効率的なパターン化のために使用され得るという事実から生じる。技術の上記の多目的のアレイ型が、しばしば微小流体技術および微小流体ネットワークの広範な使用をもたらすため、本明細書中に記載のコポリマーを使用する表面の改変および機能化は、マイクロアレイのアプローチと組合わせるのに特に適切である。この流体ネットワークは、この流体ネットワーク内のチップの局所領域を特異的に処理するために使用され得る。なぜなら、チップ表面を改変する技術が、水溶液からの単純、迅速、費用効率的な自発性吸着プロセスであり、そして従って微小流体分析およびセンシングの概念に完全に適合性であるためである。
【0137】
検出工程の観点から、2つの基本的な代替がある:
1)このチップが機能化されるバッチプロセスの型において。流体マニホルドにおいて、1つまたはいくつかの検体および試薬は、このチップ表面に局所的に塗布される。この生体親和性反応(インキュベーション工程)の完了または完了近くまで待った後、このチップを緩衝液内で洗浄し、そして上記の1つまたは組合わせた方法を使用して分析する。
2)このチップが機能化され、そして気体セルもしくは液体セルの一部、または貫流セルである連続プロセスにおいて。この表面の馴化は、液体セルまたは貫流セル内で、連続にかつ連続的にモニターされるプロセスにおいて、続いて検体溶液における特定の標的の特異的相互作用および吸着または付着によるシグナルをインサイチュでモニターすることで行われ得る。このチップの最初の表面は、後で再び回復/再生され得、そして直後の次の生体親和性アッセイのために馴化され得る。これは、何度も繰り返され得る。
【0138】
関連するが異なる領域において、このようなチップ上の生細胞を規定された様式で付着および組織化することが目的である場合、このチップの表面の処理は、バイオセンサーにおける用途を有する。タンパク質の吸着および細胞の付着は親密に関係するため、これは、規定された方法でチップ上で細胞を組織化する可能性を広げる。これは、チップ表面を、タンパク質および従って細胞に非相互作用的な領域(例えば、吸着された非機能化PEGグラフトポリイオン性コポリマーを有する領域)、ならびにいくつかまたは1つの細胞付着性タンパク質と相互作用し、そして従って細胞付着が生じる領域にパターン化することによってなされ得る。後者は、吸着された非機能化PEGグラフトポリイオン性コポリマーを有さない領域、または吸着された機能化PEGグラフトポリイオン性コポリマーを有する領域であって、それによってこの機能が、例えば細胞膜においてインテグリンレセプターと相互作用する特定のペプチドを介して、細胞(膜)との相互作用を誘導する機能である、領域であり得る。
【0139】
このパターンの特定の領域の検出は、特定の領域に局在化され得るか、または同時に複数の特定領域について行われ得る。一般的に、このパターン化された表面が、ペプチド、タンパク質、抗体または抗原、レセプターまたはそのリガンド、キレーターまたは「ヒスチジンタグ成分」、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、DNAおよびRNAフラグメント、酵素、酵素補因子またはインヒビター、レクチン、炭水化物からなる群の検体の検出のためのマイクロアレイアッセイにおいて使用される場合、重要な局面は、1つ以上の液体サンプルにおける複数の検体の経時的または同時の決定である。1つ以上の液体サンプルは、血液、血清、血漿、リンパ液、尿または組織流体のような体液あるいは卵黄を含み得る。これらはまた、必要に応じて、不透明な液体、表面水、土壌または植物の抽出物、生体またはプロセスの培養液、あるいは生物学的組織からのサンプルを含み得る。
【0140】
要約すると、本明細書中に記載される材料および方法は、多くの適用領域(例えば、薬理学的研究、コンビナトリアル化学、臨床または前臨床の発達におけるスクリーニングアッセイにおける化学的検体、生化学的検体または生物学的検体の定量決定または定性決定のための、親和性スクリーニングまたは研究における動力学的パラメータの即時的結合研究または決定のための、DNAおよびRNAの解析およびタンパク質−DNA相互作用を決定するための単一ヌクレオチド多型のようなゲノムおよびタンパク質の差異の決定のための、mRNA発現およびタンパク質(生)合成に関する調節機構の決定のための、毒物学的研究および発現プロフィール(特にmRNA、タンパク質、ペプチドまたは低分子有機(メッセンジャー)化合物のような生物学的マーカーまたは化学的マーカーの検出のための)の研究のための、薬理学的生成物の研究および開発、ヒトおよび獣医学の診断学、農芸化学的生成物の研究および開発、徴候性および前駆症状性の植物診断学における抗原、病原、または細菌の検出のための、薬学的生成物の開発または治療薬の選別における患者の層別化のための、特に、栄養学および環境性の分析における病原、有害化合物または細菌(特にサルモネラ)、プリオン、ウイルスおよび細菌の検出のための)において使用され得る。
【0141】
本発明は、以下の非限定的な実施例を参照することによって、さらに理解される。
【0142】
(実施例1.モノメトキシPETでグラフトされたPLL,PLL−g−PEG;導波管基板への適用)
以下は、非改変モノメトキシPETでグラフトされたPLL(PLL−g−PEG)の使用を記載し、このために、分析またはセンシングのタスクにおける用途のためのタンパク質耐性を、最適または最適近くまで到達するように、ポリマー構築が最適化される。明確のために、本文書中で議論される種々のポリマーを言及する場合、以下の略語系が使用される:PLL(mol.wt.PLL)−g[グラフト比]−PEG(mol.wt.PEG)は、(mol.wt.PLL)の分子量(kD)、リジン−mer/PEG側鎖のグラフト比、および分子量(mol.wt.PEG)(kD)のPEG側鎖を有するPLL骨格を有するグラフトコポリマーを意味する。
【0143】
(PLL−g−PEGの合成)
表1は、以下の手順に従って異なるポリマーを合成するために使用された質量および溶媒の詳細を示す。mol.wt.20,000または375,000のPLL(Sigma,St.Louis,MO,USA)を、50mMのナトリウムボレート緩衝液(SBB)、pH 8.5に溶解させた。この溶液を滅菌濾過した(0.2μmの細孔サイズのフィルタ)。モノメトキシPEG−ニトロフェニルカーボネート、mol.wt.5000(Shearwater Polymers,Huntsville,AL,USA)またはメトキシポリ(エチレングリコール)プロピオン酸(proprionic acid)mol.wt.2000(SPA−PEG,Shearwater Polymers Europe,Inc.,NL)のヒドロキシスクシンイミジルエステルを、50mMのSBB、pH 8.5の2.5mL中に攪拌しながら素早く溶解させたか、または固体として取得し、そして溶解したPLLに添加したかのいずれかであった。この反応を室温で6時間進行させ、その後、この反応混合物を、最初にリン酸緩衝生理食塩水(PBS;0.2g/L KCl,0.2g/L KH2PO4,8g/L NaCl,1.15g/L 無水Na2HPO4,pH 7.4±0.1,285mOsm/kg H2O±5%)に対して、続いて脱イオン水に対して、24時間透析した(Spectra−Por,mol.wt.カットオフ 12−14,000;Spectrum,Houston.TX,USA)。この生成物混合物を凍結乾燥し、そしてAr下、−20℃で保管した。PLL(375)−g(5.6)−PEG(5)−1H−NMR(D2O):ppm−1.35,1.60,1.68(−CH2−);2.88(−CH2−N−);3.55(PEG);4.20(−N−CHR−COO−)。NMRによって、リジン側鎖のピークの面積をPEGのピークの面積と比較し、櫛状のコポリマーのグラフト比を決定した。
【0144】
樹状コポリマー(Dendron−5)を、以下の手順に従って調製した。分子量20,000のモノメトキシPEG(PEG 20K;Shearwater Polymers,Huntsville.AL.USA)を、ベンゼンからの共沸蒸留で乾燥させた。PEGのヒドロキシル末端を、最初にFmoc−Glyでエステル化した。Fmoc−Gly無水物を、ジメチルホルムアミド(DMF;10mL;無水,Aldrich)およびジクロロメタン(DCM;4mL:無水,Aldrich)中のFmoc−Gly(1.78g;8当量;Novabiochem,San Diego,CA,USA)およびジイソプロピルカルボジイミド(0.469mL;4当量;DIPCDI;Aldrich)の、アルゴン下、室温で30分間攪拌する反応によって生成した。PEG(15g;1当量)を、DCM(30mL)に溶解した。DCM(5mL)中のジメチルアミノピリジン(91.6mg;1当量,Novabiochem)を、溶解したPEGに添加し、そしてこれをFmoc−Gly無水物に添加した。このPEGを含む容器を5mlのDCMで洗浄し、これをこの反応混合物に添加した。この反応を、アルゴン下、室温で6時間攪拌して進行させた。この反応混合物を、吸引下で濾紙を通して濾過し、次いで冷却した急速攪拌したエーテル中で沈殿させ、そして吸引濾過によって集めた。この得られた生成物を、第ゼロ世代樹状コポリマーとする。以下の反応順序を、Dendron5、第5世代樹状コポリマーを得るために5回繰り返した。
【0145】
続いてFmoc保護アミノ酸を、以下のようにしてPEGに付加した。DMF(Perseptive Biosystems,Framingham,MA,USA;4ml/g PEG 20K)中の20%ピペリジンにFmoc保護リジングラフトPEGを溶解させ、45℃で旋回させながら溶解するまで加熱して、結合したリジン残基上のFmoc基を除去し、次いでこの混合物を室温で30分間放置し、続いて冷却した攪拌得テール中で沈殿させ、吸引濾過および真空下で乾燥させ、500mgの各PEG−アミン生成物が残った。Fmoc−アミノ酸(3当量;Fmoc−L−Lys(Fmoc)−OH;Bachem,King of Prussia,PA,USA)およびHOBT(3当量;Novabiochem)をDMF(3ml/g アミノ酸)およびDCM(2ml/g アミノ酸)に溶解させた。DIPCDI(3当量)を添加し、そして15分後にPEG(2ml DCM/g PEG)を添加した(このPEG溶液を含む容器を、5mlのDCMで2回洗浄した)。この反応を、アルゴン下、室温で6時間攪拌して進行させた。次いで、この反応混合物を、攪拌冷却エーテル中で沈殿させ、吸引濾過し、そして真空下で乾燥させた。
【0146】
この樹状生成物を、1%で、DMF中でゲル浸透クロマトグラフィー(GPC)によって分析した(Polymer Laboratories PL−EMD 950気化質量検出器;カラム−Polymer Laboratories 5μm Mixed D 300×7.5およびPolymer Laboratories 5μm 500Å 300×7.5を連続して、Polymer Laboratories,Amherst,MA,USA)。300nmでのUV吸収(Fmoc吸収300=6558L/cm mol)で、ポリマーの質量の測定を可能にする質量検出器からのクロマトグラムの比較によって、カップリングの割合を計算した。Pluronics(登録商標)F−108 NFおよびF−68 NFを、BASF(Mount Olive,NJ,USA)から得た。
【0147】
(センサーチップ)
本研究で使用した全ての導波管は、Microvacuum,Ltd.(Budapest,Hungary)から購入し、そして以下の仕様の導波層で覆った1−mm厚のAF45ガラス基板を備える:導波材料(ゾル−ゲル技術):SixTi1-xO2、ここで、x=0.25±0..5、屈折率(nF)=1.77±0.03、厚さ(dF)=170〜220nm、基板ガラススライド、長さ(L)=12mm、幅(w)=16mm、厚さ(H)=0.55mm、屈折率(nS)=1.53、格子周期性:2400ライン/mm(0.4166μm)。
【0148】
チタンおよび酸化ニオビウムの表面に関する実験について、Leybold直流マグネトロンZ600スパッタリングユニット中で、導波層上に、さらなる14−nm厚の酸化物層をスパッターコーティングした。これら全ての表面を、XPS、AFMおよびToF−SIMSによって特徴付けた。各々の実験の前に、この導波管を以下の手順に従って清掃した:0.1MのHCl中で10分間ソニケーション、超高純度の水での大規模なリンスおよび窒素下での乾燥、続いてHarrick Plasma Cleaner/Sterilizer PDC−32G機器(Ossining,NY,USA)での2分間の酸素血漿清掃。
【0149】
(格子カップラーシステム)
この技術は、高分子吸着の直接オンラインモニタリングを可能にする、He−Neレーザーから平面導波管への励起光のインカップリング(incoupling)に関する。この方法は、この導波管の表面の上部100nmまでの距離で、高感度(すなわち、〜1ng/cm2)である。この技術は、吸着動力学のインサイチュの即時研究を可能にする。面積吸着質量密度データを、Feijterの式に従う形態方程式(mode equation)から誘導される厚さおよび屈折率の値から計算した。タンパク質吸着の計算について、0.182cm3/gのdn/dcの値を使用し、そしてPLL−g−PEG吸着の計算について、Raleigh干渉計で決定した0.202cm3/gの値を使用した。全ての格子カップラー実験を、以前に記載したKalrez(登録商標)(Dupont,USA)貫流セルを使用して、BIOS−I機器(ASI AG,Switzerland)において行った。この貫流セルを、PLL−g−PEG吸着およびタンパク質吸着の両方の研究のために使用した。流速および剪断速度は、それぞれ1mL/時間および0.83s-1であった。吸着された質量の計算を、以下の手順に従って行った:
(吸着実験のプロトコル)
(導波管表面上でのPLL−g−PEGの吸着についてのプロトコル)
サンプルを、1.0MのHCl中で10分間超音波的に清掃し、超高純度の水で大規模にリンスし、そして窒素流中で乾燥させ、続いて以前に記載した酸素−血漿清掃を2分間行った。PLL−g−PEGの改変された表面を、10mMのHEPES(1MのNaOH溶液でpHを7.4に調節した4−(2−ヒドロキシエチル)ピペラジン−1−エタンスルホン酸)中の1mg/mLのPLL−g−PEGの溶液に10分間浸漬コーティングすることによって調製した。この緩衝溶液を、今後はHEPES Z1と呼ぶ。続いて、この改変された導波管を、即座に超純水でリンスし、そして窒素下で乾燥させた。いくつかのサンプルを分析し、そしてPLL−g−PEGの吸着および性能における表面汚染の効果を試験するために、サンプル調製手順において記載したような適切な清掃工程を行わずに使用した。
【0150】
(光学的格子カップラー実験およびサンプル調製についてのプロトコル)
吸着されたPLL−g−PEG層を有するサンプルを、上記のように調製し、そして窒素流中で乾燥させた。このタンパク質および血清の吸着性能を、以下に記載される格子カップラーシステムにおいて引き続いて測定した。
【0151】
インサイチュでPLL−g−PEGで改変されたサンプルを、最初にHEPES Z1に配置し、その直後に清掃手順を行い、そして一晩浸漬した。格子カップラー機器において貫流キュベットを構築する前に、このサンプルを超純水でリンスし、そして窒素下で乾燥させた。これらの前浸漬されたサンプルをHEPES Z1中で平衡化し、そして1時間未満で平坦なベースラインに達した。次いで、このサンプルをインサイチュでPLL−g−PEG溶液(HEPES Z1中の1mg/mL)に曝露した。吸着を、引き続き30分間モニターした。次いで、このポリマー溶液をHEPES Z1に置換し、そしてタンパク質および血清の吸着性能を、後で記載するように測定した。
【0152】
(格子カップラー実験およびサンプル調製についてのプロトコル)
吸着されたPLL−g−PEG層を有するサンプルを、上記のように調製し、そして窒素流中で乾燥させた。このタンパク質および血清の吸着性能を、後に記載される格子カップラーシステムにおいて引き続いて測定した。インサイチュでPLL−g−PEGで改変されたサンプルを、最初にHEPES Z1に配置し、その直後に清掃手順を行い、そして一晩浸漬した。格子カップラー機器において貫流キュベットを構築する前に、このサンプルを超純水でリンスし、そして窒素下で乾燥させた。これらの前浸漬されたサンプルをHEPES Z1中で平衡化し、そして1時間未満で平坦なベースラインに達した。次いで、このサンプルをインサイチュでPLL−g−PEG溶液(HEPES Z1中の1mg/mL)に曝露した。吸着を、引き続き30分間モニターした。次いで、このポリマー溶液をHEPES Z1に置換し、そしてタンパク質および血清の吸着性能を、後で記載するように測定した。
【0153】
Si0.6Ti0.4O2導波管を、pH依存性測定について使用し、そしてこれを直前の手順において記載したように調製した。しかし、この場合、この溶液は、1MのNaOHまたは1MのHClの添加によって、所定のpHまで滴定された10mMのHEPESであった。このポリマー濃度は、同様のpH調節HEPES溶液において0.1mg/mlであった。1時間のポリマー吸着および30分間のpH調節溶液での洗浄の後、この溶液をpH7.4の緩衝液(HEPES Z1)に変え、そしてこの節の後で記載されるようにしてタンパク質吸着性能を測定した。所定のイオン強度の溶液を作製するためにNaClを使用したことを除いて、同様の手順をイオン強度依存性実験について使用した。
【0154】
(タンパク質吸着実験のプロトコル)
導波管を、25℃で1時間ヒト血清(コントロール血清 N,Art.#0737119,US#42384およびヒトγ−グロブリン,Roche(Switzerland))の溶液に曝露し、そして引き続いてHEPES Z1中で30分間洗浄した。ヒト血清アルブミン(HSA)、ヒトフィブリノーゲンおよびヒトフィブロネクチンを、Sigma Chemical Co.(USA)から得;そしてその関連した抗体をDako A/S(Denmark)から得た。単一のタンパク質吸着実験の場合、この導波管を、25℃の温度で1時間、HEPES Z1中の適切なタンパク質の1mg/mLの溶液に曝露し、続いてHEPES Z1中で30分間洗浄した。
【0155】
血清に曝露した後、いくつかの場合において、この導波管を、25℃の温度で30分間、ウサギ抗HSAの0.1mg/mLの溶液および0.28mg/mLのウサギ抗ヒトフィブロネクチンに対して試験し、続いてHEPES Z1中で30分間洗浄した。ヒトフィブリノーゲンの吸着を、フィブリノーゲンの1mg/mL溶液に25℃で1時間暴露し、続いてウサギ抗ヒトフィブリノーゲンの0.1mg/mL溶液に30分間暴露することによって、別々に試験した。
【0156】
(PLL(375)−g[5.6]−PEG(5)吸着およびタンパク質耐性の研究)
以下の全ての測定を、貫流セルにおいて行い、そしてPLL−g−PEGの前処理およびタンパク質吸着試験の両方を、他に記載されない場合、断続的な乾燥段階なく、インサイチュかつ継続的に行った。格子カップラー実験のからの結果(図3を参照のこと)は、PLL−g−PEGポリマーが、pH7.4の緩衝水溶液から、金属酸化物表面に自発的に吸着されたことを示す。図3に示される実施例は、PLL−g−PEGの、3つの異なる金属酸化物表面:チタン、ニオビウム、およびケイ素/チタンへの吸着に関する。この吸着プロセスは急速に起こり、そしてこの表面上への吸着されたポリマーの層の形成を生じる。Si0.6Ti0.4O2表面に代表的には、約125ng/cm2の吸着面積密度の層が形成され、そして最終的に観測された質量の95%に、最初の5分以内で達した。同様の挙動が、研究された他の2つの金属酸化物表面(すなわち、五酸化ニオビウム、二酸化チタン)についても観測された。吸着動力学は非常に類似しているが、表面に吸着されたPLL−g−PEGの得られた量は異なり、そして、図4および表1に示されるように、金属酸化物の特徴的な等電位点に依存する。
【0157】
引き続くタンパク質吸着実験は、金属酸化物の表面のPLL−g−PEG改変が、はっきりと減少したタンパク質吸着を生じることを明らかにした。代表的には、金属酸化物表面の血清への曝露は、洗浄工程の後に150nm/cm2と250nm/cm2との間の面積密度を有する吸着タンパク質の層を生成する。しかし、PLL−g−PEGの自己集合層で前コーティングした導波管は、引き続く血清タンパク質吸着における激しい低下を示す。この実施例は、図5に示される。この実験は、上記の手順に従って調製した、改変された二酸化チタン導波管および非改変二酸化チタン導波管に関する。一般に、調製手順にかかわらず、PLL(375)−g[5.6]−PEG(5)の前処理が、二酸化チタン、ケイ素/二酸化チタンおよび酸化ニオビウムの表面上の血清暴露後の、吸着されたタンパク質の面積密度において減少する大きさの順序を引き起こす(図6を参照のこと)。同様に、ヒト血清アルブミン(1mg/mL,10mM HEPES緩衝溶液,pH 7.4)の吸着は、PLL−g−PEG前処理の後に、大きさが2桁減少した(図6を参照のこと)。研究された全ての表面についいての定量的タンパク質吸着データを、表3に列挙する。
【0158】
血清暴露の後にこの表面上に残っている残余材料を、抗アルブミン、抗フィブロネクチン、および抗γ−グロブリンのようないくつかの一般的な血清タンパク質の抗体に対して試験した。これらの抗体は、格子カップラー技術によって検出したものよりも低い吸着面積密度(すなわち、2ng/cm2未満)を示し、これは、この改変された表面上に、タンパク質がその活性な形態で存在しないことを示唆する。おそらく、タンパク質以外の血清成分が、この改変された表面によってピックアップされる。血清が、フィブリノーゲン消費されるため、フィブリノーゲンはまた、HEPES Z1中の5mg/mLから別々に試験され、続いて抗フィブリノーゲンアッセイされる。PLL(375)−g[5.6]−PEG(5)−改変ケイ素/二酸化チタン表面について、85ng/cm2および150ng/cm2の吸着面積密度が、フィブリノーゲンおよび抗フィブリノーゲンについてそれぞれ観測された。抗体の結果は示さなかった。
【0159】
(吸着したPLL(375)−g[5.6]−PEG(5)層の性能および長期間安定性)
一旦表面上に定着されると、PLL(375)−g[5.6]−PEG(5)の吸着層は図7に示されるように安定であり(すなわち、1週間後で吸着層の質量の<5%の損失)そして流れているHEPES Z1溶液下で37℃で24時間にわたって、タンパク質吸収に対して抵抗性がある。この実験は、二酸化ケイ素/二酸化チタン導波管表面上のPLL(375)−g[5.6]−PEG(5)層の、最初の1時間以内のインサイチュでの堆積を含む。血清への次の2つの曝露は、20ng/cm2未満の表面吸着タンパク質を生じた。18時間後、2つのさらなる血清曝露は、同様に20ng/cm2未満を生じた。PBSをHEPES Z1の代わりに緩衝液として使用した場合にも同様の性能が観察された。
【0160】
乾燥して保存したPLL(375)−g[5.6]−PEG(5)修飾導波管は、3ヶ月を超えた後でもそれらのタンパク質抵抗性特性を保持していることが見出され、そしてHEPES緩衝溶液中で保存した導波管は、1ヶ月を超えた後でもそれらのタンパク質抵抗性を保持していることが見出された。
【0161】
Pluronics(登録商標)(2つのポリエチレンオキシド鎖が隣接したポリプロピレンオキシドから構成されるジブロックコポリマー)は、PEGを疎水性の表面に固定するために通常使用される。しかし、Pluronics(登録商標)F−108およびF−68は、ここで研究されたいかなる金属酸化物表面にも吸着しないことが見出され、そして結果としていかなるタンパク質吸着抑制特性も示さなかった。
【0162】
PLL(375)−g[5.6]−PEG(5)はまた、血清タンパク質の予め吸着された層に吸着することが見出された。血清タンパク質の代表的な吸着(すなわち、約260ng/cm2)の後、PLL(375)−g[5.6]−PEG(5)の1mg/mL溶液への続く曝露は、約90ng/cm2の表面積密度を有するポリマーのさらなる層を生じた。
【0163】
(PLL(375)−g[5.6]−PEG(5)吸着への予備汚染(precontamination)の効果)
大量の炭化水素表面汚染を示す金属酸化物表面は、それでもなお次の血清吸着を抑制したPLL(375)−g[5.6]−PEG(5)の層を吸着した。上記の手順に従う洗浄をしなかった二酸化チタン導波管は、実質的な炭化水素表面汚染を示した。しかし、これらのXPSデータはまた、PLL(375)−g[5.6]−PEG(5)のさらなる層は、実際にこの汚染された表面に吸着しないことを示す。さらに、光学格子カップラー実験は、120ng/cm2の代表的な吸着面積密度を汚染二酸化チタン導波管上に形成し、そしてこのポリマーの吸着層は、次の血清タンパク質吸着を約95%まで抑制することを示した。すなわち、PLL(375)−g[5.6]−PEG(5)の吸着特性および性能特性は、汚染された二酸化チタン表面および洗浄された二酸化チタン表面の両方の場合に同一である。
【0164】
(タンパク質相互作用へのポリマー構造の効果)
ポリマーの代替の構造を、タンパク質吸着性能の抑制のために探索した。これらの構造は、種々のPEG側鎖長、PLL骨格長およびPEGグラフト比を有するブラシ様グラフトコポリマー(表1を参照のこと)を含んだ。基部に接続された単一のPEG側鎖を有する反転した樹木様のデンドリマー状PLLもまた探索した。
【0165】
(次のタンパク質吸着への骨格(PLL)構造の効果)
グラフトコポリマー構造は、次の血清吸着抑制に影響を与えることが見出された。探索されたすべてのポリマーは、図8に示すように、約150ng/cm2の範囲の面積密度での二酸化ケイ素/二酸化チタン表面への吸着を示した。5000のモル質量のPEG側鎖を有する2つの櫛形コポリマーのうち、PLL(375)−g[5.6]−PEG(5)のみが、わずかにより明らかな血清吸着の抑制を示し、観察された吸着を約90%、30ng/cm2まで減少させた。より低いモル質量を有するグラフトコポリマー(PLL(20)−g[6.0]−PEG(5))は、血清曝露からの観察されたタンパク質吸着を、約85%、50ng/cm2まで減少させた。Dendron−5(5世代のリジンデンドリマーで構成される末端を有する20,000モル質量のPEGで構成される)はまた、120〜150ng/cm2の範囲の面積密度で二酸化ケイ素/二酸化チタン表面上に吸着されることが見出された。さらに、この吸着ポリマー層は、血清曝露による次のタンパク質吸着を、約75%、80ng/cm2まで減少させることが見出された。
【0166】
(次のタンパク質吸着に対するコポリマーグラフト比の効果)
グラフト比はまた、次の血清吸着性能に影響を与えることが見出された。ポリマー吸着および次のタンパク質抵抗性挙動に対するグラフト比の効果を探索するために、PLL(20)−g[3.5]−PEG(2)およびPLL(20)−g[5]−PEG(2)を合成した。これら2つのポリマーは、3.5:1および5.0:1(すなわち、リジンモノマー:PEG側鎖)のそれぞれのグラフト比においてのみ異なる。図8に示されるように、PLL(20)−g[3.5]−PEG(2)およびPLL(20)−g[5]−PEG(2)は、それぞれ170ng/cm2および190ng/cm2の吸着質量密度を示した。しかし、PLL(20)−g[3.5]−PEG(2)は、タンパク質吸着のさらに大きな抑制(すなわち、PLL(20)−g[5]−PEG(2)の80%の減少に対して、99%の減少)を示した。実際に、PLL(20)−g[3.5]−PEG(2)は、この研究において探索したポリマーのすべての中で、最も大きな血清からのタンパク質吸着の抑制を示した。この吸着質量の量は、格子カップラー技術の検出限界(すなわち、〜1ng/cm2)とほぼ同じ大きさである(表3を参照のこと)。
【0167】
【表1】
【0168】
【表2】
【0169】
【表3】
(実施例2:ビオチン修飾PEGグラフトPLLの適用)
この実施例は、ビオチン−ストレブトアビジン−ビオチン認識アッセイを用いるビオチンアフィニティーセンサーアッセイのためのチップへの適用のための、ビオチン修飾PEGグラフトPLLの使用を言及する。
【0170】
(官能化ビオチン化コポリマーの合成)
モル質量20,000のPLL(Sigma,CH)を、40mg/mlの濃度で50mM 四ホウ酸ナトリウム緩衝液(pH8.5)に溶解した。この溶液を、濾過滅菌(0.2μm孔径フィルター)した。所望の化学量論比の固体のメトキシポリ(エチレングリコール)プロピオン酸のn−ヒドロキシスクシンイミジルエステル(モル質量2,000)(SPA−PEG、Shearwater Polymers Europe,Inc.,NL)、および−ビオチン、ポリ(エチレングリコール)−カーボネートのn−ヒドロキシスクシンイミジルエステル(モル質量3,400)(NHS−PEG−ビオチン、Shearwater Polymers Europe,Inc.,NL)を、PLL溶液に加えて溶解した。反応を室温で6時間進行させ、その後、反応混合物をリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)に対して24時間、次いで脱イオン水に対して24時間透析(Spectra/Por、MWCO 6−8000、Spectrum、Socochim、CH)した。透析した溶液を48時間凍結乾燥し、−25℃で窒素下で保存した。
【0171】
3.5:1のLys:PEG比を有する4つのPLL−g−PEGポリマーPLL(20)−g[3.5]−{(PEG(2)}x{PEG(3.4)−ビオチン}1-x(実施例1に示されるように、血清からのタンパク質吸着の最も大きな抑制を得、そして異なる量のビオチン(0%(x=1)、10%aおよび10%b)(2つのポリマー)(x=0.9)および50%(x=5))のPEG鎖をビオチン化した)を合成した。PLL−g−PEG−ビオチン10%bの場合、NHS−PEG−ビオチンを最初に加え、そしてSPA−PEGを加える前に1時間反応させた。表4は、使用した材料の量を報告する。
【0172】
(サイズ排除クロマトグラフィー)
ポリマーのサイズ排除クロマトグラフィー分析を、Shodex Ohpakカラム(SB−894HQ(Alltech,Deerfield,IL−USA)を用いて、0.2M 炭酸ナトリウム/炭酸水素ナトリウム緩衝溶液(pH10)で行った。3.5:1のLys:PEGを有する異なるポリマーの分子量は、すべて70kDの範囲内であった。2:1および5:1のLys:PEGを有するPLL−g−PEGの分子量は、それぞれ約100kDおよび55kDであった。
【0173】
(ビオチン化PLL−g−PEGポリマー基板に固定されたストレプトアビジン−西洋わさびペルオキシダーゼ結合体の酵素活性の比較測定および絶対測定)
このアッセイのために、20nmの純粋な二酸化チタン(TiO2)からなる基板をシリコンウェーハ上に物理蒸着によって生成した。AFM(Bioscope,Digital Instruments)を介して決定したTiO2コーティングのRMSあらさは、0.3mm(走査表面:5×5μm2)であった。このウェーハを、1cm2の小片でサンプリングし、これらをアセトン(uvasol,Merck)および2−プロパノール(uvasol,Merck)中で各々5分間超音波洗浄し、窒素下(5.0)で乾燥し、続いて酸素プラズマ(プラズマ洗浄器/滅菌器PDC−32G,Harrick)で3分間洗浄した。
【0174】
(PLL−g−PEG自己集合(self−assembly))
PLL−g−PEG−OCH3、PLL−g−PEG−ビオチン(10%a)、PLL−g−PEG−ビオチン(10%b)およびPLL−g−PEG−ビオチン(50%)を、10mM HEPES緩衝液(pH7.4)中で1mg/mlの濃度で調製し、そして濾過滅菌(0.22μm Durapore Millex,Sigma−CH)した。TiO2上の異なるポリマー(ポリマー型当たり3サンプル)の自己集合を、90分間進めた。次いで、濾過滅菌したHEPES緩衝液(pH7.4)を用いてサンプルを十分にリンスし、窒素下(5.0)で乾燥した。3つの裸のTiO2サンプルをまた、参照として保存した。
【0175】
(ストレプトアビジン−西洋わさびペルオキシダーゼ吸着)
サンプルを6ウェルプレートに分配し、HEPES緩衝液(pH7.4)で1/1000まで希釈した、PBS(pH7.4)中のストレプトアビジン−西洋わさびペルオキシダーゼ結合体の溶液4mlでカバーした。(ストレプトアビジンに対する西洋わさびペルオキシダーゼ(HRP)の分子比は5:1であり;400ng ストレプトアビジン/1200ng 西洋わさびペルオキシダーゼである)。サンプルを室温で60分間インキュベートした。次いでこれらを、新鮮なHEPES緩衝液、続いて酢酸ナトリウム/クエン酸緩衝液(pH6.0)で十分にリンスした。
【0176】
(化学吸着したストレプトアビジン−西洋わさびペルオキシダーゼの酵素活性の定量化)
サンプルを24ウェルプレートの個々のウェルに直ちに移し、酢酸ナトリウム/クエン酸緩衝液(pH6.0、0.004%(v/v)H2O2および1%DMSOを含有、TMBを溶解するために以前使用した)中の3,3’−5,5’−テトラメチルベンジジン(TMB,Merck−CH)の0.42mM溶液1.6ml中で、室温で穏やかに振とうしながらインキュベートした。酢酸ナトリウム/クエン酸中のストレプトアビジン−HRP PBSの一連の希釈度(5k、10k、100k、500k、1M、5M、10M、50M)の溶液をまた調製し、同じ条件下で同時にインキュベートして較正曲線として役立てた。26分後、ペルオキシダーゼの酵素活性下で溶液が目に見えて青色に変わったときに、固体サンプルを溶液から取り出し、100μlの2M H2SO4を加えることによって反応を停止させた。次いで溶液を使い捨てキュベットに移し、450nmで吸収を測定した(JASCO 7800 UV/Vis Spectrophotometer)。
【0177】
(PLL−g−PEG2:1、3.5:1、5:1の非特異的タンパク質吸着;吸着されたポリマーの質量および最適なポリマーの選択)
図8から理解され得るように、PEG鎖間距離DがPEG回転運動の半径より小さいかまたは等しい場合、非特異的タンパク質吸着は効率的に妨げられる。反対に、PEG回転運動の半径よりも大きい鎖間距離は、裸のTiO2表面と同程度のタンパク質吸着レベルを導く。さらに、吸着されたポリマー質量における違いにもまた注目し得、これは2:1PLL−g−PEGと比較して、3.5:1PLL−g−PEGについてより高い。このことはおそらく、2:1ポリマーにおいて利用可能な少ない固定(anchoring)−NH3 +基に関連する。なぜなら、より多数のこれらの側鎖は、PEGで誘導体化されているからである。導波管の表面で吸着されたポリマーの質量は小さいが、PEG鎖の密度は、おそらく鎖重複を導くに十分高く、それ故、防タンパク質(protein repellent)PLL−g−PEG−メトキシ界面を得るために十分である。それでもなお、吸着された低いポリマー質量およびこのポリマーにおけるより少ない固定点(anchoring point)は、界面の安定性に対して有害であり得ることを議論し得る。従って、3.5:1のLys:PEG比を有するPLL−g−PEG−メトキシポリマーは、本発明者らの一連のPLL−g−PEGポリマーにおいて最適であるようである。
【0178】
図9から理解され得るように、異なる表面上のペルオキシダーゼの活性は、以下のような順位である:PLL−g−PEG−メトキシ<<TiO2<PLL−g−PEG−ビオチン50%<PLL−g−PEG−ビオチン10%a<PLL−g−PEG−ビオチン10%b。同時に、格子カップラー結果から、吸着されたストレプトアビジンの質量は、以下のような順序である:PLL−g−PEG−メトキシ(検出限界以下の質量)<PLL−g−PEG−ビオチン10%a(質量<33ng/cm2)<PLL−g−PEG−ビオチン10%b(質量<99ng/cm2)<TiO2(質量<160ng/cm2)<PLL−g−PEG−ビオチン50%(質量<283ng/cm2)。PLL−g−PEG−メトキシ上の非常に低いペルオキシダーゼ活性レベル(バックグラウンドノイズに近い(図4を参照のこと))は、表面上にストレプトアビジンばほとんど吸着されていないことを示す。
【0179】
PLL−g−PEG−ビオチン10%aおよびPLL−g−PEG−ビオチン10%bについて理解され得るように、ビオチン含有量が増加するにつれて、ペルオキシダーゼの活性レベルは著しく増加する。ビオチン含有量におけるさらなる増加(〜50%)は、ペルオキシダーゼ活性の顕著な減少を導くが、吸着されたストレプトアビジンの質量はより大きい。この段階で、表面でのビオチンの高い有量は、おそらくストレプトアビジンの変性を進め、従ってより低い活性を導く。あるいは、非常に高いビオチン密度の結果としての酵素分子の立体障害は、この観察の原因であり得る。最後に、裸の表面は、50%ビオチンの場合と比較してより低いストレプトアビジン吸着、およびより低いペルオキシダーゼ活性もまた示し、非特異的に吸着したストレプトアビジンはまたTiO2チップの表面で変性し、従って酵素の活性を低下させることを意味する。
【0180】
(格子カップラー技術を用いるPLL−g−PEG−ビオチン修飾チップ上のストレプトアビジンの特異的検出)
10mM HEPES(pH7.4)緩衝溶液およびSiO2−TiO2導波管(Microvacuum Ltd,H)をすべての実験のために使用した(詳細:セクション6.1.2を参照のこと)。修飾導波管は、導波管を50μg/ml PLL−g−PEG−ビオチンポリマー溶液にフローセル装置で20分間曝露させ、続いて緩衝液でリンスすることによって、インサイチュで調製した。次いで、PLL−g−PEG−ビオチン修飾導波管を、Control Serum N(ヒト)(Roche,CH)に30分間曝露し、次いで緩衝液中で洗浄した。測定の終わりに、1mg/mlストレプトアビジン(SIGMA,USA)を用いて20分間選択性を試験し、次いで緩衝液でリンスした。質量データを、厚さおよびモード等式(セクション5.2を参照のこと)から誘導した屈折率値から計算した。すべての実験は、BIOS−I機器(ASI AG,Zurich,CH)で行った。
【0181】
実験の最初の部分(図10で示される)は、処理した酸化物表面のタンパク質抵抗性挙動を示す。PLL−g−PEG−ビオチンでコートした導波管は、ヒト血清への曝露後に2〜3ng/cm2未満のタンパク質吸着を示す。この値は、未処理導波管について見られる吸着の200分の1である。実験の第2の部分は、センサーの特異性を示す。ストレプトアビジンの単層は、1mg/mlストレプトアビジン溶液への曝露後、同じPLL−g−PEG−ビオチン官能化表面上に急速かつ非可逆的に吸着する。図11は、PLL−g−PEG−ビオチン分子中の3つの異なるビオチン濃度(表5を参照のこと)について、チップ表面上に吸着されたPLL−g−PEG−ビオチンの量およびPLL−g−PEG−ビオチンでカバーしたチップ表面上に続いて吸着したストレプトアビジンの量を示す。修飾したポリマーはチップ表面上に吸着し、そして次のストレプトアビジン感知アッセイにおいて優れた特異性を示すことは明らかである。さらに、特異的に検出されたストレプトアビジンの量は、ビオチン化の程度に関連する。図12に示されるように、検出されたストレプトアビジンの量とビオチン表面濃度との間の関係は、実験誤差の範囲内および試験したビオチン濃度の範囲内で線形である。
【0182】
【表4】
【0183】
【表5】
【図面の簡単な説明】
【図1A】 図1A〜図1Dは、本明細書中に記載されるポリマーの化学構造である。図1Aは、負に荷電した表面の表面改変のための、ポリカチオン性ポリ(L−リシン)−g−ポリ(エチレングリコール)(PEG−g−PLL)の化学構造である。
【図1B】 図1A〜図1Dは、本明細書中に記載されるポリマーの化学構造である。図1Bは、PEG側鎖の一部の末端においてビオチンで官能化された、PEG−g−PLLポリマーの化学構造である。
【図1C】 図1A〜図1Dは、本明細書中に記載されるポリマーの化学構造である。図1Cは、正に荷電した表面の表面改変のためのポリアニオン性ポリ(L−グルタミン酸)−g−ポリ(エチレングリコール)(PEG−g−PLG)の化学構造である。
【図1D】 図1A〜図1Dは、本明細書中に記載されるポリマーの化学構造である。図1Dは、PEG側鎖の一部の末端においてビオチンで官能化された(PEG−g−PLG)ポリマーの化学構造である。
【図2A】 図2Aは、表面をタンパク質抵抗性および細胞抵抗性にするための吸着された多機能性ポリマーの該略図である。グラフトコポリマー(a)およびブロックコポリマー(b)は、カチオン性成分(太線)およびポリ(エチレングリコール)(細線)から形成される。特定のペプチドは、ポリ(エチレングリコール)鎖(点線)の先端に結合される。
【図2B】 コポリマー単層でコーティングされるチップ表面に基づく生体親和性アッセイの概略図である。認識分子は、ポリマーグラフト化PEGの末端官能基との相互作用により固定化される。PEG層が検体の生物学的成分および非生物学的成分の非特異的吸着を防ぐ一方で、表面は標的分子(左)の特異的結合のために使用され得る。
【図3】 図3は、格子カップラー技術により測定される場合の3つの金属酸化物表面上のPLL(375)−g[5.6]−PEG(5)の吸着曲線を示すグラフである。[10mM HEPES Z1(pH 7.4)、1mg/mLポリマー、1mL/時、T=26℃]。
【図4】 図4は、光学格子カップラー技術により測定された場合の金属酸化物表面の等電点におけるPLL(375)−g[5.6]−PEG(5)の吸着量の依存性を示すグラフである[10mM HEPES Z1(pH 7.4)、1mg/mLポリマー、1mL/時、T=26℃]。
【図5】 図5は、光学的格子カップラー技術により測定される場合の未改変またはPLL(375)−g[5.6]−PEG(5)改変Si0.6Ti0.4O2表面のいずれかに対する血清吸着のグラフである。[10mM HEPES Z1(pH 7.4)、1mg/mLポリマー、T=26℃。](ベースラインは、10mM HEPES Z1下で達成され、そしてスパイクは、圧力変化に関連する一時的な流速に起因する。)
【図6】 図6は、光学的格子カップラー技術により測定される場合の、PLL(375)−g[5.6]−PEG(5)改変および未改変のSi0.6Ti0.4O2、TiO2およびNb2O5の表面上への血清およびHSAの面積ごとの吸着量のグラフである。[10mM HEPES Z1(pH 7.4)、1mg/mLポリマー、1mL/時、T=26℃。]
【図7】図7は、光学的格子カップラー技術により測定される場合の、PLL(375)−g[5.6]−PEG(5)改変Si0.6Ti0.4O2表面のタンパク質吸着抑制の長期間の安定性のグラフである。[10mM HEPES Z1、1mg/mLポリマー、1mL/時、T=26℃;血清吸着、1mL/時、T=26℃下で実行されるポリマー吸着]。
【図8】 図8は、光学的格子カップラー技術により測定される場合の、コポリマーおよびSi0.6Ti0.4O2表面上のそれに続く血清の吸着された面積ごとの密度に対するポリマーアーキテクチャーの効果のグラフである。[10mM HEPES Z1、1mg/mLポリマー、1mL/時、T=26℃;血清吸着、1mL/時、T=26℃下で実行されるポリマー吸着]
【図9】 図9は、セイヨウワサビペルオキシダーゼ:異なるPLL−g−PEG誘導体でコーティングされた酸化チタンの活性のグラフである。ストレプトアビジン結合体酵素は、ビオチンを介して固定化されており、これがPLL−PEG−ビオチンのコポリマーの官能基として作用する。酵素のコーティングしていない金属酸化物ならびに非官能化PLL−g―PEG上への非特異的結合は、並行して調べられる。
【図10】 図10は、ビオチン誘導体化PLL−g−PEG−ビオチン(導波管チップ上に吸着される)の、ストレプトアビジン曝露に対する、時間分解選択的センサー応答である。
【図11】 図11は、PLL−g−PEG−ビオチン分子における3つの異なるビオチン濃度(表5を参照のこと)についての、SixTi1−xO2導波管チップ表面上に吸着されたPLL−g−PEG−ビオチンの量およびPLL−g−PEG−ビオチン被覆チップ表面上に引き続いて吸着されたストレプトアビジンの量のグラフである。
【図12】 PLL−g−PEG−ビオチンが吸着されたSixTi1−xO2から形成されたチップ表面上のポリマーにおけるビオチン濃度の関数として、光学導波管技術による検出されるストレプトアビジンの量のグラフである。
Claims (44)
- 非特異的吸着を低減させるための方法であって、分析用デバイスまたはバイオセンシングデバイスにおける荷電した表面または荷電した基板上に、ポリイオン性多官能コポリマーを塗布またはコーティングする工程を包含し、
ここで該ポリイオン性多官能コポリマーが、4より大きいpHでアニオン性電荷を有する荷電したポリイオン性ポリマー骨格にグラフト化された非相互作用性ポリマー側鎖を含み、そして
ここで該荷電した基板または表面が、該ポリイオン性ポリマー骨格の電荷と反対の電荷を有し、金属および金属酸化物および荷電したポリマーからなる群から選択される材料を含む、方法。 - 前記アニオン性骨格が、4より大きいpHで該骨格に負電荷を付与する、アミノ酸を含有する荷電したペンダント基を含むポリマー、多糖類および負に荷電したペンダント基を有する荷電した合成ポリマーからなる群から選択されるポリマーを含む、請求項1に記載の方法。
- 請求項2に記載の方法であって、ここで前記アニオン性骨格が、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸、アルギナート、カラゲーニン、ファーセレラン、ペクチン、キサンタン、ヒアルロン酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、デキストラン硫酸、ポリ(メタ)アクリル酸、酸化セルロース、カルボキシメチルセルロースおよびクロスマルメロース、マレイン酸ポリマー、ならびにフマル酸ポリマーからなる群から選択される1つ以上のユニットを含む、方法。
- 請求項1に記載の方法であって、ここで前記非相互作用性ポリマーが、ポリ(アルキレングリコール)、ポリ(アルキレンオキシド)、中性水溶性多糖類、ポリビニルアルコール、ポリ−N−ビニルピロリドン、ホスホリルコリン誘導体、非カチオン性ポリ(メタ)アクリレートおよびこれらの組合せからなる群から選択される、方法。
- 前記非相互作用性ポリマーが、該ポリマーの末端においてまたは末端の近傍において、さらなる官能化に適切な反応性基で、完全にまたは部分的に改変される、請求項1に記載の方法。
- 前記反応性基が、ヒドロキシ(−OH)、カルボキシ(−COOH)、エステル(−COOR)、チオール(−SH)、N−ヒドロキシ−スクシンイミジル、マレイミジル、キノン、ビニルスルホン基、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項5に記載の方法。
- 前記非相互作用性ポリマーのいくつかまたは全てが、該非相互作用性ポリマーの遊離の末端位置においてまたは該末端位置の近傍において、標的分子を特異的に認識し、かつ相互作用する官能性分子で、部分的または完全に官能化される、請求項1に記載の方法。
- 前記官能性分子が、タンパク質リガンド、ポリヌクレオチド、炭水化物リガンドまたは糖リガンド、単純な有機分子、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項7に記載の方法。
- 前記官能性分子が、ビオチンである、請求項8に記載の方法。
- 前記材料が、正電荷を有し、かつ5より大きい等電点(IEP)を有する酸化物および4より大きいpHで表面上に正電荷を付与するように処理された酸化物または金属からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記材料が、酸化タンタル、酸化ニオブ、酸化チタン、酸化ハフニウム、酸化ケイ素、酸化鉄および酸化クロム;鉄、クロム、鋼、タンタル、ニオブ、チタン、ハフニウム、金および銀からなる群から選択され、これらは、使用されるpHにおいて、ネイティブの酸化物フィルムの存在に起因して正電荷を帯びるか、または正電荷を該材料に誘起するように処理されているかのいずれかである、請求項10に記載の方法。
- 請求項7に記載の方法であって、前記官能化コポリマーを、流体相の官能基により結合される検体に曝し、次いで該官能化コポリマーを基板または表面上全体に吸着させる工程を包含する、方法。
- 前記官能化コポリマーを官能基により結合される検体に曝す工程を包含する、請求項7に記載の方法であって、ここで該官能化コポリマーが、該検体が結合する前または後に、基板または表面上に吸着される、方法。
- バイオセンシングデバイスまたは分析用デバイスを作製するための方法であって、水溶液中の非相互作用性ポリイオン性多官能コポリマーを、表面もしくは基板上に該コポリマーの電荷と反対の電荷を有する分析用デバイスもしくはバイオセンシングデバイスの該表面もしくは基板にまたは該表面もしくは基板に接触するように、該表面もしくは基板に塗布またはコーティングする工程を包含し、
ここで、該非相互作用性ポリイオン性多官能コポリマーは、荷電されたポリイオン性ポリマー骨格にグラフトされた非相互作用性側鎖を含むブラッシュコポリマーであり、
ここで、該非相互作用性ポリマーの側鎖のいくつかまたは全ては、該非相互作用性ポリマーの側鎖の該遊離末端位置においてまたはその近傍において、官能性分子で部分的または完全に官能化されており、
ここでいくつかの該非相互作用性ポリマーの側鎖が、標的分子を特異的に認識しかつ標的分子と相互作用する官能性部分で官能化され、そしていくつかの該非相互作用性ポリマーの側鎖が官能化されない、方法。 - 前記官能化されたコポリマーおよび非官能化コポリマーが、続けて塗布される、請求項14に記載の方法。
- 前記官能化されたコポリマーが、前記基板または表面に吸着され、そして検体に曝され、次いで前記非官能化コポリマーが、該基板または表面に吸着される、請求項15に記載の方法。
- 前記官能化されたコポリマーが、物理吸着または化学吸着により前記基板または表面に結合される、請求項7または14に記載の方法。
- 前記官能化コポリマーが、共有化学結合により前記基板または表面に結合される、請求項7または14に記載の方法。
- 前記表面が、吸着された、非改変のかつ/または非官能化ポリイオン性コポリマーを有する領域、および吸着された、改変かつ/または官能化ポリイオン性コポリマーを有する領域でパターン付けされる、請求項7または14に記載の方法。
- 前記パターンが、ミリメートル、マイクロメートルまたはマイクロメートル未満の範囲で、前記表面に対して平行な寸法を有する、請求項19に記載の方法。
- 前記パターン付けが、流体、微小流体、スタンピングまたは微小接触プリンティングにより行われる、請求項19に記載の方法。
- 前記ポリイオン性コポリマーが、前記基板または表面上に塗布され、次いで官能性分子が、流体、微小流体、スタンピング、微小接触プリンティングまたはインクジェット技術によって規定された表面パターンで該コポリマー上に結合される、請求項19に記載の方法。
- 請求項14〜22のいずれかに記載の方法により形成される、ポリマーコーティングされた基板または表面。
- 分析用デバイスまたはバイオセンシングデバイスにおいて使用するためのデバイスまたは材料における表面または基板に適用される請求項14〜22のいずれかに記載の方法により形成された、ポリマーコーティングされた基板または表面。
- 検体の定性的または定量的な測定または検出のための、請求項23に記載のポリマーコーティングされた基板または表面の使用。
- 前記検体が、ポリヌクレオチド、ペプチド、タンパク質、炭水化物、糖質、および糖タンパク質からなる群から選択される、請求項25に記載の使用。
- 前記ポリイオン性コポリマーでコーティングされた基板または表面に固定された検体の量が、電磁放射を測定もしくは使用するか、または吸収、散乱、放射、熱的現象のような方法またはこれらの組合せを使用することにより決定される、請求項25に記載の使用。
- 前記検体の量が、導波管を使用して決定される、請求項27に記載の使用。
- 前記導波管が、該導波管内に励起光を結合させるための1つ以上の光学的結合要素を備える、請求項28に記載の使用。
- 前記光学結合要素が、プリズムカップラー、重複するエバネッセント場を有する接続された光学導波管を備えるエバネッセントカップラー、該導波管に隣接して配置される好ましくは円筒形のレンズである焦点レンズを備えるエンドフェーズカップラーおよびゲーティングカップラーならびにこれらの組合せからなる群から選択される、請求項29に記載の使用。
- 前記光学結合要素が、長方形、三角形またはシヌソイドの輪郭のような任意の輪郭を有するレリーフ格子、および前記導波管において屈折率の周期的変調を有する位相格子または体積格子ならびにこれらの組合せからなる群から選択される回折格子である、請求項30に記載の使用。
- 前記光学結合要素のうち1つ以上が、長方形の輪郭を有する回折レリーフ格子である、請求項31に記載の使用。
- 前記検体が、連続型のプロセスを使用して検出される、請求項27に記載の使用。
- 前記官能化ポリイオン性コポリマーが、パターンで塗布され、そして検出が、該パターンの特定の領域に局在化される、請求項27に記載の使用。
- 前記パターンが、複数の検体を検出するための異なる官能性分子の領域を含む、請求項34に記載の使用。
- 金属表面または金属酸化物表面上の表面に対する細胞の相互作用を改変するための、請求項23に記載のポリマーコーティングされた基板または表面の使用。
- 前記基板が、分析用デバイスまたはバイオセンシングデバイスのための材料である、請求項36に記載の使用。
- 基板もしくは表面上にコーティングを含むバイオセンシングデバイスまたは分析用デバイスであって、該コーティングは、ポリイオン性多官能コポリマーを含み、該ポリイオン性多官能コポリマーは、荷電したポリイオン性ポリマー骨格にグラフトされた非相互作用性ポリマーの側鎖を含むブラシコポリマーであり、ここで、該非相互作用性ポリマーの側鎖のいくつかまたは全部は、該非相互作用性ポリマーの側鎖の該遊離末端位置においてまたはその近傍において、官能性分子で部分的または完全に官能化され、ここで、該基板または表面は、該コポリマーの電荷と反対の電荷を有する、バイオセンシングデバイスまたは分析用デバイス。
- 前記非相互作用性ポリマーの側鎖のいくつかは、官能性部分で官能化されており、該非相互作用性ポリマーの側鎖のいくつかは、官能化されていない、請求項38に記載のデバイス。
- 前記基板または表面は、ガラス、金属、金属酸化物および荷電したポリマーからなる群より選択される材料を含む、請求項38または請求項39に記載のデバイス。
- 前記官能化されたコポリマーは、物理吸着または化学吸着により前記基板または表面に結合される、請求項38〜40のいずれかに記載のデバイス。
- 前記官能化されたコポリマーは、共有化学結合により前記基板または表面に結合される、請求項38〜41のいずれかに記載のデバイス。
- 前記表面は、(a)吸着された、非改変および非官能化の少なくとも一方であるポリイオン性コポリマーを有する領域、および(b)吸着された、改変および官能化のうちの少なくとも一方であるポリイオン性コポリマーを有する領域でパターン付けされる、請求項38〜42のいずれか1項に記載のデバイス。
- 前記パターンが、ミリメートル、マイクロメートルまたはマイクロメートル未満の範囲で、前記表面に対して平行な寸法を有する、請求項43に記載のデバイス。
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