JP4614258B2

JP4614258B2 - Soft capsule with improved disintegration

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Publication number: JP4614258B2
Application number: JP2001177513A
Authority: JP
Inventors: 雅宣浅田; 勝史水谷; 良誠釜口; 有三河原; 秀基春原
Original assignee: Morishita Jintan Co Ltd
Current assignee: Morishita Jintan Co Ltd
Priority date: 2001-06-12
Filing date: 2001-06-12
Publication date: 2011-01-19
Anticipated expiration: 2021-06-12
Also published as: JP2002360665A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、乾燥状態で保存安定性が高く、水分のある状態に移すと、所望の時間で皮膜層が崩壊し、内外の遮断が解除されるソフトカプセルに関する。より詳しくは、本発明は、二層以上の構造を有するソフトカプセルであって、皮膜層にその皮膜層あるいは隣接する皮膜層を分解する酵素を含ませたカプセルに関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年の技術の進展に伴い、液体、粉体、細胞などをカプセル化する事が可能になってきた。しかし、そのカプセルを所望の条件下で速やかに崩壊させることは未だに困難である。特に、いわゆるドラッグデリバリーシステムにおける腸や大腸などの所望の部位におけるカプセルの崩壊と薬剤の放出、土壌に散布したカプセル化農薬の適当な水分条件下での放出、あるいは土壌または育成容器に播種された人工種子の速やかな力プセル崩嬢による発芽誘導などが望まれているが、未だ、満足すべき所望の崩壊性を有するカプセルは提供されていないのが実状である。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、所望の部位、場所、条件等で崩壊するカプセルが求められている。このようなカプセルが得られれば、所望の部位で活性を発揮する各種医薬品、乳酸菌などの有用微生物の所望の部位への輸送、さらには不定胚等の組織に対して適用して人工種子とするなど、広範な応用が可能となる。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の課題を解決するため、鋭意研究を行った結果、カプセルの皮膜層中に皮膜層を分解できる酵素または微生物を含有させた乾燥カプセルを得ることに成功し、得られたカプセルを望む場所に置いて水分及び温度をコントロールすると、含ませている酵素または微生物が働き始め、その条件に応じた速度で皮膜が崩壊することを認め、本発明を完成させるに至った。
【０００５】
すなわち、本発明は最内層と該最内層を覆うように順次積層された１または２以上の皮膜層を有する多層構造のソフトカプセルであって、該皮膜層の少なくとも１つの皮膜層が酵素または微生物を含有し、所定条件下、該酵素または微生物がこれを含有する皮膜層あるいは他の皮膜層を分解するように構成されたソフトカプセルに関する。
【０００６】
好ましい実施態様においては、前記ソフトカプセルの最外層の皮膜層に前記酵素または微生物が含有され、該最外層の皮膜層が乾燥されている。
【０００７】
より好ましい実施態様においては、前記ソフトカプセルが、最内層と、該最内層を覆う内皮膜層と、該内皮膜層を覆う外皮膜層とを有する三層構造のカプセルであり、該外皮膜層に該内皮膜層を分解し得る酵素または微生物が含まれている。
【０００８】
好ましい実施態様においては、前記乾燥ソフトカプセルの皮膜層が、タンパク質、多糖類、硬化油脂、および生分解性プラスチックからなる群から選択される物質で形成された皮膜層である。
【０００９】
また、好ましい実施態様においては、前記酵素が、タンパク質分解酵素、多糖類分解酵素、硬化油脂分解酵素、またはエステル分解酵素である。
【００１０】
さらに好ましい実施態様においては、前記最内層には、医薬、農薬もしくは再分化可能な植物細胞組織が含まれ、前記内皮膜層は硬化油脂を主成分とし、そして、前記外皮膜層が硬化油脂を分解し得る酵素または微生物を含む乾燥された外皮膜層である。
【００１１】
別の好ましい実施態様においては、前記ソフトカプセルが、シームレスソフトカプセルおよび継ぎ目のあるソフトカプセルからなる群から選択される。
【００１２】
また、別の本発明は、再分化可能な植物細胞組織を含有する最内層と、該最内層を覆う内皮膜層と、該内皮膜層を覆う外皮膜層とを有する三層構造のソフトカプセルからなり、該内皮膜層は硬化油脂を主成分とし、そして、該外皮膜層が硬化油脂を分解し得る酵素または微生物を含む乾燥された外皮膜層である、人工種子に関する。
【００１３】
【発明の実施の形態】
（本発明のソフトカプセルの構造）
本発明のソフトカプセルは、最内層と該最内層を覆うように順次積層された１または２以上の皮膜層を有する多層構造のソフトカプセルである。従って、二層構造、三層構造、四層構造などであり得る。例えば、三層構造の場合、図１に示す構造をとり得る。なお、図１は、ソフトカプセルを人工種子として用いる場合の模式図である。
【００１４】
二層構造の場合、最内層とこの最内層を覆う皮膜層（最外層）からなる。この皮膜層（最外層）には、この皮膜層を分解できる酵素または微生物が含有されている。酵素活性の抑制などの目的で、この皮膜層（最外層）は乾燥されていることが好ましい。
【００１５】
三層構造の場合、図１に示すように、最内層と最内層を覆う内皮膜層と、内皮膜層を覆う外皮膜層からなっている。この内皮膜層および外皮膜層の少なくとも一方の層に、いずれかの皮膜層を分解し得る酵素あるいは微生物（以下、総称して酵素等という）が含まれている。例えば、内皮膜層にこの内皮膜層を分解し得る酵素等か、外皮膜層を分解し得る酵素等か、あるいは両方の酵素等を含ませることができる。外皮膜層にも、この外皮膜層を分解し得る酵素等か、内皮膜層を分解し得る酵素等か、あるいは両方の酵素等を含ませることができる。酵素等が含まれる皮膜層がその酵素等によって分解されるときは、その皮膜層は酵素活性を抑制するために乾燥されていることが好ましい。
【００１６】
好ましい三層構造のソフトカプセルは、外皮膜層に内皮膜層を分解し得る酵素等が含まれているが、内皮膜層には酵素等は含まれていない。外皮膜層内の酵素活性を抑制しておくことが、保存中の内皮膜層の分解を防止する点から好ましいので、外皮膜層は、好ましくは、乾燥されている。
【００１７】
本発明のソフトカプセルは、隣接する層の極性が相互に異なることが好ましく、例えば、親水性層／油性層／親水性層などのように、交互に極性の異なる層であることが好ましい。最内層が水性物質である場合、この最内層を覆う皮膜層は、耐水性の油性層であることが、カプセル形成に必要なだけでなく、最内層の水分の揮散を防止するためにも重要である。
【００１８】
（最内層）
カプセルの最内層には所望の場所、条件下で放出される物質が含まれる。最内層に含まれる物質は、親水性、油性、あるいは粉末であり得る。最内層に含まれ得る物質としては、医薬品、農薬、微生物菌体、再分化可能な植物細胞組織などが挙げられる。最内層に含まれる医薬品は、特に制限されない。例えば、抗血小板作用を有するシロスタゾールなどの結晶性の粉末の場合は、硬化油脂への懸濁状態で、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）とドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）などの油脂類はそのままの形態で、あるいはエマルジョンの形態で、最内層に含ませることもできる。微生物菌体としては、ビフィズス菌、乳酸菌などの有用微生物が挙げられる。これらの微生物は水溶液としてあるいは乾燥粉末として最内層に含まれる。乾燥粉末の場合、液体油脂に懸濁して用いることができる。再分化可能な植物細胞組織としては、不定胚、不定芽、多芽体、茎頂、生長点、不定根、毛状根、プロトコルム様球体などが好ましく用いられる。ウィルスフリー組織を用いることもできる。
【００１９】
（皮膜層）
最内層に隣接する皮膜層（第１の皮膜層）としては、最内層が親水性の場合、親油性の物質で構成されることが好ましい。このような親油性の物質としては、硬化油脂が好ましく用いられる。次の皮膜層（第２の皮膜層）は、親水性の物質からなる層であり、次の皮膜層（第３の皮膜層）は油性物質からなることが好ましい。
【００２０】
最内層が親油性の物質の場合、最内層に隣接する皮膜層（第１の皮膜層）は、界面は明確にならないが、親油性の物質で構成されてもよいし、親水性の物質で構成されてもよい。
【００２１】
第１の皮膜層が親油性の物質である場合、最内層の油脂とは融点の異なる常温で固体の、酵素で分解される硬化油脂であり得る。この場合、次の皮膜層（第２の皮膜層）は、親水性の物質からなる層であり、次の皮膜層（第３の皮膜層）は油性物質からなることが好ましい。
【００２２】
第１の皮膜層が親水性の物質である場合、酵素等で分解される物質であることが必要である。このような物質として、タンパク質、多糖類、生分解生プラスチックなどが挙げられる。これらは、それぞれ単独で、あるいは２以上組合せて用いることができる。次の皮膜層（第２の皮膜層）は、親油性の物質からなる層であり、さらに次の皮膜層（第３の皮膜層）は親水性物質からなることが好ましい。
【００２３】
（最外層）
最外層の皮膜層は、最内層の種類と層の数によって決定される。最内層が親水性の場合、カプセルが二層構造であれば最外層は親油性の皮膜層であり、三層構造であれば親水性の皮膜層である。最外層は、酵素活性の抑制の点から、乾燥されていることが好ましい。
【００２４】
（皮膜層の材質）
皮膜層は、酵素等により分解されるものであればよい。従って、皮膜層全体がこれらの酵素の基質または微生物で分解されるものである必要はなく、皮膜層の一部として使用され、分解されることによって皮膜層が崩壊できる程度に含まれているものであってもよい。
【００２５】
皮膜層として用いられる物質のうち、親油性の物質としては、硬化油脂が好ましく用いられる。硬化油脂は、硬化油を主成分とする油脂を含み、硬化油のみの油脂、あるいは、硬化油に他の油脂などを混合して、所望の性質を有する様に調製した油脂を含む。好ましくは、常温では固体であり、目的に応じた融点を有し、リパーゼ類で加水分解される。硬化油脂としては、中鎖脂肪酸のトリグリセリドやジグリセリド等が挙げられ、バター、マーガリン、ショ一トニングやカカオバター等が例示できるが、これらに限定されない。
【００２６】
親水性の物質としては、タンパク質、多糖類、生分解性プラスチックスが好ましく用いられる。
【００２７】
タンパク質としては、ゼラチン、コラーゲン等が挙げられるが、これらに限定されない。これらはそれぞれ単独で、あるいは２以上組合わせて用いることができる。特に好ましいタンパク質としては、乾燥後、酸素バリアー性が高くなるゼラチンが挙げられる。
【００２８】
多糖類としては、ゲルを形成する多糖が好ましく用いられる。このような多糖類としては、デンプン、アミロース、ポリガラクツロン酸、寒天、カラギーナン、アラビアガム、ジェランガム、キサンタンガム、ペクチン、アルギン酸等が挙げられるが、これらに限定されない。これらは、それぞれ単独で、あるいは２以上組合わせて用いることができる。
【００２９】
生分解性プラスチックスとしては、ポリ乳酸、ポリヒドロキシ酪酸、ポリグルタミン酸、それらの混合物等が挙げられるが、これらに限定されない。これらは、それぞれ単独で、あるいは２以上組合わせて用いることができる。
【００３０】
また、必要に応じて、上記生分解性の物質に、糖、糖アルコール、多価アルコール、プルラン、キトサン、キチン、アミノ酸等を添加することで、皮膜層の性質を変えることができる。
【００３１】
（皮膜層を分解する酵素または微生物）
硬化油脂を分解する酵素等としては、リパーゼ類及びリパーゼを生産し得る微生物が挙げられる。リパーゼを生産する微生物としては、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、キャンディダ・ルゴーサ（Candida rugosa）などが挙げられる。農薬や人工種子として用いるときには、洗剤用リパーゼを用いることができ、カプセルを医薬品、食品に用いるときには、食品加工用リパーゼを用いることができる。酵素あるいは微生物の添加量は、カプセルの使用目的、使用条件によっても異なるが、水分が与えられ、適切な時間で内皮膜層を分解するのに必要な活性を発現する量を添加する。
【００３２】
タンパク質を分解する酵素等としては、プロテアーゼ類およびプロテアーゼを生産する微生物が挙げられる。酵素を用いる場合、使用するタンパク質の種類によっては、それに応じたプロテアーゼ類（タンパク質分解酵素）を選択することが必要になる場合がある。プロテアーゼを生産する微生物としては、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）などが挙げられる。
【００３３】
多糖類を分解する酵素等としては、用いる多糖類の種類に応じた酵素または微生物が挙げられる。例えば、デンプンの場合は酵素としてアミラーゼ類が用いられ、アミラーゼを生産する微生物としては、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）などが挙げられる。また、ポリガラクツロン酸の場合はポリガラクツロナーゼが用いられ、ポリガラクツロナーゼを生産する微生物としては、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）などが挙げられる。ペクチンの場合はぺクチナーゼが用いられ、ぺクチナーゼを生産する微生物としては、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）などが挙げられる。
【００３４】
生分解性プラスチックスであるポリ乳酸、ポリヒドロキシ酪酸を分解する酵素としては、エステラーゼ類が挙げられ、これらのエステラーゼを生産する微生物としては、リゾプス属の微生物が挙げられる。ポリグルタミン酸を分解する酵素としてはぺプチダーゼ類が挙げられ、ぺプチダーゼを生産する微生物としては、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）などが挙げられる。
【００３５】
本発明のカプセルの皮膜層に用いられる生分解性の物質と、この生分解性物質を分解するために用いる酵素またはその酵素を生産する微生物との組合せに関する上記例はほんの一例にすぎず、本発明を制限するものではなく、当業者が一般に用いる酵素学、生化学などの成書などから生分解性の物質とこれを分解し得る酵素あるいは微生物との組み合わせを適宜選択できる。
【００３６】
（本発明のソフトカプセルの製造方法）
本発明のソフトカプセルは、当業者が製造する際に通常用いるロータリー法、滴下法などの方法により、製造される。上記当業者に周知の技術で得られるソフトカプセルは、継ぎ目のあるソフトカプセル、継ぎ目のない、いわゆるシームレスソフトカプセルであり得、好ましくは、成形後、最外層が乾燥される。
【００３７】
以下、具体的に、最内層、硬化油脂層（内皮膜層）、およびゼラチン層（外皮膜層）からなる三層シームレスソフトカプセルを製造する場合について説明する。シームレスソフトカプセルは、三重ノズルを用いた滴下法で製造する事が最も望ましい。シームレスカプセルの製造方法は、例えば、バイオサイエンスとインダストリー、vol.５８、No.７、p.３１〜３４（２０００）に記載されている。このシームレスソフトカプセルの基本的な製造方法は、すでに工業的に使用されている方法であるため、大量生産は容易である。
【００３８】
まず、最内層の目的物を液体油脂あるいは水溶液などに分散あるいは溶解して準備する。内皮膜層を形成する硬化油脂を溶解し、他方で適切な濃度（例えば、１８％）のゼラチン溶液に適切な量のリパーゼを添加して、外皮膜層を形成用のゼラチン溶液を調製する。三重管ノズルに、内溶液、硬化油脂、およびゼラチン溶液を入れ、シームレスソフトカプセル製造機を用いて、液中滴下法によりカプセル化する。カプセル滴形成と固化は、酵素活性を抑制するため、できる限り低温の凝固油中で行い、三層構造のカプセルとする。得られたカプセルから凝固油を脱油後、速やかにドラム乾燥する事により乾燥カプセルが得られる。乾燥は、乾燥中にリパーゼが働かないように低温で速やかに行うのが好ましい。
【００３９】
ロータリー式カプセル製造方法でラグビーボール型のソフトカプセルを得る場合、最内層と皮膜層（最外層）の二層構造となる。皮膜層（最外層）をゼラチンとする場合、タンパク質分解酵素または微生物を含ませた乾燥したゼラチンシートを用いる。
【００４０】
あるいは、最初皮膜層（外皮層）を形成するゼラチン液あるいはゼラチン膜にはタンパク質分解酵素を添加しないでソフトカプセルを製造し、ついで、表面にタンパク質分解酵素を糖液などに溶解してコーティングし、速やかに乾燥させてもよい。目的物を硬化油脂に溶解またはスラリー状に分散させたものを内容物とする場合、リパーゼを含有する乾燥したソフトカプセルのゼラチン膜の表面にタンパク質分解酵素を糖液などに溶解してコーティングし、速やかに乾燥させてもよい。
【００４１】
得られるソフトカプセルは、所定の条件下、例えば、水分が供給された場合、適切なｐＨに設定された場合、適切な温度に設定された場合など、酵素または微生物がその活性を充分に発揮できる環境におかれた時に、その酵素または微生物が含まれる皮膜層または隣接する皮膜層が分解される。
【００４２】
このようにして得られる本発明のソフトカプセルは、種々の学術文献、特許文献等の記述において、カプセルとして表記されているアルギン酸カルシウムゲルの単一球のビーズとは全く異なるものである。さらに、湿潤アルギン酸カルシウムゲルビーズとも異なるものである。
【００４３】
（腸溶性ビフィズス菌カプセル）
腸溶性ビフィズス菌カプセルは、乾燥ビフィズス菌粉末を加温融解した硬化油脂に懸濁し、これを最内層として、上記三層シームレスソフトカプセルの製造方法で乾燥ビフィズス菌懸濁硬化油脂内溶液−硬化油脂層−耐酸性皮膜層（タンパク質分解酵素とペクチン含有ゼラチン層）の三層構造のシームレスソフトカプセルとし、これを速やかに低温乾燥して、最外層のタンパク質層を乾燥させることにより得られる。得られた腸溶性ビフィズス菌カプセルは、水分を吸収することにより、最外層のタンパク質が分解され、腸内でリパーゼの作用を受けて硬化油脂層が崩壊し、ビフィズス菌が腸内に放出される。
【００４４】
（人工種子）
液体培地あるいは固体培地で作出した細胞組織（不定胚、プロトコーム様体（以下、ＰＬＢという）等）から適切な大きさの不定胚やＰＬＢなどの再分化可能植物細胞組織を取得し、培地に懸濁し、カプセルの内容物（最内層)とする。内皮膜層として常温で固体の硬化油脂を用い、外皮膜層を適切な濃度の上記生分解性物質の溶液（例えば、２２％ゼラチン溶液）として、その溶液に適当量のリパーゼ（例えば、２００ユニット／ｇ）を添加し、三重管ノズルのシームレスソフトカプセル製造機を用いて液中滴下法によりカプセル化する。この時、内容物の不定胚が一個ずつ入るようにポンプを調製する。上記と同様の処理を行い、最外層の外皮膜層が乾燥された、カプセル化した人工種子が得られる。乾燥は、細胞組織が死滅せず、リパーゼも働かないように低温で速やかに行うのが好ましい。このようにして得られる人工種子の模式図を、図１に示す。
【００４５】
外皮膜に添加するリパーゼの量は、リパーゼの比活性によっても異なるが、人工種子を土壌あるいは育苗ポット等に播種して水を与えたときに、その温度条件で内皮膜層の硬化油脂を６時間〜１４日間で分解するような量とする。より好ましくは、１日間〜７日間で分解する様な活性を発現する量とする。
【００４６】
得られるカプセル化人工種子の粒径は、細胞組織のサイズによっても異なるが、１ｍｍ〜１２ｍｍである。より好ましくは、３ｍｍ〜１０ｍｍである。
【００４７】
このようにして得られた本発明の人工種子は、乾燥した納屋などの室温で発芽能力を保持したまま、２ヶ月以上保存する事が可能であり、特別に冷蔵庫や、低温水中で保存する必要はない。１０℃以下の冷蔵庫で保存するなら、４ヶ月以上の長期保存が可能である。
【００４８】
本発明のカプセル化人工種子は、土壌中に播種し、水を散布することで、外皮膜層がゼラチンであればゼラチン層が膨潤し、続いて内皮膜層である硬化油脂がリパーゼの作用で速やかに分解され、崩壊に至る。その時、酸素透過性が上がり、休眠状態から目覚め、発芽状態に移行すると考えられる。
【００４９】
（植物生長ホルモン）
植物生長ホルモンの場合、植物生長ホルモン水懸濁溶液を最内層とし、内皮膜層を硬化油脂とし、外皮膜層はリパーゼを混合したゼラチンとすることで、三層カプセルを得る。このカプセルを作物の根部に埋め込むことで、乾燥状態ではホルモンは作用せず、撒水または降雨によりカプセルは速やかに崩壊し、ホルモンが作用することになる。
【００５０】
【実施例】
以下、本発明を実施例によって更に具体的に説明するが、本発明がこれらの実施例に限定されないことはいうまでもない。
【００５１】
（実施例１：色素封入カプセル）
食用赤色２号水溶液を内容液（最内層）とし、硬化油脂を内皮膜層、リパーゼを添加したゼラチンを外皮膜層にして、シームレスの三層乾燥カプセルを調製した。
【００５２】
詳しくは、食用赤色２号の０．１％（ｗ／ｖ）水溶液を内容液（最内層）とし、内皮膜層を融点３２℃のトリグリセリドの硬化油（ファーマゾルＢ−１１５、日本油脂（株）製）とし、外皮膜層として、２２％（ｗ／ｖ）ゼラチン溶液に液状リパーゼ（ノボザイム３９８、ノボノルディスクバイオインダストリー（株）製）を表１に示すような各種濃度（ｗ／ｖ）で混合したものを用いた。各層の体積比は、内容液層／内皮膜層／外皮膜層＝３：３：４とした。カプセル化は常法により、三重管ノズルの無菌シームレスソフトカプセル製造機を用いて凝固油中でカプセル化し、速やかに、脱油後、１０℃の乾燥空気を送りながら、ドラム乾燥した。表面乾燥した三層カプセルの粒径は７ｍｍであった。
【００５３】
これらのカプセルは、シリカゲルを入れたポリエチレンの袋に入れ、２０℃で３ヶ月問保存後も内容液の赤色が表面に現れることはなく、安定であった。
【００５４】
調製直後のカプセルと上記条件下で３ヶ月間保存したカプセルを、各５０粒ずつシャーレ中に置き、霧吹きで均一に水を噴霧し、２５℃のインキュベータ中で保温した。経時的に内容液の赤色の斑点が表面に認められる時間を観察し、５０粒を平均して皮膜崩壊時間とした。その結果を表１に示す。
【００５５】
【表１】

【００５６】
表１に示すように、外皮膜層にリパーゼを含まないカプセルは、内皮膜層の崩壊に要する時間が極めて長かった。一方、外皮膜層にリパーゼを含むカプセルは、著しく皮膜崩壊時間が短くなり、リパーゼの添加量が多くなるほど内皮膜層である硬化油脂を分解する時間が短くなった。３ヶ月間保存後も、硬化油脂とゼラチンで包まれている内容液の水分の揮散は認められなかった。リパーゼ活性は約８％低下していることが観察されたが、リパーゼ添加の効果はほぼ同様に認められた。このことから、本発明のカプセルは、乾燥状態では、常温保存でも極めて安定であり、長期保存に耐えることが示された。さらに、外皮膜層に添加するリパーゼ量を調節することで、水を与え、望む時間で皮膜層を崩壊させることが可能であることが示された。
【００５７】
（実施例２：ニンジン不定胚をカプセル化した人工種子）
ニンジンの培養細胞と不定胚の作出は、ニンジンの根を用いて「植物細胞組織培養」（１９７９年、原田、駒嶺編、理工学社）ｐ９１〜１０４に記載されている方法に準じて行った。液体培地で作出した不定胚から網目１．４ｍｍと１．７ｍｍのナイロンメッシュを用いて１．４ｍｍ〜１．７ｍｍの大きさの不定胚を選別取得した。これらの選別した不定胚は、心臓型から魚雷型に至る形状をしていた。これらの不定胚を、ホルモンを含まず、キトサンを０．２％含むＭＳ培地に懸濁し、カプセルの内容物とした。
【００５８】
カプセル化は、内容物を変え、内容液（最内層）の不定胚が一個ずつ入るようにポンプを調節し、外皮膜層のゼラチンに添加するリパーゼを０．０５％とした以外は、実施例１と同様にして三重管ノズルの無菌シームレスソフトカプセル製造機を用いて液中滴下法により行った。得られた最外層が乾燥されたカプセル化不定胚の人工種子の粒径は７ｍｍであった。
【００５９】
比較例１として、ゼラチン皮膜層にリパーゼを添加しなかった以外は実施例２と同様にしてカプセル化ニンジン不定胚を作成した。
【００６０】
比較例２として、アルギン酸ゲルビーズ包埋ニンジン不定胚を作成した。すなわち、実施例２で作出し選別した不定胚を３％（ｗ／ｖ）アルギン酸ナトリウムを含むＭＳ培地に懸濁し、５０ｍＭの塩化カルシウム溶液中に滴下することによって不定胚を包埋したアルギン酸カルシウムゲルビーズ（粒径約６ｍｍ）を調製した。これは、従来人工種子として報告されているものと同様のものである。
【００６１】
（発芽試験１：外皮膜層にリパーゼを添加した効果）
上記ニンジン不定胚をカプセル化した外皮膜層にリパーゼを含む人工種子（実施例２）とリパーゼを含まない人工種子（比較例１）を調製した。調製直後の人工種子を、土壌殺菌を行っていない圃場の土を入れたポットに表土から３ｃｍの深さに各１００粒ずつ播種し、散水した。播種後、２５℃のインキュベータ一に入れ、３０００Ｌｕｘで、１日あたり１６時間の照明を行いながら、２日に一回散水した。１週間後、２週間後、３週間後の発芽数を数えた結果を表２に示す。
【００６２】
【表２】

【００６３】
表２に示すように、外皮膜層にリパーゼを含む人工種子は速やかに内皮膜層の硬化油脂が分解し、２週間で発芽が認められるのに対し、リパーゼを含まない人工種子は２週間では全く発芽が認められず、発芽に３週間要することが分かった。この結果より、本発明の崩壊性をコントロールしたカプセルのほうが従来のカプセルよりもはるかに速やかに内皮膜層（硬化油脂）が崩壊し、発芽にいたるため、人工種子として優れていることが示された。
【００６４】
（保存及び発芽試験２）
上記実施例２で調製した外皮膜層にリパーゼを含むカプセル包括不定胚の人工種子と、比較例２のアルギン酸カルシウムゲルビーズ包埋不定胚とを、２０℃、湿度５０％の恒温器中で２ヶ月間保存した。実施例２のカプセル化人工種子には外観の変化は認められなかったが、比較例２のアルギン酸カルシウムゲルビーズは、３日目でかなり乾燥し、ビーズが小さくなっており、１週間で不定胚も乾燥し、干からびた状態になった。人工種子調製時、１ヶ月後、２ヶ月後に、各１００粒ずつを、土壌殺菌を行っていない圃場の土を入れたポットに表土から２ｃｍの深さに播種し、散水した。播種後、ポットを２５℃、３０００Ｌｕｘで１６時間照明のインキュベーター中に置き、２日に一回散水し、各々２週間後の発芽数を数えた。結果を表３に示す。
【００６５】
【表３】

【００６６】
表３に示したように、調製直後の発芽率は、実施例２も比較例２もほぼ同じであったが、１ヶ月間以上保存すると、従来タイプの人工種子である比較例２では全く発芽しなかった。本発明のソフトカプセル化した人工種子では高率で発芽が認められた。この結果より、不定胚を含む本発明のソフトカプセルが人工種子としての保存安定性に関して、従来のアルギン酸ゲルビース包埋不定胚タイプの人工種子よりも優位であることが示された。また、長期間保存後も高率で発芽するため、人工種子として実用に耐えることが示された。
【００６７】
（実施例３：イチゴ葉芽をカプセル化した人工種子）
栽培されているイチゴから摘出した茎頂組織をシュークロース１０ｇ／ｌ及びゲル化剤としてジェランガム２ｇ／ｌを含むＭＳ倍地に置床し、暗所２５℃で１４日間培養後、ベンジルアデニン０.２ｍｇ／ｌ及びシュークロース１０ｇ／ｌを含むＭＳ液体培地に移し、２５℃で、１日当たり、２０００Ｌｕｘで１６時間照射しながら、１５０ｒｐｍで回転振とう培養を行った。３０日間培養後、得られた葉芽を、網目が１．４ｍｍと２ｍｍのナイロンメッシュを用いて選別し、１．４ｍｍ〜２ｍｍの大きさの葉芽を得た。取得した葉芽を、ホルモンを含まないＭＳ液体培地に懸濁し、カプセルの内容物とした。
【００６８】
カプセル化は、内容物を葉芽懸濁液に変え、内容液（最内層）の葉芽が一個ずつ入るようにポンプを調節し、外皮膜層のゼラチンに添加するリパーゼを０．０５％とした以外は、実施例１と同様にして三重管ノズルの無菌シームレスソフトカプセル製造機を用いて液中滴下法により行った。得られたカプセルの乾燥も実施例１と同様に低温で行い、乾燥カプセル化イチゴ葉芽の人工種子を得た。最外層を乾燥した後の粒径は８ｍｍであった。
【００６９】
他方、比較例３として、ゼラチン溶液にリパーゼを添加しなかった以外は実施例３と同様にして外皮膜層が乾燥したカプセル化イチゴ葉芽を作成した。
【００７０】
（発芽試験３）
実施例２における発芽試験と同様に、実施例３の外皮膜層にリパーゼを含んでいるカプセル化イチゴ葉芽人工種子と比較例３のリパーゼを含んでいないカプセル化イチゴ葉芽人工種子を、２０℃、湿度５０％のインキュベーター中で２ヶ月間保存し、発芽試験１と同様に発芽試験を行つた。結果を表４に示す。
【００７１】
【表４】

【００７２】
表４に示したよラに、カプセル化イチゴ葉芽の人工種子においても、カプセルの外皮膜層にリパーゼを添加した実施例３はリパーゼを添加していない比較例３よりも発芽が早いことが示された。
【００７３】
さらに、２ヶ月間保存後もこの外皮膜層にリパーゼを添加したカプセル化イチゴ葉芽の人工種子においては、高率で速やかな発芽が見られ、リパーゼを添加していない人工種子よりもはるかに優れていることが示された。
【００７４】
（実施例４：医薬品カプセル）
血小板凝集抑制作用を有するシロスタゾールを融点４２℃の硬化油脂に１ｇ／３ｇ（ｗ／ｗ）の割合で懸濁し、その懸濁液を内容液（最内層）とし、何も含まない硬化油脂のみを内皮膜層とした。外皮膜層として、ペクチンを５％（ｗ／ｗ）含むゼラチン２０％（ｗ／ｖ）溶液に、食品用粉末リパーゼ（ナガセ生化学工業株式会社製、リリパーゼＡ−１０ＦＧ）を０.０５％（ｗ／ｗ）の割合で添加したものを用いた。これらを三重管ノズルのシームレスソフトカプセル製造機を用いて凝固油中でカプセル化し、速やかに脱油後、１０℃の乾燥空気を送りながら、ドラム乾燥した。乾燥後のカプセルの粒径は２．５ｍｍであった。本カプセル１ｇ中には、シロスタゾール１００ｍｇが含まれている。
【００７５】
別途、比較例４として、外皮膜層にリパーゼを添加しない以外は実施例５と同様にして外皮膜層が乾燥したカプセルを調製した。
【００７６】
（吸収試験）
雌のビ一グル成犬６匹を１グループとして、実施例４で調製した外皮膜層にリパーゼを含むカプセル１ｇを各々経口投与した。対照として別の６匹のグループに比較例４で調製した外皮膜層にリパーゼを含んでいないカプセル１ｇを各々経口投与した。経時的に血液をサンプリングし、シロスタゾールが最高血中濃度に達する時間を求め、各グループ６匹の平均値を比較した。その結果、比較例４のカプセルを用いたグループの平均値が６時間であったのに対し、実施例４のカプセルを用いたグループの平均値は４．５時間と短かった。すなわち、実施例５の外皮膜層にリパ一ゼを含ませたカプセルの方が、比較例４よりも短時間で内皮膜層が崩壊し、薬剤が腸から吸収されていることが分かった。本発明の医薬品カプセルは、含まれる薬剤の効果が速やかに現れることが期待されるため、本発明のカプセルの優位性が明らかである。
【００７７】
（実施例５：外皮膜層に微生物を含むカプセル）
リパーゼを分泌することが知られているキャンディダ・ルゴーサ（Candida rugosa）IFO 0591株を、ＩＦＯＮｏ．１０８液体培地で培養し、培養液１００ｍｌを４℃、８０００ｒｐｍで２０分間遠心し、上清を捨てて菌体を回収し、１００ｍｌの水に再懸濁した。この懸濁液を２２％（ｗ／ｗ）のゼラチン溶液に１０％（ｖ／ｖ）の割合で加え混合して、外皮膜層用溶液とした。それ以外は実施例１と同様にして赤色色素をカプセル化し、乾燥後、濃硫酸を入れたデシケータ中でさらに２４時間乾燥した。
【００７８】
これらのカプセルは、シリカゲルを入れたポリエチレンの袋に入れ、２０℃で３ヶ月問保存後も内容液の赤色が表面に現れることはなく、安定であった。
【００７９】
調製直後のカプセルと上記条件下で３ヶ月間保存したカプセルを、各５０粒ずつシャーレ中に置き、霧吹きで均一に水を噴霧し、２５℃のインキュベータ中で保温した。経時的に内容液の赤色の斑点が表面に認められる時間を観察し、５０粒を平均して皮膜崩壊時間とした。その結果を表５に示す。
【００８０】
【表５】

【００８１】
表５に示すように、外皮膜層にリパーゼを含むカプセルは、著しく皮膜崩壊時間が短くなった。本発明のカプセルは、一種の乾燥固定化菌体であるが、乾燥状態では、常温で３ヶ月間保存後も安定であり、崩壊時間の遅延は約６％と大きくなく、長期保存に耐えることが示された。
【００８２】
【発明の効果】
本発明の、皮膜層に、この皮膜層を分解する酵素あるいは微生物を含ませたカプセルは、水分を与えられると酵素の活性に応じて皮膜層を分解し、所望の時と場所で皮膜層を崩壊させることができ、速やかな内容物の放出、内容物と外部との接触、混合を可能にし、人工種子、ドラッグデリバリーシステムの医薬品、不安定な成分の隔離、徐放性農薬等に応用できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の人工種子の形状を示す模式図である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a soft capsule in which the storage stability is high in a dry state, and when it is transferred to a moisture state, a coating layer collapses in a desired time and the internal and external blocking is released. More specifically, the present invention relates to a soft capsule having a structure of two or more layers, in which a film layer contains an enzyme that decomposes the film layer or an adjacent film layer.
[0002]
[Prior art]
With the progress of technology in recent years, it has become possible to encapsulate liquids, powders, cells and the like. However, it is still difficult to quickly disintegrate the capsule under the desired conditions. In particular, capsule disintegration and drug release at desired sites such as the intestine and large intestine in so-called drug delivery systems, release of encapsulated pesticides sprayed on soil under appropriate moisture conditions, or seeded in soil or growth containers Although it is desired to induce the germination of artificial seeds by means of a force-pell-like disintegration, a capsule having a desired desired disintegration property has not yet been provided.
[0003]
[Problems to be solved by the invention]
Therefore, capsules that can collapse at a desired site, place, condition, and the like are desired. Once such capsules are obtained, various pharmaceuticals that exhibit activity at the desired site, transport of useful microorganisms such as lactic acid bacteria to the desired site, and further applied to tissues such as somatic embryos to produce artificial seeds A wide range of applications are possible.
[0004]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive studies to solve the above-mentioned problems, the present inventors have succeeded in obtaining a dry capsule containing an enzyme or microorganism capable of degrading the coating layer in the coating layer of the capsule. When the capsules were placed where they were desired and the moisture and temperature were controlled, the contained enzymes or microorganisms started to work, and the film collapsed at a rate according to the conditions, and the present invention was completed.
[0005]
That is, the present invention is a soft capsule having a multilayer structure having an innermost layer and one or more coating layers sequentially laminated so as to cover the innermost layer, and at least one of the coating layers contains an enzyme or a microorganism. It is related with the soft capsule comprised so that the film | membrane layer or other film | membrane layer which contains this and this enzyme or microorganisms may contain under predetermined conditions.
[0006]
In a preferred embodiment, the outermost skin layer of the soft capsule contains the enzyme or microorganism, and the outermost skin layer is dried.
[0007]
In a more preferred embodiment, the soft capsule is a three-layer capsule having an innermost layer, an inner coating layer covering the innermost layer, and an outer coating layer covering the inner coating layer. Enzymes or microorganisms that can degrade the inner coating layer are included.
[0008]
In a preferred embodiment, the film layer of the dry soft capsule is a film layer formed of a substance selected from the group consisting of proteins, polysaccharides, hardened fats and oils, and biodegradable plastics.
[0009]
In a preferred embodiment, the enzyme is a proteolytic enzyme, a polysaccharide degrading enzyme, a hydrogenated fat degrading enzyme, or an ester degrading enzyme.
[0010]
In a further preferred embodiment, the innermost layer contains a pharmaceutical, agricultural chemical or redifferentiable plant cell tissue, the inner coating layer is mainly composed of hardened oil and fat, and the outer coating layer is made of hardened fat and oil. A dried outer skin layer containing enzymes or microorganisms that can be degraded.
[0011]
In another preferred embodiment, the soft capsule is selected from the group consisting of seamless soft capsules and seamed soft capsules.
[0012]
Another aspect of the present invention is a three-layer soft capsule having an innermost layer containing a redifferentiable plant cell tissue, an inner skin layer covering the innermost layer, and an outer skin layer covering the inner skin layer. The inner coat layer is related to an artificial seed whose main component is a hardened fat and oil, and the outer coat layer is a dried outer coat layer containing an enzyme or a microorganism capable of degrading the hardened fat and oil.
[0013]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
(Structure of the soft capsule of the present invention)
The soft capsule of the present invention is a soft capsule having a multilayer structure having an innermost layer and one or more coating layers sequentially laminated so as to cover the innermost layer. Therefore, it can be a two-layer structure, a three-layer structure, a four-layer structure, or the like. For example, in the case of a three-layer structure, the structure shown in FIG. 1 can be taken. In addition, FIG. 1 is a schematic diagram when a soft capsule is used as an artificial seed.
[0014]
In the case of a two-layer structure, it consists of an innermost layer and a coating layer (outermost layer) covering this innermost layer. The coating layer (outermost layer) contains an enzyme or microorganism that can decompose the coating layer. This coating layer (outermost layer) is preferably dried for the purpose of suppressing enzyme activity.
[0015]
In the case of a three-layer structure, as shown in FIG. 1, the innermost layer includes an inner coating layer that covers the innermost layer and an outer coating layer that covers the inner coating layer. At least one of the inner coating layer and the outer coating layer contains an enzyme or a microorganism (hereinafter collectively referred to as an enzyme or the like) that can degrade any of the coating layers. For example, the inner film layer may contain an enzyme or the like that can decompose the inner film layer, an enzyme or the like that can decompose the outer film layer, or both enzymes. The outer coating layer can also contain an enzyme or the like that can decompose the outer coating layer, an enzyme or the like that can decompose the inner coating layer, or both enzymes. When a film layer containing an enzyme or the like is decomposed by the enzyme or the like, the film layer is preferably dried in order to suppress enzyme activity.
[0016]
In the preferred three-layer structure soft capsule, the outer film layer contains an enzyme or the like capable of decomposing the inner film layer, but the inner film layer does not contain an enzyme or the like. Since it is preferable to suppress the enzymatic activity in the outer film layer from the viewpoint of preventing the inner film layer from being decomposed during storage, the outer film layer is preferably dried.
[0017]
In the soft capsule of the present invention, the polarities of adjacent layers are preferably different from each other. For example, it is preferable that the layers are alternately different in polarity, such as a hydrophilic layer / an oily layer / a hydrophilic layer. When the innermost layer is an aqueous material, the coating layer covering the innermost layer should be a water-resistant oily layer, not only necessary for capsule formation, but also important for preventing volatilization of moisture in the innermost layer. It is.
[0018]
(Innermost layer)
The innermost layer of the capsule contains the material that is released under the desired location and conditions. The substance contained in the innermost layer can be hydrophilic, oily, or powder. Examples of substances that can be contained in the innermost layer include pharmaceuticals, agricultural chemicals, microbial cells, and regenerative plant cell tissues. The drug contained in the innermost layer is not particularly limited. For example, in the case of a crystalline powder such as cilostazol having an antiplatelet action, the fats and oils such as eicosapentaenoic acid (EPA) and docosahexaenoic acid (DHA) are in the form of a suspension in a hardened fat or oil, or It can also be included in the innermost layer in the form of an emulsion. Examples of the microbial cells include useful microorganisms such as bifidobacteria and lactic acid bacteria. These microorganisms are contained in the innermost layer as an aqueous solution or as a dry powder. In the case of a dry powder, it can be used suspended in a liquid oil. As plant cell tissue capable of redifferentiation, somatic embryos, somatic buds, multi-buds, shoot tips, growth points, adventitious roots, hairy roots, protocol-like spheres and the like are preferably used. Virus-free tissue can also be used.
[0019]
(Coating layer)
The coating layer (first coating layer) adjacent to the innermost layer is preferably composed of a lipophilic substance when the innermost layer is hydrophilic. As such a lipophilic substance, hardened fats and oils are preferably used. The next film layer (second film layer) is preferably a layer made of a hydrophilic substance, and the next film layer (third film layer) is preferably made of an oily substance.
[0020]
When the innermost layer is a lipophilic substance, the coating layer adjacent to the innermost layer (first coating layer) does not have a clear interface, but may be composed of a lipophilic substance or a hydrophilic substance. It may be configured.
[0021]
When the first film layer is a lipophilic substance, it can be a hardened oil and fat that is solid at room temperature and has a melting point different from that of the innermost oil and fat and is decomposed by an enzyme. In this case, the next film layer (second film layer) is preferably a layer made of a hydrophilic substance, and the next film layer (third film layer) is preferably made of an oily substance.
[0022]
When the first film layer is a hydrophilic substance, the first coating layer needs to be a substance that is decomposed by an enzyme or the like. Such materials include proteins, polysaccharides, biodegradable bioplastics and the like. These can be used alone or in combination of two or more. The next coating layer (second coating layer) is a layer made of a lipophilic substance, and the next coating layer (third coating layer) is preferably made of a hydrophilic substance.
[0023]
(Outermost layer)
The outermost coating layer is determined by the type of innermost layer and the number of layers. When the innermost layer is hydrophilic, the outermost layer is a lipophilic film layer if the capsule has a two-layer structure, and the hydrophilic film layer if the capsule has a three-layer structure. The outermost layer is preferably dried from the viewpoint of inhibiting enzyme activity.
[0024]
(Material of coating layer)
The coating layer only needs to be decomposed by an enzyme or the like. Therefore, it is not necessary for the entire coating layer to be decomposed by these enzyme substrates or microorganisms, and it is used as a part of the coating layer and is contained to such an extent that the coating layer can be disintegrated by being decomposed. It may be.
[0025]
Of the substances used as the coating layer, a hardened fat is preferably used as the lipophilic substance. The hardened fats and oils include fats and oils containing hardened oil as a main component, and include fats and oils prepared only to hardened oils or mixed with hardened oils with other fats and oils to have desired properties. Preferably, it is solid at normal temperature, has a melting point according to the purpose, and is hydrolyzed with lipases. Examples of the hardened oil and fat include triglycerides and diglycerides of medium chain fatty acids, and examples thereof include butter, margarine, shoning and cacao butter, but are not limited thereto.
[0026]
As the hydrophilic substance, proteins, polysaccharides and biodegradable plastics are preferably used.
[0027]
Examples of proteins include, but are not limited to, gelatin and collagen. These can be used alone or in combination of two or more. Particularly preferred proteins include gelatin that has a high oxygen barrier property after drying.
[0028]
As the polysaccharide, a polysaccharide forming a gel is preferably used. Such polysaccharides include, but are not limited to, starch, amylose, polygalacturonic acid, agar, carrageenan, gum arabic, gellan gum, xanthan gum, pectin, alginic acid and the like. These can be used alone or in combination of two or more.
[0029]
Biodegradable plastics include, but are not limited to, polylactic acid, polyhydroxybutyric acid, polyglutamic acid, mixtures thereof, and the like. These can be used alone or in combination of two or more.
[0030]
If necessary, the properties of the coating layer can be changed by adding sugar, sugar alcohol, polyhydric alcohol, pullulan, chitosan, chitin, amino acid, or the like to the biodegradable substance.
[0031]
(Enzymes or microorganisms that degrade the coating layer)
Examples of the enzyme or the like that decomposes hardened fats and oils include lipases and microorganisms that can produce lipases. Examples of microorganisms that produce lipase include Aspergillus niger and Candida rugosa. When used as an agrochemical or artificial seed, a detergent lipase can be used, and when a capsule is used for a pharmaceutical or food, a lipase for food processing can be used. The amount of enzyme or microorganism added depends on the purpose and conditions of use of the capsule, but is added in such an amount that water is given and the activity necessary for decomposing the inner membrane layer in an appropriate time is developed.
[0032]
Examples of enzymes that degrade proteins include proteases and microorganisms that produce proteases. When an enzyme is used, it may be necessary to select a protease (proteolytic enzyme) corresponding to the type of protein used. Examples of microorganisms that produce protease include Bacillus subtilis.
[0033]
As an enzyme etc. which decompose | disassemble a polysaccharide, the enzyme or microorganisms according to the kind of polysaccharide to be used are mentioned. For example, in the case of starch, amylases are used as enzymes, and examples of microorganisms that produce amylase include Bacillus subtilis. In the case of polygalacturonic acid, polygalacturonase is used, and examples of microorganisms that produce polygalacturonase include Aspergillus niger. Pectin is used in the case of pectin, and examples of microorganisms that produce pectinase include Aspergillus niger.
[0034]
Examples of enzymes that degrade polylactic acid and polyhydroxybutyric acid, which are biodegradable plastics, include esterases. Examples of microorganisms that produce these esterases include microorganisms of the genus Rhizopus. Examples of enzymes that degrade polyglutamic acid include peptidases, and examples of microorganisms that produce peptidases include Aspergillus oryzae.
[0035]
The above-mentioned example regarding the combination of the biodegradable substance used for the coating layer of the capsule of the present invention and the enzyme used for degrading this biodegradable substance or the microorganism producing the enzyme is only an example. The invention is not limited, and a combination of a biodegradable substance and an enzyme or a microorganism capable of decomposing the biodegradable substance can be appropriately selected from a book such as enzymology or biochemistry generally used by those skilled in the art.
[0036]
(Method for producing soft capsule of the present invention)
The soft capsule of the present invention is produced by a method such as a rotary method or a dropping method which is usually used by those skilled in the art. The soft capsule obtained by a technique well known to those skilled in the art can be a seamless soft capsule or a seamless so-called seamless soft capsule. Preferably, after molding, the outermost layer is dried.
[0037]
Hereinafter, the case where the three-layer seamless soft capsule which consists of an innermost layer, a hardened oil-and-fat layer (inner coat layer), and a gelatin layer (outer coat layer) is manufactured is demonstrated. The seamless soft capsule is most preferably produced by a dropping method using a triple nozzle. The production method of the seamless capsule is described in, for example, Bioscience and Industry, vol.58, No.7, p.31-34 (2000). Since the basic manufacturing method of the seamless soft capsule is a method already used industrially, mass production is easy.
[0038]
First, an innermost object is prepared by dispersing or dissolving in a liquid oil or aqueous solution. A gelatin solution for forming the outer film layer is prepared by dissolving the hardened fat and oil forming the inner film layer, and adding an appropriate amount of lipase to a gelatin solution having an appropriate concentration (for example, 18%). The inner solution, hardened oil and fat, and gelatin solution are put in a triple tube nozzle, and encapsulated by a submerged dropping method using a seamless soft capsule manufacturing machine. Capsule droplet formation and solidification are performed in a coagulated oil as low as possible in order to suppress enzyme activity, and a capsule with a three-layer structure is obtained. A dried capsule can be obtained by removing the coagulated oil from the obtained capsule and then quickly drying the drum. Drying is preferably performed quickly at a low temperature so that lipase does not work during drying.
[0039]
When a rugby ball type soft capsule is obtained by a rotary capsule manufacturing method, it has a two-layer structure of an innermost layer and a coating layer (outermost layer). When the coating layer (outermost layer) is gelatin, a dried gelatin sheet containing proteolytic enzymes or microorganisms is used.
[0040]
Alternatively, a soft capsule is produced without adding a proteolytic enzyme to the gelatin solution or gelatin film that initially forms the skin layer (outer skin layer), and then the surface is dissolved and coated with the proteolytic enzyme dissolved in a sugar solution. It may be dried. When the target product is dissolved in a hardened oil or fat or dispersed in a slurry, the surface of the gelatin film of a dry soft capsule containing lipase is coated with a proteolytic enzyme dissolved in a sugar solution. It may be dried.
[0041]
The resulting soft capsule is an environment in which the enzyme or microorganism can sufficiently exert its activity under predetermined conditions, for example, when water is supplied, set to an appropriate pH, or set to an appropriate temperature. When placed, the coating layer containing the enzyme or microorganism or the adjacent coating layer is degraded.
[0042]
The soft capsules of the present invention thus obtained are completely different from the single sphere beads of calcium alginate gel described as capsules in various academic literatures, patent literatures and the like. It is also different from wet calcium alginate gel beads.
[0043]
(Enteric bifidobacteria capsule)
Enteric bifidobacteria capsules are suspended in a hardened oil and fat obtained by heating and melting dry bifidobacteria powder, and this is used as the innermost layer in the above-mentioned three-layer seamless soft capsule manufacturing method. -A seamless soft capsule having a three-layer structure of an acid-resistant film layer (proteolytic enzyme and pectin-containing gelatin layer), which is quickly dried at low temperature, and is obtained by drying the outermost protein layer. The obtained enteric bifidobacteria capsule absorbs moisture, whereby the outermost protein is decomposed, the action of lipase in the intestine causes the hardened oil and fat layer to collapse, and the bifidobacteria are released into the intestine. .
[0044]
(Artificial seed)
Obtain reproducible plant cell tissues such as somatic embryos and PLB of appropriate sizes from cell tissues (somatic embryos, protocomb-like bodies (hereinafter referred to as PLB), etc.) produced in liquid or solid media, and suspend them in the medium. It becomes cloudy and becomes the contents of the capsule (innermost layer). A hard oil and fat that is solid at room temperature is used as the inner coating layer, and the outer coating layer is used as a solution of the above-described biodegradable substance (for example, a 22% gelatin solution) with an appropriate concentration. / G) and encapsulate by a submerged dropping method using a seamless soft capsule manufacturing machine with a triple tube nozzle. At this time, the pump is prepared so that the somatic embryos of the contents enter one by one. By performing the same treatment as described above, an encapsulated artificial seed in which the outermost outer skin layer is dried is obtained. Drying is preferably performed quickly at a low temperature so that cell tissues are not killed and lipase does not work. A schematic diagram of the artificial seed thus obtained is shown in FIG.
[0045]
The amount of lipase added to the outer membrane varies depending on the specific activity of the lipase. However, when artificial seeds are sown in soil or seedling pots and water is given, 6% of the hardened fats and oils in the inner membrane layer are applied at that temperature condition. The amount is such that it decomposes in time to 14 days. More preferably, the amount is such that the activity is such that it degrades in 1 to 7 days.
[0046]
The particle size of the encapsulated artificial seed obtained is 1 mm to 12 mm, although it varies depending on the size of the cell tissue. More preferably, it is 3 mm to 10 mm.
[0047]
The artificial seed of the present invention thus obtained can be stored for more than 2 months while maintaining the germination ability at room temperature such as a dry barn, and needs to be specially stored in a refrigerator or low-temperature water. There is no. If stored in a refrigerator at 10 ° C. or lower, long-term storage for 4 months or longer is possible.
[0048]
The encapsulated artificial seed of the present invention is sown in soil and sprayed with water. If the outer film layer is gelatin, the gelatin layer swells, and then the hardened fat that is the inner film layer acts by the action of lipase. It decomposes quickly and collapses. At that time, oxygen permeability is increased, and it is considered that the state awakens from the dormant state and shifts to the germination state.
[0049]
(Plant growth hormone)
In the case of plant growth hormone, a plant growth hormone aqueous suspension is used as the innermost layer, the inner skin layer is hardened oil and fat, and the outer skin layer is gelatin mixed with lipase to obtain a three-layer capsule. By embedding this capsule in the root of the crop, the hormone does not act in the dry state, but the capsule quickly disintegrates due to flooding or rain, and the hormone acts.
[0050]
【Example】
EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples, but it is needless to say that the present invention is not limited to these examples.
[0051]
(Example 1: Dye-encapsulated capsule)
A seamless three-layer dry capsule was prepared using Edible Red No. 2 aqueous solution as the content liquid (innermost layer), hardened fat as inner film layer, and lipase-added gelatin as outer film layer.
[0052]
Specifically, a 0.1% (w / v) aqueous solution of Edible Red No. 2 was used as the content liquid (innermost layer), and the inner coating layer was a hardened oil of triglyceride having a melting point of 32 ° C. As the outer coating layer, liquid lipase (Novozyme 398, manufactured by Novo Nordisk Bioindustry Co., Ltd.) in a 22% (w / v) gelatin solution at various concentrations (w / v) as shown in Table 1 A mixture was used. The volume ratio of each layer was content liquid layer / inner coating layer / outer coating layer = 3: 3: 4. Encapsulation was encapsulated in solidified oil by a conventional method using an aseptic seamless soft capsule manufacturing machine with a triple tube nozzle, and immediately after deoiling, drum dried while sending dry air at 10 ° C. The particle diameter of the surface-dried three-layer capsule was 7 mm.
[0053]
These capsules were stable because they were put in a polyethylene bag containing silica gel and the content liquid did not appear on the surface even after being stored at 20 ° C. for 3 months.
[0054]
The capsules immediately after preparation and the capsules stored for 3 months under the above conditions were placed in a petri dish for 50 each, sprayed with water uniformly by spraying, and kept warm in an incubator at 25 ° C. The time during which red spots of the content liquid were observed on the surface over time was observed, and 50 grains were averaged to determine the film disintegration time. The results are shown in Table 1.
[0055]
[Table 1]

[0056]
As shown in Table 1, the capsules that did not contain lipase in the outer film layer took a very long time to collapse the inner film layer. On the other hand, capsules containing lipase in the outer film layer have a significantly shorter film disintegration time, and as the amount of lipase added is increased, the time for decomposing the hardened oil and fat as the inner film layer is shortened. Even after storage for 3 months, no water volatilization was observed in the content liquid wrapped with hardened oil and gelatin. It was observed that the lipase activity was reduced by about 8%, but the effect of adding the lipase was observed in a similar manner. From this, it was shown that the capsule of the present invention is extremely stable even when stored at room temperature in a dry state and can withstand long-term storage. Furthermore, it was shown that by adjusting the amount of lipase added to the outer film layer, it is possible to disintegrate the film layer in a desired time by supplying water.
[0057]
(Example 2: Artificial seed encapsulating carrot somatic embryo)
Production of carrot cultured cells and somatic embryos was carried out according to the method described in “Plant cell tissue culture” (1979, edited by Harada, Komazaki, Riken), p. 91-104, using carrot roots. . Somatic embryos having a size of 1.4 mm to 1.7 mm were selected and obtained from somatic embryos produced in a liquid medium using a nylon mesh having a mesh size of 1.4 mm and 1.7 mm. These selected somatic embryos had a shape ranging from a heart type to a torpedo type. These somatic embryos were suspended in an MS medium containing no hormone and 0.2% chitosan to obtain the contents of the capsule.
[0058]
Encapsulation was carried out in the same manner as in Example except that the contents were changed, the pump was adjusted so that the somatic embryos in the contents liquid (innermost layer) entered one by one, and the lipase added to the gelatin of the outer skin layer was 0.05% In the same manner as in No. 1, it was carried out by a submerged dropping method using a sterile seamless soft capsule manufacturing machine with a triple tube nozzle. The particle diameter of the artificial seed of the encapsulated somatic embryo whose outermost layer was dried was 7 mm.
[0059]
As Comparative Example 1, encapsulated carrot somatic embryos were prepared in the same manner as in Example 2 except that lipase was not added to the gelatin coating layer.
[0060]
As Comparative Example 2, an alginate gel bead-embedded carrot somatic embryo was prepared. That is, calcium alginate gel beads embedded with somatic embryos by suspending the somatic embryos produced and selected in Example 2 in MS medium containing 3% (w / v) sodium alginate and dropping them into a 50 mM calcium chloride solution. (Particle size about 6 mm) was prepared. This is the same as that conventionally reported as an artificial seed.
[0061]
(Sprouting test 1: Effect of adding lipase to the outer skin layer)
Artificial seeds (Example 2) containing lipase in the outer membrane layer encapsulating the carrot somatic embryos and artificial seeds (Comparative Example 1) containing no lipase were prepared. Immediately after the preparation, 100 artificial seeds were sown at a depth of 3 cm from the topsoil in a pot containing soil from a field where soil sterilization was not performed, and watered. After sowing, it was placed in an incubator at 25 ° C. and sprinkled once every two days while illuminating at 3000 Lux for 16 hours per day. Table 2 shows the results of counting the number of germinations after 1 week, 2 weeks and 3 weeks.
[0062]
[Table 2]

[0063]
As shown in Table 2, artificial seeds containing lipase in the outer skin layer rapidly decompose hardened fats and oils in the inner skin layer and germination is observed in 2 weeks, whereas artificial seeds not containing lipase are in 2 weeks. No germination was observed, and it was found that germination took 3 weeks. From this result, it is shown that the capsules with controlled disintegration of the present invention are superior as artificial seeds because the inner film layer (hardened oil) disintegrates and germinates much more quickly than conventional capsules. It was.
[0064]
(Storage and germination test 2)
The artificial seed of capsule-encapsulated somatic embryo containing lipase in the outer membrane layer prepared in Example 2 above and the somatic embryo embedded with calcium alginate gel beads of Comparative Example 2 in a thermostat at 20 ° C. and 50% humidity for 2 months Saved for a while. Although no change in appearance was observed in the encapsulated artificial seed of Example 2, the calcium alginate gel beads of Comparative Example 2 were considerably dried on the third day, and the beads became small. Dried and dried. At the time of artificial seed preparation, one month and two months later, 100 seeds were seeded at a depth of 2 cm from the topsoil in a pot containing soil in a field where soil sterilization was not performed, and watered. After sowing, the pot was placed in an incubator with illumination at 25 ° C. and 3000 Lux for 16 hours, watered once every two days, and the number of germination after 2 weeks was counted. The results are shown in Table 3.
[0065]
[Table 3]

[0066]
As shown in Table 3, the germination rate immediately after preparation was almost the same in Example 2 and Comparative Example 2, but when stored for more than one month, germination was completely germinated in Comparative Example 2, which is a conventional artificial seed. I didn't. Germination was observed at a high rate in the soft-encapsulated artificial seed of the present invention. From these results, it was shown that the soft capsules of the present invention containing somatic embryos are superior to the conventional seeds of the somatic embryo type embedded in alginate gel beads embedded somatic embryos in terms of storage stability as artificial seeds. Moreover, since it germinates at a high rate even after long-term storage, it was shown to be practically used as an artificial seed.
[0067]
Example 3 Artificial Seeds Encapsulating Strawberry Leaf Buds
The shoot apical tissue extracted from the cultivated strawberries was placed in MS medium containing 10 g / l sucrose and 2 g / l gellan gum as a gelling agent, cultured for 14 days at 25 ° C. in the dark, and 0.2 mg benzyladenine The mixture was transferred to an MS liquid medium containing 1 g / l and 10 g / l sucrose, and cultured with shaking at 150 rpm while irradiating at 2000 Lux for 16 hours at 25 ° C. per day. After culturing for 30 days, the obtained leaf buds were selected using a nylon mesh having a mesh size of 1.4 mm and 2 mm, and leaf buds having a size of 1.4 mm to 2 mm were obtained. The obtained leaf buds were suspended in an MS liquid medium not containing hormones to obtain capsule contents.
[0068]
Encapsulation, except changing the contents to a leaf bud suspension and adjusting the pump so that the leaf buds of the contents liquid (innermost layer) enter one by one, except that the lipase added to the gelatin of the outer skin layer is 0.05% Was carried out in the same manner as in Example 1 by a dropping method in liquid using a sterile seamless soft capsule manufacturing machine with a triple tube nozzle. The obtained capsules were dried at a low temperature in the same manner as in Example 1 to obtain dried encapsulated strawberry leaf bud artificial seeds. The particle size after drying the outermost layer was 8 mm.
[0069]
On the other hand, as Comparative Example 3, encapsulated strawberry leaf buds having a dried outer coating layer were prepared in the same manner as in Example 3 except that lipase was not added to the gelatin solution.
[0070]
(Germination test 3)
As in the germination test in Example 2, the encapsulated strawberry leaf bud artificial seed containing lipase in the outer skin layer of Example 3 and the encapsulated strawberry leaf bud artificial seed not containing lipase in Comparative Example 3 were prepared at 20 ° C. It was stored in an incubator with a humidity of 50% for 2 months, and a germination test was conducted in the same manner as the germination test 1. The results are shown in Table 4.
[0071]
[Table 4]

[0072]
As shown in Table 4, even in the artificial seed of encapsulated strawberry leaf bud, Example 3 in which lipase was added to the outer skin layer of the capsule was shown to germinate faster than Comparative Example 3 in which lipase was not added. It was.
[0073]
In addition, the encapsulated strawberry leaf bud artificial seeds with lipase added to the outer skin layer after storage for 2 months showed a high rate of rapid germination, much better than the artificial seeds without lipase added. It was shown that.
[0074]
(Example 4: pharmaceutical capsule)
Cilostazol, which has an inhibitory action on platelet aggregation, is suspended in a hardened fat with a melting point of 42 ° C. at a rate of 1 g / 3 g (w / w), and the suspension is used as the content liquid (innermost layer). The inner coating layer was used. As an outer coating layer, 0.05% (powder lipase manufactured by Nagase Seikagaku Corporation, lipase A-10FG) is added to a 20% (w / v) gelatin solution containing 5% (w / w) pectin. What was added in the ratio of w / w) was used. These were encapsulated in coagulated oil using a seamless soft capsule manufacturing machine with a triple tube nozzle, quickly deoiled, and then drum dried while sending dry air at 10 ° C. The particle size of the capsule after drying was 2.5 mm. In 1 g of this capsule, 100 mg of cilostazol is contained.
[0075]
Separately, as Comparative Example 4, a capsule having a dried outer coating layer was prepared in the same manner as in Example 5 except that lipase was not added to the outer coating layer.
[0076]
(Absorption test)
Six female big dogs were grouped as a group, and 1 g of capsules containing lipase was orally administered to the outer membrane layer prepared in Example 4. As a control, another 6 groups were orally administered with 1 g of capsules containing no lipase in the outer skin layer prepared in Comparative Example 4. The blood was sampled over time, the time for cilostazol to reach the maximum blood concentration was determined, and the average values of 6 animals in each group were compared. As a result, the average value of the group using the capsule of Comparative Example 4 was 6 hours, whereas the average value of the group using the capsule of Example 4 was as short as 4.5 hours. That is, it was found that the capsule in which the lipase was included in the outer film layer of Example 5 collapsed the inner film layer in a shorter time than Comparative Example 4, and the drug was absorbed from the intestine. The medicinal capsule of the present invention is expected to promptly show the effect of the contained drug, so that the superiority of the capsule of the present invention is clear.
[0077]
(Example 5: Capsule containing microorganisms in outer film layer)
Candida rugosa IFO 0591 strain, which is known to secrete lipase, is designated as IFO No. The cells were cultured in 108 liquid medium, 100 ml of the culture broth was centrifuged at 4 ° C. and 8000 rpm for 20 minutes, the supernatant was discarded, and the cells were collected and resuspended in 100 ml of water. This suspension was added to a 22% (w / w) gelatin solution at a rate of 10% (v / v) and mixed to obtain a solution for an outer film layer. Otherwise, the red pigment was encapsulated in the same manner as in Example 1, dried, and further dried for 24 hours in a desiccator containing concentrated sulfuric acid.
[0078]
These capsules were stable because they were put in a polyethylene bag containing silica gel and the content liquid did not appear on the surface even after being stored at 20 ° C. for 3 months.
[0079]
The capsules immediately after preparation and the capsules stored for 3 months under the above conditions were placed in a petri dish for 50 each, sprayed with water uniformly by spraying, and kept warm in an incubator at 25 ° C. The time during which red spots of the content liquid were observed on the surface over time was observed, and 50 grains were averaged to determine the film disintegration time. The results are shown in Table 5.
[0080]
[Table 5]

[0081]
As shown in Table 5, the capsule containing lipase in the outer film layer has a significantly shorter film disintegration time. The capsule of the present invention is a kind of dry-immobilized cells, but in a dry state, it is stable after storage for 3 months at room temperature, and the delay of disintegration time is not as large as about 6%, and it can withstand long-term storage It has been shown.
[0082]
【The invention's effect】
The capsule of the present invention containing an enzyme or microorganism that degrades the coating layer in the coating layer decomposes the coating layer according to the activity of the enzyme when given moisture, and the coating layer is formed at a desired time and place. It can be disintegrated and enables quick release of contents, contact between contents and the outside, and mixing, and can be applied to artificial seeds, drugs for drug delivery systems, isolation of unstable components, sustained release agricultural chemicals, etc. .
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a schematic diagram showing the shape of an artificial seed of the present invention.

Claims

最内層と、該最内層を覆う内皮膜層と、該内皮膜層を覆う外皮膜層とを有する三層構造のシームレスソフトカプセルであって、該内皮膜層が、硬化油脂を含む皮膜であり、そして、該外皮膜層が、硬化油脂を分解し得る酵素または微生物を含有し、かつ乾燥されている、シームレスソフトカプセル。And the innermost layer, and the film layer inner covering innermost layer, seamless soft capsule der three-layer structure having an outer film layer which covers the inner coating layer, the inner coating layer, with a film containing fats A seamless soft capsule wherein the outer skin layer contains an enzyme or microorganism capable of degrading hardened oil and fat , and is dried .

前記外皮膜層が、ゼラチンを含む皮膜である、請求項１に記載のシームレスソフトカプセル。The seamless soft capsule according to claim 1, wherein the outer film layer is a film containing gelatin.

前記最内層に、医薬、農薬もしくは再分化可能な植物細胞組織が含まれている、請求項１または２に記載のシームレスソフトカプセル。Wherein the innermost layer, medicine, contains pesticide or re differentiable plant cell tissue, seamless soft capsule according to 請 Motomeko 1 or 2.

再分化可能な植物細胞組織を含有する最内層と、該最内層を覆う内皮膜層と、該内皮膜層を覆う外皮膜層とを有する三層構造のシームレスソフトカプセルからなる人工種子であって、該内皮膜層が、硬化油脂を含む皮膜であり、そして、該外皮膜層が、硬化油脂を分解し得る酵素または微生物を含有し、かつ乾燥されている、人工種子。An artificial seed comprising an innermost layer containing regenerative plant cell tissue, an inner skin layer covering the innermost layer, and a seamless soft capsule having a three-layer structure having an outer skin layer covering the inner skin layer, The artificial seed in which the inner film layer is a film containing a hardened oil and fat, and the outer film layer contains an enzyme or a microorganism capable of decomposing the hardened oil and fat , and is dried.

前記外皮膜層が、ゼラチンを含む皮膜である、請求項４に記載の人工種子。The artificial seed according to claim 4, wherein the outer film layer is a film containing gelatin.