JP4614258B2 - 崩壊性が改良されたソフトカプセル - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、乾燥状態で保存安定性が高く、水分のある状態に移すと、所望の時間で皮膜層が崩壊し、内外の遮断が解除されるソフトカプセルに関する。より詳しくは、本発明は、二層以上の構造を有するソフトカプセルであって、皮膜層にその皮膜層あるいは隣接する皮膜層を分解する酵素を含ませたカプセルに関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年の技術の進展に伴い、液体、粉体、細胞などをカプセル化する事が可能になってきた。しかし、そのカプセルを所望の条件下で速やかに崩壊させることは未だに困難である。特に、いわゆるドラッグデリバリーシステムにおける腸や大腸などの所望の部位におけるカプセルの崩壊と薬剤の放出、土壌に散布したカプセル化農薬の適当な水分条件下での放出、あるいは土壌または育成容器に播種された人工種子の速やかな力プセル崩嬢による発芽誘導などが望まれているが、未だ、満足すべき所望の崩壊性を有するカプセルは提供されていないのが実状である。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
そこで、所望の部位、場所、条件等で崩壊するカプセルが求められている。このようなカプセルが得られれば、所望の部位で活性を発揮する各種医薬品、乳酸菌などの有用微生物の所望の部位への輸送、さらには不定胚等の組織に対して適用して人工種子とするなど、広範な応用が可能となる。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の課題を解決するため、鋭意研究を行った結果、カプセルの皮膜層中に皮膜層を分解できる酵素または微生物を含有させた乾燥カプセルを得ることに成功し、得られたカプセルを望む場所に置いて水分及び温度をコントロールすると、含ませている酵素または微生物が働き始め、その条件に応じた速度で皮膜が崩壊することを認め、本発明を完成させるに至った。
【０００５】
すなわち、本発明は最内層と該最内層を覆うように順次積層された１または２以上の皮膜層を有する多層構造のソフトカプセルであって、該皮膜層の少なくとも１つの皮膜層が酵素または微生物を含有し、所定条件下、該酵素または微生物がこれを含有する皮膜層あるいは他の皮膜層を分解するように構成されたソフトカプセルに関する。
【０００６】
好ましい実施態様においては、前記ソフトカプセルの最外層の皮膜層に前記酵素または微生物が含有され、該最外層の皮膜層が乾燥されている。
【０００７】
より好ましい実施態様においては、前記ソフトカプセルが、最内層と、該最内層を覆う内皮膜層と、該内皮膜層を覆う外皮膜層とを有する三層構造のカプセルであり、該外皮膜層に該内皮膜層を分解し得る酵素または微生物が含まれている。
【０００８】
好ましい実施態様においては、前記乾燥ソフトカプセルの皮膜層が、タンパク質、多糖類、硬化油脂、および生分解性プラスチックからなる群から選択される物質で形成された皮膜層である。
【０００９】
また、好ましい実施態様においては、前記酵素が、タンパク質分解酵素、多糖類分解酵素、硬化油脂分解酵素、またはエステル分解酵素である。
【００１０】
さらに好ましい実施態様においては、前記最内層には、医薬、農薬もしくは再分化可能な植物細胞組織が含まれ、前記内皮膜層は硬化油脂を主成分とし、そして、前記外皮膜層が硬化油脂を分解し得る酵素または微生物を含む乾燥された外皮膜層である。
【００１１】
別の好ましい実施態様においては、前記ソフトカプセルが、シームレスソフトカプセルおよび継ぎ目のあるソフトカプセルからなる群から選択される。
【００１２】
また、別の本発明は、再分化可能な植物細胞組織を含有する最内層と、該最内層を覆う内皮膜層と、該内皮膜層を覆う外皮膜層とを有する三層構造のソフトカプセルからなり、該内皮膜層は硬化油脂を主成分とし、そして、該外皮膜層が硬化油脂を分解し得る酵素または微生物を含む乾燥された外皮膜層である、人工種子に関する。
【００１３】
【発明の実施の形態】
（本発明のソフトカプセルの構造）
本発明のソフトカプセルは、最内層と該最内層を覆うように順次積層された１または２以上の皮膜層を有する多層構造のソフトカプセルである。従って、二層構造、三層構造、四層構造などであり得る。例えば、三層構造の場合、図１に示す構造をとり得る。なお、図１は、ソフトカプセルを人工種子として用いる場合の模式図である。
【００１４】
二層構造の場合、最内層とこの最内層を覆う皮膜層（最外層）からなる。この皮膜層（最外層）には、この皮膜層を分解できる酵素または微生物が含有されている。酵素活性の抑制などの目的で、この皮膜層（最外層）は乾燥されていることが好ましい。
【００１５】
三層構造の場合、図１に示すように、最内層と最内層を覆う内皮膜層と、内皮膜層を覆う外皮膜層からなっている。この内皮膜層および外皮膜層の少なくとも一方の層に、いずれかの皮膜層を分解し得る酵素あるいは微生物（以下、総称して酵素等という）が含まれている。例えば、内皮膜層にこの内皮膜層を分解し得る酵素等か、外皮膜層を分解し得る酵素等か、あるいは両方の酵素等を含ませることができる。外皮膜層にも、この外皮膜層を分解し得る酵素等か、内皮膜層を分解し得る酵素等か、あるいは両方の酵素等を含ませることができる。酵素等が含まれる皮膜層がその酵素等によって分解されるときは、その皮膜層は酵素活性を抑制するために乾燥されていることが好ましい。
【００１６】
好ましい三層構造のソフトカプセルは、外皮膜層に内皮膜層を分解し得る酵素等が含まれているが、内皮膜層には酵素等は含まれていない。外皮膜層内の酵素活性を抑制しておくことが、保存中の内皮膜層の分解を防止する点から好ましいので、外皮膜層は、好ましくは、乾燥されている。
【００１７】
本発明のソフトカプセルは、隣接する層の極性が相互に異なることが好ましく、例えば、親水性層／油性層／親水性層などのように、交互に極性の異なる層であることが好ましい。最内層が水性物質である場合、この最内層を覆う皮膜層は、耐水性の油性層であることが、カプセル形成に必要なだけでなく、最内層の水分の揮散を防止するためにも重要である。
【００１８】
（最内層）
カプセルの最内層には所望の場所、条件下で放出される物質が含まれる。最内層に含まれる物質は、親水性、油性、あるいは粉末であり得る。最内層に含まれ得る物質としては、医薬品、農薬、微生物菌体、再分化可能な植物細胞組織などが挙げられる。最内層に含まれる医薬品は、特に制限されない。例えば、抗血小板作用を有するシロスタゾールなどの結晶性の粉末の場合は、硬化油脂への懸濁状態で、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）とドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）などの油脂類はそのままの形態で、あるいはエマルジョンの形態で、最内層に含ませることもできる。微生物菌体としては、ビフィズス菌、乳酸菌などの有用微生物が挙げられる。これらの微生物は水溶液としてあるいは乾燥粉末として最内層に含まれる。乾燥粉末の場合、液体油脂に懸濁して用いることができる。再分化可能な植物細胞組織としては、不定胚、不定芽、多芽体、茎頂、生長点、不定根、毛状根、プロトコルム様球体などが好ましく用いられる。ウィルスフリー組織を用いることもできる。
【００１９】
（皮膜層）
最内層に隣接する皮膜層（第１の皮膜層）としては、最内層が親水性の場合、親油性の物質で構成されることが好ましい。このような親油性の物質としては、硬化油脂が好ましく用いられる。次の皮膜層（第２の皮膜層）は、親水性の物質からなる層であり、次の皮膜層（第３の皮膜層）は油性物質からなることが好ましい。
【００２０】
最内層が親油性の物質の場合、最内層に隣接する皮膜層（第１の皮膜層）は、界面は明確にならないが、親油性の物質で構成されてもよいし、親水性の物質で構成されてもよい。
【００２１】
第１の皮膜層が親油性の物質である場合、最内層の油脂とは融点の異なる常温で固体の、酵素で分解される硬化油脂であり得る。この場合、次の皮膜層（第２の皮膜層）は、親水性の物質からなる層であり、次の皮膜層（第３の皮膜層）は油性物質からなることが好ましい。
【００２２】
第１の皮膜層が親水性の物質である場合、酵素等で分解される物質であることが必要である。このような物質として、タンパク質、多糖類、生分解生プラスチックなどが挙げられる。これらは、それぞれ単独で、あるいは２以上組合せて用いることができる。次の皮膜層（第２の皮膜層）は、親油性の物質からなる層であり、さらに次の皮膜層（第３の皮膜層）は親水性物質からなることが好ましい。
【００２３】
（最外層）
最外層の皮膜層は、最内層の種類と層の数によって決定される。最内層が親水性の場合、カプセルが二層構造であれば最外層は親油性の皮膜層であり、三層構造であれば親水性の皮膜層である。最外層は、酵素活性の抑制の点から、乾燥されていることが好ましい。
【００２４】
（皮膜層の材質）
皮膜層は、酵素等により分解されるものであればよい。従って、皮膜層全体がこれらの酵素の基質または微生物で分解されるものである必要はなく、皮膜層の一部として使用され、分解されることによって皮膜層が崩壊できる程度に含まれているものであってもよい。
【００２５】
皮膜層として用いられる物質のうち、親油性の物質としては、硬化油脂が好ましく用いられる。硬化油脂は、硬化油を主成分とする油脂を含み、硬化油のみの油脂、あるいは、硬化油に他の油脂などを混合して、所望の性質を有する様に調製した油脂を含む。好ましくは、常温では固体であり、目的に応じた融点を有し、リパーゼ類で加水分解される。硬化油脂としては、中鎖脂肪酸のトリグリセリドやジグリセリド等が挙げられ、バター、マーガリン、ショ一トニングやカカオバター等が例示できるが、これらに限定されない。
【００２６】
親水性の物質としては、タンパク質、多糖類、生分解性プラスチックスが好ましく用いられる。
【００２７】
タンパク質としては、ゼラチン、コラーゲン等が挙げられるが、これらに限定されない。これらはそれぞれ単独で、あるいは２以上組合わせて用いることができる。特に好ましいタンパク質としては、乾燥後、酸素バリアー性が高くなるゼラチンが挙げられる。
【００２８】
多糖類としては、ゲルを形成する多糖が好ましく用いられる。このような多糖類としては、デンプン、アミロース、ポリガラクツロン酸、寒天、カラギーナン、アラビアガム、ジェランガム、キサンタンガム、ペクチン、アルギン酸等が挙げられるが、これらに限定されない。これらは、それぞれ単独で、あるいは２以上組合わせて用いることができる。
【００２９】
生分解性プラスチックスとしては、ポリ乳酸、ポリヒドロキシ酪酸、ポリグルタミン酸、それらの混合物等が挙げられるが、これらに限定されない。これらは、それぞれ単独で、あるいは２以上組合わせて用いることができる。
【００３０】
また、必要に応じて、上記生分解性の物質に、糖、糖アルコール、多価アルコール、プルラン、キトサン、キチン、アミノ酸等を添加することで、皮膜層の性質を変えることができる。
【００３１】
（皮膜層を分解する酵素または微生物）
硬化油脂を分解する酵素等としては、リパーゼ類及びリパーゼを生産し得る微生物が挙げられる。リパーゼを生産する微生物としては、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、キャンディダ・ルゴーサ（Candida rugosa）などが挙げられる。農薬や人工種子として用いるときには、洗剤用リパーゼを用いることができ、カプセルを医薬品、食品に用いるときには、食品加工用リパーゼを用いることができる。酵素あるいは微生物の添加量は、カプセルの使用目的、使用条件によっても異なるが、水分が与えられ、適切な時間で内皮膜層を分解するのに必要な活性を発現する量を添加する。
【００３２】
タンパク質を分解する酵素等としては、プロテアーゼ類およびプロテアーゼを生産する微生物が挙げられる。酵素を用いる場合、使用するタンパク質の種類によっては、それに応じたプロテアーゼ類（タンパク質分解酵素）を選択することが必要になる場合がある。プロテアーゼを生産する微生物としては、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）などが挙げられる。
【００３３】
多糖類を分解する酵素等としては、用いる多糖類の種類に応じた酵素または微生物が挙げられる。例えば、デンプンの場合は酵素としてアミラーゼ類が用いられ、アミラーゼを生産する微生物としては、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）などが挙げられる。また、ポリガラクツロン酸の場合はポリガラクツロナーゼが用いられ、ポリガラクツロナーゼを生産する微生物としては、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）などが挙げられる。ペクチンの場合はぺクチナーゼが用いられ、ぺクチナーゼを生産する微生物としては、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）などが挙げられる。
【００３４】
生分解性プラスチックスであるポリ乳酸、ポリヒドロキシ酪酸を分解する酵素としては、エステラーゼ類が挙げられ、これらのエステラーゼを生産する微生物としては、リゾプス属の微生物が挙げられる。ポリグルタミン酸を分解する酵素としてはぺプチダーゼ類が挙げられ、ぺプチダーゼを生産する微生物としては、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）などが挙げられる。
【００３５】
本発明のカプセルの皮膜層に用いられる生分解性の物質と、この生分解性物質を分解するために用いる酵素またはその酵素を生産する微生物との組合せに関する上記例はほんの一例にすぎず、本発明を制限するものではなく、当業者が一般に用いる酵素学、生化学などの成書などから生分解性の物質とこれを分解し得る酵素あるいは微生物との組み合わせを適宜選択できる。
【００３６】
（本発明のソフトカプセルの製造方法）
本発明のソフトカプセルは、当業者が製造する際に通常用いるロータリー法、滴下法などの方法により、製造される。上記当業者に周知の技術で得られるソフトカプセルは、継ぎ目のあるソフトカプセル、継ぎ目のない、いわゆるシームレスソフトカプセルであり得、好ましくは、成形後、最外層が乾燥される。
【００３７】
以下、具体的に、最内層、硬化油脂層（内皮膜層）、およびゼラチン層（外皮膜層）からなる三層シームレスソフトカプセルを製造する場合について説明する。シームレスソフトカプセルは、三重ノズルを用いた滴下法で製造する事が最も望ましい。シームレスカプセルの製造方法は、例えば、バイオサイエンスとインダストリー、vol.５８、No.７、p.３１〜３４（２０００）に記載されている。このシームレスソフトカプセルの基本的な製造方法は、すでに工業的に使用されている方法であるため、大量生産は容易である。
【００３８】
まず、最内層の目的物を液体油脂あるいは水溶液などに分散あるいは溶解して準備する。内皮膜層を形成する硬化油脂を溶解し、他方で適切な濃度（例えば、１８％）のゼラチン溶液に適切な量のリパーゼを添加して、外皮膜層を形成用のゼラチン溶液を調製する。三重管ノズルに、内溶液、硬化油脂、およびゼラチン溶液を入れ、シームレスソフトカプセル製造機を用いて、液中滴下法によりカプセル化する。カプセル滴形成と固化は、酵素活性を抑制するため、できる限り低温の凝固油中で行い、三層構造のカプセルとする。得られたカプセルから凝固油を脱油後、速やかにドラム乾燥する事により乾燥カプセルが得られる。乾燥は、乾燥中にリパーゼが働かないように低温で速やかに行うのが好ましい。
【００３９】
ロータリー式カプセル製造方法でラグビーボール型のソフトカプセルを得る場合、最内層と皮膜層（最外層）の二層構造となる。皮膜層（最外層）をゼラチンとする場合、タンパク質分解酵素または微生物を含ませた乾燥したゼラチンシートを用いる。
【００４０】
あるいは、最初皮膜層（外皮層）を形成するゼラチン液あるいはゼラチン膜にはタンパク質分解酵素を添加しないでソフトカプセルを製造し、ついで、表面にタンパク質分解酵素を糖液などに溶解してコーティングし、速やかに乾燥させてもよい。目的物を硬化油脂に溶解またはスラリー状に分散させたものを内容物とする場合、リパーゼを含有する乾燥したソフトカプセルのゼラチン膜の表面にタンパク質分解酵素を糖液などに溶解してコーティングし、速やかに乾燥させてもよい。
【００４１】
得られるソフトカプセルは、所定の条件下、例えば、水分が供給された場合、適切なｐＨに設定された場合、適切な温度に設定された場合など、酵素または微生物がその活性を充分に発揮できる環境におかれた時に、その酵素または微生物が含まれる皮膜層または隣接する皮膜層が分解される。
【００４２】
このようにして得られる本発明のソフトカプセルは、種々の学術文献、特許文献等の記述において、カプセルとして表記されているアルギン酸カルシウムゲルの単一球のビーズとは全く異なるものである。さらに、湿潤アルギン酸カルシウムゲルビーズとも異なるものである。
【００４３】
（腸溶性ビフィズス菌カプセル）
腸溶性ビフィズス菌カプセルは、乾燥ビフィズス菌粉末を加温融解した硬化油脂に懸濁し、これを最内層として、上記三層シームレスソフトカプセルの製造方法で乾燥ビフィズス菌懸濁硬化油脂内溶液−硬化油脂層−耐酸性皮膜層（タンパク質分解酵素とペクチン含有ゼラチン層）の三層構造のシームレスソフトカプセルとし、これを速やかに低温乾燥して、最外層のタンパク質層を乾燥させることにより得られる。得られた腸溶性ビフィズス菌カプセルは、水分を吸収することにより、最外層のタンパク質が分解され、腸内でリパーゼの作用を受けて硬化油脂層が崩壊し、ビフィズス菌が腸内に放出される。
【００４４】
（人工種子）
液体培地あるいは固体培地で作出した細胞組織（不定胚、プロトコーム様体（以下、ＰＬＢという）等）から適切な大きさの不定胚やＰＬＢなどの再分化可能植物細胞組織を取得し、培地に懸濁し、カプセルの内容物（最内層)とする。内皮膜層として常温で固体の硬化油脂を用い、外皮膜層を適切な濃度の上記生分解性物質の溶液（例えば、２２％ゼラチン溶液）として、その溶液に適当量のリパーゼ（例えば、２００ユニット／ｇ）を添加し、三重管ノズルのシームレスソフトカプセル製造機を用いて液中滴下法によりカプセル化する。この時、内容物の不定胚が一個ずつ入るようにポンプを調製する。上記と同様の処理を行い、最外層の外皮膜層が乾燥された、カプセル化した人工種子が得られる。乾燥は、細胞組織が死滅せず、リパーゼも働かないように低温で速やかに行うのが好ましい。このようにして得られる人工種子の模式図を、図１に示す。
【００４５】
外皮膜に添加するリパーゼの量は、リパーゼの比活性によっても異なるが、人工種子を土壌あるいは育苗ポット等に播種して水を与えたときに、その温度条件で内皮膜層の硬化油脂を６時間〜１４日間で分解するような量とする。より好ましくは、１日間〜７日間で分解する様な活性を発現する量とする。
【００４６】
得られるカプセル化人工種子の粒径は、細胞組織のサイズによっても異なるが、１ｍｍ〜１２ｍｍである。より好ましくは、３ｍｍ〜１０ｍｍである。
【００４７】
このようにして得られた本発明の人工種子は、乾燥した納屋などの室温で発芽能力を保持したまま、２ヶ月以上保存する事が可能であり、特別に冷蔵庫や、低温水中で保存する必要はない。１０℃以下の冷蔵庫で保存するなら、４ヶ月以上の長期保存が可能である。
【００４８】
本発明のカプセル化人工種子は、土壌中に播種し、水を散布することで、外皮膜層がゼラチンであればゼラチン層が膨潤し、続いて内皮膜層である硬化油脂がリパーゼの作用で速やかに分解され、崩壊に至る。その時、酸素透過性が上がり、休眠状態から目覚め、発芽状態に移行すると考えられる。
【００４９】
（植物生長ホルモン）
植物生長ホルモンの場合、植物生長ホルモン水懸濁溶液を最内層とし、内皮膜層を硬化油脂とし、外皮膜層はリパーゼを混合したゼラチンとすることで、三層カプセルを得る。このカプセルを作物の根部に埋め込むことで、乾燥状態ではホルモンは作用せず、撒水または降雨によりカプセルは速やかに崩壊し、ホルモンが作用することになる。
【００５０】
【実施例】
以下、本発明を実施例によって更に具体的に説明するが、本発明がこれらの実施例に限定されないことはいうまでもない。
【００５１】
（実施例１：色素封入カプセル）
食用赤色２号水溶液を内容液（最内層）とし、硬化油脂を内皮膜層、リパーゼを添加したゼラチンを外皮膜層にして、シームレスの三層乾燥カプセルを調製した。
【００５２】
詳しくは、食用赤色２号の０．１％（ｗ／ｖ）水溶液を内容液（最内層）とし、内皮膜層を融点３２℃のトリグリセリドの硬化油（ファーマゾルＢ−１１５、日本油脂（株）製）とし、外皮膜層として、２２％（ｗ／ｖ）ゼラチン溶液に液状リパーゼ（ノボザイム３９８、ノボノルディスクバイオインダストリー（株）製）を表１に示すような各種濃度（ｗ／ｖ）で混合したものを用いた。各層の体積比は、内容液層／内皮膜層／外皮膜層＝３：３：４とした。カプセル化は常法により、三重管ノズルの無菌シームレスソフトカプセル製造機を用いて凝固油中でカプセル化し、速やかに、脱油後、１０℃の乾燥空気を送りながら、ドラム乾燥した。表面乾燥した三層カプセルの粒径は７ｍｍであった。
【００５３】
これらのカプセルは、シリカゲルを入れたポリエチレンの袋に入れ、２０℃で３ヶ月問保存後も内容液の赤色が表面に現れることはなく、安定であった。
【００５４】
調製直後のカプセルと上記条件下で３ヶ月間保存したカプセルを、各５０粒ずつシャーレ中に置き、霧吹きで均一に水を噴霧し、２５℃のインキュベータ中で保温した。経時的に内容液の赤色の斑点が表面に認められる時間を観察し、５０粒を平均して皮膜崩壊時間とした。その結果を表１に示す。
【００５５】
【表１】

【００５６】
表１に示すように、外皮膜層にリパーゼを含まないカプセルは、内皮膜層の崩壊に要する時間が極めて長かった。一方、外皮膜層にリパーゼを含むカプセルは、著しく皮膜崩壊時間が短くなり、リパーゼの添加量が多くなるほど内皮膜層である硬化油脂を分解する時間が短くなった。３ヶ月間保存後も、硬化油脂とゼラチンで包まれている内容液の水分の揮散は認められなかった。リパーゼ活性は約８％低下していることが観察されたが、リパーゼ添加の効果はほぼ同様に認められた。このことから、本発明のカプセルは、乾燥状態では、常温保存でも極めて安定であり、長期保存に耐えることが示された。さらに、外皮膜層に添加するリパーゼ量を調節することで、水を与え、望む時間で皮膜層を崩壊させることが可能であることが示された。
【００５７】
（実施例２：ニンジン不定胚をカプセル化した人工種子）
ニンジンの培養細胞と不定胚の作出は、ニンジンの根を用いて「植物細胞組織培養」（１９７９年、原田、駒嶺編、理工学社）ｐ９１〜１０４に記載されている方法に準じて行った。液体培地で作出した不定胚から網目１．４ｍｍと１．７ｍｍのナイロンメッシュを用いて１．４ｍｍ〜１．７ｍｍの大きさの不定胚を選別取得した。これらの選別した不定胚は、心臓型から魚雷型に至る形状をしていた。これらの不定胚を、ホルモンを含まず、キトサンを０．２％含むＭＳ培地に懸濁し、カプセルの内容物とした。
【００５８】
カプセル化は、内容物を変え、内容液（最内層）の不定胚が一個ずつ入るようにポンプを調節し、外皮膜層のゼラチンに添加するリパーゼを０．０５％とした以外は、実施例１と同様にして三重管ノズルの無菌シームレスソフトカプセル製造機を用いて液中滴下法により行った。得られた最外層が乾燥されたカプセル化不定胚の人工種子の粒径は７ｍｍであった。
【００５９】
比較例１として、ゼラチン皮膜層にリパーゼを添加しなかった以外は実施例２と同様にしてカプセル化ニンジン不定胚を作成した。
【００６０】
比較例２として、アルギン酸ゲルビーズ包埋ニンジン不定胚を作成した。すなわち、実施例２で作出し選別した不定胚を３％（ｗ／ｖ）アルギン酸ナトリウムを含むＭＳ培地に懸濁し、５０ｍＭの塩化カルシウム溶液中に滴下することによって不定胚を包埋したアルギン酸カルシウムゲルビーズ（粒径約６ｍｍ）を調製した。これは、従来人工種子として報告されているものと同様のものである。
【００６１】
（発芽試験１：外皮膜層にリパーゼを添加した効果）
上記ニンジン不定胚をカプセル化した外皮膜層にリパーゼを含む人工種子（実施例２）とリパーゼを含まない人工種子（比較例１）を調製した。調製直後の人工種子を、土壌殺菌を行っていない圃場の土を入れたポットに表土から３ｃｍの深さに各１００粒ずつ播種し、散水した。播種後、２５℃のインキュベータ一に入れ、３０００Ｌｕｘで、１日あたり１６時間の照明を行いながら、２日に一回散水した。１週間後、２週間後、３週間後の発芽数を数えた結果を表２に示す。
【００６２】
【表２】

【００６３】
表２に示すように、外皮膜層にリパーゼを含む人工種子は速やかに内皮膜層の硬化油脂が分解し、２週間で発芽が認められるのに対し、リパーゼを含まない人工種子は２週間では全く発芽が認められず、発芽に３週間要することが分かった。この結果より、本発明の崩壊性をコントロールしたカプセルのほうが従来のカプセルよりもはるかに速やかに内皮膜層（硬化油脂）が崩壊し、発芽にいたるため、人工種子として優れていることが示された。
【００６４】
（保存及び発芽試験２）
上記実施例２で調製した外皮膜層にリパーゼを含むカプセル包括不定胚の人工種子と、比較例２のアルギン酸カルシウムゲルビーズ包埋不定胚とを、２０℃、湿度５０％の恒温器中で２ヶ月間保存した。実施例２のカプセル化人工種子には外観の変化は認められなかったが、比較例２のアルギン酸カルシウムゲルビーズは、３日目でかなり乾燥し、ビーズが小さくなっており、１週間で不定胚も乾燥し、干からびた状態になった。人工種子調製時、１ヶ月後、２ヶ月後に、各１００粒ずつを、土壌殺菌を行っていない圃場の土を入れたポットに表土から２ｃｍの深さに播種し、散水した。播種後、ポットを２５℃、３０００Ｌｕｘで１６時間照明のインキュベーター中に置き、２日に一回散水し、各々２週間後の発芽数を数えた。結果を表３に示す。
【００６５】
【表３】

【００６６】
表３に示したように、調製直後の発芽率は、実施例２も比較例２もほぼ同じであったが、１ヶ月間以上保存すると、従来タイプの人工種子である比較例２では全く発芽しなかった。本発明のソフトカプセル化した人工種子では高率で発芽が認められた。この結果より、不定胚を含む本発明のソフトカプセルが人工種子としての保存安定性に関して、従来のアルギン酸ゲルビース包埋不定胚タイプの人工種子よりも優位であることが示された。また、長期間保存後も高率で発芽するため、人工種子として実用に耐えることが示された。
【００６７】
（実施例３：イチゴ葉芽をカプセル化した人工種子）
栽培されているイチゴから摘出した茎頂組織をシュークロース１０ｇ／ｌ及びゲル化剤としてジェランガム２ｇ／ｌを含むＭＳ倍地に置床し、暗所２５℃で１４日間培養後、ベンジルアデニン０.２ｍｇ／ｌ及びシュークロース１０ｇ／ｌを含むＭＳ液体培地に移し、２５℃で、１日当たり、２０００Ｌｕｘで１６時間照射しながら、１５０ｒｐｍで回転振とう培養を行った。３０日間培養後、得られた葉芽を、網目が１．４ｍｍと２ｍｍのナイロンメッシュを用いて選別し、１．４ｍｍ〜２ｍｍの大きさの葉芽を得た。取得した葉芽を、ホルモンを含まないＭＳ液体培地に懸濁し、カプセルの内容物とした。
【００６８】
カプセル化は、内容物を葉芽懸濁液に変え、内容液（最内層）の葉芽が一個ずつ入るようにポンプを調節し、外皮膜層のゼラチンに添加するリパーゼを０．０５％とした以外は、実施例１と同様にして三重管ノズルの無菌シームレスソフトカプセル製造機を用いて液中滴下法により行った。得られたカプセルの乾燥も実施例１と同様に低温で行い、乾燥カプセル化イチゴ葉芽の人工種子を得た。最外層を乾燥した後の粒径は８ｍｍであった。
【００６９】
他方、比較例３として、ゼラチン溶液にリパーゼを添加しなかった以外は実施例３と同様にして外皮膜層が乾燥したカプセル化イチゴ葉芽を作成した。
【００７０】
（発芽試験３）
実施例２における発芽試験と同様に、実施例３の外皮膜層にリパーゼを含んでいるカプセル化イチゴ葉芽人工種子と比較例３のリパーゼを含んでいないカプセル化イチゴ葉芽人工種子を、２０℃、湿度５０％のインキュベーター中で２ヶ月間保存し、発芽試験１と同様に発芽試験を行つた。結果を表４に示す。
【００７１】
【表４】

【００７２】
表４に示したよラに、カプセル化イチゴ葉芽の人工種子においても、カプセルの外皮膜層にリパーゼを添加した実施例３はリパーゼを添加していない比較例３よりも発芽が早いことが示された。
【００７３】
さらに、２ヶ月間保存後もこの外皮膜層にリパーゼを添加したカプセル化イチゴ葉芽の人工種子においては、高率で速やかな発芽が見られ、リパーゼを添加していない人工種子よりもはるかに優れていることが示された。
【００７４】
（実施例４：医薬品カプセル）
血小板凝集抑制作用を有するシロスタゾールを融点４２℃の硬化油脂に１ｇ／３ｇ（ｗ／ｗ）の割合で懸濁し、その懸濁液を内容液（最内層）とし、何も含まない硬化油脂のみを内皮膜層とした。外皮膜層として、ペクチンを５％（ｗ／ｗ）含むゼラチン２０％（ｗ／ｖ）溶液に、食品用粉末リパーゼ（ナガセ生化学工業株式会社製、リリパーゼＡ−１０ＦＧ）を０.０５％（ｗ／ｗ）の割合で添加したものを用いた。これらを三重管ノズルのシームレスソフトカプセル製造機を用いて凝固油中でカプセル化し、速やかに脱油後、１０℃の乾燥空気を送りながら、ドラム乾燥した。乾燥後のカプセルの粒径は２．５ｍｍであった。本カプセル１ｇ中には、シロスタゾール１００ｍｇが含まれている。
【００７５】
別途、比較例４として、外皮膜層にリパーゼを添加しない以外は実施例５と同様にして外皮膜層が乾燥したカプセルを調製した。
【００７６】
（吸収試験）
雌のビ一グル成犬６匹を１グループとして、実施例４で調製した外皮膜層にリパーゼを含むカプセル１ｇを各々経口投与した。対照として別の６匹のグループに比較例４で調製した外皮膜層にリパーゼを含んでいないカプセル１ｇを各々経口投与した。経時的に血液をサンプリングし、シロスタゾールが最高血中濃度に達する時間を求め、各グループ６匹の平均値を比較した。その結果、比較例４のカプセルを用いたグループの平均値が６時間であったのに対し、実施例４のカプセルを用いたグループの平均値は４．５時間と短かった。すなわち、実施例５の外皮膜層にリパ一ゼを含ませたカプセルの方が、比較例４よりも短時間で内皮膜層が崩壊し、薬剤が腸から吸収されていることが分かった。本発明の医薬品カプセルは、含まれる薬剤の効果が速やかに現れることが期待されるため、本発明のカプセルの優位性が明らかである。
【００７７】
（実施例５：外皮膜層に微生物を含むカプセル）
リパーゼを分泌することが知られているキャンディダ・ルゴーサ（Candida rugosa）IFO 0591株を、ＩＦＯ Ｎｏ．１０８液体培地で培養し、培養液１００ｍｌを４℃、８０００ｒｐｍで２０分間遠心し、上清を捨てて菌体を回収し、１００ｍｌの水に再懸濁した。この懸濁液を２２％（ｗ／ｗ）のゼラチン溶液に１０％（ｖ／ｖ）の割合で加え混合して、外皮膜層用溶液とした。それ以外は実施例１と同様にして赤色色素をカプセル化し、乾燥後、濃硫酸を入れたデシケータ中でさらに２４時間乾燥した。
【００７８】
これらのカプセルは、シリカゲルを入れたポリエチレンの袋に入れ、２０℃で３ヶ月問保存後も内容液の赤色が表面に現れることはなく、安定であった。
【００７９】
調製直後のカプセルと上記条件下で３ヶ月間保存したカプセルを、各５０粒ずつシャーレ中に置き、霧吹きで均一に水を噴霧し、２５℃のインキュベータ中で保温した。経時的に内容液の赤色の斑点が表面に認められる時間を観察し、５０粒を平均して皮膜崩壊時間とした。その結果を表５に示す。
【００８０】
【表５】

【００８１】
表５に示すように、外皮膜層にリパーゼを含むカプセルは、著しく皮膜崩壊時間が短くなった。本発明のカプセルは、一種の乾燥固定化菌体であるが、乾燥状態では、常温で３ヶ月間保存後も安定であり、崩壊時間の遅延は約６％と大きくなく、長期保存に耐えることが示された。
【００８２】
【発明の効果】
本発明の、皮膜層に、この皮膜層を分解する酵素あるいは微生物を含ませたカプセルは、水分を与えられると酵素の活性に応じて皮膜層を分解し、所望の時と場所で皮膜層を崩壊させることができ、速やかな内容物の放出、内容物と外部との接触、混合を可能にし、人工種子、ドラッグデリバリーシステムの医薬品、不安定な成分の隔離、徐放性農薬等に応用できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の人工種子の形状を示す模式図である。

Claims (5)

1. 最内層と、該最内層を覆う内皮膜層と、該内皮膜層を覆う外皮膜層とを有する三層構造のシームレスソフトカプセルであって、該内皮膜層が、硬化油脂を含む皮膜であり、そして、該外皮膜層が、硬化油脂を分解し得る酵素または微生物を含有し、かつ乾燥されている、シームレスソフトカプセル。
2. 前記外皮膜層が、ゼラチンを含む皮膜である、請求項１に記載のシームレスソフトカプセル。
3. 前記最内層に、医薬、農薬もしくは再分化可能な植物細胞組織が含まれている、請求項１または２に記載のシームレスソフトカプセル。
4. 再分化可能な植物細胞組織を含有する最内層と、該最内層を覆う内皮膜層と、該内皮膜層を覆う外皮膜層とを有する三層構造のシームレスソフトカプセルからなる人工種子であって、該内皮膜層が、硬化油脂を含む皮膜であり、そして、該外皮膜層が、硬化油脂を分解し得る酵素または微生物を含有し、かつ乾燥されている、人工種子。
5. 前記外皮膜層が、ゼラチンを含む皮膜である、請求項４に記載の人工種子。

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