JP4570776B2

JP4570776B2 - 遺伝子輸送のための生物分解性の混合重合体ミセル

Info

Publication number: JP4570776B2
Application number: JP2000523975A
Authority: JP
Inventors: チョイ，ヤン・クウェオン; キム，ジン・セク
Original assignee: サミアン・コーポレーション
Priority date: 1997-12-12
Filing date: 1998-12-11
Publication date: 2010-10-27
Anticipated expiration: 2018-12-11
Also published as: ZA9811376B; CN1281355A; AU740342B2; JP2001525357A; EP1037611A1; EP1037611A4; DE69840175D1; IL136681A0; WO1999029303A1; BR9813548A; AU1910899A; KR20010032878A; AR018528A1; ATE412403T1; US6210717B1; EP1037611B1

Description

【０００１】
関連する出願への相互参照
本出願は、1997年12月12日提出のアメリカ合衆国仮出願番号60/069,551の特権を請求するものである。
【０００２】
発明の背景
本発明は、真核細胞内に遺伝子を輸送するためのシステムに関連する。さらに詳しくは、本発明は、両親媒性ポリエステル-ポリカチオン共重合体および両親媒性ポリエステル-糖共重合体を含む、生物分解性の混合重合体ミセルを用いて、宿主細胞に選択された核酸を輸送するための組成物および方法に関連する。
【０００３】
核酸を組織培養細胞内に輸送する方法を同定するための初期の努力は、1950年代中頃に始まった。H.E. Alexander et al., 5 Birology 172-173(1958)。それ以来、機能性のDNA、RNA、およびアンチセンスオリゴヌクレオチド（RNA機能阻害物質）のin vitroおよびin vivoにおける輸送を改善することに向けて、着実な進歩がなされた。1970年代後半にトランスフェクション技術および組み換えDNA技術が集合したため、実質的な進歩は最近20年の間に達成された。この集合は、リン酸カルシウムおよびジエチルアミノエチルデキストランが、組み換えプラスミドを培養ほ乳類細胞中で発現させるために応用されたときに始まった。P.J. Southern et al., 1 J. Mol. Appl. Gen. 327-341(1989)。現在では、核酸の輸送および発現は、科学的な注意を捕らえ続けているトピックとなった。
【０００４】
機能的な、複製しないプラスミドをin vitroで輸送することに関してはいくつかの成功が達成されたが、機能的な、複製しないプラスミドをin vivoで輸送するための現在の方法はその初期にある。トランスフェクション技術には、不溶性の無機塩、F. Graham, 52 Virology 456-462(1973)、カチオン性脂質、E.R. Lee et al., 7 Human Gene Therapy 1701-1717(1996)、カチオン性ポリマー、B.A. Demeneix et al., 7 Human Gene Therapy 1947-1954(1996)；A.V. Kabanov et al., 6 Bioconjugate Chem. 7-20(1995)；E. Wagner, 88 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 4255-4259(1991)、ウイルスベクター、A.H. Jobe, 7 Human Gene THerapy 697-704(1996)；J. Gauldie, 6 Current Opinion in Biotechnology 590-595(1995)、細胞エレクトロポレーション、アメリカ合衆国特許5,501,662(1996)；アメリカ合衆国特許5,273,525(1993)、およびマイクロインジェクション、アメリカ合衆国特許5,114,854(1992)を用いた方法が含まれる。上に挙げた方法のそれぞれに、特異的な不都合および制限がある。最も広く研究されている遺伝子輸送キャリアーは、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、およびヘルペスウイルスの系を含むウイルスベクターである。ウイルスベクターは、非ウイルスベクターと比較して高いトランスフェクション効率を示したが、そのin vivoでの使用にはかなりの制限がある。その欠点には、***細胞のみを標的とすること、宿主ゲノム中へのランダムな挿入、複製の危険性、および起こりうる宿主の免疫反応が含まれる。J.M. Wilson, 96 J. Clin. Invest. 2547-2554(1995)。
【０００５】
ウイルスベクターと比較して非ウイルスベクターは作るのが容易で、免疫反応を起こす可能性がより低く、複製反応を起こさないだろう。ジメチルアミノエチルデキストラン、リン酸カルシウムおよびポリカチオンを介したトランスフェクション手順は、実験室で組織培養細胞に用いられてきた。いくつかの条件下では、100％に近い細胞というトランスフェクション効率がin vitroで得られてきた。しかし概して、非ウイルスベクターは細胞内に遺伝物質をin vivoで導入するためには効果的でないことがわかっており、比較的低い遺伝子発現をもたらしてきた。様々なカチオン性両親媒体が詳細に研究され、遺伝子トランスフェクションを目的とするリポソーム製剤に加えられてきた。F.D. Ledley, 6 Human Gene Therapy 1129-1144(1995)。現在まで、カチオン性脂質システムは、ウイルスベクターを用いることに伴う問題を克服するという理由で最も有望なDNAトランスフェクションプロトコールであると考えられてきた。しかし、カチオン性脂質を用いたトランスフェクション効率は、依然としてウイルスベクターほどには高くなく、細胞毒性に関する不満があがってきた。それゆえ、新しい遺伝子輸送プロトコールを見つけるために、継続的な研究が必要とされている。
【０００６】
前述したことのゆえに、安全かつ効果的な、in vivo使用のための遺伝子輸送システムの開発はこの技術分野において重要な利益になるであろうということが認められるだろう。
【０００７】
発明の簡単な概要
核酸を細胞内に輸送するための組成物および方法を提供することは、本発明の1つの目的である。
【０００８】
粒子の大きさおよび電荷密度が多変量の手段によって容易に制御されるような粒状の遺伝子キャリアーを提供することにより、輸送効率を改善することも、本発明の目的である。
【０００９】
遺伝子キャリアーが生物分解性かつ生物適合性であるような、遺伝子輸送のための組成物および方法を提供することは、本発明の別の目的である。
【００１０】
これらおよび他の目的は、選択された核酸を宿主細胞内に輸送するためのキャリアーであって、両親媒性ポリエステル-ポリカチオン共重合体および両親媒性ポリエステル-糖共重合体の混合物を含むキャリアーを提供することによって取り組まれる。本発明の好ましい態様においては、ポリエステル-ポリカチオン共重合体は、重量でそのキャリアーの約5から95％を含む。ポリエステル-糖共重合体も好ましくは、重量でそのキャリアーの約5から95％を含む。ポリエステルポリカチオン共重合体は、親水性ポリカチオンブロックにアミド結合によって結合した疎水性ポリエステルブロックを含むジブロックの共重合体か、あるいは疎水性ポリエステル部分および親水性カチオン部分を含むグラフト共重合体のいずれかであり得る。ポリエステルは好ましくは、ポリ（L-乳酸）、ポリ（D-乳酸）、ポリ（D,L-乳酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリ（L-乳酸-コ-グリコール酸）、ポリ（D-乳酸-コ-グリコール酸）、ポリ（ε-カプロラクトン）、ポリ酪酸ラクトン、およびポリプロピオラクトンからなる群から選択されるメンバーである。より好ましくは、ポリエステルはポリ（L-乳酸）である。本発明の好ましい態様においては、ポリエステルは好ましくは、約500から10,000の分子量を有する。ポリカチオンは、好ましくは、ポリ（L-セリンエステル）、ポリ（D-セリンエステル）、ポリ（L-リジン）、ポリ（D-リジン）、ポリオルニチン、およびポリアルギニンからなる群から選択されるメンバーであり、より好ましくはポリ（L-セリンエステル）である。本発明の好ましい態様においては、ポリカチオンは約500から10,000の分子量を有する。
【００１１】
ポリエステル-糖共重合体には、疎水性ポリエステル部分および親水性糖部分が含まれる。ポリエステル部分は好ましくは、ポリ（L-乳酸）、ポリ（D-乳酸）、ポリ（D,L-乳酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリ（L-乳酸-コ-グリコール酸）、ポリ（D-乳酸-コ-グリコール酸）、ポリ（ε-カプロラクトン）、ポリ酪酸ラクトン、およびポリプロピオラクトンからなる群から選択されるメンバーであり、より好ましくはポリ（L-乳酸）である。本発明の好ましい態様においては、ポリエステル部分は約500から10,000の分子量を有する。糖部分には、多糖類あるいはグリコシル化された重合体のいずれかであり得る。そのようなグリコシル化された重合体は好ましくは、ガラクトース、グルコース、フコース、フルクトース、ラクトース、スクロース、マンノース、セロビオース、ニトロース、トリオース、デキストロース、トレハロース、マルトース、ガラクトサミン、グルコサミン、ガラクツロン酸、グルクロン酸、グルコン酸、およびラクトビオン酸からなる群から選択される少なくとも１つの糖部分を含み、より好ましくはラクトビオン酸である。グリコシル化された重合体のうちの重合体部分は、好ましくは、ポリ（L-セリンエステル）、ポリ（D-セリンエステル）、ポリ（L-リジン）、ポリ（D-リジン）、ポリオルニチン、およびポリアルギニンからなる群から選択され、より好ましくはポリ（L-セリンエステル）であり、より好ましくはポリ（L-リジン）である。
【００１２】
キャリアーは、（a）疎水性部分、（b）疎水性部分に結合した親水性部分、および（c）親水性部分に連結された機能部分、を含む共重合体であって、前記機能部分がリガンド、紡錘形成剤、向リソソーム性剤、核局在化シグナル、およびそれらの混合物からなる群から選択されるメンバーである共重合体、をさらに場合により含み得る。そのようなリガンドは好ましくは、トランスフェリン、上皮増殖因子、インスリン、アシアロオロソムコイド、マンノース-6-リン酸、マンノース、ルイスX、シアリルルイスX、N-アセチルラクトサミン、ガラクトース、グルコース、およびトロンボモジュリンからなる群から選択され；前記紡錘形成剤は、好ましくは、ポリミキシンBおよびヘムアグルチニンH2からなる群から選択され；前記核局在化シグナルは、好ましくは、T抗原である。
【００１３】
選択された核酸を宿主細胞内に輸送するための組成物には、混合重合体ミセル／核酸複合体が、（a）両親媒性ポリエステル-ポリカチオン共重合体および両親媒性ポリエステル-糖共重合体の混合物、および（b）効果的な量の選択された核酸を含む、水性媒質中の混合重合体ミセル／核酸複合体が含まれる。
【００１４】
選択された核酸を宿主細胞内に輸送するための方法には、混合重合体ミセル／核酸複合体が宿主細胞に接触し、糖部分が前記混合重合体ミセル／核酸複合体の受容体を介したエンドサイトーシスを引き起こし、それにより核酸が宿主細胞内に輸送されるようにするために、混合重合体ミセル／核酸複合体が、（a）両親媒性ポリエステル-ポリカチオン共重合体と、糖部分を含む両親媒性ポリエステル-糖共重合体との混合物および、（b）効果的な量の選択された核酸を含む、効果的な量の、水性媒質中の混合重合体ミセル／核酸複合体を投与することが含まれる。
【００１５】
詳細な説明
本明細書中に開示する特定の形、処理段階、および材料は多少変化し得るため、遺伝子輸送のための本組成物および方法を開示し、説明しないうちには、本発明はそのような形、処理段階、および材料に限定されないということを理解するべきである。本明細書中で用いる用語は、特定の態様を説明する目的のためにのみ使用されるのであって、本発明の範囲は添付の請求の範囲およびそれに相当するものによってのみ限定されるであろうゆえ、限定を意図するものではないということも理解されるべきである。
【００１６】
本明細書および添付の請求の範囲において使用される場合に、文脈が明らかにそうでないように指示していない限りは、単数形”a”、”an”および”the”には複数の指示物が含まれる。したがって、例えば、”ポリエステル-カチオン共重合体”を含む組成物という言及には2つあるいはそれ以上のそのようなポリエステル-カチオン共重合体の混合物が含まれ、”オリゴヌクレオチド”という言及には、１つあるいはそれ以上のそのようなオリゴヌクレオチドへの言及が含まれ、”糖部分”という言及には2つあるいはそれ以上のそのような糖基への言及が含まれる。
【００１７】
本発明を説明し請求する際には、以下の用語は以下に述べる定義にしたがって使用されるだろう。
【００１８】
本明細書中で使用する場合に、”効果的な量”とは、非毒性だが、あらゆる医療処置に伴う適度な利益／危険比で核酸を選択された細胞内に輸送するという所望の効果を提供するのに十分な量のミセル／核酸複合体を意味する。本明細書中で使用する場合に、核酸の効果的な量とは、例えば、mRNAを発現すること、タンパク質を発現すること、mRNAとのアンチセンスハイブリダイゼーションによって発現を阻害することなど、細胞内における核酸の選択された効果を提供するために選択される量を意味する。キャリアーの効果的な量は、選択された核酸と静電相互作用によって複合体を形成する一方で、水性媒質中でミセルを形成するのに十分な量を意味する。
【００１９】
用語”多糖類”および”オリゴ糖類”は、特定の大きさが別の方法で述べられていない限りは、本明細書中では大きさの限定を特に意図することなく使用されている。
【００２０】
本明細書中で使用する場合に、”投与すること”および類似の用語は、体の部分に組成物が全身的に循環することができるようにし、そこで組成物のリガンドあるいは糖部分がその同種の受容体あるいは結合部位に結合できるような、処置を受けている個体に組成物を輸送することを意味する。したがって、組成物は個体に対して好ましくは全身投与によって、典型的には皮下、筋肉内、あるいは静脈内投与、または腹腔内投与によって投与される。そのような使用のための注射可能薬物は、液体溶液あるいは懸濁液としてあるいは注射の前に液体の溶液または懸濁液として調製するのに適した固体の形状で、あるいは乳濁液としてのいずれかの、従来の形状で調製し得る。適した賦形剤には、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール、および類似のものが含まれ、もし望むならば、湿潤剤あるいは乳化剤、緩衝液、および類似のものなどの少量の補助物質を添加することができる。
【００２１】
本発明は、特定の真核細胞内に遺伝子構築物を輸送するための、自己会合した混合重合体ミセルを形成するための組成物に関連する。重合体ミセルおよび核酸は、受容体を介したエンドサイトーシスによって細胞内に取り込まれるような静電複合体を形成する。適した核酸には、DNA、RNA、およびアンチセンスオリゴヌクレオチドといった特定の遺伝子あるいはRNA機能の阻害物質が含まれる。混合重合体ミセルには2つあるいはそれ以上の成分が含まれ、その全てが生物分解性の両親媒性共重合体である。第一の成分、ポリエステル-ポリカチオン共重合体は、ポリアニオン性の核酸と静電相互作用を形成する。第二の成分、ポリエステル-糖共重合体は、in vivoでミセル-核酸複合体を選択された細胞に対して特異的に向かわせる。本発明は、場合により、１つあるいはそれ以上のさらなるポリエステル-ポリカチオン共重合体あるいはポリエステル-糖共重合体をさらに含み得る。両親媒性の共重合体は、親水性部分および疎水性部分の両方を重合体鎖中に有する、ブロックあるいはグラフト共重合体を含む。ポリエステル-ポリカチオン共重合体中では、親水性部分にはポリ（セリンエステル）などの生物分解性のカチオン性重合体が含まれる。ポリエステル-糖共重合体中では、親水性部分には多糖類あるいは単糖類-またはオリゴ糖類-含有重合体が含まれる。ポリ（乳酸）などの生物分解性のポリエステルは、両構成成分中で疎水性部分として用いられる。
【００２２】
水中では、十分な濃度の2つあるいはそれ以上の構成成分が存在する場合には、構成成分は熱力学的に安定な重合体ミセルに自発的に集合する。このミセル粒子は、回転楕円状の形状をとっており、本質において二重層を有している。中心の”層”は、疎水性ポリエステル間の疎水性相互作用によって形成されている。同様に、表面の”層”は親水性ポリカチオンおよび糖の水との対応する親水性相互作用によって形成されている。第一の構成成分の親水性部分はポリカチオンであるため、正味の正電荷はミセルの表面の周りに存在するだろう。正電荷は、核酸を成形し保護するために必須である、核酸（すなわちポリアニオン）との静電相互作用を可能にする。表面の糖基には、ミセル-核酸複合体をin vivoで特定の臓器あるいは組織の細胞に向かわせるためのリガンドが含まれ得る。また、糖基は、遺伝子の取り込みおよび発現をもたらす、受容体を介したエンドサイトーシスを引き起こす。
【００２３】
粒子の大きさはin vivoでのトランスフェクション効率、細胞障害性、および組織標的をしばしば左右するため、粒子の大きさは遺伝子輸送システムの最適化に関して決定的である。F.C. Szoka, 4 Bioconjugate Chem. 327-379(1993)。概して、遺伝子輸送粒子の推奨される大きさはウイルスの大きさを超えるべきではなく、それゆえ遺伝子輸送粒子の組織への効果的な浸透が可能になる。本発明においては、粒子の大きさは共重合体の異なる組み合わせを用いることにより容易に変化させることができる。個々の共重合体の大きさおよび構造は、集合してミセルを形成するであろう個々の共重合体の数を意味する、集合数を決定する。したがって、大きさおよび構造は重合体ミセルの粒子の大きさおよび構造を部分的に制御する。粒子の大きさは、粒子を調製する条件および方法によってさらに制御することができる。電荷密度も、ポリカチオン共重合体の化学組成、ポリカチオン部分の分子量および電荷密度、および糖含有共重合体に対するポリカチオン共重合体のモル比を変えることによって容易に制御することができる。加えて、初期および残余電荷密度を制御するために、さらなるイオン性および／または非イオン性化合物を取り入れることができる。
【００２４】
特定の細胞を標的とし、ミセルに取り入れることができるリガンドには、とりわけ、トランスフェリン、上皮増殖因子（EGF）、インスリン、アシアロオロソムコイド、マンノース-6-リン酸（単球を標的とする）、マンノース（マクロファージおよびいくつかのB細胞を標的とする）、ルイスXおよびシアリルルイスX（内皮細胞を標的とする）、N-アセチルラクトサミン（T細胞を標的とする）、ガラクトース（メラノーマ細胞を標的とする）、グルコース（結腸癌腫細胞を標的とする）、およびトロンボモジュリン（マウス肺内皮細胞を標的とする）が含まれる。ミセルに取り込むことのできる他の機能化合物には、とりわけ、ポリミキシンBおよびヘムアグルチニンHA2といった紡錘形成剤、向リソソーム性剤およびT抗原などの核局在化シグナル（NLS）が含まれる。機能化合物は外来の核酸の輸送および発現をより効果的にし、首尾良い遺伝子輸送および発現に重要な機能化合物を作る。機能化合物は、（1）官能基内にその化合物を含む第三の共重合体成分を作り出すことおよび（2）その共重合体を集合前の重合体ミセルの表面に連結させること；によってミセル内に容易に導入することができる。あるいは、機能化合物を含む第三の構成成分は、第一および第二の構成成分とともに、本来ミセルが形成する時点でミセル内に取り込ませることができる。その場合は、ミセル表面層内で露出するように、官能基が親水性部分に存在する共重合体を用いるのが好ましいだろう。したがって、ミセル-核酸複合体のトランスフェクション効率を最大限にするために、糖、リガンドおよび他の機能化合物の様々な組み合わせが、第二のおよび次の化合物内に存在し得る。官能基の種類および内容を制限無しに容易に変え得るということは、本発明の利点である。
【００２５】
本発明にしたがったミセルには、生物分解性、生物適合性の共重合体が含まれ、そのため非免疫原性かつ非毒性である。本明細書中に開示される好ましい共重合体は、腎***される、毒性のない小分子へと分解され、必要とされる遺伝子発現期間の間、不活性である。分解は単純な加水分解および／または酵素反応を介して起こる。単純な加水分解を介した分解は、共重合体の骨格がエステル結合を含む場合には優勢であり得る。酵素的分解は、リソソームなどの特定のオルガネラの存在下では有意になり得る。分解期間は、異なる種類および分子量の重合体を用いることによって数日から数カ月まで変化し得る。したがって、遺伝子輸送のための生物分解性重合体の使用により、いかにしてポリカチオン性遺伝子キャリアーに伴う毒性の問題を解決し得るかを知ることができる。ほとんどのポリカチオン性遺伝子キャリアーは、体内に長期間存在する場合には深刻な影響である、有意に細胞障害性を持つことが知られている。それゆえ、遺伝子キャリアーはその役割を果たした後には非毒性の産物へと分解されるのが好ましい。本発明は、安全かつ生物適合性の分解経路を有する、生物分解性のポリエステルあるいはポリペプチドを使用している。加えて、樹状ポリアミドアミンなどの分枝したポリカチオンは直鎖ポリカチオンよりも細胞障害性が低いため、本発明の高度に分枝したミセル構造は細胞障害性をさらに減弱し得る。F.C. Szoka, 4 Bioconjugate Chem. 372-379(1993)。したがって、本発明にしたがった重合体ミセルの都合のよい構成成分および構造は、減弱された細胞障害性を考慮して評価され得る。
【００２６】
図1に示すように、本発明にしたがった混合重合体ミセル10には、2つあるいはそれ以上の生物分解性の親水性共重合体が含まれる。第一の共重合体12は、親水性ポリカチオン部分14および疎水性ポリエステル部分16を含む、ポリエステル-ポリカチオンブロックあるいはグラフト共重合体である。親水性ポリカチオン部分14は、共重合体に水溶解性を付与するために十分大きくなければならない。第一の共重合体は、ジ、トリまたはマルチブロックあるいはグラフト共重合体として調製し得るが、好ましくはジブロックあるいはグラフト共重合体として調製し得る。ポリエステル部分16は、好ましくはポリ（L-乳酸）、ポリ（D-乳酸）、ポリ（D,L-乳酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリ（L-乳酸-コ-グリコール酸）、ポリ（D-乳酸-コ-グリコール酸）、ポリ（ε-カプロラクトン）、ポリ酪酸ラクトン、あるいはポリプロピオラクトンであるが、より好ましくはポリ（L-乳酸）である。ポリカチオン部分14は、好ましくは、ポリ（L-セリンエステル）、ポリ（D-セリンエステル）、ポリ（L-リジン）、ポリ（D-リジン）、ポリオルニチン、あるいはポリアルギニンといった、単量体単位がエステルまたはアミド結合によって結合したポリカチオンであるが、より大きな生物分解性のゆえにより好ましくはポリ（L-セリンエステル）である。
【００２７】
第二の共重合体18は、糖部分20が共重合体を水に溶解させるのに十分大きいようなポリエステル-糖ブロックあるいはグラフト共重合体である。ポリエステル部分22は、第一の共重合体12と同じであり得るかあるいは異なっていてもよく、好ましくは第一の共重合体12のポリエステル部分16について上に示したのと同じ基から選択される。糖部分20は、好ましくは多糖類ありはグリコシル化された重合体であるが、より好ましくはグリコシル化された重合体である。図1に実例にて示してあるように、グリコシル化された重合体は、１つあるいはそれ以上の単糖類あるいはオリゴ糖類あるいはその誘導体24を、１つあるいはそれ以上のヒドロキシル、カルボキシル、あるいはアミノ基などの官能基を有するポリマー26と連結することによって調製される。単糖類あるいはオリゴ糖類あるいはその誘導体は、好ましくはガラクトース、グルコース、フコース、フルクトース、ラクトース、スクロース、マンノース、セロビオース、ニトロース、トリオース、デキストロース、トレハロース、マルトース、ガラクトサミン、グルコサミン、ガラクツロン酸、グルクロン酸、グルコン酸、およびラクトビオン酸である。糖の酸型の、ポリカチオン重合体との結合が最も好ましい。したがって、本発明の最も好ましい態様は、ポリ（L-セリンエステル）あるいはポリ（L-リジン）に連結されたラクトビオン酸（4-O-β-D-ガラクトピラノシル-D-グルコン酸）を構成する。ラクトースのガラクトシル単位は、肝細胞上のガラクトース受容体の高い親和性および親和力のゆえに、都合良く肝細胞を標的とする。
【００２８】
図1にさらに示すように、混合重合体ミセル10を選択された核酸28と混合することにより、核酸上の負電荷とミセル上の正電荷の静電結合が生じ、ミセル-核酸複合体30が生じる。
【００２９】
混合重合体ミセルは、適切に設計された重量比で混合された2つあるいはそれ以上の共重合体から形成される。言い換えれば、粒子の大きさはおよそ10から100 nmの範囲にあるはずで、2つあるいはそれ以上の共重合体の重合体組成および混合比に依存するだろう。本発明の最も好ましい態様は、肝細胞表面上のガラクトシル受容体によって介されるエンドサイトーシスにより、選択された核酸を肝細胞内に効果的に輸送する。他の細胞への核酸の輸送は、選択された受容体を有する細胞と選択された糖を組み合わせることによって行い得る。例えば、混合ミセルは、マクロファージをトランスフェクトするためにはマンノースを有する共重合体から、T細胞をトランスフェクトするためにはN-アセチルガラクトサミンを有する共重合体から、結腸癌腫細胞をトランスフェクトするためにはグルコースを有する共重合体から調製し得る。
【００３０】
したがって、本発明は、選択された核酸をとりわけ肝細胞、および一般的には他の細胞内に選択された核酸を輸送するための、生物分解性の、非毒性かつ非ウイルス性のベクターを提供する。加えて、本発明は多様かつ十分明らかにされているミセル構造を構築するため、および多様な糖リガンドおよびエンドソーム破壊ペプチド（EDP）などの紡錘形成剤によって表面を機能的にするための、簡単かつ有効な方法を提供する。
【００３１】
【実施例】
実施例1
本実施例では、ポリ（L-乳酸）-ポリ（L-セリンエステル）ジブロック共重合体およびポリ（L-乳酸）-ポリ（N-ラクトシル-L-セリンエステル）ジブロック共重合体からの混合重合体ミセルの調製を説明する。
【００３２】
ポリ（ N- ベンジルオキシカルボニル -L- セリンエステル）。まず、23 Macromolecules 65-70(1990)（本明細書中で参考文献として援用している）に記載の手順にしたがって、等モル量の4-（ジメチルアミノ）ピリジンとp-トルエンスルホン酸を無水ベンゼン中で反応させることにより、4-（ジメチルアミノ）ピリジウム4-トルエンスルホネートを調製した。N-ベンジルオキシカルボニル（N-CBZ）セリン（2.392 g）を、スターラーバーを含み、窒素多岐管およびゴム中隔を取り付けた二頚丸底フラスコ内に入れ、窒素雰囲気中、シリンジからテトラヒドロフラン（30 ml）を添加することによって溶解させた。4-（ジメチルアミノ）ピリジウム4-トルエンスルホネート（2.94 g）の塩化メチレン溶液（80 ml）およびジイソプロピルカルボジイミドをシリンジから連続的に添加し、反応混合液を室温で1から5日間攪拌した。反応を完結させる際には、反応混合液を濾過してジイソプロピル尿素を除き、続いて回転エバポレーターを用いて乾燥させて完結させた。メタノール中での再結晶により反応産物を得て、ポリスチレン標品を用いたゲル浸透クロマトグラフィー（GPC）によって特性を調べた。
【００３３】
ポリ（ L- 乳酸）。3 gのL-乳酸を、スターラーバーを含み減圧蒸留装置を取り付けた単頚丸底フラスコ内に入れた。反応フラスコを窒素にて完全に満たし、続いて混合物を減圧下（5 mmHg）、160℃にて加熱した。反応時間は、様々な分子量のポリ（L-乳酸）を得るために1時間から10時間まで変化させた。大過剰量のメタノールにてクロロホルム溶液中で沈殿させることにより産物を得て、ポリスチレン標品を用いたGPCによって特性を調べた。
【００３４】
ポリ（ L- 乳酸） - ポリ（ L- セリンエステル）ジブロック共重合体。1 gのポリ（L-乳酸）（MW 1200）をテトラヒドロフランに溶解させ、2倍モル量のジアミノエタンをジシクロヘキシルカルボジイミドの存在下で添加し、アミンで終結したポリ（L-乳酸）を得た。室温で2時間攪拌した後、反応産物をメタノール中での沈殿によって得た。次に、アミンで終結したポリ（L-乳酸）を、ジシクロヘキシルカルボジイミドを用いて室温でジメチルホルムアミド中、等モル量のポリ（N-ベンジルオキシカルボニル-L-セリンエステル）（MW 2900）と反応させ、その後、触媒的水素化を用いてベンジルオキシカルボニル基を除いた。23 Macromolecules 3399-3406(1990)。
【００３５】
ポリ（ L- 乳酸） - ポリ（ N- ラクトシル -L- セリンエステル）ジブロック共重合体。ラクトビオン酸（1.33 g）の乾燥テトラヒドロフラン（50 ml）溶液を、等モル量のトリエチルアミン（500 ml）にて中和し、次に室温でイソブチルクロロカルボネート（500 ml）を添加した。10分間攪拌した後、反応混合液をポリ（L-乳酸）-ポリ（L-セリンエステル）（0.67 g）のジメチルスルホキシド溶液（50 ml）中に添加し、室温で20分間攪拌させた。反応産物を濾過およびジエチルエーテル中での沈殿によって得て、SPECTRAPOR膜チューブ（MWカットオフ1,000）を用いて水に対して透析することにより精製した。
【００３６】
混合重合体ミセル。ポリ（L-乳酸）-ポリ（L-セリンエステル）およびポリ（L-乳酸）-ポリ（N-ラクトシル-L-セリンエステル）の混合物をリン酸バッファー（pH7.4）にて作り、β-ガラクトシダーゼ遺伝子およびHepG2細胞を用いた実施例4のトランスフェクション手順にかけた。
【００３７】
実施例2
本実施例では、ポリ（L-乳酸）-ポリ（L-セリンエステル）ジブロック共重合体およびポリ（L-乳酸）-ポリ（N-ラクトシル-L-セリンエステル）ジブロック共重合体の混合物の調製を説明する。
【００３８】
手順は、アミンで終結したポリ（L-乳酸）をN-トリチルエタノールアミンにて開始するL-ラクチドの開環重合化によって合成したこと以外は、実施例1と同様に行った。N-トリチルエタノールアミンは、塩化トリチル（3 g）をエタノールアミン（20 ml）中、室温で攪拌することによって調製した。沈殿した産物を濾過によって得て、メタノール-水（9:1）にて再結晶することにより精製した。触媒量のスズオクトエート（octoate）の存在下、還流させたトルエン中でN-トリチルエタノールアミンにてL-ラクチド重合化を開始させた。ポリ（L-乳酸）を大過剰量のジエチルエーテル中で沈殿させることにより得た。0.1 Mトリフルオロ酢酸のジオキサン溶液を用いてトリチル基を除いた。
【００３９】
実施例3
本実施例では、ポリ（L-乳酸）-ポリ（L-リジン）グラフト共重合体およびポリ（L-乳酸）-ポリ（N-ラクトシル-L-リジン）グラフト共重合体からの混合重合体ミセルの調製を説明する。
【００４０】
混合重合体ミセルを、ポリ（L-乳酸）-ポリ（L-リジン）およびポリ（L-乳酸）-ポリ（N-ラクトシル-L-リジン）共重合体から調製した。ポリ（L-リジン）（MW 2700）はSigma Chemical Co.（St. Louis, MO）から入手し、ポリ（L-乳酸）（MW 1200）は、実施例1の手順に従ったポリ縮合によって調製した。ポリ（L-乳酸）のカルボキシル末端基を等モル量のイソブチルクロロギ酸にて活性化し、続いて等モル量のポリ（L-リジン）と反応させてポリ（L-乳酸）-ポリ（L-リジン）共重合体を得た。実施例1の手順に従ってラクトビオン酸をポリ（L-乳酸）-ポリ（L-リジン）と反応させることにより、ポリ（L-乳酸）-ポリ（N-ラクトシル-L-リジン）を調製した。ポリ（L-乳酸）-ポリ（L-リジン）とポリ（L-乳酸）-ポリ（N-ラクトシル-L-リジン）の様々な組み合わせをリン酸バッファー（PH 7.4）にて調製し、β-ガラクトシダーゼコード遺伝子およびヒト肝癌腫HepG2細胞を用いた実施例4のトランスフェクション手順にかけた。
【００４１】
実施例4
本実施例では、HepG2細胞を用いた混合重合体ミセルのトランスフェクションおよび細胞障害性試験を説明する。
【００４２】
混合重合体ミセルのin vitroトランスフェクション効率を、10％ウシ胎児血清を含むMEM培地中で培養したヒト肝癌腫細胞（HepG2）に対して試験した。細胞を回収し、血球計算盤を用いて計数し、2 x 10⁵ cells/mlの密度で96穴プレートにまいた。1日後、ポリ（L-乳酸）-ポリ（L-リジン）および／またはポリ（L-乳酸）-ポリ（N-ラクトシル-L-リジン）共重合体を含むミセル-遺伝子複合体およびpSV-β-galプラスミドDNA（Promega Corp., Madison, Wisconsin; EMBL受託番号X65335）の様々な製剤を、トランスフェクションの30分前に新たに調製した。96穴プレートの各穴内の培地を、血清を含まない新しい増殖培地と交換し、ミセル-遺伝子複合体を最終容量10 μlまで添加した。4時間インキュベーションした後、増殖培地を血清含有培地と交換し、細胞をさらに44時間、37℃にて5％ CO₂インキュベーター内でインキュベートした。次に、細胞を0.25％トリプシン-EDTA処理を用いて回収し、各穴に100 μlの1x可溶化バッファー（Promega, Madison, WI）を加えることにより、細胞可溶化物を得た。
【００４３】
プラスミドpSV-β-galは、ほ乳類細胞のトランスフェクション効率をモニターするための陽性対照ベクターである。pSV-β-galプラスミドには、SV40初期プロモーターおよびエンハンサー配列、転写開始部位、β-ガラクトシダーゼをコードするE. coli lacZコーディング領域、およびSV40スモールT抗原ポリアデニル化シグナルが含まれている。SV40初期プロモーターおよびエンハンサーは、lacZ遺伝子の転写を駆動する。
【００４４】
トランスフェクション効率を、細胞可溶化物中のβ-ガラクトシダーゼ酵素活性を求めることにより測定した。2xアッセイバッファー（Promega）中の等量の細胞可溶化物とo-ニトロフェニル-β-D-ガラクトピラノシド（ONPG、1.33 mg/ml）の混合物を37℃にて4時間インキュベートした。150 μlの1 M炭酸ナトリウム溶液を各穴に加えることにより反応を終結させ、420 nmにおける吸光度を吸光光度計にてβ-ガラクトシダーゼ活性に関して測定した。トランスフェクション効率を比較するためにLIPOFECTIN試薬（GIBCO/BRL, Gaithersburg, MD）を対照として用いた。LIPOFECTIN試薬は、膜で濾過した水中のカチオン性脂質N-［1-(2,3-ジオールイルオキシ)プロピル］-n,n,n-トリメチル塩化アンモニウム（DOTMA）およびジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（DOPE）の1:1(w/w)のリポソーム製剤である。
【００４５】
HepG2細胞に対する混合重合体ミセルの細胞障害性を、元来はT. Mosmann, Rapid Colorimetric Assay for Cellular Growth and Survival: Application to Proliferation and Cytotoxicity Assays, 65 J. Immunol. Methods 55-63(1983)に記載のMTT比色アッセイにより求めた。手短に述べると、細胞を対数増殖中の培養物から回収し、2 x 10⁵ cells/mlの密度で96穴プレートにまいた。24時間のインキュベーション時間の後、細胞を血清の非存在下、様々な量のポリ（L-乳酸）-ポリ（L-リジン）および／またはポリ（L-乳酸）-ポリ（N-ラクトシル-L-リジン）共重合体溶液にて処理した。4時間インキュベーションした後、増殖培地を血清含有増殖培地と置き換え、細胞をさらに44時間、37℃にて5％ CO₂インキュベーター内でインキュベートした。次に、25 μlの3-［4,5-ジメチルチオゾール-2-イル］-2,5-ジフェニル臭化テトラゾリウム（MTT）溶液（最終濃度0.5 mg/ml）を各穴に加え、37℃にて4時間インキュベートした。増殖培地を注意深く除き、150 μlのDMSOを加えて、形成されたホルムアザン結晶を溶解させた。Bio-Tek EL-3311マイクロプレートリーダー（Bio-Tek Instrument, Winooski, VT）を用いて光学密度（OD）を570 nmにて測定した。細胞の生存率（％）を以下の等式にしたがって算出した。
【００４６】
生存率（％）= ［OD₅₇₀(試料)/OD₅₇₀(対照)］x 100
式中、OD₅₇₀(対照)は、PBSバッファーのみで処理した穴由来の測定値を表し、OD₅₇₀(試料)は様々な量の重合体にて処理した穴由来の測定値を表す。
【００４７】
表1に示すように、本発明にしたがった混合重合体ミセルのトランスフェクション効率は、血清非存在下のin vitroにおけるHepG2細胞でのLIPOFECTIN試薬と同等に良かった。HepG2細胞に対する混合重合体ミセルの細胞障害性は、表2に示すようにLIPOFECTINと比較してかなり低いか、あるいはほとんどないくらいに小さく、このことは、これらのミセルが肝細胞と同様に他の組織あるいは臓器に対して広い応用性を有することを示唆している。
【００４８】
【表１】

【００４９】
【表２】

【図面の簡単な説明】
【図１】図1は、自己会合した混合重合体ミセルおよび核酸から調製される静電複合体の概略図である。

Claims

両親媒性ポリエステル-ポリカチオン共重合体および両親媒性ポリエステル-糖共重合体の混合物を含む、宿主細胞に薬剤を輸送するためのキャリアーであって、
ここで、前記両親媒性ポリエステル-ポリカチオン共重合体のポリエステルブロックが、ポリ（L-乳酸）、ポリ（D-乳酸）、ポリ（D,L-乳酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリ（L-乳酸-コ-グリコール酸）、ポリ（D-乳酸-コ-グリコール酸）、ポリ（ε-カプロラクトン）、ポリブチロラクトン、およびポリプロピオラクトンからなる群から選択されるメンバーであり；
ここで、前記両親媒性ポリエステル-ポリカチオン共重合体のポリカチオンブロックが、ポリ（L-セリンエステル）、ポリ（D-セリンエステル）、ポリ（L-リジン）、ポリ（D-リジン）、ポリオルニチン、およびポリアルギニンからなる群から選択され；そして
ここで、前記両親媒性ポリエステル-糖共重合体のポリエステル部分が、ポリ（L-乳酸）、ポリ（D-乳酸）、ポリ（D,L-乳酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリ（L-乳酸-コ-グリコール酸）、ポリ（D-乳酸-コ-グリコール酸）、ポリ（ε-カプロラクトン）、ポリブチロラクトン、およびポリプロピオラクトンからなる群から選択されるメンバーであり；
ここで、前記両親媒性ポリエステル-糖共重合体の糖部分がグリコシル化された重合体であり、ここでそのグリコシル化された重合体の重合体部分がポリ（L-セリンエステル）、ポリ（D-セリンエステル）、ポリ（L-リジン）、ポリ（D-リジン）、ポリオルニチン、およびポリアルギニンからなる群から選択されるものであり；そして
前記両親媒性ポリエステル-ポリカチオン共重合体と前記両親媒性ポリエステル-糖共重合体とが、ブロック共重合体またはジブロック共重合体である；
前記キャリアー。
前記ポリエステルポリカチオン共重合体が、前記ポリカチオンブロックにアミド結合によって結合した疎水性ポリエステルブロックを含む、ジブロック共重合体である、請求項1のキャリアー。
前記ポリエステルブロックがポリ（L-乳酸）である、請求項2のキャリアー。
前記ポリエステルブロックが500から10,000の分子量を有する、請求項2のキャリアー。
前記ポリカチオンブロックがポリ（L-セリンエステル）である、請求項1〜4のいずれか1項に記載のキャリアー。
ポリカチオンブロックが500から10,000の分子量を有する、請求項1〜5のいずれか1項に記載のキャリアー。
前記ポリエステル部分がポリ（L-乳酸）である、請求項6のキャリアー。
前記ポリエステル部分が500から10,000の分子量を有する、請求項7のキャリアー。
前記グリコシル化された重合体が、ガラクトース、グルコース、フコース、フルクトース、ラクトース、スクロース、マンノース、セロビオース、ニトロース、トリオース、デキストロース、トレハロース、マルトース、ガラクトサミン、グルコサミン、ガラクツロン酸、グルクロン酸、グルコン酸、およびラクトビオン酸からなる群から選択される少なくとも１つの糖部分を含む、請求項1〜8のいずれか1項に記載のキャリアー。
前記糖部分がラクトビオン酸である、請求項9のキャリアー。
グリコシル化された重合体の前記重合体部分がポリ（L-セリンエステル）である、請求項1〜10のいずれか1項に記載のキャリアー。
グリコシル化された重合体の前記重合体部分がポリ（L-リジン）である、請求項1〜10のいずれか1項に記載のキャリアー。
重量で5から95％の前記ポリエステル-ポリカチオン共重合体を含む、請求項1〜12のいずれか1項に記載のキャリアー。
（a）疎水性部分、（b）疎水性部分に結合した親水性部分、および（c）親水性部分に連結された機能部分、を含む共重合体であって、前記機能部分がリガンド、紡錘形成剤、向リソソーム性剤、核局在化シグナル、およびそれらの混合物からなる群から選択されるメンバーである共重合体、をさらに含む、請求項1〜13のいずれか1項に記載のキャリアー。
前記リガンドが、トランスフェリン、上皮増殖因子、インスリン、アシアロオロソムコイド、マンノース-6-リン酸、マンノース、ルイスX、シアリルルイスX、N-アセチルラクトサミン、ガラクトース、グルコース、およびトロンボモジュリンからなる群から選択され；前記紡錘形成剤が、ポリミキシンBおよびヘムアグルチニンH2からなる群から選択され；前記核局在化シグナルがT抗原である、請求項14のキャリアー。
前記薬剤が核酸である、請求項1〜15のいずれか1項に記載のキャリアー。
混合重合体ミセル／核酸複合体が、（a）両親媒性ポリエステル-ポリカチオン共重合体および両親媒性ポリエステル-糖共重合体の混合物、および（b）効果的な量の選択された核酸、を含む、水性媒質中に混合重合体ミセル／核酸複合体を含む、前記選択された核酸を宿主細胞内に輸送するための組成物であって、
ここで、前記両親媒性ポリエステル-ポリカチオン共重合体のポリエステルブロックが、ポリ（L-乳酸）、ポリ（D-乳酸）、ポリ（D,L-乳酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリ（L-乳酸-コ-グリコール酸）、ポリ（D-乳酸-コ-グリコール酸）、ポリ（ε-カプロラクトン）、ポリブチロラクトン、およびポリプロピオラクトンからなる群から選択されるメンバーであり；
ここで、前記両親媒性ポリエステル-ポリカチオン共重合体のポリカチオンブロックが、ポリ（L-セリンエステル）、ポリ（D-セリンエステル）、ポリ（L-リジン）、ポリ（D-リジン）、ポリオルニチン、およびポリアルギニンからなる群から選択され；
ここで、前記両親媒性ポリエステル-糖共重合体のポリエステル部分が、ポリ（L-乳酸）、ポリ（D-乳酸）、ポリ（D,L-乳酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリ（L-乳酸-コ-グリコール酸）、ポリ（D-乳酸-コ-グリコール酸）、ポリ（ε-カプロラクトン）、ポリブチロラクトン、およびポリプロピオラクトンからなる群から選択されるメンバーであり；
ここで、前記両親媒性ポリエステル-糖共重合体の糖部分がグリコシル化された重合体であり、ここでそのグリコシル化された重合体の重合体部分がポリ（L-セリンエステル）、ポリ（D-セリンエステル）、ポリ（L-リジン）、ポリ（D-リジン）、ポリオルニチン、およびポリアルギニンからなる群から選択されるものであり；そして
前記両親媒性ポリエステル-ポリカチオン共重合体と前記両親媒性ポリエステル-糖共重合体とが、ブロック共重合体またはジブロック共重合体である；
前記組成物。
前記ポリエステルポリカチオン共重合体が、前記ポリカチオンブロックにアミド結合によって結合した疎水性ポリエステルブロックを含むジブロック共重合体である、請求項17の組成物。
前記ポリエステルブロックがポリ（L-乳酸）である、請求項18の組成物。
前記ポリエステルブロックが500から10,000の分子量を有する、請求項19の組成物。
前記ポリカチオンブロックがポリ（L-セリンエステル）である、請求項17〜20のいずれか1項に記載の組成物。
ポリカチオンブロックが500から10,000の分子量を有する、請求項17〜20のいずれか1項に記載の組成物。
前記ポリエステル部分がポリ（L-乳酸）である、請求項22の組成物。
前記ポリエステル部分が500から10,000の分子量を有する、請求項23の組成物。
前記グリコシル化された重合体が、ガラクトース、グルコース、フコース、フルクトース、ラクトース、スクロース、マンノース、セロビオース、ニトロース、トリオース、デキストロース、トレハロース、マルトース、ガラクトサミン、グルコサミン、ガラクツロン酸、グルクロン酸、グルコン酸、およびラクトビオン酸からなる群から選択される少なくとも１つの糖部分を含む、請求項17〜24のいずれか1項に記載の組成物。
前記糖部分がラクトビオン酸である、請求項25の組成物。
グリコシル化された重合体の前記重合体部分がポリ（L-セリンエステル）である、請求項17〜26のいずれか1項に記載の組成物。
グリコシル化された重合体の前記重合体部分がポリ（L-リジン）である、請求項17〜26のいずれか1項に記載の組成物。
重量で5から95％の前記ポリエステル-ポリカチオン共重合体を含む、請求項17〜28のいずれか1項に記載の組成物。
前記混合物が、（i）疎水性部分、（ii）疎水性部分に結合した親水性部分、および（iii）親水性部分に連結された機能部分を含む共重合体であって、前記機能部分がリガンド、紡錘形成剤、向リソソーム性剤、核局在化シグナル、およびそれらの混合物からなる群から選択されるメンバーである共重合体、をさらに含む請求項17〜29のいずれか1項に記載の組成物。
前記リガンドが、トランスフェリン、上皮増殖因子、インスリン、アシアロオロソムコイド、マンノース-6-リン酸、マンノース、ルイスX、シアリルルイスX、N-アセチルラクトサミン、ガラクトース、グルコース、およびトロンボモジュリンからなる群から選択され；前記紡錘形成剤が、ポリミキシンBおよびヘムアグルチニンH2からなる群から選択され；前記核局在化シグナルがT抗原である、請求項17〜30のいずれか1項に記載の組成物。