ES2411962T3 - Métodos y composiciones para suministrar polinucleótidos - Google Patents

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Abstract

Un polipéptido recombinante del grupo de movilidad elevada, o un fragmento del mismo, que comprende: un polipéptido del factor de transcripción mitocondrial A (TFAM) que comprende al menos una caja HMGoperablemente enlazada a un dominio de transducción de proteína que está enlazado operablemente a unaseñal seleccionadora de dianas para un orgánulo no nuclear, en el que el polipéptido recombinante del grupode movilidad elevada se puede asociar con un polinucleótido para empaquetar el polinucleótido para elsuministro al orgánulo no nuclear.

Description

Métodos y composiciones para suministrar polinucleótidos
ANTECEDENTES
1.
CAMPO TÉCNICO
La presente descripción se refiere generalmente a composiciones y métodos para el suministro de polinucleótidos, más particularmente a composiciones y métodos para la transfección, por ejemplo transfección de orgánulos.
2.
TÉCNICA RELACIONADA
Se han descrito muchas enfermedades mitocondriales que surgen de mutaciones homoplásmicas individuales en ADN mitocondrial (mtDNA). Estas enfermedades afectan típicamente a tejidos no mitóticos (cerebro, retina, músculo), presentes con fenotipos variables, y pueden aparecer esporádicamente y son intratables. Cada vez más pruebas implican a las anomalías del mtDNA en enfermedades tales como Parkinson y diabetes tipo II, pero siguen sin estar definidas las mutaciones etiológicas específicas para estas patologías. La comprensión de las relaciones genotipo-fenotipo de mtDNA y el desarrollo de un tratamiento específico para enfermedades a base de mtDNA está impedido por la incapacidad de manipular el genoma mitocondrial.
En el transcurso de la evolución, muchos organismos abordaron la tarea de introducir macromoléculas en células vivas. Aparte de los mecanismos de captación activos o mediados habitualmente por receptores, específicos de células, la solución general que ha surgido independientemente en muchas estirpes se basa en péptidos desarrollados específicamente para interaccionar con e insertarse en membranas bicapa lipídicas. De este modo, las colicinas bacterianas, las porinas humanas, y los dominios de transducción de proteína (PTD) de diversas especies comparten el motivo de una hélice alfa cargada positivamente, frecuentemente con una estructura anfipática, que es capaz de insertarse en membranas lipídicas, y suministrar intracelularmente cargas más grandes. Informes de investigación recientes confirman el uso exitoso de PTD fusionados a proteínas para su suministro a través de fronteras biológicas, incluyendo la barrera hematoencefálica, y la placenta.
Otro aspecto de gran importancia en el suministro de macromoléculas en organismos es la necesidad de protegerlas de la degradación proteolítica, nucleolítica e inmunitaria y su eliminación mientras atraviesan espacios extracelulares. Un enfoque usado a menudo es revestir ADN con proteínas capaces de sobrevivir al duro viaje hasta la diana. Las proteínas de la cápside vírica han tenido bastante éxito, aunque, para los fines de suministrar ADN a seres humanos, sufren un inconveniente significativo – la inmunogenicidad, la capacidad para provocar una fuerte reacción inmunitaria, reduciendo enormemente la eficacia de la terapia génica.
De este modo, existe la necesidad de composiciones y métodos mejorados para el suministro de polinucleótidos al interior de la célula.
Matsuhima et al, J. Biol. Chem., 278(33):31149-31158 (2003) en el documento titulado “functional domains of chicken mitochondrial transcription factor A for the maintenance of mitochondrial DNA copy number in lymphoma cell line DT40”, explica los dominios funcionales de varios polipéptidos TFAM.
El documento DE19856052 describe proteínas de fusión obtenidas entre las cadenas pesadas de la toxina tetánica y HMG 1.
En un primer aspecto de la presente invención, se proporciona un polipéptido del grupo de movilidad elevada recombinante, o un fragmento del mismo, que comprende:
un polipéptido del factor de transcripción mitocondrial A (TFAM) que comprende al menos una caja HMG operablemente enlazada a un dominio de transducción de proteína que está enlazado operablemente a una señal seleccionadora de dianas para un orgánulo no nuclear, en el que el polipéptido del grupo de movilidad elevada recombinante se puede asociar con un polinucleótido para empaquetar el polinucleótido para el suministro al orgánulo no nuclear.
Se proporcionan vehículos de suministro de polinucleótidos no víricos, y métodos para su uso. En general, la descripción proporciona proteínas de unión a polinucleótidos modificadas que comprenden un dominio de transducción de proteína operablemente enlazado a una señal seleccionadora de dianas, por ejemplo una señal seleccionadora de orgánulos no nucleares. Un aspecto proporciona un polipéptido que comprende al menos un dominio de la caja HMG, más típicamente al menos dos dominios de la caja HMG y al menos un dominio de transducción de proteína. El polipéptido se puede asociar con un polinucleótido, haciendo que el polinucleótido se condense. El polipéptido también puede revestir al polinucleótido. El revestimiento y/o condensación del polinucleótido ayuda a proteger de la degradación al polinucleótido. El dominio de transducción de proteína ayuda al complejo polipéptido-polinucleótido a atravesar membranas y a entrar en el interior de la célula o un orgánulo. La señal seleccionadora de dianas ayuda a dirigir el complemento hacia un sitio de interés, y suministrar de ese modo el polinucleótido.
Las composiciones descritas se pueden usar para suministrar polinucleótidos a localizaciones específicas en una célula, incluyendo, pero sin limitarse a, mitocondrias y cloroplastos. En algunos aspectos, los polinucleótidos codifican una proteína terapéutica o una proteína que compensa proteínas no funcionales o la ausencia de proteínas. En consecuencia, algunos aspectos proporcionan métodos para tratar enfermedades, por ejemplo enfermedades relacionadas con mitocondrias o cloroplastos.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
La Figura 1 es un diagrama de un diseño de plásmido ejemplar (izquierda) y una estructura proteica ejemplar (derecha) para TFAM con un dominio PTD seguido de una MLS.
La Figura 2 es un panel de micrografías de fluorescencia que muestra el transcurso de tiempo de mtDNA marcado con Alexa 488 (verde) complejado con PTD-MLS-TFAM añadido a células Sy5y. Red = MitoTracker Red.
Las Figuras 3A-C son micrografías de fluorescencia que muestran la tinción con MtRed y BrdU (FITC) de células rho0 (A), SY5Y normales (B) y rho0 16 h después de la transfección con mtDNA complejado con PTD-MLS-TFAM (C).
La Figura 4 es un gel de agarosa de productos de la PCR que amplifica la región alrededor de la mutación LHON 11778A después de SfaN1. Línea 1 - cíbrido LHON; Línea 2 - Sy5y; Línea 3 - Rho0; Línea 4 - Rho0 transfectada con LHON mtDNA; Línea 5 - Rho0 transfectada sin ADN.
La Figura 5A es una micrografía de fluorescencia que muestra células SY5Y normales 24 horas después de la transfección con mtDNA-MtEGFP clonada como un gen de fusión con ND6 en el sitio BamHI de mtDNA y coteñida con MiitoTracker Red.
La Figura 5B es una inmunotransferencia para EGFP usando anticuerpo JL-8 (Clontech) que muestra un producto de fusión proteico de 45 kDa entre ND6 y EGFP (flecha superior), así como la EGFP de 33 kDa (flecha inferior).
La Figura 6 es una inmunotransferencia de mtEGFP al silenciar con siRNA a PoIG después de cinco días. La línea final muestra el fracaso de EGFP siRNA para lograr el silenciamiento en un marco de tiempo similar.
La Figura 7A es un diagrama esquemático ejemplar de mtEGFP que contiene una señal de localización nuclear (NLS) y PTD clonado en mtDNA que contiene nuevos sitios de restricción, BgIII y NotI.
Las Figuras 7B-C son micrografías de fluorescencia que muestran células Sy5y que expresan NLS-mtEGFP-PTD que localiza a mitocondrias y el núcleo. (C) Las células se contratiñen con Mito Tracker Red.
La Figura 8A es un diagrama esquemático ejemplar del sitio BamHI erradicado en mtDNA, y BamHI-cDNA clonado en mtDNA.
La Figura 8B es un gel 24 horas después de la transfección, que muestra el fragmento de la PCR de mtDNA procedente de células que se digirieron con BamHI. La línea 1 no se digirió, y la línea 2 de mtDNA de control se digirió.
La Figura 8C es un gel que muestra lisados mitocondriales de células que se incubaron con ADN que contiene un sitio BamHI. Las células del control (línea 1) no muestran actividad de BamHI, mientras que las células transfectadas (línea 2) poseen actividad de BamHI.
La Figura 9 es un gel que muestra PTD-BgIII recombinante dirigido a mitocondrias que provocó la eliminación rápida de la proteína mtEGFP en células que expresan un mtDNA que posee un sitio de restricción BgIIImtEGFP, durante un período de tiempo de 5 días.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
1. Definiciones
Al describir y reivindicar la materia objeto descrita, se usará la siguiente terminología según las definiciones expuestas más abajo.
El término “polipéptidos” incluye proteínas y sus fragmentos. Los polipéptidos se describen aquí como secuencias de restos de aminoácidos. Esas secuencias se escriben de izquierda a derecha en la dirección desde el término amino al término carboxi. Según la nomenclatura estándar, las secuencias de restos de aminoácidos se denominan por un código de tres letras o una única letra, como se indica a continuación: alanina (Ala, A), arginina (Arg, R), asparagina (Asn, N), ácido aspártico (Asp, D), cisteína (Cys, C), glutamina (Gln, Q), ácido glutámico (Glu, E), glicina (Gly, G), histidina (His, H), isoleucina (Ile, I), leucina (Leu, L), lisina (Lys, K), metionina (Met, M), fenilalanina (Phe, F), prolina (Pro, P), serina (Ser, S), treonina (Thr, T), triptófano (Trp, W), tirosina (Tyr, Y), y valina (Val, V).
“Variante” se refiere a un polipéptido o polinucleótido que difiere de un polipéptido o polinucleótido de referencia, pero retiene propiedades esenciales. Una variante típica de un polipéptido difiere en la secuencia de aminoácidos de otro polipéptido de referencia. Generalmente, las diferencias son limitadas, de manera que las secuencias del polipéptido de referencia y la variante son en conjunto prácticamente similares y, en muchas regiones, idénticas. Una variante y un polipéptido de referencia pueden diferir en la secuencia de aminoácidos en una o más modificaciones (por ejemplo, sustituciones, adiciones, y/o supresiones). Un resto de aminoácido sustituido o insertado puede estar codificado o no por el código genético. Una variante de un polipéptido puede ser de origen natural, tal como una variante alélica, o puede ser una variante que no se conoce que es de origen natural.
Se pueden hacer modificaciones y cambios en la estructura de los polipéptidos de la descripción y todavía obtener una molécula que tiene características similares al polipéptido (por ejemplo, una sustitución de aminoácidos conservativa). Por ejemplo, ciertos aminoácidos se pueden sustituir por otros aminoácidos en una secuencia sin pérdida apreciable de actividad. Debido a que es la capacidad interactiva y la naturaleza de un polipéptido lo que define esa actividad funcional biológica del polipéptido, se pueden realizar ciertas sustituciones de las secuencias de aminoácidos en una secuencia polipeptídica y no obstante obtener un polipéptido con propiedades similares.
A la hora de obtener tales cambios, se puede considerar el índice hidropático de los aminoácidos. La importancia del índice hidropático de los aminoácidos a la hora de conferir una función biológica interactiva en un polipéptido se entiende generalmente en la técnica. Se sabe que ciertos aminoácidos se pueden sustituir por otros aminoácidos que tienen un índice o puntuación hidropática similar, y todavía pueden dar como resultado un polipéptido con actividad biológica similar. A cada aminoácido se le ha asignado un índice hidropático en base a su hidrofobia y características de carga. Esos índices son: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteína/cisteína (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (-0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptófano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspartato (-3,5); asparagina (-3,5); lisina (-3,9); y arginina (-4,5).
Se cree que el carácter hidropático relativo del aminoácido determina la estructura secundaria del polipéptido resultante, lo que a su vez define la interacción del polipéptido con otras moléculas, tales como enzimas, sustratos, receptores, anticuerpos, antígenos, y similares. Se sabe en la técnica que un aminoácido se puede sustituir por otro aminoácido que tiene un índice hidropático similar, y todavía obtener un polipéptido funcionalmente equivalente. En tales cambios, se prefiere particularmente la sustitución de aminoácidos cuyos índices hidropáticos están dentro de ± 2, se prefieren particularmente aquellos dentro de ± 1, e incluso son más particularmente preferidos aquellos dentro de ± 0,5.
La sustitución de aminoácidos similares se puede realizar también en base a la hidrofilia, particularmente cuando el polipéptido o péptido equivalente funcional biológico creado de ese modo está destinado al uso en realizaciones inmunológicas. Se han asignado los siguientes valores de hidrofilia a los restos de aminoácidos: arginina (+3,0); lisina (+3,0); aspartato (+3,0 ± 1); glutamato (+3,0 ± 1); serina (+0,3); asparagina (+0,2); glutamina (+0,2); glicina (0); prolina (-0,5 ± 1); treonina (-0,4); alanina (-0,5); histidina (-0,5); cisteína (-1,0); metionina (-1,3); valina (-1,5); leucina (-1,8); isoleucina (-1,8); tirosina (-2,3); fenilalanina (-2,5); triptófano (-3,4). Se entiende que un aminoácido se puede sustituir por otro que tenga un valor de hidrofilia similar y todavía obtener un polipéptido biológicamente equivalente, y en particular un polipéptido inmunológicamente equivalente. En tales cambios, se prefiere la sustitución de aminoácidos cuyos valores de hidrofilia está dentro de ± 2, se prefieren particularmente aquellos dentro de ± 1, e incluso son más particularmente preferidos aquellos dentro de ± 0,5.
Como se bosqueja anteriormente, las sustituciones de aminoácidos se basan generalmente en la similitud relativa de los sustituyentes de las cadenas laterales de los aminoácidos, por ejemplo su hidrofobia, hidrofilia, carga, tamaño, y similar. Las sustituciones ejemplares que toman en consideración diversas de las características anteriores son bien conocidas por los expertos en la técnica, e incluyen (resto original: sustitución ejemplar): (Ala: Gly, Ser), (Arg: Lys), (Asn: Gln, His), (Asp: Glu, Cys, Ser), (Gin: Asn), (Glu: Asp), (Gly: Ala), (His: Asn, Gln), (Ile: Leu, Val), (Leu: Ile, Val), (Lys: Arg), (Met: Leu, Tyr), (Ser: Thr), (Thr: Ser), (Tip: Tyr), (Tyr: Trp, Phe), y (Val: Ile, Leu). Las realizaciones de esta descripción contemplan así equivalentes funcionales o biológicos de un polipéptido como se expone anteriormente. En particular, realizaciones de los polipéptidos pueden incluir variantes que tienen alrededor de 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, y 95% de identidad de secuencia con el polipéptido de interés.
“Identidad”, como se conoce en la técnica, es una relación entre dos o más secuencias polipeptídicas, según se determina comparando las secuencias. En la técnica, “identidad” también significa el grado de relatividad de las secuencias entre polipéptidos según se determina mediante el emparejamiento entre cadenas de tales secuencias. La “Identidad” y “similitud” se pueden calcular fácilmente por métodos conocidos, incluyendo, pero sin limitarse a, los descritos en (Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., Ed., Oxford University Press, Nueva York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., Ed., Academic Press, Nueva York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Parte I, Griffin, A. M., y Griffin, H. G., Eds., Humana Press, Nueva Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; y Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., Eds., M Stockton Press, Nueva York, 1991; y Carillo, H., y Lipman, D., SIAM J Applied Math., 48: 1073 (1988).
Se diseñan métodos preferidos para determinar la identidad, para dar el emparejamiento más grande entre las secuencias ensayadas. Los métodos para determinar la identidad y similitud están codificados en programas de ordenador públicamente disponibles. El porcentaje de identidad entre dos secuencias se puede determinar usando software de análisis (es decir, Sequence Analysis Software Package del Genetics Computer Group, Madison Wis.) que incorpora el algoritmo de Needelman y Wunsch, (J. Mol. Biol., 48: 443-453, 1970) (por ejemplo, NBLAST, y XBLAST). Para determinar la identidad para los polipéptidos de la presente invención, se usan los parámetros por defecto.
A título de ejemplo, una secuencia polipeptídica puede ser idéntica a la secuencia de referencia, es decir, ser 100% idéntica, o puede incluir hasta un cierto número entero de alteraciones de aminoácidos en comparación con la secuencia de referencia, de manera que el % de identidad es menor que 100%. Tales alteraciones se seleccionan de: al menos una supresión, sustitución, incluyendo la sustitución conservativa y no conservativa, o inserción de aminoácidos, y en el que dichas alteraciones se pueden producir en las posiciones aminoterminales o carboxiterminales de la secuencia polipeptídica de referencia o en cualquier otra parte entre esas posiciones terminales, entremezcladas ya sea individualmente entre los aminoácidos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos en la secuencia de referencia. El número de alteraciones de aminoácidos para un % de identidad se determina multiplicando el número total de aminoácidos en el polipéptido de referencia por el porcentaje numérico del porcentaje de identidad respectivo (dividido entre 100), y restando entonces ese producto del mencionado número total de aminoácidos en el polipéptido de referencia.
Como se usa aquí, la expresión “baja restricción” se refiere a condiciones que permiten que un polinucleótido o polipéptido se una a otra sustancia con poca o ninguna especificidad de secuencia.
Como se usa aquí, el término “purificado”, y términos similares, se refiere al aislamiento de una molécula o compuesto en una forma que está sustancialmente libre (al menos 60% libre, preferiblemente 75% libre, y lo más preferible 90% libre) de otros componentes normalmente asociados con la molécula o compuesto en un entorno nativo.
Como se usa aquí, la expresión “vehículo farmacéuticamente aceptable” engloba cualquiera de los vehículos farmacéuticos estándar, tal como una disolución salina tamponada con fosfato, agua y emulsiones tales como una emulsión de aceite/agua o de agua/aceite, y diversos tipos de agentes humectantes.
Como se usa aquí, el término “tratar” incluye aliviar los síntomas asociados con un trastorno o afección específico, y/o prevenir o eliminar dichos síntomas.
“Operablemente enlazado” se refiere a una yuxtaposición en la que los componentes están configurados para llevar a cabo su función habitual. Por ejemplo, las secuencias de control o promotores enlazados operablemente a una secuencia codificante son capaces de efectuar la expresión de la secuencia codificante, y una secuencia de localización de orgánulos operablemente enlazada a proteína dirigirá la proteína enlazada para situarla en el orgánulo específico.
“Señal o secuencia o dominio de localización” o “señal o secuencia o dominio seleccionador de diana” se usan de forma intercambiable, y se refiere a una señal que dirige una molécula hacia una célula, tejido, orgánulo o región intracelular específica. La señal puede ser un resto polinucleotídico, polipeptídico o de hidrato de carbono, o puede ser un compuesto orgánico o inorgánico suficiente para dirigir una molécula aneja hacia una localización deseada. Las señales de localización de orgánulos ejemplares incluyen señales de localización nuclear conocidas en la técnica y otras señales de localización de orgánulos conocidas en la técnica tales como las proporcionadas en las Tablas 1 y 2 y descritas en Emanuelson et al., Predicting Subcellular Localization of Proteins Based on Their Nterminal Amino Acid Sequence. Journal of Molecular Biology. 300(4):1005-16, 21 de julio de 2000, y en Cline y Henry, Import and Routing of Nucleus-encoded Chloroplast Proteins. Annual Review of Cell & Developmental Biology. 12:1-26, 1996. Se apreciará que no es necesario que esté incluida toda la secuencia dada en las Tablas 1 y 2, y las modificaciones que incluyen truncamientos de estas secuencias están dentro del alcance de la descripción, con la condición de que las secuencias operen para dirigir una molécula enlazada hacia un orgánulo específico. Las señales de localización de orgánulos de la presente descripción pueden tener 80 a 100% de homología con las secuencias de la Tabla 1 y 2. Una clase de señales de localización de orgánulos adecuadas incluyen aquellas que no interaccionan con el orgánulo seleccionado como diana en un mecanismo de receptor:ligando. Por ejemplo, las señales de localización de orgánulos incluyen señales que tienen o que confieren una carga neta, por ejemplo una carga positiva. Las señales positivamente cargadas se pueden usar para buscar orgánulos cargados negativamente, tales como las mitocondrias. Las señales cargadas negativamente se pueden usar para buscar orgánulos cargados positivamente.
“Dominio de transducción de proteína” o PTD se refiere a un polipéptido, polinucleótido, hidrato de carbono, o a compuestos orgánicos o inorgánicos que facilitan el atravesamiento de la bicapa lipídica, de la micela, de la membrana celular, de la membrana del orgánulo, o de la membrana de la vesícula. Un PTD unido a otra molécula facilita que la molécula atraviese las membranas, por ejemplo yendo desde el espacio extracelular hacia el espacio intracelular, o del citosol hacia dentro de un orgánulo. Los PTDs ejemplares incluyen, pero no se limitan a, HIV TAT
YGRKKRRQRRR (SEC. ID NO. 1) o RKKRRQRRR (SEC. ID NO. 2); 11 restos de arginina, o polipéptidos o polinucleótidos positivamente cargados que tienen 8-15 restos, preferiblemente 9-11 restos.
Como se usa aquí, la expresión “ADN exógeno” o “secuencia de ácido nucleico exógena” o “polinucleótido exógeno” se refiere a una secuencia de ácido nucleico que se introdujo en una célula u orgánulo desde una fuente externa. Típicamente, la secuencia exógena introducida es una secuencia recombinante.
Como se usa aquí, el término “transfección” se refiere a la introducción de una secuencia de ácido nucleico en el interior de un espacio cerrado por una membrana de una célula viva, incluyendo la introducción de la secuencia de ácido nucleico en el citosol de una célula así como el espacio interior de una mitocondria, núcleo o cloroplasto. El ácido nucleico puede estar en forma de ADN o ARN desnudo, asociado con diversas proteínas, o el ácido nucleico se puede incorporar en un vector.
Como se usa aquí, el término “vector” se usa con referencia a un vehículo usado para introducir una secuencia de ácido nucleico en una célula. Un vector vírico es un virus que se ha modificado para permitir que se introduzcan secuencias de ADN recombinante en células hospedantes u orgánulos celulares.
Como se usa aquí, el término “orgánulo” se refiere a estructuras unidas a membranas celulares tales como el cloroplasto, mitocondria, y núcleo. El término “orgánulo” incluye orgánulos naturales y sintéticos.
Como se usa aquí, la expresión “orgánulo no nuclear” se refiere a cualquier estructura unida a membrana celular presente en una célula, excepto el núcleo.
Como se usa aquí, el término “polinucleótido” se refiere generalmente a cualquier polirribonucleótido o polidesoxirribonucleótido, que puede ser ARN o ADN sin modificar o ARN o ADN modificado. De este modo, por ejemplo, polinucleótidos, como se usa aquí, se refiere a, entre otros, ADN monocatenario y bicatenario, ADN que es una mezcla de regiones mono-y bicatenarias, ARN mono- y bicatenario, y ARN que es una mezcla de regiones mono- y bicatenarias, moléculas híbridas que comprenden ADN y ARN que pueden ser monocatenarios o, más típicamente, bicatenarios, o una mezcla de regiones mono- y bicatenarias. La expresión “ácido nucleico” o “secuencia de ácido nucleico” también engloba un polinucleótido como se define anteriormente.
Además, polinucleótido, como se usa aquí, se refiere a regiones tricatenarias que comprenden ARN o ADN o tanto ARN como ADN. Las cadenas en tales regiones pueden ser de la misma molécula o de diferentes moléculas. Las regiones pueden incluir todas de una o más de las moléculas, pero más típicamente implican sólo una región de algunas de las moléculas. Una de las moléculas de una región de triple hélice es a menudo un oligonucleótido.
Como se usa aquí, el término polinucleótido incluye ADN o ARN como se describe anteriormente que contienen una
o más bases modificadas. De este modo, los ADN o ARN con cadenas principales modificadas por estabilidad o por otras razones son “polinucleótidos”, como ese término se destina aquí. Además, los ADN o ARN que comprenden bases no habituales, tales como inosina, o bases modificadas, tales como bases tritiladas, por nombrar sólo dos ejemplos, son polinucleótidos como se usa aquí el término.
Se apreciará que se ha realizado una gran variedad de modificaciones a ADN y ARN que sirven para muchos fines útiles conocidos por los expertos en la técnica. El término polinucleótido, como se emplea aquí, abarca tales formas química, enzimática o metabólicamente modificadas de polinucleótidos, así como las formas químicas de ADN y ARN características de virus y células, incluyendo células simples y complejas, entre otros.
“Oligonucleótido(s)” se refiere a polinucleótidos relativamente cortos. A menudo, el término se refiere a desoxirribonucleótidos monocatenarios, pero se puede referir igualmente a ribonucleótidos mono- o bicatenarios, híbridos de ARN:ADN, y ADN bicatenarios, entre otros.
2. Polipéptidos de unión a polinucleótidos o de empaquetamiento de polinucleótidos modificados
A. Dominio de unión a polinucleótidos
Las composiciones y métodos para el suministro de un polinucleótido proporcionado aquí incluyen polipéptidos de unión a polinucleótidos o polipéptidos de empaquetamiento de polinucleótidos que tienen un PTD y opcionalmente una señal o dominio seleccionador de dianas. El polipéptido modificado o recombinante puede ser cualquier polipéptido que se sabe que se une o empaqueta un polinucleótido. El polipéptido recombinante se puede usar como agente terapéutico, ya sea solo o en combinación con un polinucleótido. El polipéptido de unión a polinucleótidos incluye al menos una porción de un miembro del grupo de movilidad elevada (HMG) de proteínas, en particular al menos un dominio de la caja HMG. Generalmente, el dominio HMG incluye un plegamiento global de tres hélices estabilizadas en una configuración con “forma de L” mediante dos núcleos hidrófobo. Las proteínas cromosómicas del grupo de movilidad elevada HMG1 o HMG2, que son normales en todas las eucariotas, se unen a ADN de una manera no específica de la secuencia, por ejemplo para promover la función de la cromatina y la regulación génica. Pueden interaccionar directamente con nucleosomas, y se cree que son moduladores de la estructura de cromatina. También son importantes a la hora de activar un número de reguladores de la expresión génica, incluyendo p53,
factores de transcripción Hox, y receptores de hormonas esteroides, al incrementar su afinidad por ADN. Las proteínas HMG incluyen HMG-1/2, HMG-I(Y) y HMG-14/17.
Las proteínas de la caja HMG-1/2 se pueden distinguir además en tres subfamilias según el número de dominios HMG presentes en la proteína, su reconocimiento de secuencia específica y su relación evolutiva. El primer grupo contiene proteínas cromosómicas unidas a ADN sin especificidad de secuencia (clase I, HMG1 y HMG2), el segundo factores de transcripción ribosómicos y mitocondriales que muestran especificidad de secuencia en presencia de otro factor asociativo cuando se une con ADN (clase II, proteína ABF-2 de unión a ARS de levadura, UBF y factor mtTF-1 de transcripción mitocondrial), y el tercero factores de transcripción específicos de genes que muestran unión a ADN específica de secuencia (clase III, factores LEF-1 y TCF-1 de unión al potenciador de linfoide; el factor determinante del sexo de mamíferos SRY, y las proteínas SOX estrechamente relacionadas; y las proteínas reguladoras fúngicas Mat-MC, Mat-a1, Ste11 y Rox1). El dominio de unión a ADN de la caja HMG1/2 tiene alrededor de 75 aminoácidos, y contiene restos de prolina, aromáticos y básicos muy conservados. Las propiedades habituales de las proteínas del dominio HMG incluyen la interacción con el surco menor de la hélice de ADN, la unión a una estructura de ADN irregular, y la capacidad para modular la estructura de ADN mediante flexión.
Las proteínas SOX (caja HMG tipo SRY) tienen funciones críticas en un número de procesos de desarrollo, incluyendo la determinación del sexo, la formación del esqueleto, el desarrollo de células pre-B y T, y la inducción neural. SOX9 desempeña un papel directo durante la condrogénesis mediante la unión y activación del potenciador específico de condrocitos del gen Col2a1. La pérdida de la función del gen SOX9 conduce a la patología genética conocida como displasia campomélica (CD), una forma de enanismo caracterizada por malformación esquelética extrema, y aquella en la que tres cuartos del individuo XY son intersexuales o muestran una inversión sexual macho a hembra. Hay más de 20 miembros clonados en la familia SOX. Todos ellos contienen un dominio HMG, que se puede unir específicamente al motivo de ADN bicatenario y comparte >50% de identidad con el dominio HMG de SRY, el factor determinante de los testículos humanos. Se ha definido que el sitio preferido de unión al ADN de SOX9 es AGAACAATGG, que contiene el elemento de unión al núcleo de SOX (SCBE), AACAAT. Los nucleótidos 5’ AG y 3’ GG de flanqueo potencian la unión mediante SOX9.
La proteína de unión a polinucleótido recombinante tiene al menos un dominio de la caja HMG, generalmente al menos dos, más particularmente 2-5 dominios de la caja HMG. El dominio de la caja HMG se puede unir a una secuencia de ADN rica en AT, por ejemplo, usando una gran superficie sobre la cara cóncava de la proteína, para la unión al surco menor del ADN. Esta unión flexiona el eje de la hélice de ADN lejos del sitio de contacto. Las hélices primera y segunda contactan con el ADN, ajustándose sus términos N en el surco menor, mientras que la hélice 3 está principalmente expuesta al disolvente. El intercalado parcial de restos alifáticos y aromáticos en la hélice 2 se produce en el surco menor.
De otro modo, el polipéptido de unión a polinucleótido puede tener al menos un dominio de unión a polinucleótido, típicamente dos o más dominios de unión a polinucleótido. Los dominios de unión a polinucleótido representativos conocidos en la técnica incluyen, pero no se limitan a, motivos de hélice-giro-hélice, incluyendo homeodominios y dominios POU; dominios de dedo de cinc tales como C2H2 y C2C2; dominios de hélices anfipáticas tales como la cremallera de leucina y dominios de hélice-bucle-hélice; y plegamientos de histona. El dominio de unión a polinucleótido puede ser específico para una secuencia polinucleotídica específica, o preferiblemente se une de forma no específica a un polinucleótido. Como alternativa, el dominio de unión a polinucleótido puede tener más de un tipo de dominio de unión a polinucleótido.
También se describen polipéptidos de unión a polinucleótidos modificados que tienen un motivo de hélice-giro-hélice
o al menos una región de unión a polinucleótido de una proteína de hélice-giro-hélice. Las proteínas de hélice-girohélice tienen una estructura similar a proteínas reguladoras bacterianas tales como las proteínas represoras I y las proteínas cro, las proteínas represoras lac, etc., que se unen como dímeros, y sus sitios de unión son palindrómicos. Contienen 3 regiones helicoidales separadas por giros cortos, que son el motivo por el que se denominan proteínas de hélice-giro-hélice. Una hélice proteica (hélice 3) en cada subunidad del dímero ocupa el surco mayor de dos giros sucesivos de la hélice de ADN. De este modo, los polipéptidos de unión a polinucleótidos descritos pueden formar dímeros u otros complejos de múltiples componentes, y tienen 1 a 3 hélices.
De otro modo, el polipéptido de unión a polinucleótido modificado incluye un homeodominio o una porción de una proteína de homeodominio. Las proteínas de homeodominio se unen a una secuencia de 180 pares de bases inicialmente identificada en un grupo de genes denominados genes homeóticos. En consecuencia, la secuencia se denominó la homeocaja. Los 180 pb corresponden a 60 aminoácidos en la proteína correspondiente. Este dominio proteico se denomina el homeodominio. Las proteínas que contienen homeodominios se han identificado desde entonces en un amplio intervalo de organismos, incluyendo vertebrados y plantas. El homeodominio muestra un grado elevado de conservación de secuencias. El homeodominio contiene 4 regiones helicoidales !. Las hélices II y III están conectadas por 3 aminoácidos que comprenden un giro. Esta región tiene una estructura muy similar a las hélices II y III de las proteínas de unión a ADN bacterianas.
También se describe un polipéptido de unión a polinucleótido modificado que tiene un dominio de dedo de cinc o al menos una porción de una proteína de dedo de cinc. Las proteínas de dedo de cinc tienen un dominio con la estructura general: Phe (algunas veces Tyr) - Cys - 2 a 4 aminoácidos - Cys - 3 aminoácidos - Phe (algunas veces
Tyr) - 5 aminoácidos - Leu - 2 aminoácidos - His -3 aminoácidos - His. Los restos de fenilalanina o tirosina, que aparecen en posiciones invariantes, son necesarios para la unión al ADN. Se han encontrado secuencias similares en un abanico de otras proteínas de unión a ADN, aunque el número de dedos varía. Por ejemplo, el factor de transcripción SP1, que se une a la caja GC encontrada en la región próxima promotora de un número de genes, tiene 3 dedos. Este tipo de dedo de cinc, que tiene 2 cisteínas y 2 histidinas, se denomina un dedo de cinc C2H2.
Se ha encontrado otro tipo de dedo de cinc que une cinc entre 2 pares de cisteínas en un abanico de proteínas de unión a ADN. La estructura general de este tipo de dedo de cinc es: Cys - 2 aminoácidos -Cys -13 aminoácidos -Cys - 2 aminoácidos - Cys. Esto se denomina un dedo de cinc C2C2. Se encontró en un grupo de proteínas conocidas como la superfamilia de receptores de esteroides, cada una de las cuales tiene 2 dedos de cinc C2C2.
También se describe un polipéptido de unión a polinucleótido modificado que tiene una cremallera de leucina o al menos una porción de una proteína de cremallera de leucina. La primera proteína de cremallera de leucina se identificó a partir de extractos de células hepáticas, y se denominó C/EBP debido a que es una proteína de unión a potenciador, y se pensó originalmente que se unía a la secuencia próxima del promotor CAAT. C/EBP sólo se unirá a ADN como un dímero. La región de la proteína en la que se unen los dos monómeros para obtener el dímero sedenomina el dominio de dimerización. Éste cae hacia el extremo C-terminal de la proteína. Cuando se examinó la secuencia de aminoácidos, se encontró que aparece un resto de leucina cada séptimo aminoácido a lo largo de un tramo de 35 aminoácidos. Si esta región fuese para formar una hélice, entonces todas estas leucinas se alinearían en una cara de la hélice.
Debido a que la leucina tiene una cadena lateral hidrófoba, una cara de la hélice es muy hidrófoba. La cara opuesta tiene aminoácidos con cadenas laterales cargadas que son hidrófilas. La combinación de características hidrófobas e hidrófilas da a la molécula su nombre anfipático. Adyacente a la región de cremallera de leucina se encuentra una región de 20-30 aminoácidos, que es rica en los aminoácidos básicos (cargados positivamente) lisina y arginina. Esta es el dominio de unión a ADN – a menudo denominado como el dominio bZIP – la región básica de la cremallera de leucina. Se piensa que C/EBP se une a ADN mediante estas regiones bZIP que envuelven a la hélice de ADN.
La estructura de cremallera de leucina-bZIP se ha encontrado en un abanico de otras proteínas, incluyendo los productos de los oncogenes jun y fos. Mientras que C/EBP se une a ADN como un homodímero de subunidades idénticas, fos no puede formar homodímeros en absoluto, y los homodímeros jun/jun tienden a ser inestables. Sin embargo, los heterodímeros fos/jun son mucho más estables. Estos heterodímeros fos/jun corresponden a un factor de transcripción general denominado AP1, que se une a una variedad de promotores y potenciadores y activa la transcripción. El sitio de unión a AP1 de consenso es TGACTCA (SEC. ID. NO.: 3), que es palindrómico.
También se describe un polipéptido de unión a polinucleótido modificado que tiene un dominio de hélice-bucle-hélice
o una porción de unión a polinucleótido de una proteína de hélice-bucle-hélice. Las proteínas de hélice-bucle-hélice son similares a cremalleras de leucina por cuanto forman dímeros vía hélices anfipáticas. Se descubrieron por primera vez como una clase de proteínas cuando se observó una región de similitud entre dos proteínas de unión a potenciadores denominadas E47 y E12. Esta región conservada tiene el potencial para formar dos hélices anfipáticas separadas por un bucle, por tanto hélice-bucle-hélice. Próximo al dominio de dimerización se encuentra un dominio de unión a ADN, nuevamente rico en aminoácidos básicos y denominado el dominio bHLH. Estas estructuras también se encuentran en un número de genes requeridos para el desarrollo del sistema nervioso de Drosophila – el complejo Achaete-scute, y en una proteína denominada MyoD, que es necesaria para la diferenciación muscular de mamíferos.
De otro modo, el polipéptido de unión a polinucleótido modificado incluye un polipéptido de histona, un fragmento de un polipéptido de histona, o al menos un plegamiento de histona. Los plegamientos de histona existen en monómeros de polipéptidos de histona ensamblados en dímeros. Los polipéptidos de histona incluyen H2A, H2B, H3, y H4, que pueden formar heterodímeros H2A-2B y H3-H4. Se apreciará que los polipéptidos similares a histona también se pueden usar en las composiciones y métodos descritos. Los polipéptidos similares a histona incluyen, pero no se limitan a, HMf, o la histona de Methanothermous fervidus, u otras histonas de arqueas conocidas en la técnica, y polipéptidos que contienen plegamientos de histona tales como MJ1647, CBF, TAFII o el factor de transcripción IID, SPT3, y Dr1-DRAP (Sanderman, K. et al. (1998) CMLS. Cell. Mol. Life Sci. 54:1350-1364.
La solicitud describe un polipéptido de factor de transcripción mitocondrial A (TFAM) modificado. TFAM es un miembro del grupo de movilidad elevada (HMG) de proteínas que tienen dos dominios de caja HMG. TFAM, así como otras proteínas HMG, se unen, envuelven, flexionan y desenrollan ADN. De este modo, la presente descripción incluye polipéptidos que inducen un cambio estructural en el polinucleótido cuando el polipéptido se une
o se asocia con el polinucleótido. Induciendo un cambio conformacional en el polinucleótido, el polipéptido empaqueta al polinucleótido. Se ha dado a conocer que TFAM se une a ADN mitocondrial en una relación de 900:1 (Alam, T. I. et al. (2003) Nucleic Acid Res. 31 (6):1640-1645). Se apreciará que la cantidad de polipéptido que se une a polinucleótido usado en las composiciones y métodos descritos aquí puede variar dependiendo del tamaño y cantidad del polinucleótido a suministrar. Las relaciones adecuadas de polipéptido de unión a polinucleótido a pares de bases de polinucleótido a suministrar incluyen, pero no se limitan a, alrededor de 1:1 a 1:1.000, más preferiblemente 1:100, incluso más preferiblemente 1:alrededor de 10 a alrededor de 20 pares de bases de
polinucleótido a suministrar. También se apreciará que TFAM, otro polipéptido de unión a polinucleótido, o una combinación de dos o más polipéptidos de unión a polinucleótido, se puede añadir a un polinucleótido para envolver
o cubrir el polinucleótido, y de ese modo empaquetar el polinucleótido y protegerlo de la degradación.
TFAM se puede modificar para incluir un PTD y opcionalmente una señal seleccionadora de dianas. La señal seleccionadora de dianas puede incluir una secuencia de monómeros que facilita la localización de la molécula hacia un tejido, célula u orgánulo específico. Los monómeros pueden ser aminoácidos, bases nucleotídicas o nucleosídicas, o grupos de azúcares tales como glucosa, galactosa, y similares, que forman señales de seleccionador de dianas de hidratos de carbono.
B. Dominio de transducción de proteína
El polipéptido de unión a polinucleótido se puede modificar para incluir un dominio de transducción de proteína (PTD), también conocido como péptidos que penetran células (CPPS). Los PTD son conocidos en la técnica, e incluyen, pero no se limitan a, pequeñas regiones de proteínas que son capaces de atravesar una membrana celular en un mecanismo independiente de receptores (Kabouridis, P. (2003) Trends in Biotechnology (11):498-503). Aunque se han documentado varios PTD, los dos PTD empleados más habitualmente derivan de la proteína TAT de VIH (Frankel y Pabo, 1988) y factor de transcripción de Antennapedia de Drosophila, cuyo PTD se conoce como penetratina (Derossi et al., (1994) J Biol Chem. 269(14):10444-50).
El homeodominio de Antennapedia tiene una longitud de 68 restos de aminoácidos y contiene cuatro hélices alfa (SEC. ID NO. 4). La penetrapina es un dominio activo de esta proteína que consiste en una secuencia de 16 aminoácidos derivada de la tercera hélice de Antennapedia (Fenton et al., 1998). La proteína TAT (SEC. ID NO. 5) consiste en 86 aminoácidos, y está implicada en la replicación del VIH-1. El PTD de TAT consiste en un dominio de secuencia de 11 aminoácidos (restos 47 a 57; YGRKKRRQRRR (SEC. ID. NO.1)) de la proteína progenitora que parece que es crítica para la captación (Vives et al., 1997). Adicionalmente, se ha mostrado que el dominio básico Tat(49-57) o RKKRRQRRR (SEC. ID NO. 2) (Wender et al. 2000) es un PTD. En la bibliografía actual, se ha favorecido a TAT para la fusión a proteínas de interés para la importación celular. Varias modificaciones a TAT, incluyendo sustituciones de glutamina por alanina, es decir, Q ∀ A, han demostrado un incremento en la captación celular desde 90% (Wender et al. 2000) hasta 33 veces en células de mamíferos (Ho et al. (2001) Cancer Res. 61(2):474-7). La captación más eficiente de proteínas modificadas se reveló mediante experimentos de mutagénesis de PTD de TAT, que muestran que un tramo de 11 argininas fue varios órdenes de magnitud más eficiente como vehículo de suministro intercelular. De este modo, algunas realizaciones incluyen PTD que son catiónicos o anfipáticos. Adicionalmente, los PTD ejemplares incluyen, pero no se limitan a, poly-Arg – RRRRRRR (SEC. ID. NO.: 6); PTD-5 - RRQRRTSKLMKR (SEC. ID. NO.: 7); transportano GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL (SEC. ID. NO.: 8); KALA -WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKCEA (SEC. ID. NO.: 9); y RQIKIWFQNRRMKWKK (SEC. ID. NO.: 207).
C. Señal o dominio seleccionador de dianas
En todavía otras realizaciones, el polipéptido de unión a polinucleótido modificado se modifica para incluir una señal
o dominio seleccionador de dianas. La señal o secuencia seleccionadora de dianas es específica para un orgánulo no nuclear. Por ejemplo, las composiciones descritas aquí se pueden modificar con macromoléculas que terminan en galactosilo para dirigir las composiciones al hígado o a células hepáticas. Las composiciones modificadas entran selectivamente en los hepatocitos tras la interacción de los restos de galactosa portadores con el receptor de asialoglucoproteína presente en grandes cantidades y con elevada afinidad sólo en estas moléculas. Además, las composiciones descritas aquí se pueden dirigir hacia regiones, compartimientos u orgánulos intracelulares específicos.
La presente descripción también se refiere al suministro específico de polinucleótidos a compartimientos u orgánulos intracelulares. Los polinucleótidos pueden codificar un polipéptido o pueden interferir con la expresión de un polinucleótido diferente. Las células eucariotas contienen estructuras u orgánulos unidos a la membrana. Los orgánulos pueden tener una sola membrana o múltiples membranas, y pueden existir tanto en células vegetales como animales. Dependiendo de la función del orgánulo, el orgánulo puede consistir en componentes específicos tales como proteínas y cofactores. Los polinucleótidos suministrados al orgánulo pueden codificar polipéptidos que pueden potenciar o contribuir al funcionamiento del orgánulos. Algunos orgánulos, tales como mitocondrias y cloroplastos, contienen su propio genoma. Los ácidos nucleicos se replican, transcriben y traducen en estos orgánulos. Las proteínas se importan y los metabolitos se exportan. De este modo, existe un intercambio de material a través de las membranas de los orgánulos. En algunas realizaciones, los polinucleótidos que codifican polipéptidos mitocondriales se suministran específicamente a mitocondrias.
Los orgánulos ejemplares incluyen el núcleo, mitrocondria, cloroplasto, lisosoma, peroxisoma, Golgi, retículo endoplásmico, y nucleolo. Los orgánulos sintéticos se pueden formar a partir de lípidos, y pueden contener proteínas específicas en las membranas lipídicas. Adicionalmente, el contenido de orgánulos sintéticos se puede manipular para que contengan componentes para la traducción de ácidos nucleicos.
1. Señales de localización nuclear
Las composiciones descritas aquí pueden incluir una o más señales de localización nuclear. Las señales de localización nuclear (NLS) o dominios son conocidos en la técnica, e incluyen, por ejemplo, el antígeno SV 40 T o un fragmento del mismo, tal como PKKKRKV (SEC. ID. NO.: 10). La NLS puede ser secuencias catiónicas simples de alrededor de 4 a alrededor de 8 aminoácidos, o puede ser bipartita, que tiene dos racimos cargados positivamente interdependientes separados mediante una región ligadora resistente a mutaciones de alrededor de 10-12 aminoácidos. La NLS representativa adicional incluye, pero no se limita a, GKKRSKV (SEC. ID. NO.: 11); KSRKRKL (SEC. ID. NO.: 12); KRPAATKKAGQAKKKKLDK (SEC. ID. NO.: 13); RKKRKTEEESPLKDKAKKSK (SEC. ID. NO.: 14); KDCVMNKHHRNRCQYCRLQR (SEC. ID. NO.: 15); PAAKRVKLD (SEC. ID. NO.: 16); y KKYENVVIKRSPRKRGRPRK (SEC. ID. NO.: 17).
2. Selección de la diana mitocondrial
En algunas realizaciones de la presente descripción, se describen polipéptidos de unión a polinucleótidos modificados que suministran específicamente polinucleótidos a mitocondrias. Las mitocondrias contienen la maquinaria molecular para la conversión de energía a partir de la ruptura de glucosa en trifosfato de adenosina (ATP). La energía almacenada en los enlaces de fosfato de alta energía de ATP está disponible entonces para poner en marcha funciones celulares. Las mitocondrias son mayoritariamente proteína, pero están presentes algunos lípidos, ADN y ARN. Estos orgánulos generalmente esféricos tienen una membrana exterior que rodea a una membrana interior que se pliega (crestas) en un armazón de enzimas de fosforilación oxidativa y de transporte de electrones. La mayoría de las mitocondrias tienen crestas parecidas a mesetas planas, pero aquellas en células secretoras de esteroides pueden tener crestas tubulares. La matriz mitocondrial contiene las enzimas del ciclo del ácido cítrico, de la oxidación de ácidos grasos, y ácidos nucleicos mitocondriales.
El ADN mitocondrial es bicatenario y circular. El ARN mitocondrial se encuentra en tres variedades estándar: ribosómico, mensajero y de transferencia, pero cada uno es específico para las mitocondrias. En las mitocondrias se produce cierta síntesis proteica en los ribosomas mitocondriales, que son diferentes de los ribosomas citoplásmicos. Otras proteínas mitocondriales se obtienen en ribosomas citoplásmicos, con un péptido señal que las dirige hacia las mitocondrias. La actividad metabólica de la célula está relacionada con el número de crestas y el número de mitocondrias en una célula. Las células con actividad metabólica elevada, tales como la del músculo cardíaco, tienen muchas mitocondrias bien desarrolladas. Se forman nuevas mitocondrias a partir de mitocondrias preexistentes cuando crecen y se dividen.
Las membranas internas de las mitocondrias contienen una familia de proteínas de secuencia y estructura relacionada que transportan diversos metabolitos a través de la membrana. Sus secuencias de aminoácidos tienen una estructura tripartita, hecha de tres secuencias relacionadas de alrededor de 100 aminoácidos de longitud. Las repeticiones de un portador están relacionadas con las presentes en los otros, y se conservan varios rasgos de secuencias característicos a lo largo de la familia.
La dirección de polinucleótidos específicos hacia orgánulos se puede lograr modificando las composiciones descritas para expresar señales seleccionadoras de orgánulos específicos. Estas secuencias seleccionan como dianas a orgánulos específicos, pero en algunas realizaciones la interacción de la señal seleccionadora de dianas con el orgánulo no se produce a través de una interacción tradicional de tipo receptor:ligando. La célula eucariota comprende un número de compartimientos u orgánulos unidos a la membrana discretos. La estructura y función de cada orgánulo está determinada en gran medida por su complemento único de polipéptidos constituyentes. Sin embargo, la inmensa mayoría de estos polipéptidos comienzan su síntesis en el citoplasma. De este modo, la biogénesis y mantenimiento de los orgánulos requieren que las proteínas recientemente sintetizadas sean dirigidas de forma exacta hacia su compartimiento apropiado. Esto se logra a menudo mediante secuencias señalizadoras aminoterminales, así como modificaciones post-traduccionales y estructura secundaria. Para las mitocondrias, se han deducido varias señales seleccionadoras de dianas aminoterminales, y están incluidas, en parte, en la Tabla 1.
En una realización, la señal seleccionadora del orgánulo puede contener al menos dos, preferiblemente 5-15, más preferiblemente alrededor de 11 grupos cargados, provocando que la señal seleccionadora de dianas sea llevada hacia orgánulos que tienen una carga opuesta neta. En otra realización, la señal seleccionadora de dianas puede contener una serie de grupos cargados que hace que la señal seleccionadora de dianas sea transportada al interior de un orgánulo, ya sea contra o a favor de un gradiente de potencial electromagnético. Los grupos cargados adecuados son grupos que están cargados en condiciones intracelulares, tales como aminoácidos con grupos funcionales cargados, grupos amino, ácidos nucleicos, y similares. Las señales de localización/selección de dianas mitocondriales consiste generalmente en una secuencia líder de aminoácidos muy cargados positivamente. Esto permite que la proteína sea dirigida hacia las mitocondrias muy cargadas negativamente. A diferencia de los enfoques de tipo receptor:ligando que se basan en el movimiento browniano estocástico para el ligando para su acercamiento al receptor, la señal de localización mitocondrial de algunas realizaciones es llevada a las mitocondrias debido a la carga.
A fin de entrar en las mitocondrias, una proteína debe interaccionar generalmente con la maquinaria de importación mitocondrial, que consiste en complejos Tim y Tom (translocasa de la membrana mitocondrial interna/externa). Con respecto a la señal de selección de dianas mitocondrial, la carga neta lleva a la proteína enlazada hacia los complejos y continúa llevando la proteína hacia las mitocondrias. Los complejos Tim y Tom permiten que las
proteínas atraviesen las membranas. En consecuencia, una realización de la presente invención suministra composiciones de la presente descripción hacia el espacio mitocondrial interno utilizando una señal de selección de dianas positivamente cargada y la maquinaria de importación mitocondrial. En otra realización, los polipéptidos enlazados a PTD que contienen una señal de localización mitocondrial no parecen utilizar el complejo TOM/TIM para entrar en la matriz mitocondrial; véase Del Gaizo et al. (2003) Mol Genet Metab. 80(1-2):170-80.
Dada la importancia de las mitocondrias en la enfermedad humana, en la proliferación celular, la muerte celular y envejecimiento, la presente descripción también engloba la manipulación del genoma mitocondrial para suministrar los medios mediante los cuales se pueden tratar enfermedades mitocondriales conocidas (LHON, MELAS, etc.) y enfermedades mitocondriales putativas (envejecimiento, enfermedad de Alzheimer, de Parkinson, diabetes, cardiopatía).
3. Selección de cloroplastos
En otra realización, las composiciones modificadas descritas aquí suministran específicamente polinucleótidos a cloroplastos incluyendo una señal o dominio de localización de cloroplastos. Para cloroplastos, se han deducido varias señales de selección de dianas aminoterminales, y están incluidas, en parte, en la Tabla 2. El cloroplasto es un orgánulo fotosintético en eucariotas, con una doble membrana circundante. El fluido dentro de la membrana doble se denomina el estroma. El cloroplasto tiene una región nucleoide para alojar su ADN desnudo circular. El estroma es también el sitio del ciclo de Calvin. El ciclo de Calvin es la serie de reacciones químicas catalizadas por enzimas que producen hidratos de carbonos y otros compuestos a partir de dióxido de carbono.
Dentro del estroma existen sacos membránicos pequeños denominados tilacoides. Los sacos están apilados en grupos. Cada grupo se denomina grano. Hay muchos granos en cada cloroplasto. Las membranas tilacoides son el sitio de las reacciones de luz fotosintéticas. Los tilacoides tienen proteínas intrínsecas y extrínsecas, algunas con grupos prostéticos especiales, que permiten que los electrones se muevan desde un complejo proteico a otro. Estas proteínas constituyen un sistema de transporte electrónico conocido algunas veces como el esquema Z.
El grupo prostético para dos proteínas membránicas críticas (P680 y P700) es una molécula de pigmento clorofílico. Estas proteínas que se unen a la clorofila dan a los tilacoides un intenso color verde. Los muchos tilacoides en un cloroplasto dan al cloroplasto un color verde. Los muchos cloroplastos en una célula mesofílica de hoja dan a esa célula un color verde. Las muchas células mesofílicas en una hoja dan a la hoja un color verde. La molécula clorofílica absorbe energía luminosa y se estimula a un electrón dentro de la nube electrónica en una estructura química resonante que rodea a un ion magnesio. Este electrón excitado es eliminado por las proteínas de transporte electrónico circundantes en la membrana. El movimiento de estos electrones, y los protones acompañantes, da como resultado en último lugar el atrapamiento de la energía en un enlace de fosfato en ATP. El tilacoide es así la localización para la absorción de luz y la síntesis de ATP. El estroma usa el ATP para almacenar la energía atrapada en enlaces carbono-carbono de hidratos de carbono. Algunos cloroplastos muestran granos de almidón en desarrollo. Estos representan polímeros complejos de hidratos de carbono para el almacenamiento a largo plazo.
Dadas las funciones bioenergéticas de los cloroplastos, la capacidad para introducir genes exógenos puede conducir a las plantas con una mayor viabilidad en entornos de otro modo hostiles, y a una eficiencia mayor de la fotosíntesis. Además, se cree que la expresión de genes exógenos en los cloroplastos es significativamente más eficiente en cloroplastos con respecto a la expresión de genes exógenos introducidos en el núcleo de la célula. De este modo, otras realizaciones se refieren a la transfección de cloroplastos para estrategias biosintéticas más eficaces para productos comerciales.
3. Complejos de polipéptido de unión a polinucleótido modificado:polinucleótido
Los polipéptidos de unión a polinucleótidos modificados que tienen un dominio de transducción de proteína, y opcionalmente una señal seleccionadora de dianas, se pueden combinar con un polinucleótido de interés para formar un complejo de polipéptido-polinucleótido. Por ejemplo, el polipéptido modificado se puede unir reversiblemente al polinucleótido de interés. La unión o interacción entre el polipéptido modificado y el polinucleótido de interés es suficientemente fuerte para proteger al polinucleótido de la degradación, pero reversible de manera que el polinucleótido mantiene su actividad biológica una vez ha sido suministrado a la célula u orgánulo. La actividad biológica del polinucleótido puede incluir expresar el polipéptido codificado por el polinucleótido o la actividad enzimática del polinucleótido si es una ribozima o una ADNzima.
También se describe un método para transfectar un orgánulo no nuclear combinando un polipéptido de unión a polinucleótido, por ejemplo TFAM, con un polinucleótido a suministrar y una cantidad de un lípido y/o poliamina para formar un complejo, y poner en contacto una célula, por ejemplo una célula de mamífero, con un complejo. La proteína de unión a polinucleótido incluye opcionalmente un PTD y opcionalmente una señal seleccionadora de dianas. El lípido y/o poliamina puede ser ramificado o sin ramificar, saturado o insaturado, y tiene típicamente una longitud de cadena de carbono de alrededor de 6 a alrededor de 50 carbonos, más típicamente alrededor de 10 a alrededor de 30 carbonos, incluso más típicamente alrededor de 15 a alrededor de 20 carbonos. También se puede suministrar una nucleasa al orgánulo no nuclear. La nucleasa se puede seleccionar de manera que escinde ácidos nucleicos endógenos, pero no escinde los ácidos nucleicos heterólogos que se introducen en el orgánulo no nuclear.
Como alternativa, un orgánulo no nuclear transfectado, por ejemplo una mitocondria, puede tener una nucleasa suministrada a él, en el que la nucleasa se selecciona de manera que escinde los ácidos nucleicos transfectados o los ácidos nucleicos heterólogos en el orgánulo no nuclear.
En una realización, el polinucleótido de interés está enlazado operablemente a un promotor u otros elementos reguladores conocidos en la técnica. De este modo, el polinucleótido puede ser un vector, tal como un vector de expresión. La manipulación de polinucleótidos para la expresión en un sistema procariota o eucariota se puede realizar mediante técnicas generalmente conocidas por los expertos en la expresión recombinante. Se cree que se puede emplear virtualmente cualquier sistema de expresión en la expresión de las secuencias nucleicas y de aminoácidos descritas.
Un vector de expresión comprende típicamente una de las composiciones descritas bajo el control de uno o más promotores. Para unir una secuencia codificante “bajo el control de” un promotor, se coloca el extremo 5’ del sitio de iniciación traduccional del marco de lectura generalmente entre alrededor de 1 y 50 nucleótidos “en dirección 3’” de (es decir, 3’ de) del promotor escogido. El promotor “en dirección 5’” estimula la transcripción del ADN insertado y promueve la expresión de la proteína recombinante codificada. Este es el significado de “expresión recombinante” en el contexto usado aquí.
Existen muchas técnicas estándar para construir vectores de expresión que contienen los ácidos nucleicos apropiados y las secuencias de control transcripcional/traduccional a fin de lograr la expresión proteica o peptídica en una variedad de sistemas de expresión de hospedantes. Los tipos celulares disponibles para la expresión incluyen, pero no se limitan a, bacterias, tales como E. coli y B. subtilis transformadas con vectores de expresión de ADN fágico, ADN plasmídico o ADN cosmídico recombinantes. Se apreciará que cualquiera de estos vectores se puede empaquetar y suministrar usando uno o más de los polipéptidos empaquetadores de polinucleótidos descritos.
Los vectores de expresión para uso en células de mamíferos incluyen normalmente un origen de replicación (según sea necesario), un promotor situado enfrente del gen a expresar, junto con cualesquiera sitios de unión a ribosoma necesarios, sitios de ayuste de ARN, sitio de poliadenilación, y secuencias terminadoras transcripcionales. El origen de la replicación se puede proporcionar mediante construcción del vector para incluir un origen exógeno, tal como se puede suministrar a partir de SV40 u otra fuente vírica (por ejemplo, polioma, adeno, VSV, BPV), o se puede proporcionar mediante el mecanismo de replicación cromosómico de la célula hospedante. Si el vector se integra en el cromosoma de la célula hospedante, este último es a menudo suficiente.
Los promotores pueden derivar del genoma de células de mamíferos (por ejemplo, promotor de metalotioneína) o de virus de mamíferos (por ejemplo, el promotor tardío de adenovirus; el promotor del virus de la vacuna 7.5K). Además, también es posible, y puede ser deseable, utilizar secuencias promotoras o de control asociadas normalmente con la secuencia génica deseada, con la condición de que tales secuencias de control sean compatibles con los sistemas de células hospedantes.
Se puede utilizar un número de sistemas de expresión a base de virus, por ejemplo los promotores usados normalmente derivados de polioma, adenovirus 2, citomegalovirus y virus 40 del simio (SV40). Los promotores temprano y tardío del virus SV40 son útiles debido a que ambos se obtienen fácilmente a partir del virus como un fragmento que también contiene el origen de la replicación vírica de SV40. También se pueden usar fragmentos de SV40 más pequeños o más grandes, con la condición de que se incluye la secuencia de aproximadamente 250 pb que se extiende desde el sitio HindIII hacia el sitio BgII situado en el origen de replicación vírico.
En los casos en los que se use un adenovirus como vector de expresión, las secuencias codificantes se pueden ligar a un complejo de control de la transcripción/traducción adenovírico, por ejemplo el promotor tardío y la secuencia líder tripartita. Este gen quimérico se puede insertar en el genoma adenovírico mediante recombinación in vitro o in vivo. La inserción en una región no esencial del genoma vírico (por ejemplo, la región E1 o E3) dará como resultado un virus recombinante que es viable y capaz de expresar proteínas en hospedantes infectados.
Las señales de iniciación específicas también pueden ser necesarias para la traducción eficiente de las composiciones descritas. Estas señales incluyen el codón de iniciación ATG y secuencias adyacentes. Adicionalmente, puede ser necesario proporcionar señales de control traduccionales exógenas, que incluyen el codón de iniciación ATG. El experto normal en la técnica sería capaz fácilmente de determinar esta necesidad y proporcionar las señales necesarias. Es bien conocido que el codón de iniciación debe estar en el marco (o en fase) con el marco de lectura de la secuencia codificante deseada para asegurar la traducción de todo el inserto. Estas señales de control traduccional exógenas y los codones de iniciación pueden ser de una variedad de orígenes, tanto naturales como sintéticos. La eficiencia de la expresión se puede potenciar mediante la inclusión de elementos potenciadores de la transcripción o terminadores de la transcripción apropiados.
En la expresión eucariota, también se deseará típicamente incorporar en la unidad transcripcional un sitio de poliadenilación apropiado si no había ninguno contenido en el segmento clonado original. Típicamente, el sitio de adición poly A se coloca alrededor de 30 a 2000 nucleótidos “en dirección 3’” del sitio de terminación de la proteína en una posición antes de la terminación de la transcripción.
Para la producción a largo plazo con rendimiento elevado de proteínas recombinantes, se prefiere la expresión estable. Por ejemplo, se pueden manipular estirpes celulares que expresan de forma estable constructos que codifican proteínas. En lugar de usar vectores de expresión que contienen orígenes víricos de replicación, se pueden transformar células hospedantes con vectores controlados con elementos de control de la expresión apropiados (por ejemplo, promotor, potenciador, secuencias, terminadores de la transcripción, sitios de poliadenilación, etc.), y un marcador seleccionable. Tras la introducción del ADN extraño, las células manipuladas se pueden dejar crecer durante 1-2 días en un medio enriquecido, y después se cambian a un medio selectivo. El marcador seleccionable en el plásmido recombinante confiere resistencia a la selección, y permite que las células integren de forma estable el plásmido en sus cromosomas y crezcan para formar foci, que a su vez se pueden clonar y expandir en estirpes celulares.
Una realización proporciona un polipéptido TFAM modificado que tiene al menos un PTD, y al menos una señal de localización mitocondrial. El TFAM modificado se puede asociar con un polinucleótido de interés. La asociación se puede lograr in vitro o in vivo. TFAM se puede mezclar en cantidades suficientes para envolver o unir al polinucleótido de interés. Típicamente, una molécula de TFAM envuelve alrededor de 15 pares de bases de un polinucleótido diana. Se puede añadir suficiente TFAM modificado a un polinucleótido de interés para revestir completamente el exterior del polinucleótido y/o para condensar el polinucleótido. El polinucleótido se empaqueta de manera que el PTD y la señal opcional seleccionadora de dianas se presentan sobre la superficie del polinucleótido empaquetado. Se apreciará que se puede empaquetar más de un polinucleótido en un único complejo usando más de un polipéptido de unión o de empaquetamiento de polinucleótido modificado.
El polinucleótido codifica generalmente un polipéptido funcional, un polinucleótido antisentido, o un ARN inhibidor, y se empaqueta con el polipéptido de unión a polinucleótido modificado. Al menos una célula se pone en contacto con el complejo resultante, ya sea in vitro o in vivo. El dominio de transducción de proteína facilita el atravesamiento de la membrana externa de las células, y suministra el polinucleótido al interior de la célula. Una vez en el citoplasma, una señal o dominio seleccionador de dianas opcional facilita la localización del polinucleótido de interés hacia una región de interés, por ejemplo hacia la mitocondria o el núcleo. Una vez que el polinucleótido de interés se suministra a su destino, se puede transcribir y finalmente traducir. Como alternativa, si el polinucleótido de interés es un polinucleótido antisentido o un polinucleótido enzimático, el polinucleótido de interés puede actuar en o cerca del sitio de suministro, por ejemplo en el citosol o en un orgánulo.
Se ha dado a conocer que los polinucleótidos inhibidores son inestables in vivo, en parte debido a que enzimas endógenas y respuestas inmunitarias degradan activamente polinucleótidos inhibidores, por ejemplo ARN inhibidor pequeño (siRNA). La tecnología de siRNA es conocida en la técnica, y se puede usar con la presente descripción cualquier siRNA, incluyendo siRNAs monocatenarios o multicatenarios. De este modo, una realización de la presente descripción proporciona composiciones y métodos para suministrar ARN inhibidor intacto, por ejemplo siRNA, a una célula, tejido, u órgano de interés. Un siRNA se puede combinar con un polipéptido de unión a polinucleótido que tenga un dominio de transducción de proteína, y opcionalmente una señal seleccionadora de dianas, para formar un complejo. El polipéptido de unión a polinucleótido modificado se puede asociar con el siRNA de manera que el siRNA es envuelto, cubierto, condensado o unido por el polipéptido modificado, protegiendo de ese modo al siRNA de la degradación enzimática. La asociación es reversible, de manera que, con el suministro del siRNA al destino deseado, el siRNA puede funcionar para inhibir la transcripción o traducción de su polinucleótido diana.
También se describe un método para transfectar un hospedante, una célula del hospedante, o un orgánulo celular del hospedante, por ejemplo el núcleo, mitocondrias, o cloroplastos, que incluye las etapas de poner en contacto una célula de hospedante con un complejo que incluye un polipéptido de unión a polinucleótido modificado que tiene al menos un PTD, y opcionalmente al menos una señal seleccionadora de dianas, en combinación con un polinucleótido de interés. El complejo de polinucleótido-polipéptido actúa como un vector no vírico. Las células de un hospedante se pueden transfectar y administrar a un segundo hospedante, o células de hospedante se pueden transfectar y administrar al hospedante. La transfección puede ocurrir in vivo o in vitro.
Las células adecuadas para la transfección incluyen células capaces de ser transfectadas, por ejemplo células eucariotas o procariotas. Las células pueden ser somáticas, quiescentes, embriónicas, mitóticas, células madre, células progenitoras, células de estirpe germinal, células pluripotentes, células totipotentes, células madre embriónicas, células heterólogas, no diferenciadas, parcialmente diferenciadas, endodérmicas, mesodérmicas, ectodérmicas, inmortalizadas, o cultivos primarios. Las señales seleccionadoras de orgánulos de la presente descripción incluyen polipéptidos que tienen una carga neta positiva, una NLS, y aquellas enumeradas en Tablas 1 y
2. Los PTD adecuados incluyen, pero no se limitan a, HIV TAT YGRKKRRQRRR (SEC. ID NO. 1) o RKKRRQRRR (SEC. ID NO. 2); 11 restos de arginina, o polipéptidos o polinucleótidos positivamente cargados que tienen 8-15 restos, preferiblemente 9-11 restos. La expresión orgánulo no nuclear pretende englobar todos los orgánulos distintos del núcleo. Se apreciará que las composiciones descritas incluyen una señal seleccionadora de dianas, por ejemplo una señal seleccionadora de orgánulos, que hace que el complejo se asocie con el orgánulo, típicamente a un orgánulo que tiene una carga neta negativa o una región que tiene una carga negativa. En una realización, la asociación de la señal seleccionadora de dianas con el orgánulo no se produce a través de una interacción receptor:ligando. La asociación del orgánulo y del complejo puede ser iónica, no covalente, covalente, reversible o irreversible. Las asociaciones complejo:orgánulo ejemplares incluyen, pero no se limitan a, proteína-proteína,
proteína-hidrato de carbono, proteína-ácido nucleico, ácido nucleico-ácido nucleico, proteína-lípido, lípido-hidrato de carbono, anticuerpo-antígeno, o avidina-biotina. La señal seleccionadora de orgánulos del complejo puede ser una proteína, péptido, anticuerpo, fragmento de anticuerpo, lípido, hidrato de carbono, biotina, avidina, estreptavidina, grupo químico, u otro ligando que provoca la asociación específica entre el orgánulo y el complejo, preferiblemente una asociación electromagnética entre restos cargados opuestamente.
La interacción específica entre el complejo introducido y su diana, por ejemplo un tipo específico de célula o un orgánulo, se puede lograr mediante al menos dos métodos. En un método ejemplar, un complejo no vírico recombinante puede incluir un polipéptido recombinante que expresa una señal seleccionadora de dianas que interacciona con el orgánulo seleccionado como diana. Preferiblemente, el complejo expresa un polipéptido externo que es específico para el orgánulo diana. En otro método, el complejo se modifica para incorporar una proteína exógena seleccionadora de dianas, a la que se une un orgánulo. Como alternativa, un complejo puede incluir un polipéptido recombinante modificado que interacciona específicamente con una célula, tejido, órgano, u orgánulo deseado, por ejemplo expresando una secuencia de aminoácidos que interacciona con la célula u orgánulo específico. Se apreciará por los expertos en la técnica que el complejo se puede modificar químicamente para que tenga una carga neta positiva o negativa, dependiendo del agente de modificación. Por ejemplo, el complejo se puede revestir con polilisina u otros agentes que contienen un grupo amino primario. Adicionalmente, los grupos amino se pueden enlazar al complejo, o el compuesto que contiene grupos amino se puede enlazar al complejo. El enlazamiento puede ser reversible o irreversible, covalente o no covalente. En la técnica se conocen otros grupos cargados para conferir una carga a un compuesto, y se pueden incorporar en el complejo.
Los ácidos nucleicos, que incluyen, pero no se limitan a, polinucleótidos, ácidos nucleicos antisentido, ácidos nucleicos peptídicos, ácidos nucleicos naturales o sintéticos, ácidos nucleicos con bases químicamente modificadas, ARN, ADN, híbridos de ARN-ADN, ácidos nucleicos enzimáticos tales como ribozimas y ADNzimas, genes nativos/endógenos y genes no nativos/exógenos, y sus fragmentos o combinaciones, se pueden introducir en una célula u orgánulo de una célula hospedante, en particular células u orgánulos que pueden transcribir y/o traducir ácidos nucleicos en proteínas, tales como el núcleo, las mitocondrias y cloroplastos. En una realización de la presente invención, todo o parte del genoma mitocondrial o cloroplástico se puede introducir en un orgánulo. Los ácidos nucleicos se pueden introducir en el orgánulo con el complejo cuando el complejo atraviesa la membrana del orgánulo vía dominios de transducción de proteína.
También se describe un método para transfectar orgánulos celulares, por ejemplo orgánulos eucariotas, poniendo en contacto la célula con un complejo que incluye un polipéptido de unión a polinucleótido en combinación con un polinucleótido, en el que el polipéptido de unión a polinucleótido incluye un PTD y opcionalmente una señal o dominio seleccionador de dianas. La señal seleccionadora de dianas puede ser un polipéptido, modificado o no modificado, presentado sobre la superficie del complejo, que permite que el complejo se asocie específicamente con la célula u orgánulo diana. Las señales seleccionadoras de dianas ejemplares incluyen señales de localización nuclear, señales seleccionadoras de dianas mitocondriales, incluyendo las señales seleccionadoras de dianas dadas en la TABLA 1, y otras señales que tienen una carga neta positiva. La puesta en contacto de una célula con el complejo es la manera que introduce el complejo o el polinucleótido en el citosol de dicha célula. El complejo puede asociarse además con su orgánulo diana específico o región intracelular de la célula, y el polinucleótido se puede introducir en el orgánulo. La introducción del polinucleótido en el orgánulo se puede lograr transduciendo el polinucleótido a través de las membranas del orgánulo vía un dominio de transducción de proteína expresado sobre la superficie del complejo.
La introducción de un polinucleótido en el citosol de una célula eucariota, en una forma funcional intacta, se puede lograr usando técnicas estándar conocidas por los expertos en la técnica, o a través de la modificación del polipéptido de unión a polinucleótido recombinante con dominios de transducción de proteína. Tales procedimientos de transfección incluyen, pero no se limitan a, microinyección, electroporación, permeabilización con cloruro de calcio, permeabilización con polietilenglicol, fusión protoplástica o permeabilización de lípidos catiónicos. Por ejemplo, un polipéptido de unión a polinucleótido se modifica para incluir un dominio de transducción de proteína que permite que el polipéptido unido a un polinucleótido a transducir atraviese una bicapa lipídica que incluye una membrana celular, membrana de orgánulo, o membrana plasmática. Los PTD adecuados incluyen, pero no se limitan a, PTD de 11 argininas o Tat-PTD (SEC. ID NOs. 3 ó 4) y poly-Arg - RRRRRRR (SEC. ID. NO.: 6); PTD-5 -RRQRRTSKLMKR (SEC. ID. NO.: 7); transportano GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL (SEC. ID. NO.: 8); y KALA
-
WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKCEA (SEC. ID. NO: 9).
Se describe un método para introducir secuencias de ácidos nucleicos exógenas en una mitocondria de una célula de mamífero. Cualquier técnica de transfección mitocondrial debería asegurar que un ácido nucleico atraviesa tres membranas (la membrana plasmática y las membranas mitocondriales externa e interna), dirige la copia elevada de moléculas de mtDNA, y utiliza un replicón mitocondrial circular mínimo. En la presente descripción, un polipéptido de unión a polinucleótido recombinante se usa como un vehículo de suministro para introducir secuencias de ácidos nucleicos en un orgánulo, por ejemplo la mitocondria. El polipéptido recombinante empaqueta los polinucleótidos para evitar que sean degradados, y para condensar los polinucleótidos para el suministro. La condensación de polinucleótidos incluye la estructura ordenada de polinucleótidos en condiciones concentradas.
Según otra realización, un polipéptido recombinante de unión a polinucleótido, que tiene un PTD y una señal seleccionadora de dianas mitocondrial se usa para la transfección mitocondrial. Este enfoque permite la manipulación directa de mtDNA y la introducción del genoma circular en un número elevado de copias. Este método se puede usar para manipular o sustituir mtDNA. Por ejemplo, todo el genoma mitocondrial humano (SEC ID NO. 218) se puede sustituir por secuencias introducidas. Por ejemplo, primero se pueden generar células Rho0 para eliminar mtDNA endógeno, seguido de la transfección mitocondrial, dando como resultado que se sustituye todo el genoma mitocondrial de las células. Como alternativa, las mitocondrias se pueden transfectar sin proceder primero con la generación de células Rho0. En este caso, el ácido nucleico introducido se incorporará (recombinará) con las secuencias de mtDNA endógeno existentes, dando como resultado la manipulación de las secuencias de mtDNA. Se puede usar cualquier método para restaurar la funcionalidad total de las mitocondrias dañadas.
También se describe un método para modificar el genoma de un orgánulo no nuclear, por ejemplo una mitocondria, que comprende transfectar el orgánulo no nuclear con un polinucleótido que codifica una enzima que escinde específicamente el genoma del orgánulo no nuclear, pero no escinde el polinucleótido. Una enzima ejemplar incluye, pero no se limita a, una nucleasa tal como BamH1. Se apreciará que se puede usar cualquier enzima que escinda selectivamente ácidos nucleicos endógenos al orgánulo no nuclear sin escindir ácidos nucleicos heterólogos. Ácidos nucleicos heterólogos se refiere a ácidos nucleicos introducidos desde otro organismo o a partir de una fuente distinta de la mitocondria u organismo hospedante de la mitocondria. El polinucleótido que codifica la enzima se puede suministrar sólo o en combinación con un segundo polinucleótido, usando los métodos descritos aquí. El segundo polinucleótido puede codificar un segundo polipéptido, por ejemplo, que funciona dentro y fuera del orgánulo no nuclear. El segundo polipéptido puede funcionar en el núcleo y puede ser un factor de transcripción, un potenciador o un supresor de la activación o transcripción génica, una subunidad de un factor de transcripción, un polipéptido de unión a ADN, o similar. El segundo polipéptido puede actuar específicamente o de forma no específica sobre uno o más genes específicos o secuencias de ácidos nucleicos. El segundo polipéptido expresado en el orgánulo no nuclear se puede suministrar fuera del orgánulo no nuclear. El segundo polipéptido puede comprender al menos un PTD y opcionalmente una señal seleccionadora de dianas, para facilitar la translocación del segundo polipéptido hacia una localización intracelular o extracelular deseada, por ejemplo el núcleo, citoplasma, membrana plasmática, etc. Se apreciará que el segundo polipéptido puede codificar un polipéptido segregado, un polipéptido intracelular, un polipéptido transmembránico, o un polipéptido que se presenta al menos parcialmente sobre la superficie exterior de una membrana celular. Los polipéptidos segregados incluyen, pero no se limitan a, factores de crecimiento, citocinas, quimiocinas, neurotransmisores, insulina, o sus combinaciones.
Como alternativa, el polinucleótido que codifica la enzima se puede empaquetar mediante un polipéptido de unión a polinucleótido y se puede combinar con un vector lipídico y/o poliamínico para el suministro al orgánulo no nuclear. Un vector lipídico y/o poliamínico ejemplar incluye, pero no se limita a, LIPOFECTAMINE™. El vector lipídico y/o poliamínico se puede modificar para presentar una señal seleccionadora de dianas en el exterior, para ayudar en el suministro del polinucleótido al orgánulo no nuclear.
En algunas realizaciones, el polinucleótido que codifica el polinucleótido enzimático también codifica al menos un segundo polipéptido, por ejemplo un polipéptido que compensa una mutación en el genoma del orgánulo no nuclear. El segundo polipéptido puede compensar una mutación, supresión, inversión, sustitución o transposición nula en el genoma del orgánulo no nuclear. Como alternativa, el segundo polipéptido codifica un polipéptido funcional que se puede suministrar a una localización fuera del orgánulo no nuclear por ejemplo el núcleo.
También se describe un método para modificar un genoma de un orgánulo no nuclear, que comprende transfectar el orgánulo no nuclear con un polinucleótido que codifica una enzima que escinde específicamente ácidos nucleicos heterólogos pero que no escinde el polinucleótido que codifica la enzima o los ácidos nucleicos endógenos del orgánulo no nuclear. Se describe también un método para modificar un genoma de un orgánulo no nuclear, que comprende poner en contacto una célula con un polipéptido enzimático que comprende un PTD y una señal seleccionadora de dianas operablemente enlazada al polipéptido enzimático. El polipéptido enzimático puede ser una nucleasa o enzima de restricción, específica para un sitio de restricción encontrado en el genoma del orgánulo no nuclear. Como alternativa, el polipéptido enzimático puede escindir ácidos nucleicos en un sitio encontrado en ácidos nucleicos heterólogos y no en ácidos nucleicos endógenos al orgánulo no nuclear. El polipéptido enzimático se puede suministrar solo o en combinación con un polinucleótido.
Las secuencias de localización de mitocondrias adecuadas son conocidas por los expertos en la técnica (véase la Tabla 1), e incluyen la señal de localización mitocondrial de la subunidad VIII de la citocromo oxidasa humana, la presencuencia de la subunidad IV de la citocromo c oxidasa de levadura, y el péptido líder aminoterminal de la ornitina-transcarbamilasa de rata. En una realización, las secuencias introducidas se expresan en la cabeza de la cápside vírica.
Las señales de localización de orgánulos son conocidas por los expertos en la técnica, y se pueden usar cualesquiera de esas señales para dirigir el complejo hacia el orgánulo diana. Las secuencias de localización adecuadas para uso en la presente descripción se describen en Emanuelson et al., Predicting Subcellular Localization of Proteins Based on Their N-terminal Amino Acid Sequence. Journal of Molecular Biology. 300(4):1005-16, 21 de julio de 2000, y en Cline y Henry, Import and Routing of Nucleusencoded Chloroplast Proteins. Annual Review of Cell & Developmental Biology. 12:1-26, 1996. Más particularmente, en la TABLA 1 se da
una lista de señales de localización de mitocondrias para dirigir proteínas o ácidos nucleicos enlazados hacia las mitocondrias. En la TABLA 2 se da una lista de señales de localización de cloroplastos para dirigir proteínas o ácidos nucleicos enlazados hacia los cloroplastos. En una realización, la señal de localización de mitocondrias o de cloroplastos está enlazada operablemente a una proteína de superficie de virus. Se apreciará que parte o todas las secuencias dadas en las Tablas 1 y 2 se pueden usar como señales seleccionadoras de orgánulos.
Tabla 1
Señales de Localización para el Envío a Mitocondrias. (verificado usando la Base de Datos del Mitochondrial Project MITOP -- http://mips.gsf.de/proj/medgen/mitop/)
Denominación MITOP (nº de acceso)
SEC ID NO Nombre del gen Nombre completo del gen
106092 (NP633590)
18 Etfa precursor de cadena alfa de flavoproteína de transferencia de electrones -ratón
106098 (Q9DCW4)
19 Etfb cadena beta de flavoproteína de transferencia de electrones - ratón
107450 (NP000099)
20 Dld precursor de dihidrolipoamida deshidrogenasa – humano
87979 (NP067274)
21 Ak3 nucleósido-trifosfato--adenilato cinasa 3 – ratón
88529 (NP080720)
22 Cs citrato sintasa, mitocondrial
891996 (AA031763)
23 Cps1 carbamoil-fosfato sintetasa 1
97045 (NP032641)
24 Mod2 complejo de enzima málica, mitocondrial – ratón
97499 (AAH49802)
25 Pcca precursor de cadena alfa de propionil-CoA carboxilasa – ratón
A27883 (NP000273)
26 PCCA precursor de cadena alfa de propionil-CoA carboxilasa
A28053 NP031647)
27 Cbr2 carbonil reductasa (NADPH) -ratón
A29881 (XP331748)
28 mpp-2 precursor de subunidad beta de peptidasa del procesamiento mitocondrial (betampp) (proteína I del núcleo del complejo de ubiquinol-citocromo c reductasa)
A30605 (NP000008)
29 ACADS precursor de acil-CoA deshidrogenasa, específico de cadena corta
A31998 (WP000117)
30 ETFA precursor de cadena alfa de flavoproteína de transferencia de electrones
A32422
31 DBT precursor de dihidrolipoamida S-(2metilpropanoil)transferasa
A32800 (NP002147)
32 HSPD1 precursor de proteína 60 del choque térmico
A36442 (XP326125)
33 mpp-1 precursor de cadena alfa de peptidasa del procesamiento mitocondrial
A37033 (NP002216)
34 IVD precursor de isovaleril-CoA deshidrogenasa
A37157 (NP898871)
35 BCKD precursor de cadena beta de 3-metil-2oxobutanoato deshidrogenasa (lipoamida) E1
A38234
36 OGDH precursor de oxoglutarato deshidrogenasa (lipoamida)
A39503 (NP002387)
37 ME2 precursor de malato deshidrogenasa (NAD+), mitocondrial
A40487 (NP004101)
38 FDXR ferredoxina--NADP+ reductasa, forma larga, precursor
A40559(NP001599)
39 ACADL acil-CoA deshidrogenasa de cadena larga (LCAD)
A40872
40 ALDH5 precursor de aldehído deshidrogenasa (NAD+) 5, mitocondrial
A41581 (NP005720)
41 CYP3 precursor de peptidilprolil isomerasa 3
A42224 (P22572)
42 arg-2 carbamoil-fosfato sintasa, específica de arginina, precursor de cadena pequeña (carbamoil-fosfato sintetasa específica de arginina, cadena de glutamina) (cps-a)
A42845
43 BDH precursor de D-beta-hidroxibutirato deshidrogenasa (3-hidroxibutirato deshidrogenasa) (fragmento)
A45470 (AAP88794)
44 HMGC hidroximetilglutaril-CoA liasa
A47255 (AAH55030)
45 Pcx piruvato carboxilasa
A53020 (AAH53661)
46 PCCB precursor de cadena beta de propionil-CoA carboxilasa
A53719(NP036216)
47 GLUDP precursor de glutamato deshidrogenasa (NAD(P)+) 2
A55075(NP032329)
48 HspE1 chaperonina-10
A55680(NP001600)
49 ACADS precursor de acil-CoA deshidrogenasa de cadena corta/ramificada
A55723(P42126)
50 DCI precursor de dodecenoil-CoA deltaisomerasa, mitocondrial
A55724(NP031408)
51 Acadm Acil-CoA deshidrogenasa, precursor específico de cadena media (MCAD)
AA227572 (NM201263)
52 WARS2 triptofanil-tRNA sintetasa 2 (mitocondrial) humano
AB029948 (NP060297)
53 SerRS seril-tRNA sintetasa mitocondrial (cDNA FLJ20450 FIS, CLONE KAT05607) -humano
ACDL_MOUSE (AAH27412)
54 Acadl Acil-CoA deshidrogenasa, precursor específico de cadena larga (LCAD)
AF047042 (AAC25560)
55 CS citrato sintasa, mitocondrial
AF097441 (NP006558)
56 FARS1 mRNA de fenilalanina-tRNA sintetasa (FARS1), gen nuclear que codifica proteína mitocondrial - humano
ATPO_HUMAN (NP001688)
57 ATP5O precursor de proteína que confiere sensibilidad a oligomicina ATP sintasa, mitocondrial
AXHU (AAP35327)
58 FDX1 precursor adrenodoxina
CCHU (NP061820)
59 HCS citocromo c
CCNC (CAA29050)
60 cyc-1 Citocromo c
CE06620(NP056155)
61 - Probable leucil-tRNA sintetasa, mitocondrial
CE09597 (AAG31658)
62 - Piruvato deshidrogenasa (E2) dihidrolipoamida acetiltransferasa
CH10_MOUSE (NP032329)
63 Hspe1 proteína de choque térmico de 10 KD, mitocondrial (hsp10) (chaperonina de 10K) ratón
CH60_CAEEL (NP497429)
64 hsp60 precursor de homólogo de chaperonina hsp60 (proteína de choque térmico 60) (hsp-60)
DEHUE2 (NP000681)
65 ALDH2 precursor de aldehído deshidrogenasa (NAD+) 2, mitocondrial
DEHUE (NP005262)
66 GLUD1 precursor de glutamato deshidrogenasa (NAD(P)+)
DEHULP (NP000099)
67 DLD precursor de dihidrolipoamida deshidrogenasa
DEHUPA (NP000275)
68 PDHA1 precursor de cadena alfa de piruvato deshidrogenasa (lipoamida)
DEHUPB (AAH00439)
69 PDHB precursor de cadena beta de piruvato deshidrogenasa (lipoamida)
DEHUPT (NP005381)
70 PDHA2 precursor de cadena alfa de piruvato deshidrogenasa (lipoamida), específico de los testículos (E1)
DEHUXA (NP000700)
71 BCKDH precursor de cadena alfa de 3-metil-2oxobutanoato deshidrogenasa (lipoamida)
DEMSMM (P08249)
72 Mor1 precursor de malato deshidrogenasa, mitocondrial
DSHUN
73 SOD2 precursor de superóxido dismutasa (Mn)
ECHM_HUMAN (NP004083)
74 ECHS1 enoil-CoA hidratasa, mitocondrial (enoil-CoA hidratasa de cadena corta (SCEH))
GABT_HUMAN (JC4022)
75 ABAT 4-aminobutirato aminotransferasa, precursor mitocondrial (gamma-amino-Nbutirato-transaminasa) (GABA transaminasa)
GCDH_HUMAN (AAP35352)
76 GCDH precursor de glutaril-CoA deshidrogenasa (GCD) -humano
GCDH_MOUSE (NP032123)
77 Gcdh precursor de glutaril-CoA deshidrogenasa (GCD) -ratón
HCD1_CAEEL (NP499075)
78 - Probable 3-hidroxiacil-CoA deshidrogenasa F54C8.1
HCD2_CAEEL (NP509584)
79 - Probable 3-hidroxiacil-CoA deshidrogenasa B0272.3
HHMS60 (NP034607)
80 Hsp60 precursor de proteína 60 de choque térmico
HMGL_MOUSE (AAB27965)
81 Hmgcl precursor de hidroximetilglutaril-CoA liasa (HG-CoA liasa) (HL) (3-hidroxi-3metilglutarato-CoA liasa)
148884 (AAC52130)
82 - Componente E1 de 2-oxoglutarato deshidrogenasa (fragmento)
I48966 (AAH05476)
83 Aldh2 precursor de aldehído deshidrogenasa (NAD+) 2, mitocondrial
I49605
84 Acads Acil-CoA deshidrogenasa, precursor específico de cadena corta (SCAD) (butiril-CoA deshidrogenasa)
I52240 (NP000007)
85 ACAD precursor de acil-CoA deshidrogenasa, específico de cadena media
I55465 (AAH39158)
86 PDK1 isoforma 1 de piruvato deshidrogenasa cinasa -humano
157023 (DSHUN)
87 Sod2 precursor de superóxido dismutasa (Mn)
170159 (AAC42010)
88 PDK2 isoforma 2 de piruvato deshidrogenasa cinasa -humano
170160(NP005382)
89 PDK3 isoforma 3 de piruvato deshidrogenasa cinasa -humano
JC2108 (AAA56664)
90 HADH precursor de cadena alfa del complejo multienzimático de oxidación beta de ácidos grasos de cadena larga, mitocondrial
JC2109 (NP000174)
91 HADH precursor de cadena beta del complejo multienzimático de oxidación beta de ácidos grasos de cadena larga, mitocondrial
JC2460 (AAH11617)
92 PC precursor de piruvato carboxilasa
JC4879 (NP005318)
93 SCHAD 3-hidroxiacil-CoA deshidrogenasa, específico de cadena corta, precursor
KIHUA3 (AAH16180)
94 AK3 nucleósido-trifosfato-adenilato cinasa 3
M2GD_HUMAN (AAF21941)
95 DMGD dimetilglicina deshidrogenasa, precursor mitocondrial (ME2GLYDH) -humano
MDHM_HUMAN (AAH01917)
96 MDH2 precursor de malato deshidrogenasa mitocondrial (fragmento)
O75439
97 PMPC precursor de la subunidad beta de peptidasa del procesamiento mitocondrial (beta-MPP) (P-52)
ODO1_MOUSE (AAC52130)
98 Ogdh componente E1 de 2-oxoglutarato deshidrogenasa (alfa-cetoglutarato deshidrogenasa) (fragmento)
ODPA_CAEEL (NP495693)
99 Probable componente de piruvato deshidrogenasa E1, precursor de la subunidad alfa (PDHE1-a)
OWHU (NP000522)
100 OTC precursor de ornitina carbamoiltransferasa
OWMS (CAA30121)
101 Otc precursor de ornitina carbamoiltransferasa
P21549 (NP000021)
102 AGXT alanina-glioxilato aminotransferasa
PUT2_HUMAN (NP733844)
103 ALDH4 precursor de delta-1-pirrolin-5-carboxilato deshidrogenasa (P5C deshidrogenasa)
Q0140(NP009320)
104 VAR1 VAR1 -proteína ribosomal mitocondrial
Q10713(NP055975)
105 KIAA0123 precursor de la subunidad alfa de peptidasa del procesamiento mitocondrial (alfa-MPP) (P-55) (HA1523)
Q16654(NP002603)
106 PDK4 isoforma 4 de piruvato deshidrogenasa cinasa - humano
ROHU (CAA42060)
107 TST tiosulfato sulfurtransferasa
S01174 (NP034455)
108 Got2 precursor de aspartato transaminasa, mitocondrial
S08680 (NP032676)
109 Mut precursor de la cadena alfa de metilmalonil-CoA mutasa
S13025 (CAA39695)
110 nuo-40 cadena de NADH deshidrogenasa (ubiquinona) 40K
S13048 (PI9974)
111 cyt citocromo c
S16239 (AAH57347)
112 Glud precursor de glutamato deshidrogenasa (NAD(P)+)
S23506 (NP032836)
113 Pdha1 piruvato deshidrogenasa (lipoamida)
S25665 (CAA32052)
114 DLAT h dihidrolipoamida S-acetiltransferasa del corazón - humano (fragmento)
S26984 (P33540)
115 probable ARN polimerasa dirigida por ADN -maranhar de plásmido de mitocondria (SGC3)
S32482(NP001976)
116 ETFB cadena beta de flavoproteína de transferencia de electrones
S38770(P42125)
117 Dci 3,2-trans-enoil-CoA isomerasa, precursor mitocondrial (dodecenoil-CoA deltaisomerasa)
S39807
118 Bckdhb cadena beta de 3-metil-2-oxobutanoato deshidrogenasa (lipoamida)
S40622 (NP000246)
119 MUT precursor de metilmalonil-CoA mutasa (MCM)
S41006 (CAE65137)
120 - proteína hipotética t05g5.6
S41563
121 cit-1 citrato (si)-sintasa, mitocondrial
S42366
122 PRSS15 Homología de proteinasa Lon
S42370 (NP499264)
123 - homólogo de citrato sintasa
S47532 (NP002148)
124 HSPE1 proteína 10 de choque térmico
S53351 (NP006671)
125 ME2.1 precursor de malato deshidrogenasa (descarboxilante de oxaloacetato) (NADP+), mitocondrial
S60028 (NP032023)
126 Fdxr precursor de ferredoxina--NADP+ reductasa
S65760 (NP034152)
127 Dbt precursor de dihidrolipoamida transacilasa
S71881(NP031559)
128 Bckdha precursor alfa de la cadena E1 de alfacetoácido deshidrogenasa de cadena ramificada
SCOT_HUMAN (NP000427)
129 OXCT precursor de succinil-CoA:3-ketoácidocoenzima A transferasa (succinil CoA:3oxoácido CoA-transferasa) (OXCT)
SODM_CAEEL (NP492290)
130 sod-2 precursor de superóxido dismutasa (Mn)
SODN_CAEEL (NP510764)
131 sod-3 precursor de superóxido dismutasa (Mn)
SYHUAE
132 ALAS2 5-aminolevulinato sintasa 2
SYHUAL (NP000679)
133 ALAS1 precursor de 5-aminolevulinato sintasa 1
SILM_HUMAN (NP056155)
134 KIAA0028 Probable leucil-tRNA sintetasa, precursor mitocondrial (Leucina-tRNA ligasa) (Leurs) (KIAA0028)
SYMSAL
135 Alas2 precursor mitocondrial de 5aminolevulinato sintasa (específico de eritroides) (ALAS-E)
SYNCLM (XP323115)
136 leu-5 precursor de leucina-tRNA ligasa, mitocondrial
SYNCYT
137 cyt-18 precursor de tirosina-tRNA ligasa, mitocondrial
SYWM_CAEEL (T15761)
138 Probable triptofanil-tRNA sintetasa, mitocondrial (triptófano--tRNA ligasa) (TRPRS)
THTR_MOUSE (NP033463)
139 Tst tiosulfato sulfurtransferasa
U80034 (NP005923)
140 MIPEP peptidasa intermedia mitocondrial
U82328 (NP003468)
141 PDX1 precursor de subunidad de proteína X del complejo de piruvato deshidrogenasa
XNHUDM (NP002071)
142 GOT2 precursor de aspartato transaminasa, mitocondrial
XNHUO (NP000265)
143 OAT precursor de ornitina--oxo-ácido transaminasa
XNHUSP (NP000021)
144 AGXT serina-piruvato aminotransferasa (SPT) (alanina--glioxilato aminotransferasa) (AGT)
XNMSO (AAH08119)
145 Oat precursor de ornitina--oxo-ácido transaminasa
XXHU
146 DLAT precursor de dihidrolipoamida Sacetiltransferasa (fragmento)
YAL044c (P39726)
147 GCV3 GCV3 -glicina decarboxilasa, subunidad H
YBL022c (NP009531)
148 PIM1 PIM1 – protease dependiente de ATP, mitocondrial
YBL038w (NP009515)
149 MRPL16 MRPL16 -proteína ribosomal de la subunidad grande, mitocondrias
YBL080c (NP009473)
150 PET112 PET112 - requerida para mantener ADN mitocondrial de rho+
YBL090w (NP009463)
151 MRP21 MRP21 -proteína ribosomal mitocondrial
YBR120c (NP009678)
152 CBP6 CBP6 -proteína del procesamiento de apo-citocromo B pre-mRNA
YBR122c (CAA55624)
153 MRPL36 MRPL36 -precursor de proteína ribosomal YmL36, mitocondrial
YBR146w (NP009704)
154 MRPS9 MRPS9 -precursor de proteína S9 ribosomal, mitocondrial
YBR221c (NP009780)
155 PDB1 PDB1 precursor de cadena beta de piruvato deshidrogenasa (lipoamida)
YBR227c (NP009786)
156 MCX1 MCX1 -homólogo ClpX en mitocondrias
YBR251w (NP009810)
157 MRPS5 MRPS5 -proteína ribosomal S5, mitocondrial
YBR268w (NP009827)
158 MRPL37 MRPL37 proteína ribosomal YmL37, mitocondrial
YBR282w (NP009841)
159 MRPL27 MRPL27 -precursor de proteína ribosomal YmL27, mitocondrial
YCR003w (NP009929)
160 MRPL32 MRPL32 proteína ribosomal YmL32, mitocondrial
YCR024c (NP009953)
161 - asn-tRNA sintetasa, mitocondrial
YCR028c-a (NP009958)
162 RIM1 RIM1 proteína de unión a ssDNA, mitocondrial
YCR046c (NP009975)
163 IMG1 IMG1 -proteína ribosomal, mitocondrial
YDL202w (NP010079)
164 MRPL11 MRPL11 -proteína ribosomal de la subunidad grande, mitocondrial
YDR148c (NP010432)
165 KGD2 KGD2 – componente E2 del complejo de 2-oxoglutarato deshidrogenasa
YDR194c (NP010480)
166 MSS116 MSS116 -ARN helicasa de la familia de la caja DEAD, mitocondrial
YDR462w (NP010750)
167 MRPL28 MRPL28 -proteína ribosomal de la subunidad grande (YmL28), mitocondrial
YFL018c(NP116635)
168 LPD1 LPD1 precursor de dihidrolipoamida deshidrogenasa
YGR244c (NP011760)
169 LSC2 subunidad beta de succinato-CoA ligasa
YHR008c (NP011872)
170 SOD2 SOD2 -precursor de superóxido dismutasa (Mn), mitocondrial
YIL070c(NP012194)
171 MAM33 MAM33 proteína de la matriz ácida mitocondrial
YJL096w (CAA89390)
172 MRPL49 MRPL49 proteína ribosomal YmL49, mitocondrial
YJR113c (NP012647)
173 RSM7 RSM7 – similitud con la proteína ribosomal S7 bacteriana, cloroplástica y mitocondrial
YKL040c(NP012884)
174 NFU1 NFU1 -homeostasia del hierro
ILL027w (NP013073)
175 ISA1 ISA1 proteína mitocondrial requerida
para el metabolismo normal del hierro
ILR059c (NP013160)
176 REX2 REX2 - 3’-5’ exonucleasa putative
YML110c (NP013597)
177 COQ5 COQ5 – biosíntesis de ubiquinona, metiltransferasa
YMR062c (NP013778)
178 ECM40 ECM40 - acetilornitina acetiltransferasa
YMR072w (NP013788)
179 ABF2 ABF2 -proteína del grupo de movilidad elevada
YOL095c (NP014546)
180 HMI1 HMI1 -ADN helicasa mitocondrial
YOR040w (NP014683)
181 GLO4 GLO4 - gioxalasa II (hidroxiacilglutationa hidrolasa)
YOR142w (NP014785)
182 LSC1 LSC1 – subunidad alfa de succinato-CoA ligasa
YPL118w (NP015207)
183 MRP51 MRP51 – fuerte similitud con proteína hipotética de S.kluyveri
YPL135w (NP015190)
184 ISU1 ISU1 -proteína con similitud con proteínas de fijación de nitrógeno al racimo de hierro-azufre
YPL252c(NP015071)
185 YAH1 YAH1 similitud con adrenodoxina y ferrodoxina
YPL262w (NP015061)
186 FUM1 FUM1 -fumarato hidratasa
YPR047w (CAA89167)
187 MSF1 MSF1 -cadena alfa de fenilalanina--tRNA ligasa, mitocondrial
YPR067w (NP015392)
188 ISA2 ISA2 proteína mitocondrial requerida para el metabolismo del hierro
Tabla 2 5
Señales de Localización para el Envío aCloroplastos:
Denominación (nº de acceso)
SEC ID NO Descripción
CA782533
189 dominio de péptido de tránsito de la proteína ribosomal S9 del apicoblasto
P27456 (CAA62482)
190 péptido señal de la glutationa reductasa (GR) del guisante
BAB91333
191 Término NH2 de Cr-RSH que codifica una guanosina 3’,5’bispirofosfato (ppGpp) sintasa-degradasa putativa
CAB42546
192 proteínas 14-3-3
AAC64139 AAC64109 AAD01509
193 194 195 Partícula de reconocimiento de la señal de cloroplasto que incluye las subunidades cpSRP54, cpSRP43 o un fragmento de las mismas
PWSPG, FESP1, P00221,
196 197 198 péptidos de tránsito cloroplásticos
P05435, BAA37170, BAA37171, AAA81472
199 200 201 202
X52428 (CAA36675)
203 AtOEP7, en particular el dominio transmembránico (TMD) y su región de siete aminoácidos vecinos C-terminal (véase Lee YJ, Plant Cell 2001 Oct; 13(10):2175-90)
CA757092, CA755666
204 205 péptido de tránsito cloroplástico N-terminal THI1, en particular 4 a 27 restos
La identificación de las secuencias específicas necesarias para la translocalización de una proteína enlazada en un cloroplasto o mitocondria se puede determinar usando el software predictivo conocido por los expertos en la técnica, incluyendo las herramientas dadas en http://www.mips.biochem.mpg.de/cgi-bin/proj/medgen/mitofilter.
4. Transfección de plantas
Otra realización proporciona composiciones para la transfección de plantas, por ejemplo el suministro de un polinucleótido a un cloroplasto. Las técnicas para la transfección de plantas son conocidas en la técnica. Por ejemplo, Agrobacterium tumefaciens y Agrobacterium rhizogenes tienen ambos la capacidad para transferir porciones de su ADN en los genomas de plantas, y se pueden usar para transfectar células vegetales. El mecanismo mediante el cual transfieren ADN es el mismo; sin embargo, las diferencias en los fenotipos resultantes se atribuyen a la presencia de un plásmido Ti en Agrobacterium tumefaciens y el plásmido Ri en Agrobacterium rhizogenes. El ADN del plásmido Ti induce a que crezcan masas tumorosas en las plantas hospedantes, mientras que el ADN del plásmido Ri conduce a la proliferación abundante de raíces. Agrobacterium tumefaciens es capaz de infectar casi cualquier tejido vegetal, mientras que Agrobacterium rhizogenes sólo puede infectar a las raíces.
El plásmido Ti de Agrobacterium es una molécula de ADN bicatenario circular grande (T-DNA) de aproximadamente 200 kb, que existe como una unidad de replicación autónoma. Los plásmidos se mantienen en la bacteria, y sólo se puede transferir una región específica (región T) de aproximadamente 20 kb desde la bacteria al hospedante. Para lograr esta transferencia, el plásmido Ti contiene una serie de genes que codifican su propia replicación, escisión desde el plásmido, transferencia a la célula hospedante, incorporación en el genoma hospedante y la inducción de la formación de tumores.
Agrobacterium puede detectar y migrar hacia células vegetales lesionadas mediante la detección de señales químicas que escapan desde la planta herida. Este proceso de detección se denomina como quimiotaxia. Agrobacterium puede reconocer compuestos vegetales tales como acetosirinogona, ácido sinapínico, alcohol coniferílico, ácido cafeico y ácido metilsiríngico, que induce la virulencia bacteriana. Para comenzar el proceso de infección, Agrobacterium se debe unir ella misma a la célula hospedante. Esta unión se logra mediante un grupo de genes situados en el cromosoma bacteriano. La bacteria se puede anclar en el sitio de la lesión, mediante la producción de fibrillas de celulosa. Las fibrillas se unen a la superficie celular del hospedante vegetal y facilitan el agrupamiento de otras bacterias sobre la superficie celular. Se cree que este agrupamiento puede ayudar a la transferencia exitosa de T-DNA. Una vez unida al hospedante, la bacteria es libre para comenzar el procesamiento y la transferencia de la región T. Una realización de la presente descripción describe transfectar una célula vegetal con Agrobacterium, en el que Agrobacterium se ha modificado para unirse a un orgánulo vegetal, por ejemplo un cloroplasto. Agrobacterium se puede modificar además para que codifique un ácido nucleico de interés para la expresión en el orgánulo. Al unirse al orgánulo, Agrobacterium puede suministrar el ácido nucleico diana al cloroplasto.
Para transferir la región T del plásmido Ti al orgánulo de la célula hospedante, la región T se debe procesar de manera que se corte desde el plásmido y se dirija hacia el orgánulo. La región T se corta desde el plásmido Ti y se dirige a la célula hospedante u orgánulo. Una vez empaquetado apropiadamente, la transferencia del complejo T está mediada por varias proteínas, y se piensa que es similar a la conjugación bacteriana. Una vez dentro de la célula vegetal u orgánulo, el complejo T se pasa a través de la membrana.
5. Células y estirpes celulares ejemplares
Como se describe, el complejo de transfección comprende un polipéptido recombinante que tiene un dominio de transducción de proteína y una señal de localización de orgánulos en combinación con un polinucleótido. El complejo se puede introducir en orgánulos de células a partir de una estirpe celular. La estirpe celular puede ser una estirpe celular transformada que se puede mantener indefinidamente en cultivo celular, o la estirpe celular puede ser
un cultivo celular primario. Las estirpes celulares ejemplares son aquellas disponibles de la American Type Culture Collection, incluyendo estirpes celulares vegetales. El ácido nucleico se puede replicar y transcribir en el núcleo de una célula de la estirpe celular transfectada. La señal seleccionadora de dianas se puede escindir enzimáticamente si es necesario de manera que el complejo esté libre para permanecer en el orgánulo diana.
Se puede transfectar cualquier célula eucariota para producir orgánulos que expresan un ácido nucleico específico, por ejemplo un gen metabólico, incluyendo células primarias así como estirpes celulares establecidas. Los tipos de células adecuados incluyen, pero no se limitan a, células no diferenciadas o parcialmente diferenciadas, incluyendo células madre, células totipotentes, células pluripotentes, células madre embriónicas, células de masas internas, células madres adultas, células de la médula ósea, células procedentes de sangre del cordón umbilical, y células derivadas de ectodermo, mesodermo, o endodermo. Las células diferenciadas adecuadas incluyen células somáticas, células neuronales, células del músculo esquelético, del músculo liso, células pancreáticas, células hepáticas, y células cardíacas. Las células vegetales adecuadas se pueden seleccionar de monocotilos y dicotilos, e incluyen maíz, haba de soja, legumbres, forrajes, y granos tales como arroz y trigo.
Si el orgánulo a seleccionar como diana es un cloroplasto, entonces la célula hospedante se puede seleccionar de células fotosintéticas eucariotas conocidas. Si el orgánulo a transfectar es la mitocondria, entonces se puede usar cualquier célula eucariota, incluyendo células de mamíferos, por ejemplo células humanas. Las células se transfectan ya sea transitoria o establemente para expresar el ácido nucleico exógeno. En una realización, un constructo de ADN que codifica un gen informador se integra en el genoma mitocondrial de una célula para producir una estirpe celular transgénica estable que comprende orgánulos que expresan el gen informador deseado.
En otra realización, siRNA o polinucleótidos antisentido (incluyendo siRNA o polinucleótidos antisentido dirigidos a proteínas relacionadas con mtDNA) se pueden transfectar en un orgánulo usando las composiciones descritas aquí.
6. Herramientas de investigación
La presente descripción se puede usar como una herramienta para investigar consecuencias celulares de la expresión génica, por ejemplo expresión de mtDNA, el mecanismo de heteroplasmia, replicación de mtDNA y herencia, así como efectos umbrales. Usando este enfoque, se pueden generar ratones mutantes, que permiten a los investigadores estudiar mutaciones en ADN nuclear y en mtDNA no encontradas en la naturaleza. Más particularmente, los métodos y composiciones descritos aquí se pueden usar para generar células que contienen mitocondrias que tienen genotipos idénticos o grados variables de heteroplasmia. Para preparar células homoplásicas, primero se preparan células Rho0 (desprovistas de mtDNA) usando interferencia de ARN (RNAi). Por ejemplo, se pueden generar células Rho0 usando RNAi dirigido a la ADN polimerasa mitocondrial humana. Las estirpes celulares Rho0 ejemplares se generan con RNAi dirigido contra proteínas mitocondriales implicadas en el mantenimiento de mtDNA. Estas células Rho0 se mantienen y se propagan en medio de soporte que contiene piruvato, y después se transfieren con un genoma mitocondrial funcional. Tras la selección metabólica, eliminando piruvato del medio de soporte, sólo sobrevivirán aquellas células que contienen mitocondrias transfectadas de forma exitosa, generando así una población de células que tienen todas genomas mitocondriales idénticos.
Entonces se pueden generar de manera controlada estirpes celulares que tienen grados variables de heteroplasmia, fusionando dos o más estirpes celulares de homoplasmia para generar cíbridos. Los cíbridos se pueden generar usando cualquier técnica conocida para introducir orgánulos en una célula receptora, incluyendo, pero sin limitarse a, fusión de membrana celular mediada por polietilenglicol (PEG), permeabilización de la membrana celular, fusión con el citoplasto de la célula, fusión de la membrana mediada por virus, fusión mediada por liposomas, microinyección, u otros métodos conocidos en la técnica.
7. Animales no humanos transgénicos
Las técnicas descritas en la presente descripción también se pueden usar para generar animales no humanos transgénicos. En particular, la microinyección de cigotos, la transferencia nuclear, la electrofusión de blastómeros y la inyección de blastocitos de cíbridos de células madre embriónicas (ES) han proporcionado cada una estrategias factibles para crear ratones hetero- y homoplásmicos que contienen mtDNA a partir de estirpes celulares transfectadas (es decir, células que contienen mitocondrias transfectadas). Una célula madre embriónica (ES) se puede transfectar e inyectar en el blastocito de un embrión humano como medio para generar ratones quiméricos. De otro modo, primero se preparan cíbridos de células madre embriónicas (ES) (procedentes de células transfectadas y células ES rhos, o procedentes de dos células transfectadas de forma separada), seguido de la inyección de blastocitos en embriones. El uso de células que poseen mtDNA específico de interés permite la creación de ratones transmitocondriales que son heteroplásmicos o incluso homoplásmicos para el ADN transfectado. En teoría, esta técnica ofrece la posibilidad de transferir cualquier mtDNA mutante que se pueda obtener a partir de células transfectadas cultivadas a un modelo de organismo completo. Por ejemplo, estos métodos y composiciones descritos se podrían usar para crear modelos de ratón de enfermedad de mtDNA humana.
Usando las composiciones y métodos descritos para la transfección de mtDNA, serán posibles investigaciones en cuestión tal como el efecto de variar proporciones de los polimorfismos de “supresión común” de 5000 pb, que se acumulan con el envejecimiento, encontrados en diabetes y enfermedades neurodegenerativas, y la dinámica de la
complementación del mtDNA. También hay usos terapéuticos potenciales de este enfoque. La introducción dirigida a dianas del genoma mitocondrial normal ofrece tratamiento tanto para enfermedades a base de mtDNA clásicas como enfermedades de envejecimiento tales como afecciones cerebrales neurodegenerativas y diabetes de comienzo en el adulto, que se han asociado con la disfunción mitocondrial basada en mtDNA.
También se describen organismos no humanos transcriptados y métodos para obtenerlos y usarlos. Los organismos no humanos mono- o multicelulares, preferiblemente mamíferos no humanos, más preferiblemente ratones, se pueden transfectar con las composiciones descritas aquí administrando las composiciones de la presente descripción al organismo no humano. Por ejemplo, el polinucleótido sigue siendo episómico y no se integra de forma estable en el genoma del organismo hospedante. El polinucleótido puede evitar la expresión de un gen de interés. De este modo, la expresión del polinucleótido en el hospedante se puede controlar mediante la cantidad de polinucleótido administrada al hospedante.
Los organismos no humanos transfectados descritos tienen varias ventajas con respecto a los organismos transgénicos tradicionales. Por ejemplo, el organismo transfectado descrito aquí se puede producir en menos tiempo que los organismos transgénicos tradicionales sin reproducción sexual. Además, la expresión del polinucleótido de interés en el hospedante se puede regular directamente mediante la cantidad de polinucleótido de interés administrada al hospedante. La expresión de un polinucleótido de interés controlada por la dosis se puede correlacionar con fenotipos y cambios observados en el animal transfectado. Adicionalmente, se pueden incluir en el polinucleótido de interés elementos de control de la expresión y/o de la replicación inducibles para proporcionar expresión y/o replicación inducibles y dependientes de la dosis. Los elementos de control de la expresión y/o de la replicación inducibles adecuados son conocidos en la técnica.
8. Kits
La presente descripción también se refiere a un kit o paquete que suministra los elementos necesarios para llevar a cabo la transfección de organismos eucariotas o procariotas, en particular la transfección de orgánulos. Se proporciona un kit que comprende un constructo de proteína de unión a ADN que incluye un dominio de transducción de proteína y opcionalmente una señal y dominio seleccionadores de dianas. El constructo proteico se puede combinar con un polinucleótido para formar un complejo que se puede usar para transfectar un hospedante o una célula hospedante. En una realización, el constructo proteico provisto con el kit comprende una señal de localización nuclear, mitocondrial o cloroplástica seleccionada de las conocidas para dirigirse al orgánulo, enunciadas parcialmente en las Tablas I y II. En otra realización, el constructo proteico comprende una secuencia que codifica un tramo de 11 restos de arginina o una secuencia de aminoácidos de HIV-Tat, seguido de una señal de localización mitocondrial, por ejemplo la señal de localización de TFAM, opcionalmente enlazada de forma operable a una señal seleccionadora de dianas.
Se proporciona un kit que comprende células que expresan el constructo proteico. Las células se pueden cultivar para producir el constructo proteico en grandes cantidades, que se puede cosechar, purificar y concentrar. Los componentes individuales de los kits se pueden envasar en una variedad de recipientes, por ejemplo viales, tubos, placas de pocillos de microtitulación, botellas, y similares. Se pueden incluir otros reactivos en recipientes separados y proporcionados con el kit; por ejemplo, muestras de control positivo, muestras de control negativo, tampones, medios de cultivo celular, etc. Preferiblemente, los kits también incluirán instrucciones para uso. El kit incluye un constructo que tiene un dominio de unión a polinucleótido que se hibrida o se une a una secuencia de ácido nucleico predeterminada. El kit puede incluir un polipéptido de unión a polinucleótido, que se hibrida o se une de forma no específica a polinucleótidos de interés.
9. Enfermedades o síndromes genéticos
Las realizaciones de la presente descripción proporcionan composiciones aplicables para protocolos de terapia génica y el tratamiento de enfermedades o trastornos relacionados con los genes. Las enfermedades genéticas adecuadas que se pueden tratar con las composiciones descritas aquí incluyen, pero no se limitan a: cáncer; enfermedad de Canavan; enfermedad de Alzheimer; enfermedad de Parkinson; hipercolesterolemia; fibrosis cística; anemia; arterioesclerosis; distrofia muscular; SIDA; asma; diabetes; artritis; deficiencia de adenosina desaminasa; enfermedad de Gaucher; hemoglobinopatías tales como anemia de células falciformes y las talasemias; y enfermedades autoinmunitarias.
La disfunción de orgánulos puede provocar enfermedad en un hospedante, por ejemplo un hospedante humano o un hospedante vegetal. En particular, problemas con mitocondrias o cloroplastos pueden dar como resultado enfermedad. Las enfermedades mitocondriales resultan de fallos de las mitocondrias, compartimientos especializados presentes en cada célula del cuerpo, excepto glóbulos rojos. La lesión celular e incluso la muerte celular son el resultado del fallo mitocondrial. Si este proceso se repite por todo el cuerpo, todo el sistema comienza a fallar, y la vida de la persona en la que esto está ocurriendo se ve seriamente comprometida. La enfermedad puede ser en niños, por ejemplo individuos con menos de 18 años de edad, típicamente menos de 12 años de edad,
o adultos, por ejemplo individuos de 18 años o más. De este modo, se describen además métodos para tratar un hospedante al que se le ha diagnosticado una enfermedad relacionada con orgánulos, en particular una enfermedad mitocondrial, introduciendo un vector en la célula hospedante, en los que el vector se une específicamente al
orgánulo, y en los que el vector comprende un ácido nucleico que codifica una proteína o péptido mitocondrial. La presente descripción engloba manipular, aumentar o sustituir porciones del genoma mitocondrial de la célula del mamífero para tratar enfermedades provocadas por defectos o anormalidades genéticas mitocondriales.
Las enfermedades mitocondriales ejemplares incluyen, pero no se limitan a: enfermedad de Alpers; síndrome de Barth; defectos de la #-oxidación; deficiencia de carnitina-acil-carnitina; deficiencia de carnitina; deficiencia de coenzima Q10; deficiencia del Complejo I; deficiencia del Complejo II; deficiencia del Complejo III; deficiencia del Complejo IV; deficiencia del Complejo V; deficiencia de citocromo c oxidasa (COX); síndrome de oftalmoplejía externa progresiva crónica (CPEO); deficiencia de CPT I; deficiencia de CPT II; aciduria glutárica tipo II; acidosis láctica; deficiencia de acil-CoA deshidrogenasa de cadena larga (LCAD); LCHAD; citopatía mitocondrial; agotamiento de ADN mitocondrial; encefalopatía mitocondrial; miopatía mitocondrial; encefalomiopatía mitocondrial con acidosis láctica y episodios semejantes a apoplejía (MELAS); epilepsia mioclónica con fiebres rojas rasgadas (MERRF); síndrome de Leigh heredado maternalmente (MILS); encefalomiopatía miogastrointestinal (MNGIE); neuropatía, ataxia y retinitis pigmentosa (NARP); neuropatía óptica hereditaria de Leber (LHON); oftalmoplejía externa progresiva (PEO); síndrome de Pearson; síndrome de Kearns-Sayre (KSS); síndrome de Leigh; disautonomía intermitente; deficiencia de piruvato carboxilasa; deficiencia de piruvato deshidrogenasa; mutaciones y supresiones de la cadena respiratoria; deficiencia de acil-CoA deshidrogenasa de cadena corta (SCAD); SCHAD; y deficiencia de acil-CoA deshidrogenasa de cadena muy larga (VLCAD).
Algunas enfermedades mitocondriales son un resultado de problemas en la cadena respiratoria en las mitocondrias. La cadena respiratoria consiste en cuatro grandes complejos proteicos: I, II, III y IV (citocromo c oxidasa, o COX), ATP sintasa, y dos pequeñas moléculas que transportan electrones, coenzima Q10 y citocromo c. La cadena respiratoria es la etapa final en el proceso de obtención de energía en la mitocondria, en la que se genera la mayoría del ATP. Las encefalomiopatías mitocondriales que pueden estar provocadas por deficiencias en uno o más de los complejos de la cadena respiratoria específicos incluyen MELAS, MERFF, síndrome de Leigh, KSS, Pearson, PEO, NARP, MILS y MNGIE.
La cadena respiratoria mitocondrial está formada de proteínas que proceden tanto de ADN nuclear como mtDNA. Aunque sólo 13 de apenas 100 proteínas de la cadena respiratoria proceden del mtDNA, estas 13 proteínas contribuyen a cada parte de la cadena respiratoria excepto al complejo II, y son necesarios otros 24 genes mitocondriales justo para fabricar esas 13 proteínas. De este modo, un defecto en un gen nuclear o en uno de los 37 genes mitocondriales puede provocar que la cadena respiratoria se rompa. Se apreciará que el ámbito de la presente descripción incluye transfectar mitocondrias con al menos uno o parte de un gen implicado en la función mitocondrial, en particular al menos uno o parte de los 37 genes mitocondriales para restaurar o incrementar la función de la cadena respiratoria. Usando los métodos descritos aquí, se puede introducir en una mitocondria hospedante cualquier o parte de un genoma mitocondrial, por ejemplo el genoma mitocondrial humano SEC ID NO:
218.
Parece que las enfermedades de las mitocondrias provocan el mayor daño a las células del cerebro, corazón, hígado, músculos esqueléticos, riñón y los sistemas endocrino y respiratorio. De este modo, la transfección de mitocondrias en estas células y tejidos con ácidos nucleicos específicos está dentro del alcance de la presente invención, en particular la transfección de mitocondrias con ácidos nucleicos que codifican proteínas codificadas en las mitocondrias en lugar de proteínas codificadas nuclearmente. Se apreciará que las mitocondrias se pueden transfectar para expresar cualquier proteína ya sea que esté presente de forma natural en la mitocondria o no, o codificada naturalmente por mtDNA o ADN nuclear. Dependiendo de qué células se vean afectadas, los síntomas pueden incluir pérdida de control motor, debilidad muscular y dolor, trastornos gastrointestinales y dificultades para tragar, mal crecimiento, cardiopatía, hepatopatía, diabetes, complicaciones respiratorias, ataques, problemas visuales/auditivos, acidosis láctica, retrasos en el desarrollo y susceptibilidad a la infección.
Las mutaciones de mtDNA ejemplares que se pueden abordar por la presente descripción incluyen, pero no se limitan a: tRNAleu- A3243G, A3251 G, A3303G, T3250C T3271C y T3394C; tRNALys- A8344G, G11778A, G8363A, T8356C; ND1-G3460A; ND4- A10750G, G14459A; ND6-T14484A; 12S rRNA-A1555G; MTTS2-C12258A; ATPasa 6-T8993G, T8993C; tRNASer(UCN)-T7511C; 11778 y 14484, mutaciones LHON, así como mutaciones o supresiones en ND2, ND3, ND5, citocromo b, citocromo oxidasa I-III, y ATPasa 8.
También se describe un método para restaurar o incrementar la función de la cadena respiratoria en la célula hospedante, que incluye introducir un complejo de polipéptido de unión a polinucleótido-polinucleótido en la célula hospedante, en el que el complejo se une específicamente a la mitocondria y comprende un ácido nucleico que codifica una proteína o péptido de la cadena respiratoria. El ácido nucleico del complejo se puede inyectar o suministrar de otro modo al interior de las mitocondrias cuando el complejo se dirige a las mitocondrias.
También se describe un método para restaurar o incrementar la actividad de citocromo oxidasa en un hospedante, que incluye transfectar mitocondrias en una célula, por ejemplo una célula del músculo esquelético, en el que el complejo comprende un ácido nucleico que codifica citocromo oxidasa o un componente funcional de la misma. Un componente funcional significa una parte o fragmento de la proteína o complejo proteico o subunidad que lleva a cabo una función biológica independientemente o en combinación con otra proteína, fragmento, o subunidad.
También se describe un método para incrementar o restaurar la #-oxidación en un hospedante, que incluye obtener células del hospedante, transfectar un orgánulo en las células del hospedante, introducir un complejo que comprende un ácido nucleico que codifica proteínas implicadas en la espiral de la #-oxidación y transporte de carnitina, en el que el vector se une específicamente al orgánulo; e introducir las células transfectadas del hospedante nuevamente en el hospedante.
También se describen métodos para restaurar la función mitocondrial perdida o reducida como resultado de mutaciones de punto o supresiones. Por ejemplo, KSS, PEO y Pearson, son tres enfermedades que resultan de un tipo de mutación de mtDNA denominado una supresión (se pierden porciones específicas del ADN) o agotamiento de mtDNA (un acortamiento general de mtDNA). De este modo, las células de hospedantes diagnosticados con KSS, PEO, Pearson o enfermedad similar pueden ver transfectadas sus mitocondrias con el vector vírico recombinante. En las células, se puede introducir un complejo que comprende un ácido nucleico que corresponde a la supresión en el mtDNA que causa el estado enfermo. El complejo se unirá al orgánulo y suministrará el ácido nucleico al interior de las mitocondrias, donde se expresa el ácido nucleico. El producto de la expresión se puede incorporar entonces en las mitocondrias e incrementar o restaurar la función mitocondrial. Las células transfectadas se pueden volver a introducir en el hospedante. Se apreciará que las células hospedantes u otras células se pueden transfectar como se describe aquí e introducir en un hospedante que tiene orgánulos disfuncionales, en particular mitocondrias.
Se apreciará por los expertos en la técnica que la presente descripción engloba suministrar, ya sea separadamente
o en combinación, ácidos nucleicos a las mitocondrias que son codificados de forma natural por mtDNA o ADN nuclear.
La presente descripción también contempla aliviar los síntomas de enfermedades mitocondriales creando células que tienen mitocondrias transfectadas y no transfectadas. Como alternativa, se pueden transfectar o sustituir todas las mitocondrias en una célula.
También se describe un método para compensar una mutación de mtDNA en un hospedante, incluyendo el método identificar un hospedante que tiene una mutación de mtDNA, obtener una célula que comprende dicha mutación de mtDNA a partir de dicho hospedante, transfectar una mitocondria de la célula hospedante, introducir un complejo que se une específicamente al orgánulo en la célula hospedante, en el que el complejo comprende un ácido nucleico que codifica un producto funcional que corresponde a la mutación de mtDNA, e introducir dicha célula transfectada en el hospedante. Un ácido nucleico que codifica un producto funcional que corresponde a la mutación de mtDNA significa una secuencia que produce una proteína sin la mutación correspondiente. Por ejemplo, si una célula hospedante tiene una mutación ND4-A10750G, el ácido nucleico transfectado codificaría un producto de tipo salvaje del gen ND4. El complejo no vírico se puede introducir en el hospedante, por ejemplo, intravenosamente.
10. Administración
Las composiciones proporcionadas aquí se pueden administrar a un hospedante en un vehículo fisiológicamente aceptable. Los métodos preferidos de administración incluyen la administración directa o sistémica a una célula. Las composiciones se pueden administrar a una célula o a un paciente, como se conoce generalmente en la técnica para aplicaciones de terapia génica. En aplicaciones de terapia génica, las composiciones se introducen en las células a fin de transfectar un orgánulo. “Terapia génica” incluye tanto terapia génica convencional, en la que se logra un efecto duradero mediante un único tratamiento, como la administración de agentes terapéuticos génicos, que implica la administración de una sola vez o repetida de un ADN o ARN terapéuticamente eficaz.
Las composiciones de complejos modificados o el polipéptido recombinante solo se pueden combinar en mezcla con un vehículo portador farmacéuticamente aceptable. Las formulaciones terapéuticas se preparan para almacenamiento mezclando el ingrediente activo, que tiene el grado deseado de pureza, con vehículos, excipientes
o estabilizantes fisiológicamente aceptables opcionales (Remington’s Pharmaceutical Sciences 16ª edición, Osol, A. Ed. (1980)), en forma de formulaciones liofilizadas o disoluciones acuosas. Los vehículos, excipientes o estabilizantes aceptables son no tóxicos para los receptores a las dosis y concentraciones empleadas, e incluyen tampones, tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes, incluyendo ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular (menos de alrededor de 10 restos); proteínas, tales como seroalbúmina, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona, aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros hidratos de carbono, incluyendo glucosa, manosa, o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; alcoholes de azúcares, tales como manitol o sorbitol; contraiones formadores de sales, tales como sodio; y/o tensioactivos no iónicos, tales como Tween, Pluronics o PEG.
Las composiciones de la presente descripción se pueden administrar parenteralmente. Como se usa aquí, “administración parenteral” se caracteriza por administrar una composición farmacéutica a través de una brecha física de un tejido del sujeto. La administración parenteral incluye administrar mediante inyección, a través de una incisión quirúrgica, o a través de una herida no quirúrgica que penetra el tejido, y similar. En particular, la administración parenteral incluye la inyección subcutánea, intraperitoneal, intravenosa, intraarterial, intramuscular, intraesternal, y técnicas de infusión dialítica renal.
Las formulaciones parenterales pueden incluir el ingrediente activo combinado con un vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como agua estéril o disolución salina isotónica estéril. Tales formulaciones se pueden preparar, envasar o vender en una forma adecuada para la administración en bolo o para la administración continua. Las formulaciones inyectables se pueden preparar, envasar o vender en forma de dosis unitaria, tal como en ampollas, o en recipientes de múltiples dosis que contienen un conservante. Las formulaciones para la administración parenteral incluyen suspensiones, disoluciones, emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, pastas, formulaciones secas reconstituibles (es decir, en polvo o granulares), y formulaciones implantables de liberación sostenida o formulaciones biodegradables. Tales formulaciones también pueden incluir uno o más ingredientes adicionales, incluyendo agentes de suspensión, de estabilización o de dispersión. Las formulaciones parenterales se pueden preparar, envasar o vender en forma de una suspensión o disolución acuosa u oleosa inyectable estéril. Las formulaciones parenterales también pueden incluir agentes dispersantes, agentes humectantes, o agentes de suspensión descritos aquí. Los métodos para preparar estos tipos de formulaciones son conocidos. Las formulaciones inyectables estériles se pueden preparar usando diluyentes o disolventes parenteralmente aceptables no tóxicos, tales como agua, 1,3-butanodiol, disolución de Ringer, disolución de cloruro sódico isotónica, y aceites fijos tales como monoglicéridos o diglicéridos sintéticos. Otras formulaciones parenteralmente administrables incluyen formas microcristalinas, preparaciones liposomiales, y sistemas de polímeros biodegradables. Las composiciones para liberación o implantación sostenida pueden incluir materiales poliméricos o hidrófobos farmacéuticamente aceptables, tales como emulsiones, resinas de intercambio iónico, polímeros apenas solubles, y sales apenas solubles.
Las composiciones farmacéuticas se pueden preparar, envasar o vender en una formulación bucal. Tales formulaciones pueden estar en forma de comprimidos, polvos, aerosoles, disoluciones atomizadas, suspensiones, o tabletas obtenidas usando métodos conocidos, y pueden contener de alrededor de 0,1% a alrededor de 20% (p/p) de ingrediente activo, conteniendo el resto de la formulación una composición oralmente soluble o degradable y/o uno o más ingredientes adicionales como se describe aquí. Preferiblemente, las formulaciones en polvo o aerosolizadas tienen un tamaño medio de partículas o de gotita que oscila de alrededor de 0,1 nanometros a alrededor de 200 nanometros cuando están dispersas.
Como se usa aquí, “ingredientes adicionales” incluye uno o más de los siguientes: excipientes, agentes tensioactivos, agentes dispersantes, diluyentes inertes, agentes de granulación, agentes de desintegración, agentes aglutinantes, agentes lubricantes, agentes edulcorantes, agentes saborizantes, agentes colorantes, conservantes, composiciones fisiológicamente degradables (por ejemplo, gelatina), vehículos acuosos, disolventes acuosos, vehículos oleosos y disolventes oleosos, agentes de suspensión, agentes dispersantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes, emolientes, tampones, sales, agentes espesantes, cargas, agentes emulsionantes, antioxidantes, antibióticos, agentes antifúngicos, agentes estabilizantes, y materiales poliméricos o hidrófobos farmacéuticamente aceptables. Se conocen otros “ingredientes adicionales” que se pueden incluir en las composiciones farmacéuticas. Los ingredientes adicionales adecuados se describen en Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Genaro, ed., Easton, Pa. (1985).
Las dosis y concentraciones deseadas de vectores modificados descritos aquí en composiciones farmacéuticas de la presente descripción pueden variar dependiendo del uso particular ideado. La determinación de la dosis o ruta de administración apropiada está dentro de la pericia de un médico normal. Los experimentos con animales proporcionan una guía fiable para la determinación de dosis eficaces para terapia humana. Se puede llevar a cabo un escalado entre especies de las dosis eficaces siguiendo los principios expuestos por Mordenti, J. y Chappell, W. “The use of interspecies scaling in toxicokinetics” en Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi et al., Eds., Pergamon Press, Nueva York 1989, p. 42-96.
EJEMPLOS
Ejemplo 1: Constructos recombinantes
El dominio de transducción de una proteína de 11 aminoácidos (PTD) de la proteína de HIV Tat se clonó en dirección 5’ y en el marco de la señal de localización mitocondrial (MLS) del factor A de transcripción mitocondrial (TFAM) humano. Para la transfección nuclear, la MLS se sustituyó por la señal de localización nuclear de 9 aminoácidos (NLS) del antígeno T del virus SV40. La proteína recombinante se expresó en bacterias, y se aisló en una columna quelante de níquel que utiliza una etiqueta 6X histidina expresada en el término C inmediatamente en dirección 3’ del sitio de enterocinasa. La proteína purificada se incubó con enterocinasa y se purificó adicionalmente en una columna con níquel, en la que se recogió el paso del flujo. La proteína se dializó toda la noche a 4ºC contra disolución salina que contiene disolución salina tamponada con fosfato al 33%. La proteína purificada se concentró, y la concentración de la proteína se evaluó con el ensayo de Bradford (Biorad). La proteína purificada se analizó con SDS-Page para verificar la pureza.
De forma breve, se aisló genoma mitocondrial humano de longitud completa a partir de una preparación mitocondrial de la estirpe celular de neuroblastoma humano, SH-SY5Y. Se marcó 1 ∃g del ADN con el fluoróforo Alexa 488 (Molecular Probes). El genoma mitocondrial marcado con Alexa se incubó con la proteína recombinante PTD-MLS-Tfam durante 30 minutos a temperatura ambiente. El ADN marcado con Alexa y la proteína recombinante complejados se introdujeron en un cultivo de células SY5Y que contienen el colorante MitoTracker Red (Molecular
Probes), y se tomaron imágenes confocales en el período de tiempo de 30 minutos tras la introducción de la mezcla complejada de ADN-proteína. Rojo indica mitocondrias, y verde es el ADN marcado con Alexa. La superposición de las imágenes produce amarillo, que indica colocalización (Figura 1A).
Ejemplo 2: Expresión mitocondrial de GFP
Se mutó ADNc de la GFP (proteína fluorescente verde) en la posición nucleotídica 270 para generar el siguiente cambio de codones (UGG UGA). UGA es leído por la maquinaria de traducción mitocondrial como un triptófano, mientras que la maquinaria traduccional nuclear lo lee como un codón de parada – que produce una GFP reducida no fluorescente cuando es traducida por la maquinaria nuclear, pero un producto fluorescente de longitud completa cuando es traducido en las mitocondrias. El ADNc de GFP resultante mitocondrialmente codificado se complejó con la PTD-MLS-Tfam como se describe anteriormente y se introdujo en un cultivo de células SY5Y previamente teñidas con MitoTracker Red. Las células se visualizaron en imágenes con microscopía confocal 24 horas después de la transfección. La señal de GFP (verde) se observó colocalizada con MitoTracker Red (rojo), produciendo una fluorescencia amarilla cuando se superponen (Figuras 1B y 1C).
Para verificar adicionalmente que la proteína recombinante fue capaz de transfectar células, se transfectaron células Rho, generadas a partir de células SY5Y que contienen genoma mitocondrial de tipo salvaje, con genoma mitocondrial mutante procedente de cíbridos LHON (neuropatía óptica hereditaria de Leber). La mutación LHON es una transición G ∀ A en la posición nucleotídica 11778 del genoma mitocondrial. Esta mutación elimina un sitio de restricción SfaNI – de este modo, la digestión de un producto de PCR de 500 pb generado con cebadores que flanquean el sitio de restricción con SfaNI produce en el estado de tipo salvaje dos productos más pequeños (300 y 200 pb). El producto de la PCR generado a partir del genoma mutante de LHON no se puede digerir y permanece como un producto de 500 pb. En la Figura 2, la línea más a la izquierda (Línea 1) es el producto de la PCR generado a partir de células LHON, y de este modo no es digerido por restricción. La Línea 2 procede de células Rho que reciben sólo ADN mitocondrial LHON desnudo. La Línea 3 procede de células Rho que reciben sólo la PTD-MLS-Tfam recombinante. La Línea 4 procede de células Rho que reciben LHON mtDNA complejado con la PTD-MLS-Tfam recombinante. La Línea 5 son las células Rho de control solas. La Línea 4 muestra que la proteína recombinante complejada con el ADN mutante es capaz de introducir un genoma mitocondrial mutante en células Rho.
Ejemplo 3: Datos de secuencias de constructos
Secuencia de TFAM (señal de localización mitocondrial (subrayada) (Locus Link ID: 7019) (SEC. ID. NO.: 206)
Secuencia de PTD-MLS-TFAM (PTD subrayado; MLS subrayada doble) (SEC. ID. NO.: 208): 30
PTD-NLS-TFAM (Señal de localización nuclear Localization (subrayada) sustituye a la mitocondrial; PTD subrayado
doble) (SEC. ID. NO.: 209):
Longitud del péptido de PTD-MLS-TFAM: 260 (SEC. ID. NO.: 210)
Longitud del péptido de PTD-NLS-TFAM: 228 (SEC. ID. NO.: 211)
Similitudes proteicas de organismos modelo seleccionados que se pueden usar en las composiciones y métodos descritos aquí:
H.sapiens
sp:Q00059 - MTT1_HUMAN factor 1 de transcripción, precursor 100% / 246 aa
(SEC ID NO: 212):
mitocondrial (MTTF1) (véase ProtEST)
M. musculus
ref.:NP_033386.1 - factor A de transcripción, mitocondrial [Mus 63% / 237 aa
(SEC ID NO: 213):
musculus] (véase ProtEST)
R. norvegicus:
ref.:NP_112616.1 - factor A de transcripción, mitocondrial [Rattus 64% / 237 aa
(SEC ID NO: 214):
norvegicus] (véase ProtEST)
A. thaliana
Ref.:NP_192846.1 – proteína semejante a 98b [Arabidopsis thaliana] 27% / 189 aa
(SEC ID NO: 214)::
(véase ProtEST)
C. elegans
ref.:NP_501245.1 -F45E4.9.p [Caenorhabditis elegans] 27% / 189 aa
(SEC ID NO: 216)::
(véase ProtEST)
D. melanogaster.
ref. :NP_524415.1 - factor A de transcripción mitocondrial [Drosophila34% / 183 aa
(SEC ID NO: 217):
melanogaster] (véase ProtEST)
Los datos de secuencias para las secuencias citadas aquí son conocidos en la técnica, por ejemplo en GenBank.
Ejemplo 4: Datos de imágenes de transfección nuclear
PTD-NLS-TFAM recombinante se marcó con colorante Alexa 488 (Molecular Probes) y se visualizó usando
10 microscopía confocal en células Sy5y preincubadas con el colorante MitoTracker Red (Molecular Probes). La fluorescencia verde indica la PTD-NLS-TFAM recombinante marcada con Alexa 488, y la fluorescencia roja indica mitocondrias, proporcionando una distribución perinuclear para el análisis de las fronteras nucleares. Se capturaron varias imágenes a 5, 10 y 20 minutos tras la introducción de la proteína recombinante marcada en los medios celulares, con microscopía confocal. Obsérvese que el constructo recombinante logra una localización más intensa
15 cuando está en el núcleo (captura de imagen de 20 minutos), lo que implica condensación en presencia de ADN.
Ejemplo 5: Vector de suministro génico
La molécula de vector de suministro génico representado en la Figura 1 se usó para suministrar ADN. Este vector, combina los tres elementos de suministro génico descrito anteriormente, permite por primera vez la introducción de
genomas mitocondriales de longitud completa y genes exógenos clonados en mtDNA en el compartimiento matricial mitocondrial, tanto en células en división como en células que no se dividen.
Para permitir la captación celular rápida de ADN unido a TFAM, se añadió una secuencia de PTD, específicamente un tramo de poli-arginina, al término N de la molécula del vector. La carga (+) del PTD ayuda en la yuxtaposición a la superficie cargada (-) de las células vivas, mientras que su naturaleza anfipática conduce a la invasión de la membrana celular. La dirección específica del ADN hacia el compartimiento mitocondrial se logró añadiendo la señal seleccionadora de dianas mitocondriales (MLS) aminoterminal de malato deshidrogenasa al vector entre el PTD y la TFAM. La combinación de PTD y MLS se denominará posteriormente como dominio seleccionador de diana mitocondrial (MTD).
La Figura 2 muestra que mtDNA de tipo salvaje que se ha marcado con colorante Alexa 488 y se ha complejado con PTD-NLS-TFAM entra rápidamente en las mitocondrias de las células SY5Y en 15 minutos.
La Figura 3 muestra la restauración rápida de la replicación de mtDNA y la función bioenergética tras la introducción de mtDNA de tipo salvaje mediante los métodos descritos. La imagen superior (A) es de células rho0 teñidas con MitoTracker Red (MTRed), para localizar mitocondrias en función de su %&M, y tras la incubación durante 12 horas con BrdU e inmunoteñidas para BrdU con FITC. Se detectaron bajos niveles de acumulación de MTRed, reflejando un bajo valor de %&M, y la ausencia de tinción de BrdU. La parte (B) muestra una célula SY5Y normal, y la parte (C) muestra una célula rho0 16 horas después de la transfección con PTD-MLS-TFAM complejado con mtDNA de tipo salvaje. Hay un incremento notable en la captación de MTRed y de tinción de BrdU.
Ejemplo 6: Funcionalidad de ADN transfectado
La funcionalidad del ADN transfectado se verificó mediante el rescate del fenotipo rho0. Se cultivaron células Rho0 sin mtADN endógeno mediante incubación prolongada con bromuro de etidio. Tales células sobreviven solamente en medios suplementados con uridina y piruvato, y no tienen actividades medibles de la cadena de transporte de electrones, cuyas subunidades están codificadas parcialmente por el genoma mitocondrial. Se añadió MTD-TFAM complejada con LHON mtDNA a los medios de células rho0 creadas a partir de células Sy5y. La Figura 4 muestra la introducción exitosa en y la replicación de LHON mtDNA en células rho0. La mutación de LHON 11778A provoca la pérdida del sitio SfaNI presente en mtDNA de tipo salvaje. En células rho0, se amplificó un pseudogén similar semejante a tipo salvaje y se cortó mediante SfaN1. Tras la transfección de LHON mtDNA en rho0 y la pasada a través de selección metabólica, principalmente el LHON mtDNA introducido se encuentra libre del sitio SfaNI.
Ejemplo 7: Transfección de EGFP
La verificación adicional del suministro mitocondrial de ADN se logró mediante la introducción del gen para la proteína fluorescente verde, EGFP. Puesto que la tabla de traducción mitocondrial difiere del código nuclear, se manipuló el ADNc para EGFP de manera que las mitocondrias fuesen capaces de traducir la proteína fluorescente de longitud completa (cambio de codones en la posición nucleotídica 173 de mtEGFP desde UGG a UGA), mientras que la traducción nuclear dará como resultado una proteína truncada que carece de actividad fluorescente. La EGFP mitocondrial mutagenizada (mtEGFP) se clonó en el genoma mitocondrial en uno de dos sitios (el sitio BamHI que produce ND6 fusionado a mtEGFP y en la unión de dos genes COX3 Y ATP6). Esto asegura que la replicación y transcripción de los productos génicos mitocondriales no se ve perturbada, y que sólo la replicación mitocondrial y la maquinaria transcripcional es capaz de mantener el constructo de gen informador-mtDNA. En ambos casos, debido a la transcripción del genoma mitocondrial como un transcrito policistrónico a partir de un promotor normal, la secuencia de mtEGFP introducida se transcribió junto con los genes mitocondriales endógenos del mitosoma, y se tradujo en un producto fluorescente funcional, mientras que la mtEGFP transfectada nuclear no produjo ninguna fluorescencia (Figura 5). Para verificar adicionalmente la expresión de mtEGFP por mitocondrias, se usó interferencia de ARN contra la mtDNA polimerasa, polimerasa gamma (PolG). Usando una combinación de tres siRNAs, los niveles de PolG se hicieron indetectables en tres días, provocando la pérdida rápida de mtDNA. De forma similar, se encontró que mtEGFP fue indetectable (Figura 6) con RNAi contra PolG, pero no con el siRNA de control contra EGFP.
Ejemplo 8: Translocación de proteínas codificadas por ADN exógeno
La utilidad general de las composiciones y métodos descritos para dirigir el suministro génico hacia mitocondrias y expresar mtDNA y genes clonados se expandió adicionalmente para ensayar la posibilidad de tener genes mitocondrialmente expresados dirigidos hacia otros compartimientos subcelulares. Para ensayar esta posibilidad, se fusionó mtEGFP con secuencias que codifican una combinación de PTD y la señal de localización nuclear (NLS) del antígeno T grande de Sv40, y se clonó en el sitio COX3-ATP6. La proteína resultante es una fusión de EGFP y NLS+PTD (el dominio de escape mitocondrial, MED). El MED permite que la proteína de fusión abandone a las mitocondrias y sea dirigido hacia el núcleo. Como se muestra en la Fig. 7, la MED-NLS-EGFP se concentró en los núcleos en un grado significativo, y fue detectable en las mitocondrias. El proceso es más bien eficiente, mostrando más del 10% de las células una acumulación nuclear robusta de proteína mitocondrialmente traducida.
Ejemplo 9: Digestión de ADN endógeno
Varios grupos han dado a conocer una ventaja selectiva de mtDNA mutante con respecto al de tipo salvaje. Para permitir que el mtDNA introducido arrincone a cualquier mtDNA endógeno, ya sea mutante o de otro modo, se eliminó el sitio BamHI en ND6 del mtDNA clonado. La mutagénesis no provoca ningún cambio de aminoácidos. El ADNc de la endonucleasa de restricción BamHI se clonó en el sitio COX3-ATP6. Eliminando el sitio BamHI e incluyendo la endonucleasa de restricción BamHI como parte del mtDNA clonado, la enzima BamHI podría digerir por restricción cualquier mtDNA endógeno y sería incapaz de digerir el mtDNA introducido. 24 horas después de la transfección en células Sy5y, mtDNA endógeno fue indetectable usando PCR (Figura 8A). Además, los lisados mitocondriales mostraron actividad de BamHI significativa (Figura 8B).
Una vez suministrado, el ADN se integra permanentemente en el genoma, a pesar de perder su potencial terapéutico. Para superar esta limitación, se introdujo el sitio de restricción BgIII en el mtDNA clonado que expresa mtEGFP. Se creó una enzima de restricción BgIII recombinante que contenía un MTD en el término amino. Después de varias pasadas en cultivo, la expresión de mtEGFP estaba intacta. El MTD-BglII recombinante se añadió a las células Sy5y que expresan mtEGFP, y se observó una caída escarpada en la expresión de EGFP y niveles detectables del mtDNA clonado, permitiendo la posibilidad de modificaciones genéticas no permanentes (Figura 9).
Se debería de enfatizar que las realizaciones descritas anteriormente de la presente descripción, particularmente cualesquiera realizaciones “preferidas”, son meramente ejemplos posibles de implementaciones, expuestos meramente para una comprensión clara de los principios de esta descripción. Se pueden realizar muchas variaciones y modificaciones a la realización o realizaciones descritas anteriormente de esta descripción.
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> Gencia Corporation Khan, Shaharyar
<120> Métodos y composiciones para suministrar polinucleótidos
<130> 120701-2030
<150> 60/568,436
<151> 05/05/2004
<150> 60/513,983
<151> 24/10/2003
<160> 218
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 11
<212> PRT
<213> Virus de la inmunodeficiencia humana
<400> 1
<210> 2
<211> 9
<212> PRT
<213> Virus de la inmunodeficiencia humana
<400> 2
<210> 3
<211> 7
<212> PRT
<213> secuencia artificial
<220> 5 <223> Sitio de consenso AP-1
<400> 3
<210> 4
<211> 16 10 <212> PRT
<213> Drosophila melanogaster
<400> 4
<210> 5 15 <211> 86
<212> PRT
<213> VIH
<400> 5
20 <210> 6
<211> 7
<212> PRT
<213> secuencia artificial
<220>
<223> dominio de transducción de proteínas
<400> 6
<210> 7
<211> 12
<212> PRT
<213> secuencia artificial
<220>
<223> dominio de transducción de proteínas
<400> 7
<210> 8
<211> 27
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<213> secuencia artificial 20 <220>
<223> dominio de transducción de proteínas
<400> 8
<210> 9 25 <211> 29
<212> PRT
<213> secuencia artificial
<220>
<223> dominio de transducción de proteínas 30 <400> 9
<210> 10
<211> 7
<212> PRT
<213> secuencia artificial
<220>
<223> Señal de localización nuclear del antígeno SV40
<400> 10
10 <210> 11
<211> 7
<212> PRT
<213> secuencia artificial
<220> 15 <223> señal de localización nuclear
<400> 11
<210> 12
<211> 7
<212> PRT
<213> secuencia artificial
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<223> señal de localización nuclear
<400> 12
<210> 13
<211> 19
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<213> secuencia artificial 30 <220>
<223> señal de localización nuclear
<400> 13
<210> 14 5 <211> 20
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<213> secuencia artificial
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<223> señal de localización nuclear 10 <400> 14
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<213> secuencia artificial
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<211> 9
<212> PRT
<213> secuencia artificial
<220> 25 <223> señal de localización nuclear
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<210> 17
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<212> PRT
<213> secuencia artificial
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<223> señal de localización nuclear
<400> 17
10 <210> 18
<211> 252
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 18
<210> 19
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<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 19
<210> 20
<211> 509
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 20
<210> 21
<211> 227
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 21
<210> 22
<211> 464
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 22
<210> 23
<211> 1500
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 23
<210> 24
<211> 572
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 24
<210> 25
<211> 724
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 25
<210> 26
<211> 703
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 26
<210> 27
<211> 244
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 27
<210> 28
<211> 476
<212> PRT
<213> Neurospora crassa
<400> 28
<210> 29 <211> 412
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 29
<210> 30
<211> 333
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 30
<210> 31
<211> 482
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 31
<210> 32
<211> 573
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 32
<210> 33
<211> 577
<212> PRT
<213> Neurospora crassa
<400> 33
<210> 34
<211> 423
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 34
<210> 35
<211> 392
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 35
<210> 36
<211> 1000
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 36
<210> 37
<211> 584
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 37
<210> 38
<211> 496
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 38
<210> 39
<211> 430
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 39
<210> 40
<211> 517
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 40
<210> 41
<211> 207
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 41
<210> 42
<211> 453
<212> PRT
<213> Neurospora crassa
<400> 42
<210> 43
<211> 343
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 43
<210> 44
<211> 325
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 44
<210> 45
<211> 1178
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 45
<210> 46
<211> 539
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 46
<210> 47
<211> 558
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 47
<210> 48
<211> 102
<212> PRT
<213> Mus musculus
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<210> 49
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<212> PRT
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<212> PRT
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<210> 51
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<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 51
<210> 52
<211> 2875
<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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<210> 59
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<212> PRT
<213> Homo sapiens 10 <400> 59
<210> 60
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<212> PRT
<213> Neurospora crassa
<400> 60
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<213> Caenorhabditis elegans
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<213> Mus musculus
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<211> 450
<212> PRT
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<400> 88
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
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<210> 91 <211> 488
<212> PRT
<213> Homo sapiens
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<211> 1218
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 92
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<212> PRT
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
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<211> 130
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 98
<210> 99
<211> 397
<212> PRT
<213> Caenorhabditis elegans
<400> 99
<210> 100
<211> 354
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 100
<210> 101
<211> 366
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 101
<210> 102
<211> 392
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 102
<210> 103
<211> 563
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 103
<210> 104
<211> 398
<212> PRT
<213> Saccharomyces cerevisiae
<400> 104
<210> 105
<211> 525
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 105
<210> 106
<211> 411
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 106
<210> 107
<211> 296
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 107
<210> 108
<211> 430
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 108
<210> 109
<211> 748
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 109
<210> 110
<211> 375
<212> PRT
<213> Neurospora crassa
<400> 110
<210> 111
<211> 111
<212> PRT
<213> Caenorhabditis elegans
<400> 111
<210> 112
<211> 558
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 112
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<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 113
<210> 114
<211> 220
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 114
<210> 115
<211> 896
<212> PRT
<213> Neurospora crassa
<400> 115
<210> 116
<211> 255
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 116
<210> 117
<211> 289 <212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 117
<210> 118
<211> 390
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 118
<210> 119
<211> 742
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 119
<210> 120
<211> 288
<212> PRT
<213> Caenorhabditis elegans
<400> 120
<210> 121
<211> 469
<212> PRT
<213> Neurospora crassa
<400> 121
<210> 122
<211> 937
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 122
<210> 123
<211> 468
<212> PRT
<213> Caenorhabditis elegans
<400> 123
<210> 124
<211> 102
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 124 <210> 125
<211> 604
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 125
<210> 126 <211> 494
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 126
<210> 127
<211> 482
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 127
<210> 128
<211> 442
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 128
<210> 129
<211> 520
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 129
<210> 130
<211> 221
<212> PRT
<213> Caenorhabditis elegans
<400> 130
<210> 131
<211> 218
<212> PRT
<213> Caenorhabditis elegans
<400> 131
<210> 132
<211> 587
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 132
<210> 133
<211> 640
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 133
<210> 134
<211> 903
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 134
<210> 135
<211> 586
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 135
<210> 136
<211> 994
<212> PRT
<213> Neurospora crassa
<400> 136
<210> 137
<211> 531
<212> PRT
<213> Neurospora crassa
<400> 137
<210> 138
<211> 350
<212> PRT
<213> Caenorhabditis elegans
<400> 138
<210> 139
<211> 297
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 139
<210> 140
<211> 713
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 140
<210> 141
<211> 501
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 141
<210> 142
<211> 430
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 142
<210> 143
<211> 439
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 143
<210> 144
<211> 392
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 144
<210> 145
<211> 439
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 145
<210> 146
<211> 615
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 146
<210> 147
<211> 177
<212> PRT
<213> Saccharomyces cerevisiae
<400> 147
<210> 148
<211> 1133
<212> PRT
<213> Saccharomyces cerevisiae
<400> 148
<210> 149
<211> 232
<212> PRT
<213> Saccharomyces cerevisiae
<400> 149
<210> 150
<211> 541
<212> PRT
<213> Saccharomyces cerevisiae
<400> 150
<210> 151
<211> 177
<212> PRT
<213> Saccharomyces cerevisiae
<400> 151
<210> 152
<211> 162
<212> PRT
<213> Saccharomyces cerevisiae
<400> 152
<210> 153
<211> 196
<212> PRT
<213> Saccharomyces cerevisiae
<400> 153
<210> 154
<211> 278
<212> PRT
<213> Saccharomyces cerevisiae
<400> 154
<210> .155
<211> 366
<212> PRT
<213> Saccharomyces cerevisiae
<400> 155
<210> 156
<211> 520
<212> PRT
<213> Saccharomyces cerevisiae
<400> 156
<210> 157
<211> 307
<212> PRT
<213> Saccharomyces cerevisiae
<400> 157
<210> 158
<211> 105
<212> PRT
<213> Saccharomyces cerevisiae
<400> 158
<210> 159
<211> 146
<212> PRT
<213> Saccharomyces cerevisiae
<400> 159
<210> 160
<211> 183
<212> PRT
<213> Saccharomyces cerevisiae
<400> 160
<210> 161
<211> 492
<212> PRT
<213> Saccharomyces cerevisiae
<400> 161
<210> 162
<211> 135
<212> PRT
<213> Saccharomyces cerevisiae
<400> 162
<210> 163
<211> 169
<212> PRT
<213> Saccharomyces cerevisiae
<400> 163
<210> 164
<211> 249
<212> PRT
<213> Saccharomyces cerevisiae
<400> 164
<210> 165
<211> 463
<212> PRT
<213> Saccharomyces cerevisiae
<400> 165
<210> 166
<211> 664
<212> PRT
<213> Saccharomyces cerevisiae
<400> 166
<210> 167
<211> 147
<212> PRT
<213> Saccharomyces cerevisiae
<400> 167
<210> 168
<211> 499
<212> PRT
<213> Saccharomyces cerevisiae
<400> 168
<210> 169
<211> 427
<212> PRT
<213> Saccharomyces cerevisiae
<400> 169
<210> 170
<211> 233
<212> PRT
<213> Saccharomyces cerevisiae
<400> 170
<210> 171
<211> 266
<212> PRT
<213> Saccharomyces cerevisiae
<400> 171
<210> 172
<211> 224
<212> PRT
<213> Saccharomyces cerevisiae
<400> 172
<210> 173
<211> 247
<212> PRT
<213> Saccharomyces cerevisiae
<400> 173
<210> 174
<211> 264
<212> PRT
<213> Saccharomyces cerevisiae
<400> 174
<210> 175
<211> 258 <212.> PRT
<213> Saccharomyces cerevisiae
<400> 175
<210> 176
<211> 269
<212> PRT
<213> Saccharomyces cerevisiae
<400> 176
<210> 177
<211> 307
<212> PRT
<213> Saccharomyces cerevisiae
<400> 177
<210> 178
<211> 441
<212> PRT
<213> Saccharomyces cerevisiae
<400> 178
<210> 179
<211> 183
<212> PRT
<213> Saccharomyces cerevisiae
<400> 179
<210> 180
<211> 706
<212> PRT
<213> Saccharomyces cerevisiae
<400> 180
<210> 181
<211> 285
<212> PRT
<213> Saccharomyces cerevisiae
<400> 181
<210> 182
<211> 329
<212> PRT
<213> Saccharomyces cerevisiae
<400> 182
<210> 183
<211> 344
<212> PRT
<213> Saccharomyces cerevisiae
<400> 183
<210> 184
<211> 165
<212> PRT
<213> Saccharomyces cerevisiae
<400> 184
<210> 185
<211> 172
<212> PRT
<213> Saccharomyces cerevisiae
<400> 185
<210> 186
<211> 488
<212> PRT
<213> Saccharomyces cerevisiae
<400> 186
<210> 187
<211> 474
<212> PRT
<213> Saccharomyces cerevisiae
<400> 187
<210> 188
<211> 185
<212> PRT
<213> Saccharomyces cerevisiae
<400> 188
<210> 189
<211> 750
<212> ADN
<213> Glycine max
<400> 189 <210> 190
<211> 552
<212> PRT
<213> Pisum sativum
<400> 190
<210> 191
<211> 735
<212> PRT
<213> Chlamydomonas reinhardtii
<400> 191
<210> 192
<211> 260
<212> PRT
<213> Pisum sativum
<400> 192
<210> 193
<211> 564
<212> PRT
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 193
<210> 194
<211> 525
<212> PRT 5 <213> PISUM SATIVUM
<220>
<221 > CARACTERÍSTICAS DIVERSAS
<222> (181)..(181)
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido de origen natural 10 <400> 194
<210> 195
<211> 376
<212> PRT
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 195
<210> 196
<211> 364
<212> PRT
<213> Spinacia oleracea
<400> 196
<210> 197
<211> 147
<212> PRT
<213> Spinacia oleracea
<400> 197
<210> 198
<211> 147
<212> PRT
<213> Spinacia oleracea
<400> 198
<210> 199
<211> 364
<212> PRT
<213> Spinacia oleracea
<400> 199
<210> 200
<211> 179
<212> PRT
<213> Oryza sativa (grupo variedad de cultivo japonica)
<400> 200
<210> 201
<211> 185
<212> PRT
<213> Oryza sativa (grupo variedad de cultivo japonica)
<400> 201
<210> 202
<211> 1259
<212> PRT
<213> Pisum sativum
<400> 202
<210> 203
<211> 332
<212> PRT
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 203
<210> 204
<211> 255
<212> ADN
<213> Oryza sativa
<400> 204
<210> 205
<211> 606
<212> ADN
<213> Oryza sativa (grupo variedad de cultivo japonica)
<220>
<221> CARACTERÍSTICAS DIVERSAS
<222> (349)..(349)
<223> nes a, c, g,o t
<400> 205
<210> 206
<211> 741
<212> ADN
<213> secuencia TFAM
<400> 206
<210> 207
<211> 16
<212> PRT
<213> secuencia artificial
<220>
<223> transportano
<400> 207
<210> 208
<211> 780
<212> ADN
<213> secuencia PTD-MLS-TFAM
<400> 208
<210> 209
<211> 684
<212> ADN
<213> secuencia PTD-NLS-TFAM
<400> 209
<210> 210
<211 > 259
<212> PRT
<213> péptido PTD-MLS-TFAM
<400> 210
<210> 211
<211> 227
<212> PRT
<213> péptido PTD-NLS-TFAM
<400> 211
<210> 212
<211> 246
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 212
<210> 213
<211> 243
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 213
<210> 214
<211> 244
<212> PRT
<213> Rattus norvegicus
<400> 214
<210> 215
<211> 446
<212> PRT
<213> Arabidopsis thaliana
<400> 215
<210> 216
<211> 204
<212> PRT
<213> Caenorhabditis elegans
<400> 216
<210> 217
<211 > 257
<212> PRT
<213> Drosophila melanogaster
<400> 217
<210> 218
<211> 16571
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 218

Claims (33)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Un polipéptido recombinante del grupo de movilidad elevada, o un fragmento del mismo, que comprende:
    un polipéptido del factor de transcripción mitocondrial A (TFAM) que comprende al menos una caja HMG operablemente enlazada a un dominio de transducción de proteína que está enlazado operablemente a una señal seleccionadora de dianas para un orgánulo no nuclear, en el que el polipéptido recombinante del grupo de movilidad elevada se puede asociar con un polinucleótido para empaquetar el polinucleótido para el suministro al orgánulo no nuclear.
  2. 2.
    El polipéptido de la reivindicación 1, en el que el polipéptido recombinante del grupo de movilidad elevada se asocia con 10 a 100 nucleótidos de un polinucleótido que se va a suministrar a un orgánulo seleccionado como diana, y de ese modo empaqueta el polinucleótido para el suministro al orgánulo seleccionado como diana.
  3. 3.
    El polipéptido de la reivindicación 1, en el que el polipéptido recombinante del grupo de movilidad elevada comprende una secuencia seleccionada de SEC ID NO. 210, o un fragmento de la misma, suficiente para la unión a un polinucleótido.
  4. 4.
    El polipéptido de la reivindicación 1, en el que la señal seleccionadora de dianas comprende una señal de localización mitocondrial o una señal de localización de cloroplastos.
  5. 5.
    El polipéptido de la reivindicación 4, en el que la señal de localización mitocondrial comprende una secuencia que tiene una homología del 80-100% con una señal de localización mitocondrial derivada de una proteína seleccionada del grupo que consiste en hexocinasa I, amino oxidasa (que contiene flavina) A, hexocinasa IV, forma celular beta pancreática, proteína relacionada con el receptor periférico de benzodiazepinas, metaxina 2, receptor de importación de proteína de membrana externa mitocondrial putativa (hTOM), glutationa transferasa; canal aniónico 2 dependiente del voltaje (proteína de membrana mitocondrial externa porínica), citocromo b5, receptor periférico de benzodiazepinas, anclaje de cinasa de célula germinal S-AKAP84, proteína de anclaje de cinasa A, precursor de carnitina O-palmitoiltransferasa I, hexocinasa II, amino oxidasa (que contiene flavina) B, ácido graso de cadena larga-CoA ligasa 2, ácido graso de cadena larga-CoA ligasa 1 (palmitoil-CoA ligasa), canal aniónico 1 dependiente del voltaje, metaxina 1, translocasa de 34 kDa de membrana mitocondrial externa putativa humana hTOM34, canal aniónico 4 dependiente del voltaje (proteína porínica de la membrana mitocondrial externa), citocromo-b5 reductasa, canal aniónico 3 dependiente del voltaje (proteína porínica de la membrana mitocondrial externa), homólogo de la subunidad TOM20 del receptor de importación mitocondrial (proteína de la membrana externa de 20 kd mitocondrial) (receptor de la membrana mitocondrial externa TOM20), precursor del homólogo de discos marginales tumorosos (HTID-1), SEC ID Nos. 18-51, SEC ID Nos. 53-188 y el polipéptido codificado por SEC ID No: 52.
  6. 6.
    El polipéptido de la reivindicación 4, en el que la señal de localización de cloroplastos tiene una homología del 80100% con una señal de localización de cloroplastos derivada de una proteína seleccionada del grupo que consiste en el dominio peptídico de tránsito de la proteína ribosomal de apicoblasto S9, péptido de señal de glutationa reductasa (GR) del guisante, término NH2 de Cr-RSH que codifica una guanosina 3’,5’-bispirofosfato (ppGpp) sintasa-degradasa putativa, proteínas 14-3-3, partícula de reconocimiento de la señal de cloroplastos que incluye las subunidades cpSRP54, cpSRP43 o un fragmento de las mismas, péptidos de tránsito de cloroplastos AtOEP7 que incluye el dominio transmembránico (TMD) y su región de siete aminoácidos vecinos C-terminal, péptido de tránsito cloroplástico N-terminal THI 1, SEC. ID Nos. 190-203, el polipéptido codificado por SEC ID No: 189, el polipéptido codificado por SEC ID No: 204 y el polipéptido codificado por SEC ID No: 205.
  7. 7.
    El polipéptido de la reivindicación 1, en el que el dominio de transducción de proteína comprende una pluralidad de restos de aminoácidos que tienen una carga neta positiva en condiciones fisiológicas.
  8. 8.
    El polipéptido de la reivindicación 7, en el que el dominio de transducción de proteína comprende 8-15 restos de aminoácidos.
  9. 9.
    El polipéptido de la reivindicación 1, en el que el dominio de transducción de proteína comprende 11 restos de arginina.
  10. 10.
    El polipéptido de la reivindicación 1, en el que el dominio de transducción de proteína se selecciona del grupo que consiste en YGRKKRRQRRR (SEC. ID. NO.: 1), RKKRRQRRR (SEC. ID. NO. 2), aminoácidos 48-60 de la proteína de HIV-1 TAT, la tercera hélice de homeodominio de Antennapedia, RQIKIWFQNRRMKWKK (SEC. ID. NO.: 207), una región de poliarginina, 7 restos de arginina, RRQRRTSKLMKR (SEC. ID. NO.: 7), GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL (SEC. ID. NO.: 8), WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKACEA (SEC. ID. NO.: 9), un fragmento de los mismos, o una combinación de los mismos.
  11. 11.
    El polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en el que el dominio de transducción de proteína facilita el atravesamiento de una membrana, y en el que la membrana es una membrana celular, una membrana plasmática, una membrana de orgánulo, una membrana de micela, una membrana bicapa, una membrana de una sola capa, una membrana de vesícula, una membrana nuclear, o una membrana mitocondrial.
  12. 12.
    Una composición que comprende:
    (a)
    un polipéptido recombinante del grupo de movilidad elevada, o un fragmento del mismo, en el que el polipéptido recombinante del grupo de movilidad elevada, o un fragmento del mismo, comprende un polipéptido del factor A de transcripción mitocondrial (TFAM) que comprende al menos una caja HMG enlazada operablemente a un dominio de transducción de proteína que está enlazado operablemente a una señal seleccionadora de dianas para un orgánulo no nuclear, y
    (b)
    un polinucleótido,
    en la que el polinucleótido está asociado físicamente con el polipéptido recombinante del grupo de movilidad elevada, o fragmento del mismo.
  13. 13.
    La composición de la reivindicación 12, en la que la asociación física protege al polinucleótido de la degradación.
  14. 14.
    La composición de la reivindicación 12, en la que el polipéptido recombinante del grupo de movilidad elevada, o un fragmento del mismo, se une de forma reversible a una región del polinucleótido.
  15. 15.
    La composición de la reivindicación 12, en la que el polinucleótido comprende un promotor enlazado operablemente a una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido, siRNA, o un polinucleótido antisentido.
  16. 16.
    La composición de la reivindicación 12, en la que el polinucleótido comprende ARN, ADN, o una combinación de los mismos.
  17. 17.
    La composición de la reivindicación 12, en la que el polinucleótido comprende un dominio enzimático.
  18. 18.
    La composición de la reivindicación 12, en la que el polinucleótido comprende ARN enzimático o ADN enzimático.
  19. 19.
    La composición de la reivindicación 12, en la que el polinucleótido es monocatenario o multicatenario.
  20. 20.
    El polipéptido o composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, para uso en terapia.
  21. 21.
    Un método in vitro de empaquetamiento de un polinucleótido, que comprende:
    combinar un polinucleótido con una cantidad de un polipéptido recombinante del grupo de movilidad elevada suficiente para empaquetar el polinucleótido,
    en el que el polipéptido recombinante del grupo de movilidad elevada comprende un polipéptido TFAM que comprende al menos un dominio de la caja HMG operablemente enlazado a un dominio de transducción de proteína que está enlazado operablemente a una señal seleccionadora de dianas para un orgánulo no nuclear,
    en el que el dominio de transducción de proteína y la señal seleccionadora de dianas se presentan sobre una superficie exterior del polinucleótido empaquetado.
  22. 22.
    El método de la reivindicación 21, en el que el polipéptido recombinante del grupo de movilidad elevada se asocia reversiblemente con el polinucleótido.
  23. 23.
    El método de la reivindicación 21, en el que el polipéptido recombinante del grupo de movilidad elevada reviste al polinucleótido.
  24. 24.
    El método de la reivindicación 21, en el que la asociación del polipéptido recombinante del grupo de movilidad elevada con el polinucleótido induce a un cambio conformacional en el polinucleótido.
  25. 25.
    El método de la reivindicación 21, en el que el dominio de la caja HMG se asocia con el polinucleótido de una manera específica de la secuencia.
  26. 26.
    El método de la reivindicación 21, en el que el dominio de la caja HMG se asocia de forma no específica con el polinucleótido.
  27. 27.
    El método de la reivindicación 21, en el que la etapa de combinación se produce in vitro.
  28. 28.
    Un complejo de polinucleótido-polipéptido, comprendiendo el complejo de polinucleótido-polipéptido:
    (1)
    un polipéptido recombinante del grupo de movilidad elevada que comprende un polipéptido TFAM que comprende al menos una caja HMG operablemente enlazada a un dominio de transducción de proteína que está operablemente enlazado a una señal seleccionadora de orgánulos no nucleares, y
    (2)
    un polinucleótido que codifica un primer polipéptido enzimático o un ácido nucleico enzimático y al menos un segundo polipéptido.
  29. 29.
    El complejo de la reivindicación 28, en el que el polinucleótido comprende un genoma mitocondrial o un fragmento del mismo.
  30. 30.
    El complejo de la reivindicación 28, en el que el orgánulo no nuclear es una mitocondria.
  31. 31.
    El complejo de la reivindicación 28, en el que el primer polipéptido enzimático es una endonucleasa.
  32. 32.
    El complejo de la reivindicación 28, en el que el ácido nucleico enzimático comprende ADN, ARN, o una combinación de los mismos.
  33. 33.
    El complejo de la reivindicación 28, en el que el polinucleótido codifica más de un polipéptido mitocondrial.
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