JP4568174B2 - Biosensor and method for immobilizing physiologically active substance - Google Patents
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本発明は、バイオセンサー及び生理活性物質の固定化方法に関する。 The present invention relates to a biosensor and a method for immobilizing a physiologically active substance.
生理活性物質を測定チップに固定化するための代表的な手法として、生理活性物質のアミノ基と測定チップ上のカルボキシル基とを結合させる方法（アミンカップリング法）が広く用いられている。この方法では、固定化の際に生理活性物質を、その等電点よりも低いｐＨを有する緩衝液に溶解する必要がある。すなわち、等電点以下のｐＨでは生理活性物質は＋荷電となるのに対し、測定チップ上のカルボキシル基はアルカリ側からｐＨ３．５程度の酸性域まで−荷電を持つ。それゆえ、静電引力によって生理活性物質が測定チップ上に濃縮される。この濃縮（プレコンセントレーション）を行わない場合、生理活性物質の固定量が大幅に低下するため、固定化される生理活性物質は、その等電点よりも低いｐＨの緩衝液に溶解する必要があることが、非特許文献１及び特許文献１に記載されている。
As a typical method for immobilizing a physiologically active substance on a measurement chip, a method of binding an amino group of a physiologically active substance and a carboxyl group on the measurement chip (amine coupling method) is widely used. In this method, it is necessary to dissolve the physiologically active substance in a buffer solution having a pH lower than its isoelectric point at the time of immobilization. In other words, the physiologically active substance is positively charged at a pH below the isoelectric point, while the carboxyl group on the measurement chip is negatively charged from the alkali side to the acidic range of about pH 3.5. Therefore, the physiologically active substance is concentrated on the measurement chip by electrostatic attraction. When this concentration (preconcentration) is not performed, the amount of the physiologically active substance immobilized is greatly reduced. Therefore, the physiologically active substance to be immobilized must be dissolved in a buffer solution having a pH lower than its isoelectric point. It is described in
このことは、カルボキシル基を有する測定チップ、例えば非特許文献１に記載されているカルボキシメチルデキストランが固定された測定チップでは、カルボキシル基の酸解離定数であるｐＨ３．５以下のｐＨではプレコンセントレーションが行われないため、タンパク質の固定が困難であることを意味している。
This is because, in a measurement chip having a carboxyl group, for example, a measurement chip in which carboxymethyldextran described in Non-Patent
そこで本発明は、このような実状に鑑みて、カルボキシル基の酸解離定数であるｐＨ３．５以下のｐＨでプレコンセントレーション効果を得ることができ、さらに生理活性物質を表面に共有結合し得るバイオセンサー及び生理活性物質の固定化方法を提供することを解決すべき課題とした。 Therefore, in view of such a situation, the present invention can obtain a preconcentration effect at a pH of 3.5 or less, which is an acid dissociation constant of a carboxyl group, and can further bioactively bind a physiologically active substance to the surface. Providing a sensor and a method for immobilizing a physiologically active substance was an issue to be solved.
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、生理活性物質を化学的に固定化できる反応性基と、カルボキシル基の酸解離定数よりも低い酸解離定数を有するアニオン性基とを有する表面を備えたバイオセンサーを用いることにより、カルボキシル基の酸解離定数（ｐＫａ＝３．５）よりも低いｐＨを有する生理活性物質含有液を用いた場合においてもプレコンセントレーション（濃縮）効果を得ることができると同時に生理活性物質を表面に共有結合により固定化できることを見出し、本発明を完成するに至った。 As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have found that a reactive group capable of chemically immobilizing a physiologically active substance and an anionic property having an acid dissociation constant lower than the acid dissociation constant of a carboxyl group By using a biosensor having a surface having a group, preconcentration (concentration) even when a bioactive substance-containing liquid having a pH lower than the acid dissociation constant (pKa = 3.5) of the carboxyl group is used. The inventors have found that a physiologically active substance can be immobilized on the surface by covalent bonding, and the present invention has been completed.
即ち、本発明によれば、生理活性物質を化学的に固定化できる反応性基と、カルボキシル基の酸解離定数よりも低い酸解離定数を有するアニオン性基とを併せ持つ表面を有するバイオセンサーが提供される。 That is, according to the present invention, there is provided a biosensor having a surface having both a reactive group capable of chemically immobilizing a physiologically active substance and an anionic group having an acid dissociation constant lower than that of a carboxyl group. Is done.
好ましくは、生理活性物質を化学的に固定化できる反応性基と、カルボキシル基の酸解離定数よりも低い酸解離定数を有するアニオン性基とを併せ持つ表面は、水溶性高分子が結合している表面、疎水性高分子が結合している表面、又は自己組織化単分子膜が形成されている表面の何れかである。 Preferably, a surface having both a reactive group capable of chemically immobilizing a physiologically active substance and an anionic group having an acid dissociation constant lower than the acid dissociation constant of the carboxyl group is bound with a water-soluble polymer. Either a surface, a surface to which a hydrophobic polymer is bonded, or a surface on which a self-assembled monolayer is formed.
好ましくは、本発明のバイオセンサーは、生理活性物質を化学的に固定化できる反応性基と、カルボキシル基の酸解離定数よりも低い酸解離定数を有するアニオン性基とを併せ持つ高分子を基板にコートすることにより得られる。 Preferably, the biosensor of the present invention uses, as a substrate, a polymer having both a reactive group capable of chemically immobilizing a physiologically active substance and an anionic group having an acid dissociation constant lower than that of a carboxyl group. Obtained by coating.
好ましくは、生理活性物質を化学的に固定化できる反応性基は、ビニルスルホン基又はその前駆体、ハロトリアジン基、エポキシ基、カルボン酸活性エステル基、アルデヒド基、イソシアネート基、又はアセトアセチル基のいずれかである。
好ましくは、カルボキシル基の酸解離定数よりも低い酸解離定数を有するアニオン性基は、硫酸エステル基、リン酸エステル基、又はスルホン酸基である。
Preferably, the reactive group capable of chemically immobilizing the physiologically active substance is a vinyl sulfone group or a precursor thereof, a halotriazine group, an epoxy group, a carboxylic acid active ester group, an aldehyde group, an isocyanate group, or an acetoacetyl group. Either.
Preferably, the anionic group having an acid dissociation constant lower than the acid dissociation constant of the carboxyl group is a sulfate ester group, a phosphate ester group, or a sulfonic acid group.
好ましくは、生理活性物質を化学的に固定化できる反応性基と、カルボキシル基の酸解離定数よりも低い酸解離定数を有するアニオン性基とを併せ持つ表面が金属上に形成されている。
好ましくは、金属は金、銀、銅、白金またはアルミニウムのいずれかである。
Preferably, a surface having both a reactive group capable of chemically immobilizing a physiologically active substance and an anionic group having an acid dissociation constant lower than the acid dissociation constant of the carboxyl group is formed on the metal.
Preferably, the metal is any of gold, silver, copper, platinum or aluminum.
好ましくは、本発明のバイオセンサーは、非電気化学的検出に使用される。
好ましくは、本発明のバイオセンサーは、表面プラズモン共鳴分析に使用される。
Preferably, the biosensor of the present invention is used for non-electrochemical detection.
Preferably, the biosensor of the present invention is used for surface plasmon resonance analysis.
本発明の別の側面によれば、生理活性物質を化学的に固定化できる反応性基と、カルボキシル基の酸解離定数よりも低い酸解離定数を有するアニオン性基とを併せ持つ表面に、生理活性物質含有液を接触させることを含む、生理活性物質の固定化方法が提供される。 According to another aspect of the present invention, a surface having both a reactive group capable of chemically immobilizing a physiologically active substance and an anionic group having an acid dissociation constant lower than the acid dissociation constant of a carboxyl group, Provided is a method for immobilizing a physiologically active substance, which comprises contacting a substance-containing liquid.
好ましくは、生理活性物質を化学的に固定化できる反応性基と、カルボキシル基の酸解離定数よりも低い酸解離定数を有するアニオン性基とを併せ持つ表面は、バイオセンサーの表面である。 Preferably, the surface having both a reactive group capable of chemically immobilizing a physiologically active substance and an anionic group having an acid dissociation constant lower than the acid dissociation constant of the carboxyl group is a biosensor surface.
本発明のさらに別の側面によれば、生理活性物質が共有結合により表面に結合している上記した本発明のバイオセンサーと被験物質とを接触させる工程を含む、該生理活性物質と相互作用する物質を検出または測定する方法が提供される。 According to still another aspect of the present invention, the bioactive substance interacts with the bioactive substance, comprising the step of bringing the biosensor of the present invention in which the bioactive substance is covalently bonded to the surface into contact with the test substance. A method for detecting or measuring a substance is provided.
好ましくは、生理活性物質と相互作用する物質を非電気化学的方法により検出または測定する。
好ましくは、生理活性物質と相互作用する物質を表面プラズモン共鳴分析により検出または測定する。
Preferably, a substance that interacts with a physiologically active substance is detected or measured by a non-electrochemical method.
Preferably, a substance that interacts with a physiologically active substance is detected or measured by surface plasmon resonance analysis.
本発明のバイオセンサーによれば、カルボキシル基の酸解離定数（ｐＫａ＝３．５）よりも低いｐＨを有する生理活性物質含有液を用いた場合においても、静電引力によって生理活性物質が測定チップ上に濃縮されるプレコンセントレーション効果を得ることができると同時に、生理活性物質をバイオセンサーの表面に共有結合により固定化することができる。 According to the biosensor of the present invention, even when a bioactive substance-containing liquid having a pH lower than the acid dissociation constant (pKa = 3.5) of the carboxyl group is used, the bioactive substance is measured by electrostatic attraction. The preconcentration effect concentrated on the top can be obtained, and at the same time, the physiologically active substance can be immobilized on the biosensor surface by covalent bonding.
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。なお本発明において、数値が物性値、特性値等を表す場合に、「（数値１）〜（数値２）」という記載は「（数値１）以上（数値２）以下」の意味を表す。 Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail. In the present invention, when a numerical value represents a physical property value, a characteristic value, or the like, the description “(numerical value 1) to (numerical value 2)” means “(numerical value 1) or more and (numerical value 2) or less”.
本発明のバイオセンサーは、生理活性物質を化学的に固定化できる反応性基と、カルボキシル基の酸解離定数よりも低い酸解離定数を有するアニオン性基とを併せ持つ表面を有することを特徴とする。 The biosensor of the present invention has a surface having both a reactive group capable of chemically immobilizing a physiologically active substance and an anionic group having an acid dissociation constant lower than the acid dissociation constant of a carboxyl group. .
生理活性物質を化学的に固定化できる反応性基としては、例えば、タンパク質が持つアミノ基、チオール基、水酸基またはカルボキシル基などと反応することができ、かつ下記で説明するカルボキシル基の酸解離定数よりも低い酸解離定数を有するアニオン性基とは反応しないものであれば特に限定されない。上記反応性基の具体例としては、以下の表１に記載するものが挙げられる。 Examples of the reactive group capable of chemically immobilizing a physiologically active substance include an acid dissociation constant of a carboxyl group that can react with an amino group, a thiol group, a hydroxyl group, or a carboxyl group of a protein, and is described below. If it does not react with the anionic group which has a lower acid dissociation constant, it will not be specifically limited. Specific examples of the reactive group include those described in Table 1 below.
生理活性物質を化学的に固定化できる反応性基としては、好ましくは、ビニルスルホン基およびその前駆体、ハロトリアジン基、エポキシ基、カルボン酸活性エステル基、アルデヒド基、イソシアネート基、アセトアセチル基のいずれかである。低ｐＨ領域における反応性の高さの観点から、より好ましくは、カルボン酸活性エステル基である。 The reactive group capable of chemically immobilizing a physiologically active substance is preferably a vinylsulfone group and its precursor, a halotriazine group, an epoxy group, a carboxylic acid active ester group, an aldehyde group, an isocyanate group, or an acetoacetyl group. Either. From the viewpoint of high reactivity in a low pH region, a carboxylic acid active ester group is more preferable.
カルボン酸活性エステルは反応性が高いため、水の存在下で徐々に加水分解が起こってしまう。それゆえ、カルボン酸活性エステルを含むモノマーを重合することでポリマーを合成することには困難が伴う。それゆえ、第一ステップとしてカルボン酸を含むポリマーを合成した後、このポリマーを表面に結合させる直前、あるいは表面に結合させた後に、カルボキシル基を活性エステルへと変換することが好ましい。 Since the carboxylic acid active ester has high reactivity, hydrolysis gradually occurs in the presence of water. Therefore, it is difficult to synthesize a polymer by polymerizing a monomer containing a carboxylic acid active ester. Therefore, after synthesizing a polymer containing a carboxylic acid as the first step, it is preferable to convert the carboxyl group to an active ester immediately before or after the polymer is bonded to the surface.
カルボキシル基を活性化するための方法は、公知の方法を利用することができる。例えば、水溶性カルボジイミドである1-(3-Dimethylaminopropyl)-3 ethylcarbodiimide（EDC）とN-Hydroxysuccinimide（NHS）により活性化する方法を利用でき、特願２００４−２３８３９６号に記載の方法（即ち、基板の表面に存在するカルボキシル基を特定の構造を有するウロニウム塩、ホスホニウム塩、又はトリアジン誘導体のいずれかの化合物を用いて活性化することによりカルボン酸アミド基を形成する方法）、並びに特願２００４−２７５０１２号に記載の方法（即ち、基板の表面に存在するカルボキシル基を、カルボジイミド誘導体又はその塩で活性化し、水酸基を有する含窒素ヘテロ芳香族化合物、電子吸引性基を有するフェノール誘導体又はチオール基を有する芳香族化合物のいずれかの化合物でエステルとした後に、アミンと反応させることによりカルボン酸アミド基を形成する方法）を好ましく用いることもできる。 As a method for activating the carboxyl group, a known method can be used. For example, a method of activation with water-soluble carbodiimide 1- (3-Dimethylaminopropyl) -3 ethylcarbodiimide (EDC) and N-Hydroxysuccinimide (NHS) can be used, and the method described in Japanese Patent Application No. 2004-238396 (ie, substrate) Of forming a carboxylic acid amide group by activating a carboxyl group present on the surface of the carboxylic acid group using any one of a uronium salt, a phosphonium salt, or a triazine derivative having a specific structure), and Japanese Patent Application No. 2004-2004 275012 (ie, a carboxyl group present on the surface of a substrate is activated with a carbodiimide derivative or a salt thereof, and a nitrogen-containing heteroaromatic compound having a hydroxyl group, a phenol derivative having an electron-withdrawing group, or a thiol group After making an ester with any of the aromatic compounds having Ri carboxylic acid amide groups may be preferably used a method) for forming a.
カルボキシル基の酸解離定数よりも低い酸解離定数を有するアニオン性基としては、硫酸エステル基、リン酸エステル基、スルホン酸基が好ましく、化学安定性の観点からスルホン酸基がより好ましい。 The anionic group having an acid dissociation constant lower than the acid dissociation constant of the carboxyl group is preferably a sulfate ester group, a phosphate ester group or a sulfonic acid group, and more preferably a sulfonic acid group from the viewpoint of chemical stability.
生理活性物質を化学的に固定化できる反応性基と、カルボキシル基の酸解離定数よりも低い酸解離定数を有するアニオン性基とを併せ持つ表面のいずれかであることが好ましい。 The surface is preferably either a surface having both a reactive group capable of chemically immobilizing a physiologically active substance and an anionic group having an acid dissociation constant lower than that of the carboxyl group.
自己組織化単分子膜について説明する。チオールやジスルフィド類などの硫黄化合物は金等の貴金属基板上に自発的に吸着し単分子サイズの超薄膜を与える。またその集合体は基板の結晶格子や吸着分子の分子構造に依存した配列を示すことから自己組織化膜と呼ばれている。自己組織化単分子膜としては、金表面のアルカンチオール類、ガラス表面のアルキルシラン類、シリコン表面のアルコール類等が挙げられる。アルカンチオール類の具体例としては、7−カルボキシ−１−ヘプタンチオール、10-カルボキシ-1-デカンチオール、4,4'-ジチオジブチリックアシッド、11-ヒドロキシ-1-ウンデカンチオール、11-アミノ-1-ウンデカンチオールなどを使用することができる。これら自己組織化単分子膜が、生理活性物質を化学的に固定化できる反応性基を有する化合物と、カルボキシル基の酸解離定数よりも低い酸解離定数を有するアニオン性基を有する化合物から形成される場合、生理活性物質を２次元表面にプレコンセントレーションし、結合することが可能となる。 The self-assembled monolayer will be described. Sulfur compounds such as thiols and disulfides spontaneously adsorb on a noble metal substrate such as gold to give an ultra-thin film of single molecular size. The aggregate is called a self-assembled film because it shows an arrangement depending on the crystal lattice of the substrate and the molecular structure of adsorbed molecules. Examples of the self-assembled monolayer include alkanethiols on the gold surface, alkylsilanes on the glass surface, alcohols on the silicon surface, and the like. Specific examples of alkanethiols include 7-carboxy-1-heptanethiol, 10-carboxy-1-decanethiol, 4,4′-dithiodibutyric acid, 11-hydroxy-1-undecanethiol, 11-amino- 1-undecanethiol and the like can be used. These self-assembled monolayers are formed from a compound having a reactive group capable of chemically immobilizing a physiologically active substance and a compound having an anionic group having an acid dissociation constant lower than that of a carboxyl group. The bioactive substance can be preconcentrated and bound to the two-dimensional surface.
本発明で用いることができる疎水性高分子化合物は、一般的には吸水性を有しないか吸水性が低い高分子化合物であり、水への溶解度（２５℃）は好ましくは１０％以下であり、より好ましくは１％以下であり、最も好ましくは０．１％以下である。 The hydrophobic polymer compound that can be used in the present invention is generally a polymer compound that has no water absorption or low water absorption, and its solubility in water (25 ° C.) is preferably 10% or less. More preferably, it is 1% or less, and most preferably 0.1% or less.
疎水性高分子としては、具体的には、ポリアクリル酸誘導体、ポリメタクリル酸誘導体、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリブタジエン、ポリメチルペンテン、シクロオレフィンポリマー、ポリスチレン（ＰＳ）、アクリロニトリル／ブタジエン／スチレン共重合体（ＡＢＳ）、スチレン／無水マレイン酸共重合体・ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリエチレンナフタレート（ＰＥＮ）、ナイロン６、ナイロン６６、酢酸セルロース（ＴＡＣ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、変性ポリフェニレンエーテル（ｍ−ＰＰＥ）、ポリフェニレンサルファイド（ＰＰＳ）、ポリエーテルケトン（ＰＥＫ）、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、ポリスルホン（ＰＳＦ）、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、ポリフェニレンサルファイド（ＰＰＳ）、液晶ポリマー（ＬＣＰ）などを挙げることができる。これら疎水性高分子表面に、生理活性物質を化学的に固定化できる反応性基と、カルボキシル基の酸解離定数よりも低い酸解離定数を有するアニオン性基とを導入した場合も、生理活性物質を２次元表面にプレコンセントレーションし、結合することが可能となる。 Specific examples of the hydrophobic polymer include polyacrylic acid derivatives, polymethacrylic acid derivatives, polyethylene (PE), polypropylene (PP), polybutadiene, polymethylpentene, cycloolefin polymer, polystyrene (PS), acrylonitrile / butadiene. / Styrene copolymer (ABS), styrene / maleic anhydride copolymer / polyvinyl chloride (PVC), polyethylene terephthalate (PET), polyethylene naphthalate (PEN), nylon 6, nylon 66, cellulose acetate (TAC), Polycarbonate (PC), modified polyphenylene ether (m-PPE), polyphenylene sulfide (PPS), polyether ketone (PEK), polyether ether ketone (PEEK), polysulfone (PSF), polyether Sulfone (PES), polyphenylene sulfide (PPS), and the like a liquid crystal polymer (LCP). Even when a reactive group capable of chemically immobilizing a physiologically active substance and an anionic group having an acid dissociation constant lower than the acid dissociation constant of a carboxyl group are introduced on the surface of these hydrophobic polymers, the physiologically active substance Can be preconcentrated and bonded to a two-dimensional surface.
疎水性高分子化合物の基板へのコーティングは常法によって行うことができ、例えば、スピン塗布、エアナイフ塗布、バー塗布、ブレード塗布、スライド塗布、カーテン塗布、さらにはスプレー法、蒸着法、キャスト法、浸漬法等によって行うことができる。 Coating of the hydrophobic polymer compound on the substrate can be performed by a conventional method, for example, spin coating, air knife coating, bar coating, blade coating, slide coating, curtain coating, spraying, vapor deposition, casting, It can be performed by an immersion method or the like.
水溶性高分子としては、デキストラン誘導体、デンプン誘導体、セルロース誘導体、ゼラチン等の天然高分子、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド誘導体、ポリメチルビニルエーテル等の合成高分子等が挙げられる。先に記載した疎水性高分子も、アニオン性基の導入率が高い場合は水溶性高分子となる。バイオセンサーへの応用との観点からは、水溶性天然高分子が好ましく、デキストラン誘導体が特に好ましい。 Examples of the water-soluble polymer include natural polymers such as dextran derivatives, starch derivatives, cellulose derivatives, and gelatin, and synthetic polymers such as polyvinyl alcohol, polyethylene glycol, polyvinyl pyrrolidone, polyacrylamide derivatives, and polymethyl vinyl ether. The hydrophobic polymer described above also becomes a water-soluble polymer when the introduction rate of the anionic group is high. From the viewpoint of application to a biosensor, a water-soluble natural polymer is preferable, and a dextran derivative is particularly preferable.
表面に結合された水溶性高分子は３次元ヒドロゲルを形成する。この３次元ヒドロゲルに反応性官能基が導入された場合、生理活性物質を３次元的に固定化することが可能となることが特許文献１に記載されている。３次元的な固定化は２次元表面への固定化と比較して、生理活性物質の結合量が多くなるため、バイオセンサー用途を考えた場合、極めて有利である。このような観点から本発明では、生理活性物質を化学的に固定化できる反応性基と、カルボキシル基の酸解離定数よりも低い酸解離定数を有するアニオン性基を併せ持つ水溶性高分子が結合した表面、すなわち生理活性物質を化学的に固定化できる反応性基と、カルボキシル基の酸解離定数よりも低い酸解離定数を有するアニオン性基を併せ持つ３次元ヒドロゲルにより、生理活性物質を固定することが好ましい。
The water-soluble polymer bound to the surface forms a three-dimensional hydrogel.
また、本発明で用いることができる疎水性高分子化合物及び水溶性高分子は、合成高分子化合物でもよいし、天然高分子又はその誘導体でもよい。 The hydrophobic polymer compound and water-soluble polymer that can be used in the present invention may be a synthetic polymer compound, a natural polymer, or a derivative thereof.
本発明に用いられる、アミノ基と共有結合し得る反応性官能基（以下、反応性官能基と記載）と、カルボン酸よりもｐKaの低いアニオン性基（以下、アニオン性基と記載）とを有するポリマーを製造するに当たり、重合方法については特に制約はないが、例えば縮重合法によって製造されていてもよく、またエチレン性不飽和結合を有する化合物を用いてラジカル重合、アニオン重合等の方法によって製造されていてもよい。さらには天然高分子（例えば、デキストラン、セルロースがごとき天然多糖類、ゼラチンがごときポリアミノ酸等）、又はその誘導体から合成されても良い。 A reactive functional group (hereinafter referred to as a reactive functional group) that can be covalently bonded to an amino group and an anionic group having a lower pKa than a carboxylic acid (hereinafter referred to as an anionic group) used in the present invention There is no particular limitation on the polymerization method in producing the polymer having, but for example, it may be produced by a condensation polymerization method, or by a method such as radical polymerization or anion polymerization using a compound having an ethylenically unsaturated bond. It may be manufactured. Furthermore, it may be synthesized from natural polymers (for example, dextran, natural polysaccharides such as cellulose, polyamino acids such as gelatin), or derivatives thereof.
本発明に用いられるポリマーに対する官能基の導入方法についても特に制約はなく、反応性官能基を有するモノマーとアニオン性基を有するモノマーとの共重合反応を行って重合体を製造してもよいし、予め重合体を製造した後にいわゆる高分子反応により、前記の反応性官能基とアニオン性基を導入してもよい。さらには反応性官能基の前駆体を有するモノマー化合物とアニオン性基を用いて共重合反応を行い、その後に適切な方法によって反応性官能基を生成させる方法も有効である。本発明に用いられるポリマーは、反応性官能基を有するモノマー成分とアニオン性基を有するモノマー成分以外に、他のモノマー成分が共重合されていても良い。 The method for introducing a functional group into the polymer used in the present invention is not particularly limited, and a polymer may be produced by carrying out a copolymerization reaction between a monomer having a reactive functional group and a monomer having an anionic group. The reactive functional group and the anionic group may be introduced by a so-called polymer reaction after a polymer is produced in advance. Furthermore, a method of carrying out a copolymerization reaction using a monomer compound having a precursor of a reactive functional group and an anionic group and then generating a reactive functional group by an appropriate method is also effective. In the polymer used in the present invention, in addition to the monomer component having a reactive functional group and the monomer component having an anionic group, other monomer components may be copolymerized.
本発明に用いられるアニオン性基を有するモノマーとしては、ビニルスルホン酸、メタリルスルホン酸、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸、スルホエチルメタクリレート、スチレンスルホン酸、２−（ホスホノエチルオキシ）エチルメタクリレート等が挙げられる。 Examples of the monomer having an anionic group used in the present invention include vinyl sulfonic acid, methallyl sulfonic acid, 2-acrylamido-2-methylpropane sulfonic acid, sulfoethyl methacrylate, styrene sulfonic acid, and 2- (phosphonoethyloxy). Examples include ethyl methacrylate.
本発明に用いられる反応性官能基を有するモノマーに関しては、特願２００５−４６９７７号に記載の化合物を好ましく用いることが出来る。具体的には、以下に示す化合物が代表的な例である。 With respect to the monomer having a reactive functional group used in the present invention, the compounds described in Japanese Patent Application No. 2005-46977 can be preferably used. Specifically, the following compounds are typical examples.
本発明に用いられる、カルボン酸活性エステルの前駆体である、カルボキシル基を有するモノマーとしては、アクリル酸、メタクリル酸、４−ビニル安息香酸等が挙げられる。 Examples of the monomer having a carboxyl group that is a precursor of the carboxylic acid active ester used in the present invention include acrylic acid, methacrylic acid, 4-vinylbenzoic acid and the like.
本発明に用いられる、反応性官能基を有するモノマー成分とアニオン性基を有するモノマー成分以外の、他のモノマー成分としては、以下のモノマーが挙げられる。 Examples of the other monomer components other than the monomer component having a reactive functional group and the monomer component having an anionic group used in the present invention include the following monomers.
アクリル酸エステル類、メタクリル酸エステル類、エチレン性不飽和カルボン酸のアミド類：アクリルアミド、メタクリルアミド、Ｎ−アクリロイルモルホリン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（もしくはその塩）等、芳香族単量体：スチレン、ビニルトルエン、ｐ−ｔ−ブチルスチレン、ビニルナフタレン等、その他のビニル単量体：エチレン、プロピレン、塩化ビニル、塩化ビニリデン、トリフロロエチレン、トリフロロクロロエチレン、酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル、ビニルアルコール、Ｎ−ビニルピロリドン、Ｎ−ビニルアセトアミド、アクリロニトリル、メタクリロニトリル等。ノニオン性基を有するモノマー：２−ヒドロキシエチルアクリレート、２−ヒドロキシエチルメタクリレート、ヒドロキシプロピルアクリレート、ヒドロキシプロピルメタクリレート、２−ヒドロキシ−３−クロロプロピルアクリレート、β−ヒドロキシエチル−β′−アクリロイルオキシエチルフタレート、１，４−ブチレングリコールモノアクリレート、ヒドロキシスチレン、アリルアルコール、メタアリルアルコール、イソプロペニルアルコール、１−ブテニルアルコール等。両性イオン基を有するモノマー： [２−(メタクリロイルオキシ)エチル] ジメチル−（３−スルホプロピル）アンモニウムヒドロキシド 、［２−（メタクリロイルオキシ）エチル］ホスホリルコリン等。 Acrylic esters, methacrylic esters, amides of ethylenically unsaturated carboxylic acids: acrylamide, methacrylamide, N-acryloylmorpholine, N, N-dimethylacrylamide, 2-acrylamido-2-methylpropanesulfonic acid (or its) Salt), aromatic monomers: styrene, vinyl toluene, pt-butyl styrene, vinyl naphthalene, etc. Other vinyl monomers: ethylene, propylene, vinyl chloride, vinylidene chloride, trifluoroethylene, trifluorochloro Ethylene, vinyl acetate, vinyl propionate, vinyl alcohol, N-vinylpyrrolidone, N-vinylacetamide, acrylonitrile, methacrylonitrile and the like. Monomers having a nonionic group: 2-hydroxyethyl acrylate, 2-hydroxyethyl methacrylate, hydroxypropyl acrylate, hydroxypropyl methacrylate, 2-hydroxy-3-chloropropyl acrylate, β-hydroxyethyl-β′-acryloyloxyethyl phthalate, 1,4-butylene glycol monoacrylate, hydroxystyrene, allyl alcohol, methallyl alcohol, isopropenyl alcohol, 1-butenyl alcohol and the like. Monomers having zwitterionic groups: [2- (methacryloyloxy) ethyl] dimethyl- (3-sulfopropyl) ammonium hydroxide, [2- (methacryloyloxy) ethyl] phosphorylcholine and the like.
本発明に用いられる合成高分子化合物の具体例としては、例えば化合物１が挙げられる。化合物１は銀塩写真用の高分子硬膜剤として公知であり、その使用法については、例えば特開２００１−２６４９４８号に開示されている。このような高分子硬膜剤が結合された表面は、本発明として好ましく用いることが可能である。化合物１は、特開昭６０−６１７４２号に記載の方法で合成される。特開昭６０−６１７４２号に記載のＰ−１、Ｐ−４、Ｐ−６、Ｐ−１０、Ｐ−１５、Ｐ−１６、Ｐ−２１もまた、好ましく用いることが出来る。
Specific examples of the synthetic polymer compound used in the present invention include
本発明に用いられる天然高分子又はその誘導体として、デキストラン、セルロース、グアーガム、スターチ、ヒドロキシエチルデキストラン、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシエチルグアーガム、ヒドロキシエチルスターチ、メチルデキストラン、メチルセルロース、メチルグアーガム、メチルスターチ、エチルデキストラン、エチルセルロース、エチルグアーガム、エチルスターチ、ヒドロキシプロピルデキストラン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルグアーガム、ヒドロキシプロピルスターチ、ヒドロキシエチルメチルセルロース、ヒドロキシエチルメチルグアーガム、ヒドロキシエチルメチルスターチ、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルグアーガム及びヒドロキシプロピルメチルスターチ等が挙げられ、なかでもデキストラン、ヒドロキシエチルデキストラン、ヒドロキシプロピルデキストラン、セルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースが好ましい。また、これらの多糖類のヒドロキシエチル基、ヒドロキシプロピル基等の置換基は、単一の置換基で置換されたものでもよいし、複数の置換基で置換されたものでもよく、その構成単糖残基当たりの置換度は０．１〜３．０、特に０．５〜１．５が好ましい。また、これら多糖類又はその誘導体の重量平均分子量は、１万〜1000万、特に10万〜100万の範囲のものが好ましい。 As natural polymers or derivatives thereof used in the present invention, dextran, cellulose, guar gum, starch, hydroxyethyl dextran, hydroxyethyl cellulose, hydroxyethyl guar gum, hydroxyethyl starch, methyl dextran, methyl cellulose, methyl guar gum, methyl starch, ethyl dextran, Ethyl cellulose, ethyl guar gum, ethyl starch, hydroxypropyl dextran, hydroxypropyl cellulose, hydroxypropyl guar gum, hydroxypropyl starch, hydroxyethyl methyl cellulose, hydroxyethyl methyl guar gum, hydroxyethyl methyl starch, hydroxypropyl methyl cellulose, hydroxypropyl methyl guar gum and hydroxypropyl Chirusutachi the like. Among them dextran, hydroxyethyl dextran, hydroxypropyl dextran, cellulose, hydroxyethyl cellulose, hydroxypropyl cellulose are preferred. Moreover, the substituents such as hydroxyethyl group and hydroxypropyl group of these polysaccharides may be substituted with a single substituent or may be substituted with a plurality of substituents, and the constituent monosaccharides thereof The degree of substitution per residue is preferably 0.1 to 3.0, particularly preferably 0.5 to 1.5. The weight average molecular weight of these polysaccharides or derivatives thereof is preferably 10,000 to 10,000,000, particularly 100,000 to 1,000,000.
天然高分子又はその誘導体に対しアニオン性基を導入する方法は、公知の方法を利用することができる。例えば多糖類にスルホン酸を導入する場合、アルカリ条件下でビニルスルホン酸、３−ハロ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸、３−ハロプロパンスルホン酸、１，３−プロパンサルトン、１，４−ブタンサルトン、１，３−ブタンサルトン等を反応させることで、スルホン酸基を導入することが可能となる。ピリジン中で多糖類とクロルスルホン酸とを反応させることで、硫酸エステルを導入することが可能となる。ピリジン中で多糖類とオキシ塩化リンとを反応させることで、リン酸エステルを導入することが可能となる。アニオン性基を有する天然高分子は、市販の化合物を用いることも可能である。このような化合物としては例えば、デキストラン硫酸であるＤＳ−Ｓ１８、ＤＳ−Ｓ５、ＤＳ−５００等（名糖産業社製）を挙げることができる。これらのアニオン性基を有する天然高分子に対し、反応性基あるいはその前駆体（例えばカルボキシル基）を導入することで、本発明に使用可能なポリマーとなる。 As a method for introducing an anionic group into a natural polymer or a derivative thereof, a known method can be used. For example, when sulfonic acid is introduced into a polysaccharide, vinyl sulfonic acid, 3-halo-2-hydroxypropane sulfonic acid, 3-halopropane sulfonic acid, 1,3-propane sultone, 1,4-butane sultone under alkaline conditions It is possible to introduce a sulfonic acid group by reacting 1,3-butanesultone or the like. By reacting a polysaccharide and chlorosulfonic acid in pyridine, it is possible to introduce a sulfate ester. It is possible to introduce a phosphate ester by reacting a polysaccharide with phosphorus oxychloride in pyridine. A commercially available compound can also be used as the natural polymer having an anionic group. Examples of such a compound include dextran sulfate DS-S18, DS-S5, DS-500 and the like (manufactured by Meito Sangyo Co., Ltd.). By introducing a reactive group or a precursor thereof (for example, a carboxyl group) into a natural polymer having these anionic groups, a polymer that can be used in the present invention is obtained.
カルボキシル基を有する多糖類であるカルボキシメチルデキストラン、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸等に対し、上記の方法でアニオン性基を導入することによっても、本発明に使用可能なポリマーを得ることが可能である。カルボキシル基を有する多糖類は、市販の化合物を用いることが可能であり、具体的には、カルボキシメチルデキストランであるＣＭＤ、ＣＭＤ−Ｌ、ＣＭＤ−Ｄ４０（名糖産業社製）、カルボキシメチルセルロースナトリウム（和光純薬社製）、アルギン酸ナトリウム（和光純薬社製）、等を挙げることが出来る。これらのカルボキシル基を有する天然高分子に対し、アニオン性気を導入することで、本発明に使用可能なポリマーとなる。アニオン性基を導入する方法は、上記反応を用いることが可能であり、また、カルボキシル基の一部を活性化し、２−アミノエタン−１−スルホン酸（タウリン）、２−アミノエチルジハイドロジェンホスフェート、２−アミノエチルハイドロジェンスルフェート等と反応させることで、それぞれスルホン酸、硫酸エステル、リン酸エステルを導入することが可能となる。カルボキシル基と活性化剤とのモル比、反応時間、反応回数により、これらのアニオン性基とカルボキシル基との割合を制御可能である。 A polymer that can be used in the present invention can also be obtained by introducing an anionic group into a carboxymethyl dextran, carboxymethyl cellulose, alginic acid or the like, which is a polysaccharide having a carboxyl group, by the above method. As the polysaccharide having a carboxyl group, a commercially available compound can be used. Specifically, CMD, CMD-L, CMD-D40 (manufactured by Meisho Sangyo Co., Ltd.), sodium carboxymethylcellulose ( Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), sodium alginate (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), and the like. By introducing anionicity into these natural polymers having a carboxyl group, a polymer that can be used in the present invention is obtained. The method of introducing an anionic group can use the above-mentioned reaction, and also activates a part of the carboxyl group to give 2-aminoethane-1-sulfonic acid (taurine), 2-aminoethyl dihydrogen phosphate. By reacting with 2-aminoethyl hydrogen sulfate or the like, it becomes possible to introduce sulfonic acid, sulfuric acid ester and phosphoric acid ester, respectively. The ratio of these anionic groups and carboxyl groups can be controlled by the molar ratio of the carboxyl group to the activator, the reaction time, and the number of reactions.
カルボキシル基と硫酸エステル基を有する多糖類は、本発明にそのまま用いることも可能である。このような多糖類としては、コンドロイチンＣ硫酸（和光純薬社製）やヘパリンナトリウム（和光純薬社製）を挙げることができる。 The polysaccharide having a carboxyl group and a sulfate group can be used as it is in the present invention. Examples of such polysaccharides include chondroitin C sulfuric acid (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and heparin sodium (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
天然高分子又はその誘導体に対し反応性官能基を導入する方法は、公知の方法を利用することができる。例えば多糖類にアセトアセチル基を導入する場合、多糖類をジメチルホルムアミド等の良溶媒に溶解した後にジケテンガスを添加する方法、多糖類粉末にジケテンガスを添加する方法、多糖類とアセト酢酸エステルを溶液中で反応させエステル交換する方法、などが用いられる。他の反応性官能基の導入法に関しては、特願２００５−４６９７７号に記載の方法を好ましく用いることができる。 As a method for introducing a reactive functional group into a natural polymer or a derivative thereof, a known method can be used. For example, when introducing an acetoacetyl group into a polysaccharide, a method of adding diketene gas after dissolving the polysaccharide in a good solvent such as dimethylformamide, a method of adding diketene gas to the polysaccharide powder, and a solution of polysaccharide and acetoacetate in solution And a method of transesterification and the like. Regarding the method for introducing other reactive functional groups, the method described in Japanese Patent Application No. 2005-46977 can be preferably used.
本発明によれば、上記したような生理活性物質を化学的に固定化できる反応性基と、カルボキシル基の酸解離定数よりも低い酸解離定数を有するアニオン性基とを併せ持つ表面に、生理活性物質含有液を接触させることを含む、生理活性物質の固定化方法が提供される。本発明の上記固定化方法においては、表面にアニオン性基が導入されていることにより、カルボキシル基の酸解離定数（ｐＫａ＝３．５）よりも低いｐＨを有する生理活性物質含有液を接触させた場合であっても、静電引力によって生理活性物質が測定チップの表面上に濃縮されるプレコンセントレーション効果を得ることができる。 According to the present invention, a surface having both a reactive group capable of chemically immobilizing a physiologically active substance as described above and an anionic group having an acid dissociation constant lower than the acid dissociation constant of the carboxyl group is provided on the surface. Provided is a method for immobilizing a physiologically active substance, which comprises contacting a substance-containing liquid. In the above immobilization method of the present invention, a biologically active substance-containing liquid having a pH lower than the acid dissociation constant of the carboxyl group (pKa = 3.5) is brought into contact with the surface by introducing an anionic group. Even in this case, it is possible to obtain a preconcentration effect in which the physiologically active substance is concentrated on the surface of the measurement chip by electrostatic attraction.
本発明で言うバイオセンサーとは最も広義に解釈され、生体分子間の相互作用を電気的信号等の信号に変換して、対象となる物質を測定・検出するセンサーを意味する。通常のバイオセンサーは、検出対象とする化学物質を認識するレセプター部位と、そこに発生する物理的変化又は化学的変化を電気信号に変換するトランスデューサー部位とから構成される。生体内には、互いに親和性のある物質として、酵素／基質、酵素／補酵素、抗原／抗体、ホルモン／レセプターなどがある。バイオセンサーでは、これら互いに親和性のある物質の一方を基板に固定化して分子認識物質として用いることによって、対応させるもう一方の物質を選択的に計測するという原理を利用している。 The biosensor referred to in the present invention is interpreted in the broadest sense, and means a sensor that measures and detects a target substance by converting an interaction between biomolecules into a signal such as an electrical signal. A normal biosensor is composed of a receptor site for recognizing a chemical substance to be detected and a transducer site for converting a physical change or chemical change generated therein into an electrical signal. In the living body, there are enzymes / substrates, enzymes / coenzymes, antigens / antibodies, hormones / receptors and the like as substances having affinity for each other. Biosensors use the principle that one of these substances having affinity with each other is immobilized on a substrate and used as a molecular recognition substance, thereby selectively measuring the other substance to be matched.
本発明のバイオセンサーでは、金属表面又は金属膜を基板として用いることができる。金属表面あるいは金属膜を構成する金属としては、例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用を考えた場合、表面プラズモン共鳴が生じ得るようなものであれば特に限定されない。好ましくは金、銀、銅、アルミニウム、白金等の自由電子金属が挙げられ、特に金が好ましい。それらの金属は単独又は組み合わせて使用することができる。また、上記基板への付着性を考慮して、基板と金属からなる層との間にクロム等からなる介在層を設けてもよい。 In the biosensor of the present invention, a metal surface or a metal film can be used as a substrate. The metal constituting the metal surface or metal film is not particularly limited as long as surface plasmon resonance can occur when, for example, a surface plasmon resonance biosensor is considered. Preferred examples include free electron metals such as gold, silver, copper, aluminum, and platinum, with gold being particularly preferred. These metals can be used alone or in combination. In consideration of adhesion to the substrate, an intervening layer made of chromium or the like may be provided between the substrate and the layer made of metal.
金属膜の膜厚は任意であるが、例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用を考えた場合、０．１ｎｍ以上５００ｎｍ以下であるのが好ましく、特に１ｎｍ以上２００ｎｍ以下であるのが好ましい。５００ｎｍを超えると、媒質の表面プラズモン現象を十分検出することができない。また、クロム等からなる介在層を設ける場合、その介在層の厚さは、０．１ｎｍ以上１０ｎｍ以下であるのが好ましい。 Although the thickness of the metal film is arbitrary, for example, when considering use for a surface plasmon resonance biosensor, the thickness is preferably 0.1 nm to 500 nm, particularly preferably 1 nm to 200 nm. If it exceeds 500 nm, the surface plasmon phenomenon of the medium cannot be sufficiently detected. Moreover, when providing the intervening layer which consists of chromium etc., it is preferable that the thickness of the intervening layer is 0.1 to 10 nm.
金属膜の形成は常法によって行えばよく、例えば、スパッタ法、蒸着法、イオンプレーティング法、電気めっき法、無電解めっき法等によって行うことができる。 The metal film may be formed by a conventional method, for example, sputtering, vapor deposition, ion plating, electroplating, electroless plating, or the like.
金属膜は好ましくは基板上に配置されている。ここで、「基板上に配置される」とは、金属膜が基板上に直接接触するように配置されている場合のほか、金属膜が基板に直接接触することなく、他の層を介して配置されている場合をも含む意味である。本発明で使用することができる基板としては例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用を考えた場合、一般的にはＢＫ７等の光学ガラス、あるいは合成樹脂、具体的にはポリメチルメタクリレート、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、シクロオレフィンポリマーなどのレーザー光に対して透明な材料からなるものが使用できる。このような基板は、好ましくは、偏光に対して異方性を示さずかつ加工性の優れた材料が望ましい。 The metal film is preferably disposed on the substrate. Here, “arranged on the substrate” means that the metal film is arranged so as to be in direct contact with the substrate, and that the metal film is not directly in contact with the substrate, but through other layers. This also includes the case where they are arranged. As a substrate that can be used in the present invention, for example, in the case of a surface plasmon resonance biosensor, generally, optical glass such as BK7, or synthetic resin, specifically polymethyl methacrylate, polyethylene terephthalate, polycarbonate A material made of a material transparent to laser light such as a cycloolefin polymer can be used. Such a substrate is preferably made of a material that does not exhibit anisotropy with respect to polarized light and has excellent processability.
上記のようにして得られたバイオセンサーにおいては、生理活性物質を化学的に固定化できる反応性基を介して生理活性物質を共有結合させることによって、金属表面又は金属膜に生理活性物質を固定化することができる。 In the biosensor obtained as described above, the physiologically active substance is immobilized on the metal surface or metal film by covalently bonding the physiologically active substance via a reactive group capable of chemically immobilizing the physiologically active substance. Can be
本発明におけるバイオセンサー表面に対し生理活性物質を接触させることにより、バイオセンサーの表面に存在する生理活性物質を化学的に固定化できる反応性基と生理活性物質とが共有結合するため、バイオセンサーに生理活性物質を固定化することが可能となる。 Since the bioactive substance is brought into contact with the biosensor surface in the present invention, the bioactive substance is covalently bonded to the reactive group capable of chemically immobilizing the bioactive substance present on the biosensor surface. It is possible to immobilize a physiologically active substance on the surface.
本発明において固定される生理活性物質としては、測定対象物と相互作用するものであれば特に限定されず、例えば免疫蛋白質、酵素、微生物、核酸、低分子有機化合物、非免疫蛋白質、免疫グロブリン結合性蛋白質、糖結合性蛋白質、糖を認識する糖鎖、脂肪酸もしくは脂肪酸エステル、あるいはリガンド結合能を有するポリペプチドもしくはオリゴペプチドなどが挙げられる。 The physiologically active substance immobilized in the present invention is not particularly limited as long as it interacts with the measurement object. For example, immune proteins, enzymes, microorganisms, nucleic acids, low molecular organic compounds, non-immune proteins, immunoglobulin binding And a sugar chain, a sugar chain that recognizes sugar, a fatty acid or a fatty acid ester, or a polypeptide or oligopeptide having a ligand binding ability.
免疫蛋白質としては、測定対象物を抗原とする抗体やハプテンなどを例示することができる。抗体としては、種々の免疫グロブリン、即ちＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤを使用することができる。具体的には、測定対象物がヒト血清アルブミンであれば、抗体として抗ヒト血清アルブミン抗体を使用することができる。また、農薬、殺虫剤、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、抗生物質、麻薬、コカイン、ヘロイン、クラック等を抗原とする場合には、例えば抗アトラジン抗体、抗カナマイシン抗体、抗メタンフェタミン抗体、あるいは病原性大腸菌の中でＯ抗原26、86、55、111 、157 などに対する抗体等を使用することができる。 Examples of immunity proteins include antibodies and haptens that use the measurement target as an antigen. As the antibody, various immunoglobulins, that is, IgG, IgM, IgA, IgE, and IgD can be used. Specifically, when the measurement target is human serum albumin, an anti-human serum albumin antibody can be used as the antibody. In addition, when using pesticides, insecticides, methicillin-resistant Staphylococcus aureus, antibiotics, narcotics, ***e, heroin, cracks, etc. as antigens, for example, anti-atrazine antibodies, anti-kanamycin antibodies, anti-methamphetamine antibodies, or pathogenic E. coli Among them, antibodies against O antigens 26, 86, 55, 111, 157 and the like can be used.
酵素としては、測定対象物又は測定対象物から代謝される物質に対して活性を示すものであれば、特に限定されることなく、種々の酵素、例えば酸化還元酵素、加水分解酵素、異性化酵素、脱離酵素、合成酵素等を使用することができる。具体的には、測定対象物がグルコースであれば、グルコースオキシダーゼを、測定対象物がコレステロールであれば、コレステロールオキシダーゼを使用することができる。また、農薬、殺虫剤、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、抗生物質、麻薬、コカイン、ヘロイン、クラック等を測定対象物とする場合には、それらから代謝される物質と特異的反応を示す、例えばアセチルコリンエステラーゼ、カテコールアミンエステラーゼ、ノルアドレナリンエステラーゼ、ドーパミンエステラーゼ等の酵素を使用することができる。 The enzyme is not particularly limited as long as it shows activity against the measurement object or a substance metabolized from the measurement object, and various enzymes such as oxidoreductase, hydrolase, isomerase , A desorbing enzyme, a synthesizing enzyme and the like can be used. Specifically, if the measurement object is glucose, glucose oxidase can be used, and if the measurement object is cholesterol, cholesterol oxidase can be used. Also, when pesticides, insecticides, methicillin-resistant Staphylococcus aureus, antibiotics, narcotics, ***e, heroin, cracks, etc. are used as measurement objects, they exhibit a specific reaction with substances metabolized from them, such as acetylcholinesterase. Enzymes such as catecholamine esterase, noradrenaline esterase and dopamine esterase can be used.
微生物としては、特に限定されることなく、大腸菌をはじめとする種々の微生物を使用することができる。
核酸としては、測定の対象とする核酸と相補的にハイブリダイズするものを使用することができる。核酸は、ＤＮＡ（ｃＤＮＡを含む）、ＲＮＡのいずれも使用できる。ＤＮＡの種類は特に限定されず、天然由来のＤＮＡ、遺伝子組換え技術により調製した組換えＤＮＡ、又は化学合成ＤＮＡの何れでもよい。
低分子有機化合物としては通常の有機化学合成の方法で合成することができる任意の化合物が挙げられる。
The microorganism is not particularly limited, and various microorganisms including Escherichia coli can be used.
As the nucleic acid, one that hybridizes complementarily with the nucleic acid to be measured can be used. As the nucleic acid, either DNA (including cDNA) or RNA can be used. The type of DNA is not particularly limited, and may be any of naturally derived DNA, recombinant DNA prepared by gene recombination technology, or chemically synthesized DNA.
Examples of the low molecular weight organic compound include any compound that can be synthesized by an ordinary organic chemical synthesis method.
非免疫蛋白質としては、特に限定されることなく、例えばアビジン（ストレプトアビジン）、ビオチン又はレセプターなどを使用できる。
免疫グロブリン結合性蛋白質としては、例えばプロテインＡあるいはプロテインＧ、リウマチ因子（ＲＦ）等を使用することができる。
糖結合性蛋白質としては、レクチン等が挙げられる。
脂肪酸あるいは脂肪酸エステルとしては、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、ステアリン酸エチル、アラキジン酸エチル、ベヘン酸エチル等が挙げられる。
The non-immune protein is not particularly limited, and for example, avidin (streptavidin), biotin or a receptor can be used.
As the immunoglobulin-binding protein, for example, protein A or protein G, rheumatoid factor (RF) and the like can be used.
Examples of sugar-binding proteins include lectins.
Examples of the fatty acid or fatty acid ester include stearic acid, arachidic acid, behenic acid, ethyl stearate, ethyl arachidate, and ethyl behenate.
上記のようにして生理活性物質を固定化したバイオセンサーは、当該生理活性物質と相互作用する物質の検出及び／又は測定のために使用することができる。 The biosensor on which a physiologically active substance is immobilized as described above can be used for detection and / or measurement of a substance that interacts with the physiologically active substance.
本発明では、センサー用基板に固定化されている生理活性物質と被験物質との相互作用を非電気化学的方法により検出及び／又は測定することが好ましい。非電気化学的方法としては、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定技術、水晶発振子マイクロバランス（ＱＣＭ）測定技術、金のコロイド粒子から超微粒子までの機能化表面を使用した測定技術などが挙げられる。 In the present invention, it is preferable to detect and / or measure the interaction between the physiologically active substance immobilized on the sensor substrate and the test substance by a non-electrochemical method. Non-electrochemical methods include surface plasmon resonance (SPR) measurement technology, quartz crystal microbalance (QCM) measurement technology, measurement technology using functionalized surfaces from gold colloidal particles to ultrafine particles.
本発明の好ましい態様によれば、本発明のバイオセンサーは、例えば、透明基板上に配置される金属膜を備えていることを特徴とする表面プラズモン共鳴用バイオセンサーとして用いることができる。 According to a preferred aspect of the present invention, the biosensor of the present invention can be used as a surface plasmon resonance biosensor characterized by including a metal film disposed on a transparent substrate, for example.
表面プラズモン共鳴用バイオセンサーとは、表面プラズモン共鳴バイオセンサーに使用されるバイオセンサーであって、該センサーより照射された光を透過及び反射する部分、並びに生理活性物質を固定する部分とを含む部材を言い、該センサーの本体に固着されるものであってもよく、また脱着可能なものであってもよい。 The surface plasmon resonance biosensor is a biosensor used in the surface plasmon resonance biosensor, and includes a part that transmits and reflects light emitted from the sensor, and a part that fixes a physiologically active substance. And may be fixed to the main body of the sensor or may be removable.
表面プラズモン共鳴の現象は、ガラス等の光学的に透明な物質と金属薄膜層との境界から反射された単色光の強度が、金属の出射側にある試料の屈折率に依存することによるものであり、従って、反射された単色光の強度を測定することにより、試料を分析することができる。 The phenomenon of surface plasmon resonance is due to the fact that the intensity of monochromatic light reflected from the boundary between an optically transparent substance such as glass and the metal thin film layer depends on the refractive index of the sample on the metal exit side. Yes, so the sample can be analyzed by measuring the intensity of the reflected monochromatic light.
表面プラズモンが光波によって励起される現象を利用して、被測定物質の特性を分析する表面プラズモン測定装置としては、Kretschmann配置と称される系を用いるものが挙げられる（例えば特開平６−１６７４４３号公報参照）。上記の系を用いる表面プラズモン測定装置は基本的に、例えばプリズム状に形成された誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成されて試料液などの被測定物質に接触させられる金属膜と、光ビームを発生させる光源と、上記光ビームを誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射条件が得られるように種々の角度で入射させる光学系と、上記界面で全反射した光ビームの強度を測定して表面プラズモン共鳴の状態、つまり全反射減衰の状態を検出する光検出手段とを備えてなるものである。 As a surface plasmon measuring device for analyzing the characteristics of a substance to be measured using a phenomenon in which surface plasmons are excited by light waves, there is an apparatus using a system called Kretschmann arrangement (for example, JP-A-6-167443). See the official gazette). A surface plasmon measuring apparatus using the above system basically includes a dielectric block formed in a prism shape, for example, and a metal film formed on one surface of the dielectric block and brought into contact with a substance to be measured such as a sample liquid. A light source that generates a light beam; an optical system that causes the light beam to enter the dielectric block at various angles so that a total reflection condition is obtained at an interface between the dielectric block and the metal film; and It comprises light detecting means for detecting the surface plasmon resonance state, that is, the state of total reflection attenuation by measuring the intensity of the light beam totally reflected at the interface.
なお上述のように種々の入射角を得るためには、比較的細い光ビームを入射角を変化させて上記界面に入射させてもよいし、あるいは光ビームに種々の角度で入射する成分が含まれるように、比較的太い光ビームを上記界面に収束光状態であるいは発散光状態で入射させてもよい。前者の場合は、入射した光ビームの入射角の変化に従って、反射角が変化する光ビームを、上記反射角の変化に同期して移動する小さな光検出器によって検出したり、反射角の変化方向に沿って延びるエリアセンサによって検出することができる。一方後者の場合は、種々の反射角で反射した各光ビームを全て受光できる方向に延びるエリアセンサによって検出することができる。 In order to obtain various incident angles as described above, a relatively thin light beam may be incident on the interface by changing the incident angle, or a component incident on the light beam at various angles is included. As described above, a relatively thick light beam may be incident on the interface in a convergent light state or a divergent light state. In the former case, a light beam whose reflection angle changes according to the change in the incident angle of the incident light beam is detected by a small photodetector that moves in synchronization with the change in the reflection angle, or the direction in which the reflection angle changes Can be detected by an area sensor extending along the line. On the other hand, in the latter case, it can be detected by an area sensor extending in a direction in which each light beam reflected at various reflection angles can be received.
上記構成の表面プラズモン測定装置において、光ビームを金属膜に対して全反射角以上の特定入射角で入射させると、該金属膜に接している被測定物質中に電界分布をもつエバネッセント波が生じ、このエバネッセント波によって金属膜と被測定物質との界面に表面プラズモンが励起される。エバネッセント光の波数ベクトルが表面プラズモンの波数と等しくて波数整合が成立しているとき、両者は共鳴状態となり、光のエネルギーが表面プラズモンに移行するので、誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射した光の強度が鋭く低下する。この光強度の低下は、一般に上記光検出手段により暗線として検出される。なお上記の共鳴は、入射ビームがｐ偏光のときにだけ生じる。したがって、光ビームがｐ偏光で入射するように予め設定しておく必要がある。 In the surface plasmon measuring apparatus having the above configuration, when a light beam is incident on a metal film at a specific incident angle that is greater than the total reflection angle, an evanescent wave having an electric field distribution is generated in the measured substance in contact with the metal film. The evanescent wave excites surface plasmons at the interface between the metal film and the substance to be measured. When the wave number vector of the evanescent light is equal to the wave number of the surface plasmon and the wave number matching is established, both are in a resonance state and the energy of the light is transferred to the surface plasmon. The intensity of the reflected light decreases sharply. This decrease in light intensity is generally detected as a dark line by the light detection means. The resonance described above occurs only when the incident beam is p-polarized light. Therefore, it is necessary to set in advance so that the light beam is incident as p-polarized light.
この全反射減衰（ＡＴＲ）が生じる入射角、すなわち全反射減衰角（θＳＰ）より表面プラズモンの波数が分かると、被測定物質の誘電率が求められる。この種の表面プラズモン測定装置においては、全反射減衰角（θＳＰ）を精度良く、しかも大きなダイナミックレンジで測定することを目的として、特開平１１−３２６１９４号公報に示されるように、アレイ状の光検出手段を用いることが考えられている。この光検出手段は、複数の受光素子が所定方向に配設されてなり、前記界面において種々の反射角で全反射した光ビームの成分をそれぞれ異なる受光素子が受光する向きにして配設されたものである。 If the wave number of the surface plasmon is known from the incident angle at which this total reflection attenuation (ATR) occurs, that is, the total reflection attenuation angle (θSP), the dielectric constant of the substance to be measured can be obtained. In this type of surface plasmon measurement apparatus, as shown in Japanese Patent Application Laid-Open No. 11-326194, in order to measure the total reflection attenuation angle (θSP) with high accuracy and a large dynamic range, It is considered to use detection means. This light detection means is provided with a plurality of light receiving elements arranged in a predetermined direction, and arranged so that different light receiving elements receive light beam components totally reflected at various reflection angles at the interface. Is.
そしてその場合は、上記アレイ状の光検出手段の各受光素子が出力する光検出信号を、該受光素子の配設方向に関して微分する微分手段が設けられ、この微分手段が出力する微分値に基づいて全反射減衰角（θＳＰ）を特定し、被測定物質の屈折率に関連する特性を求めることが多い。 In that case, there is provided differential means for differentiating the light detection signals output from the light receiving elements of the arrayed light detection means with respect to the arrangement direction of the light receiving elements, and based on the differential value output by the differential means. In many cases, the total reflection attenuation angle (θSP) is specified to obtain a characteristic related to the refractive index of the substance to be measured.
また、全反射減衰（ＡＴＲ）を利用する類似の測定装置として、例えば「分光研究」第４７巻 第１号（１９９８）の第２１〜２３頁および第２６〜２７頁に記載がある漏洩モード測定装置も知られている。この漏洩モード測定装置は基本的に、例えばプリズム状に形成された誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成されたクラッド層と、このクラッド層の上に形成されて、試料液に接触させられる光導波層と、光ビームを発生させる光源と、上記光ビームを上記誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックとクラッド層との界面で全反射条件が得られるように種々の角度で入射させる光学系と、上記界面で全反射した光ビームの強度を測定して導波モードの励起状態、つまり全反射減衰状態を検出する光検出手段とを備えてなるものである。 Moreover, as a similar measuring device using total reflection attenuation (ATR), for example, “Spectroscopic Research” Vol. 47, No. 1, (1998), pages 21 to 23 and pages 26 to 27 are described. Devices are also known. This leakage mode measuring device is basically a dielectric block formed in a prism shape, for example, a clad layer formed on one surface of the dielectric block, and formed on the clad layer to be in contact with the sample liquid. Optical waveguide layer to be generated, a light source for generating a light beam, and the light beam to the dielectric block at various angles so that a total reflection condition is obtained at the interface between the dielectric block and the cladding layer. The optical system includes an incident optical system and light detection means for detecting the excitation state of the waveguide mode, that is, the total reflection attenuation state by measuring the intensity of the light beam totally reflected at the interface.
上記構成の漏洩モード測定装置において、光ビームを誘電体ブロックを通してクラッド層に対して全反射角以上の入射角で入射させると、このクラッド層を透過した後に光導波層においては、ある特定の波数を有する特定入射角の光のみが導波モードで伝搬するようになる。こうして導波モードが励起されると、入射光のほとんどが光導波層に取り込まれるので、上記界面で全反射する光の強度が鋭く低下する全反射減衰が生じる。そして導波光の波数は光導波層の上の被測定物質の屈折率に依存するので、全反射減衰が生じる上記特定入射角を知ることによって、被測定物質の屈折率や、それに関連する被測定物質の特性を分析することができる。 In the leakage mode measuring apparatus having the above-described configuration, when a light beam is incident on the cladding layer through the dielectric block at an incident angle greater than the total reflection angle, the light waveguide layer transmits a specific wave number after passing through the cladding layer. Only light having a specific incident angle having a wave length propagates in the waveguide mode. When the waveguide mode is excited in this way, most of the incident light is taken into the optical waveguide layer, resulting in total reflection attenuation in which the intensity of light totally reflected at the interface is sharply reduced. Since the wave number of guided light depends on the refractive index of the substance to be measured on the optical waveguide layer, knowing the specific incident angle at which total reflection attenuation occurs, the refractive index of the substance to be measured and the measurement object related thereto The properties of the substance can be analyzed.
なおこの漏洩モード測定装置においても、全反射減衰によって反射光に生じる暗線の位置を検出するために、前述したアレイ状の光検出手段を用いることができ、またそれと併せて前述の微分手段が適用されることも多い。 In this leakage mode measuring apparatus, the above-mentioned array-shaped light detecting means can be used to detect the position of the dark line generated in the reflected light due to the total reflection attenuation, and the above-described differentiating means is applied in conjunction therewith. Often done.
また、上述した表面プラズモン測定装置や漏洩モード測定装置は、創薬研究分野等において、所望のセンシング物質に結合する特定物質を見いだすランダムスクリーニングへ使用されることがあり、この場合には前記薄膜層（表面プラズモン測定装置の場合は金属膜であり、漏洩モード測定装置の場合はクラッド層および光導波層）上に上記被測定物質としてセンシング物質を固定し、該センシング物質上に種々の被検体が溶媒に溶かされた試料液を添加し、所定時間が経過する毎に前述の全反射減衰角（θＳＰ）の角度を測定している。 In addition, the surface plasmon measurement device and the leakage mode measurement device described above may be used for random screening to find a specific substance that binds to a desired sensing substance in the field of drug discovery research. In this case, the thin film layer A sensing substance is fixed on the sensing substance on the sensing substance (a metal film in the case of a surface plasmon measuring apparatus, a clad layer and an optical waveguide layer in the case of a leakage mode measuring apparatus), and various analytes are placed on the sensing substance. A sample solution dissolved in a solvent is added, and the total reflection attenuation angle (θSP) is measured every time a predetermined time elapses.
試料液中の被検体が、センシング物質と結合するものであれば、この結合によりセンシング物質の屈折率が時間経過に伴って変化する。したがって、所定時間経過毎に上記全反射減衰角（θＳＰ）を測定し、該全反射減衰角（θＳＰ）の角度に変化が生じているか否か測定することにより、被検体とセンシング物質の結合状態を測定し、その結果に基づいて被検体がセンシング物質と結合する特定物質であるか否かを判定することができる。このような特定物質とセンシング物質との組み合わせとしては、例えば抗原と抗体、あるいは抗体と抗体が挙げられる。具体的には、ウサギ抗ヒトＩｇＧ抗体をセンシング物質として薄膜層の表面に固定し、ヒトＩgＧ抗体を特定物質として用いることができる。 If the analyte in the sample liquid binds to the sensing substance, the refractive index of the sensing substance changes with time due to this binding. Therefore, by measuring the total reflection attenuation angle (θSP) every predetermined time and measuring whether or not the total reflection attenuation angle (θSP) has changed, the binding state of the analyte and the sensing substance is determined. It is possible to determine whether or not the analyte is a specific substance that binds to the sensing substance based on the result. Examples of the combination of the specific substance and the sensing substance include an antigen and an antibody, or an antibody and an antibody. Specifically, a rabbit anti-human IgG antibody can be immobilized on the surface of the thin film layer as a sensing substance, and a human IgG antibody can be used as the specific substance.
なお、被検体とセンシング物質の結合状態を測定するためには、全反射減衰（θＳＰ）の角度そのものを必ずしも検出する必要はない。例えばセンシング物質に試料液を添加し、その後の全反射減衰角（θＳＰ）の角度変化量を測定して、その角度変化量の大小に基づいて結合状態を測定することもできる。前述したアレイ状の光検出手段と微分手段を全反射減衰を利用した測定装置に適用する場合であれば、微分値の変化量は、全反射減衰角（θＳＰ）の角度変化量を反映しているため、微分値の変化量に基づいて、センシング物質と被検体との結合状態を測定することができる（本出願人による特願２０００−３９８３０９号参照）。このような全反射減衰を利用した測定方法および装置においては、底面に予め成された薄膜層上にセンシング物質が固定されたカップ状あるいはシャーレ状の測定チップに、溶媒と被検体からなる試料液を滴下供給して、上述した全反射減衰角（θＳＰ）の角度変化量の測定を行っている。 Note that in order to measure the binding state between the subject and the sensing substance, it is not always necessary to detect the angle of total reflection attenuation (θSP) itself. For example, a sample solution can be added to the sensing substance, and the amount of change in the total reflection attenuation angle (θSP) thereafter can be measured, and the binding state can be measured based on the magnitude of the angle change. If the above-described arrayed light detecting means and differentiating means are applied to a measuring device using total reflection attenuation, the change amount of the differential value reflects the angle change amount of the total reflection attenuation angle (θSP). Therefore, the binding state between the sensing substance and the analyte can be measured based on the amount of change in the differential value (see Japanese Patent Application No. 2000-398309 by the present applicant). In such a measurement method and apparatus using total reflection attenuation, a sample liquid consisting of a solvent and an analyte is placed on a cup-shaped or petri-shaped measuring chip in which a sensing substance is fixed on a thin film layer formed in advance on the bottom surface. The amount of change in angle of the total reflection attenuation angle (θSP) described above is measured.
さらに、ターンテーブル等に搭載された複数個の測定チップの測定を順次行うことにより、多数の試料についての測定を短時間で行うことができる全反射減衰を利用した測定装置が、特開２００１−３３０５６０号公報に記載されている。 Furthermore, a measuring apparatus using total reflection attenuation capable of measuring a large number of samples in a short time by sequentially measuring a plurality of measuring chips mounted on a turntable or the like is disclosed in JP-A-2001-2001. No. 330560.
本発明のバイオセンサーを表面プラズモン共鳴分析に使用する場合、上記したような各種の表面プラズモン測定装置の一部として適用することができる。
以下の実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
When the biosensor of the present invention is used for surface plasmon resonance analysis, it can be applied as a part of various surface plasmon measurement devices as described above.
The following examples further illustrate the present invention, but the scope of the present invention is not limited to these examples.
実施例１：
本実施例は、タンパク質を固定するためのセンサーチップの作製に関するものである。
（１）試料１（比較例）の作成
カルボキシメチルデキストランが結合した表面として、Biacore社センサーチップCM-5（research grade）を、そのまま用いた。
Example 1:
This example relates to the production of a sensor chip for immobilizing proteins.
(1) Preparation of Sample 1 (Comparative Example) Biacore sensor chip CM-5 (research grade) was used as it was as the surface to which carboxymethyldextran was bound.
（２）試料２（実施例）の作成
カルボキシル基とスルホン酸基を併せ持つ表面として、Biacore社センサーチップCM-5（research grade）のカルボキシル基の一部を、タウリンで置換した表面を用いた。
(2) Preparation of Sample 2 (Example) As a surface having both a carboxyl group and a sulfonic acid group, a surface obtained by substituting a part of the carboxyl group of Biacore sensor chip CM-5 (research grade) with taurine was used.
CM-5を Biacore社製の表面プラズモン共鳴装置であるBiacore3000にセットし、0.4MのEDC（1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide：同仁化学製）および2.8mMのHODhbt （3,4-Dihydro-3-hydroxy-4-oxo-1,2,3-benzotriazine：東京化成）を含む水溶液と５分接触させ、さらにタウリン（2-アミノエタン-1-スルホン酸：和光純薬製）の1.0M溶液（NaOHにてpH10.0に調整）と５分接触させることで、カルボキシメチルデキストランのカルボキシル基の一部がスルホン酸基に置換された表面が作製される。EDC/HODhbtによる活性化時間、タウリンの反応時間、さらにこの操作の繰り返し回数により、スルホン酸基への置換率を制御することが可能である。 CM-5 was set on Biacore3000, a surface plasmon resonance device manufactured by Biacore, and 0.4M EDC (1- (3-Dimethylaminopropyl) -3-ethylcarbodiimide: Dojin Chemical) and 2.8 mM HODhbt (3,4- Contact with an aqueous solution containing Dihydro-3-hydroxy-4-oxo-1,2,3-benzotriazine (Tokyo Kasei) for 5 minutes, and 1.0M of taurine (2-aminoethane-1-sulfonic acid: Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) By contacting with a solution (adjusted to pH 10.0 with NaOH) for 5 minutes, a surface in which some of the carboxyl groups of carboxymethyldextran are substituted with sulfonic acid groups is produced. The substitution rate to the sulfonic acid group can be controlled by the activation time by EDC / HODhbt, the reaction time of taurine, and the number of repetitions of this operation.
実施例２
本実施例は、実施例１で得られた２種類のセンサーチップに対し、カルボン酸のｐＫａよりも高く、タンパク質の等電点（ｐＩ）よりも低い溶液ｐＨにおける、タンパク質のプレコンセントレーションおよび固定化に関するものである。
タンパク質としては、ニュートラルアビジン（PIERCE製）を用いた。ニュートラルアビジンの等電点（ｐＩ）は、ATTO社のAE-8150を用いた電気泳動実験で、同時測定したマーカー（Broad pI Kit, pH 3.5-9.3：Amersham Biosciences社製）との比較から、ｐＩ=６．０程度であることを確認した。
Example 2
In this example, preconcentration and immobilization of protein at a solution pH higher than the pKa of carboxylic acid and lower than the isoelectric point (pI) of protein relative to the two types of sensor chips obtained in Example 1. It is related to conversion.
Neutral avidin (manufactured by PIERCE) was used as the protein. The isoelectric point (pI) of neutral avidin was determined by comparing with the marker (Broad pI Kit, pH 3.5-9.3: manufactured by Amersham Biosciences) simultaneously measured in electrophoresis experiments using AE-8150 manufactured by ATTO. It was confirmed that the value was about 6.0.
1mgのニュートラルアビジンを1mlのHBS-EPバッファー（ビアコア社製、pH7.4）に溶解した溶液を10μl秤量し、90μlの酢酸バッファー（ビアコア社製、pH5.0）を加えることで、0.1mg/mlのニュートラルアビジン溶液（pH5.0, 0.1mg/ml）を調整した。 10 mg of a solution of 1 mg of neutral avidin dissolved in 1 ml of HBS-EP buffer (Biacore, pH 7.4) is weighed, and 90 μl of acetate buffer (Biacore, pH 5.0) is added to give 0.1 mg / ml of neutral avidin solution (pH 5.0, 0.1 mg / ml) was prepared.
実施例１で作製した試料１、２をBiacore社製の表面プラズモン共鳴装置であるBiacore3000にセットし、0.4MのEDC（1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide）および0.1MのNHS （N-Hydroxysuccinimide）を含む水溶液、ニュートラルアビジン溶液（pH5.0, 0.1mg/ml）、エタノールアミン溶液（ビアコア社）を、各々５分間流した後、10mMNaOHを１分間×２回流した場合のプレコンセントレーションおよび固定化について検討した。得られたセンサーグラムを図１に示す。
カルボキル基のみが結合している試料１、およびその一部がスルホン酸基に置換されている試料２は、カルボン酸のｐＫａ以上かつニュートラルアビジンの等電点以下であるｐＨ５．０における固定量はそれぞれ13000RUと10500RU程度であり、このｐＨでは、ほぼ同等のプレコンセントレーションおよび固定効果があることが証明された。
実施例３
本実施例は、実施例１で得られた２種類のセンサーチップに対し、カルボン酸のｐＫａおよびニュートラルアビジンのｐＩよりも低い溶液ｐＨにおける、ニュートラルアビジンのプレコンセントレーションおよび固定化に関するものである。
酢酸バッファー（ビアコア社製、pH5.0）をグリシンバッファー（ビアコア社製、pH1.5）に変更した以外は実施例２と同一の操作を行なった。得られたセンサーグラムを図２に示す。
Example 3
This example relates to neutral avidin preconcentration and immobilization of the two sensor chips obtained in Example 1 at a solution pH lower than the carboxylic acid pKa and the neutral avidin pI.
The same operation as in Example 2 was performed except that the acetate buffer (Biacore, pH 5.0) was changed to a glycine buffer (Biacore, pH 1.5). The obtained sensorgram is shown in FIG.
カルボキシメチルデキストランが結合している試料１は、カルボキシル基のｐＫａのｐＨである1.5では、ニュートラルアビジンのプレコンセントレーションおよび固定化が全く観察されない。これに対し本発明の試料２では、10000RU程度のプレコンセントレーションが観察され、活性化／固定化／エタノールアミン結合／アルカリ洗浄後も5000RU以上のＮニュートラルアビジンが残存していることが確認された。
In
このことは、アミノ基と共有結合し得る反応性官能基と、カルボン酸よりもｐKaの低いアニオン性基とを併せ持つ本発明の表面により、カルボキシル基のｐＫａ以下のｐＨにおけるＣＡのプレコンセントレーションおよび固定化が達成されたことを意味している。 This is because the surface of the present invention having both a reactive functional group capable of covalently bonding to an amino group and an anionic group having a pKa lower than that of a carboxylic acid, preconcentration of CA at a pH lower than the pKa of the carboxyl group and This means that immobilization has been achieved.
実施例４
実施例４および実施例５は、ニュートラルアビジン以外のタンパク質においても、同様の効果があることを確認するものである。実施例４では、タンパク質としてＣＡ（Carbonic Anhydrase：SIGMA社製）を用いた。ＣＡの等電点（ｐＩ）は、ATTO社のAE-8150を用いた電気泳動実験で、同時測定したマーカー（Broad pI Kit, pH 3.5-9.3：Amersham Biosciences社製）との比較から、ｐＩ=５．８程度であることを確認した。
Example 4
Example 4 and Example 5 confirm that there is a similar effect in proteins other than neutral avidin. In Example 4, CA (Carbonic Anhydrase: manufactured by SIGMA) was used as a protein. The isoelectric point (pI) of CA was calculated by comparing pI = with a marker (Broad pI Kit, pH 3.5-9.3: manufactured by Amersham Biosciences) simultaneously measured in an electrophoresis experiment using AE-8150 of ATTO. It was confirmed that it was about 5.8.
1mgのＣＡを1mlのHBS-EPバッファー（ビアコア社製、pH7.4）に溶解した溶液を10μl秤量し、90μlのグリシンバッファー（ビアコア社製、pH1.5）を加えることで、0.1mg/mlのＣＡ溶液（pH1.5, 0.1mg/ml）を調整し、実施例３と同様の測定を行った。得られたセンサーグラムを図３に示す。 10 μl of a solution of 1 mg CA dissolved in 1 ml of HBS-EP buffer (Biacore, pH 7.4) is weighed and 90 μl of glycine buffer (Biacore, pH 1.5) is added to give 0.1 mg / ml A CA solution (pH 1.5, 0.1 mg / ml) was prepared, and the same measurement as in Example 3 was performed. The obtained sensorgram is shown in FIG.
カルボキシメチルデキストランが結合している試料１は、カルボキシル基のｐＫａ以下のｐＨである1.5では、タンパク質のプレコンセントレーションおよび固定は全く観察されない。これに対し本発明の試料２では、6000RU程度のプレコンセントレーションが観察され、活性化／固定化／エタノールアミン反応／アルカリ洗浄後も2500RU程度のＣＡが残存していることが確認された。
In
実施例５
実施例５では、タンパク質としてフィブリノーゲン（SIGMA社製）を用いた。フィブリノーゲンの等電点（ｐＩ）は、ATTO社のAE-8150を用いた電気泳動実験で、同時測定したマーカー（Broad pI Kit, pH 3.5-9.3：Amersham Biosciences社製）との比較から、ｐＩ=５．５程度であることを確認した。
1mgのフィブリノーゲンを1mlのHBS-EPバッファー（ビアコア社製、pH7.4）に溶解した溶液を10μl秤量し、90μlのグリシンバッファー（ビアコア社製、pH1.5）を加えることで、0.1mg/mlのフィブリノーゲン溶液（pH1.5, 0.1mg/ml）を調整し、実施例３と同様の測定を行った。得られたセンサーグラムを図４に示す。
Example 5
In Example 5, fibrinogen (manufactured by SIGMA) was used as the protein. The isoelectric point (pI) of fibrinogen was determined by comparison with a marker (Broad pI Kit, pH 3.5-9.3: Amersham Biosciences) simultaneously measured in an electrophoresis experiment using AE-8150 manufactured by ATTO. It was confirmed that it was about 5.5.
10 μl of a solution of 1 mg of fibrinogen dissolved in 1 ml of HBS-EP buffer (Biacore, pH 7.4) is weighed, and 90 mg of glycine buffer (Biacore, pH 1.5) is added to give 0.1 mg / ml A fibrinogen solution (pH 1.5, 0.1 mg / ml) was prepared, and the same measurement as in Example 3 was performed. The obtained sensorgram is shown in FIG.
カルボキシメチルデキストランが結合している試料１は、カルボキシル基のｐＫａ以下のｐＨである1.5では、タンパク質のプレコンセントレーションおよび固定は全く観察されない。これに対し本発明の試料２では、5000RU程度のプレコンセントレーションが観察され、活性化／固定化／エタノールアミン反応／アルカリ洗浄後も4600RU程度のフィブリノーゲンが残存していることが確認された。
In
本発明の表面は実施例２に示した様に、カルボン酸のｐＫａ以上かつタンパク質の等電点以下のｐＨにおいては、カルボキシ基のみを有する表面と同等のプレコンセントレーション／固定化能を有する。さらに本発明の表面は、カルボキシ基のみを有する表面では不可能な、カルボン酸のｐＫａ以下のｐＨにおいても、様々なタンパク質のプレコンセントレーションおよび固定化が可能であることが証明された。 As shown in Example 2, the surface of the present invention has a preconcentration / immobilization ability equivalent to that of a surface having only a carboxy group at a pH not lower than the pKa of the carboxylic acid and not higher than the isoelectric point of the protein. Furthermore, the surface of the present invention was proved to be capable of preconcentration and immobilization of various proteins even at a pH below the pKa of carboxylic acid, which is impossible with a surface having only carboxy groups.
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