JP5026815B2 - Biosensor and method for immobilizing physiologically active substance - Google Patents
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Description
本発明は、バイオセンサー及び生理活性物質の固定化方法に関する。 The present invention relates to a biosensor and a method for immobilizing a physiologically active substance.
生理活性物質を測定チップに固定化するための代表的な手法として、生理活性物質のアミノ基と測定チップ上のカルボキシル基とを結合させる方法（アミンカップリング法）が広く用いられている。この方法では、固定化の際に生理活性物質を、その等電点よりも低いｐＨを有する緩衝液に溶解する必要がある。すなわち、等電点以下のｐＨでは生理活性物質は＋荷電となるのに対し、測定チップ上のカルボキシル基はアルカリ側からｐＨ３．５程度の酸性域まで−荷電を持つ。それゆえ、静電引力によって生理活性物質が測定チップ上に濃縮される。この濃縮（プレコンセントレーション）を行わない場合、生理活性物質の固定量が大幅に低下するため、固定化される生理活性物質は、その等電点よりも低いｐＨの緩衝液に溶解する必要があることが、非特許文献１及び特許文献１に記載されている。 As a typical method for immobilizing a physiologically active substance on a measurement chip, a method of binding an amino group of a physiologically active substance and a carboxyl group on the measurement chip (amine coupling method) is widely used. In this method, it is necessary to dissolve the physiologically active substance in a buffer solution having a pH lower than its isoelectric point at the time of immobilization. In other words, the physiologically active substance is positively charged at a pH below the isoelectric point, while the carboxyl group on the measurement chip is negatively charged from the alkali side to the acidic range of about pH 3.5. Therefore, the physiologically active substance is concentrated on the measurement chip by electrostatic attraction. When this concentration (preconcentration) is not performed, the amount of the physiologically active substance immobilized is greatly reduced. Therefore, the physiologically active substance to be immobilized must be dissolved in a buffer solution having a pH lower than its isoelectric point. It is described in Non-Patent Document 1 and Patent Document 1.
このことは、低ｐＨ条件下で変性する生理活性物質は、活性を維持したまま固定化することが不可能であることを意味している。また、酸性タンパク質がごとき生理活性物質は、ｐＨ３．５程度でも総電化として＋荷電をもたないため、プレコンセントレーション効果を得ることができず、結果として固定化することが不可能となる。 This means that a physiologically active substance that denatures under low pH conditions cannot be immobilized while maintaining its activity. In addition, a physiologically active substance such as an acidic protein does not have a positive charge as a total electrification even at a pH of about 3.5, so that a preconcentration effect cannot be obtained and as a result cannot be immobilized.
等電点よりも高いｐＨの緩衝液に溶解された生理活性物質は、固体表面上に固定化されたカチオンポリマーとの間の静電引力により、固体表面に固定化することが可能となる。この原理を用いて、タンパク質と有機高分子イオンを交互積層する手法が特許文献２に記載されている。 A physiologically active substance dissolved in a buffer solution having a pH higher than the isoelectric point can be immobilized on the solid surface by electrostatic attraction between the cationic polymer and the cationic polymer immobilized on the solid surface. Patent Document 2 describes a technique of alternately laminating proteins and organic polymer ions using this principle.
この方法は、生理活性物質を簡便に固定化し得るという意味で非常に優れているものの、バイオセンサー用途への適用を考えた場合、２つの問題が生じる。１つめの問題は、タンパク質と基板との間の結合が静電相互作用のみに基づいているため、酸性溶液やアルカリ性溶液を用いた洗浄操作により、固体表面に静電吸着した生理活性物質の一部が解離してしまう可能性があることである２つめの問題点は、生理活性物質は密にパッキングした単分子層として得られることである。生理活性物質の固定量を上げるためには、生理活性物質を３次元的に固定することが望ましい。さらに、生理活性物質が密にパッキングしていることは、生理活性物質と相互作用する化合物の結合・解離挙動を測定するバイオセンサー用途には好ましくない。 Although this method is very excellent in the sense that a physiologically active substance can be immobilized easily, two problems arise when considering application to biosensor applications. The first problem is that the binding between the protein and the substrate is based only on electrostatic interaction, so that a physiologically active substance electrostatically adsorbed on the solid surface by a washing operation using an acidic solution or an alkaline solution is used. The second problem, which is that the part may be dissociated, is that the physiologically active substance is obtained as a densely packed monomolecular layer. In order to increase the amount of the physiologically active substance immobilized, it is desirable to immobilize the physiologically active substance three-dimensionally. Furthermore, the dense packing of the physiologically active substance is not preferable for biosensor applications that measure the binding / dissociation behavior of compounds that interact with the physiologically active substance.
そこで本発明は、このような実状に鑑みて、生理活性物質の等電点以上のｐＨでプレコンセントレーション効果を得ることができ、さらに生理活性物質を表面に共有結合し得るバイオセンサー及び生理活性物質の固定化方法を提供することを解決すべき課題とした。 Therefore, in view of such a situation, the present invention can obtain a preconcentration effect at a pH equal to or higher than the isoelectric point of a physiologically active substance, and further can bioactivate a biosensor capable of covalently binding the physiologically active substance to the surface. Providing a method for immobilizing substances was an issue to be solved.
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、１級または２級アミノ基を有する表面を用いることで、生理活性物質の等電点以上のｐＨを有する生理活性物質含有液がプレコンセントレーション（濃縮）効果を得ることができ、さらにこの状態でカルボン酸活性化剤と接触させることで、生理活性物質を表面に共有結合により固定化できることを見出し、本発明を完成するに至った。 As a result of intensive studies in order to solve the above problems, the present inventors use a surface having a primary or secondary amino group, thereby containing a physiologically active substance having a pH higher than the isoelectric point of the physiologically active substance. The liquid can obtain a preconcentration (concentration) effect, and in this state, it is found that a physiologically active substance can be immobilized on the surface by covalent bonding by contacting with a carboxylic acid activator, and the present invention is completed. It came to.
即ち、本発明によれば、生理活性物質を生理活性物質の等電点以上のｐＨでプレコンセントレーションさせた後に、該生理活性物質を化学的に固定化することが可能な１級または２級アミノ基を有するポリマーが結合した固体基板からなるバイオセンサーが提供される。 That is, according to the present invention, after preconcentrating a physiologically active substance at a pH equal to or higher than the isoelectric point of the physiologically active substance, the first or second class capable of chemically immobilizing the physiologically active substance. A biosensor comprising a solid substrate to which a polymer having an amino group is bound is provided.
本発明の別の側面によれば、１級または２級のアミノ基を有するポリマーが結合した固体基板に対し、カルボキシル基を有する生理活性物質を、等電点以上のｐＨにおいてプレコンセントレーションさせた後、カルボン酸活性化剤と接触させることにより、アミノ基を有するポリマーと生理活性物質とを結合させることを含む、生理活性物質の固定方法が提供される。 According to another aspect of the present invention, a physiologically active substance having a carboxyl group is preconcentrated at a pH above the isoelectric point on a solid substrate to which a polymer having a primary or secondary amino group is bound. Thereafter, a method for immobilizing a physiologically active substance is provided, which comprises bringing a polymer having an amino group into contact with the physiologically active substance by contacting with a carboxylic acid activator.
好ましくは、１級または２級のアミノ基を有するポリマーは、カルボキシル基を有するポリマーとポリアミンとを反応させることにより得られるポリマーである。
好ましくは、カルボキシル基を有するポリマーはカルボキシメチルデキストランである。
Preferably, the polymer having a primary or secondary amino group is a polymer obtained by reacting a polymer having a carboxyl group with a polyamine.
Preferably, the polymer having a carboxyl group is carboxymethyldextran.
好ましくは、１級または２級アミノ基を有するポリマーが結合した固体基板は、水溶性高分子が結合している固体基板、疎水性高分子が結合している固体基板、又は自己組織化単分子膜が形成されている固体基板の何れかである。 Preferably, the solid substrate to which a polymer having a primary or secondary amino group is bonded is a solid substrate to which a water-soluble polymer is bonded, a solid substrate to which a hydrophobic polymer is bonded, or a self-assembled monomolecule One of the solid substrates on which the film is formed.
好ましくは、１級または２級アミノ基を有するポリマー層が、金属上に形成されている。
好ましくは、金属は金、銀、銅、白金またはアルミニウムのいずれかである。
好ましくは、本発明のバイオセンサーは、非電気化学的検出に使用される。
好ましくは、本発明のバイオセンサーは、表面プラズモン共鳴分析に使用される。
Preferably, a polymer layer having primary or secondary amino groups is formed on the metal.
Preferably, the metal is any of gold, silver, copper, platinum or aluminum.
Preferably, the biosensor of the present invention is used for non-electrochemical detection.
Preferably, the biosensor of the present invention is used for surface plasmon resonance analysis.
本発明のさらに別の側面によれば、生理活性物質が共有結合により表面に結合している上記した本発明のバイオセンサーと被験物質とを接触させる工程を含む、該生理活性物質と相互作用する物質を検出または測定する方法が提供される。 According to still another aspect of the present invention, the bioactive substance interacts with the bioactive substance, comprising the step of bringing the biosensor of the present invention in which the bioactive substance is covalently bonded to the surface into contact with the test substance. A method for detecting or measuring a substance is provided.
好ましくは、生理活性物質と相互作用する物質を非電気化学的方法により検出または測定する。
好ましくは、生理活性物質と相互作用する物質を表面プラズモン共鳴分析により検出または測定する。
Preferably, a substance that interacts with a physiologically active substance is detected or measured by a non-electrochemical method.
Preferably, a substance that interacts with a physiologically active substance is detected or measured by surface plasmon resonance analysis.
本発明のバイオセンサーによれば、生理活性物質の等電点以上のｐＨを有する生理活性物質含有液を用いた場合においても、静電引力によって生理活性物質が測定チップ上に濃縮されるプレコンセントレーション効果を得ることができ、さらに、生理活性物質をバイオセンサーの表面に共有結合により固定化することができる。 According to the biosensor of the present invention, even when a bioactive substance-containing liquid having a pH equal to or higher than the isoelectric point of the bioactive substance is used, the preconcentration in which the bioactive substance is concentrated on the measurement chip by electrostatic attraction. The bioactive substance can be immobilized on the biosensor surface by covalent bonding.
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。なお本発明において、数値が物性値、特性値等を表す場合に、「（数値１）〜（数値２）」という記載は「（数値１）以上（数値２）以下」の意味を表す。 Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail. In the present invention, when a numerical value represents a physical property value, a characteristic value, or the like, the description “(numerical value 1) to (numerical value 2)” means “(numerical value 1) or more and (numerical value 2) or less”.
本発明のバイオセンサーは、１級または２級アミノ基を有する表面を有し、これにより、生理活性物質の等電点以上のｐＨを有する生理活性物質含有液がプレコンセントレーション（濃縮）効果を得ることができ、さらにこの状態でカルボン酸活性化剤と接触させることで、生理活性物質を表面に共有結合により固定化できることを特徴とする。 The biosensor of the present invention has a surface having a primary or secondary amino group, so that a bioactive substance-containing liquid having a pH equal to or higher than the isoelectric point of the bioactive substance has a preconcentration effect. Further, the bioactive substance can be immobilized on the surface by covalent bond by contacting with a carboxylic acid activator in this state.
１級または２級アミノ基を有する表面は、自己組織化単分子膜表面、疎水性高分子結合表面、水溶性高分子結合表面のいずれかであることが好ましい。生理活性物質を３次元的に結合可能であるという観点からは、水溶性高分子が結合している表面が最も好ましい。 The surface having a primary or secondary amino group is preferably any of a self-assembled monolayer surface, a hydrophobic polymer binding surface, and a water-soluble polymer binding surface. From the viewpoint that a physiologically active substance can be bound three-dimensionally, the surface to which a water-soluble polymer is bound is most preferable.
自己組織化単分子膜について説明する。チオールやジスルフィド類などの硫黄化合物は金等の貴金属基板上に自発的に吸着し単分子サイズの超薄膜を与える。またその集合体は基板の結晶格子や吸着分子の分子構造に依存した配列を示すことから自己組織化膜と呼ばれている。自己組織化単分子膜としては、金表面のアルカンチオール類、ガラス表面のアルキルシラン類、シリコン表面のアルコール類等が挙げられる。アルカンチオール類の具体例としては、7−カルボキシ−１−ヘプタンチオール、10-カルボキシ-1-デカンチオール、4,4'-ジチオジブチリックアシッド、11-ヒドロキシ-1-ウンデカンチオール、11-アミノ-1-ウンデカンチオールなどを使用することができる。 The self-assembled monolayer will be described. Sulfur compounds such as thiols and disulfides spontaneously adsorb on a noble metal substrate such as gold to give an ultra-thin film of single molecular size. The aggregate is called a self-assembled film because it shows an arrangement depending on the crystal lattice of the substrate and the molecular structure of adsorbed molecules. Examples of the self-assembled monolayer include alkanethiols on the gold surface, alkylsilanes on the glass surface, alcohols on the silicon surface, and the like. Specific examples of alkanethiols include 7-carboxy-1-heptanethiol, 10-carboxy-1-decanethiol, 4,4′-dithiodibutyric acid, 11-hydroxy-1-undecanethiol, 11-amino- 1-undecanethiol and the like can be used.
また、本発明において自己組織化単分子膜を形成する分子として一般式Ａ−１（一般式Ａ−１において、ｎは３から２０の整数を示し、Ｘは官能基を示す）に示すアルカンチオール誘導体を用いることにより、Au-S結合とアルキル鎖同士のvan der Waals力に基づき、配向性を持つ単分子膜が自己組織的に形成される。自己組織化膜は、アルカンチオール誘導体の溶液中に金基板を浸漬するという極めて簡便な手法で作成される。一般式Ａ−１において例えば、X=NH2である化合物を用いて自己組織化膜を形成させることで、アミノ基を有する有機層で金表面を被覆することが可能となる。 In the present invention, alkanethiol represented by general formula A-1 (in general formula A-1 , n represents an integer of 3 to 20 and X represents a functional group) is a molecule that forms a self-assembled monolayer. By using the derivative, a monomolecular film having an orientation is formed in a self-organized manner based on the van der Waals force between the Au—S bond and the alkyl chain. The self-assembled film is prepared by an extremely simple technique in which a gold substrate is immersed in a solution of an alkanethiol derivative. In the general formula A-1 , for example, by forming a self-assembled film using a compound where X = NH2, the gold surface can be covered with an organic layer having an amino group.
末端にアミノ基を有するアルカンチオールは、アルキル鎖を介してチオール基とアミノ基が連結している化合物（一般式１−１）（一般式１−１において、ｎは３から２０の整数を示す）でもよく、末端にカルボキシル基を有するアルカンチオール（一般式１−２、１−３）（一般式１−２においてｎは３から２０の整数を示し、一般式４においてｎはそれぞれ独立に１から２０の整数を示す）と大過剰のヒドラジドまたはジアミンを反応させた化合物でもよい。末端にカルボキシル基を有するアルカンチオールと大過剰のヒドラジドまたはジアミンとの反応は、溶液状態で行ってもよく、また、末端にカルボキシル基を有するアルカンチオールを基板表面に結合した後、大過剰のヒドラジドまたはジアミンを反応させてもよい。 The alkanethiol having an amino group at the terminal is a compound (general formula 1-1 ) in which the thiol group and the amino group are linked via an alkyl chain (in the general formula 1-1 , n represents an integer of 3 to 20). And alkanethiol having a carboxyl group at the terminal (general formulas 1-2 and 1-3 ) (in formula 1-2 , n represents an integer of 3 to 20, and in formula 4, each n is independently 1 Or a compound obtained by reacting a large excess of hydrazide or diamine. The reaction between the alkanethiol having a carboxyl group at the terminal and a large excess of hydrazide or diamine may be carried out in a solution state, or after binding the alkanethiol having a carboxyl group at the terminal to the substrate surface, a large excess of hydrazide. Or you may make diamine react.
１−１〜１−３のアルキル基の繰返し数は、3以上20以下が好ましく、さらに3以上16以下が好ましく、4以上8以下が最も好ましい。アルキル鎖が短いと自己組織化膜を形成しにくく、アルキル鎖が長いと水溶性が低下し、ハンドリングが困難になる。 The repeating number of the alkyl group of 1-1 to 1-3 is preferably 3 or more and 20 or less, more preferably 3 or more and 16 or less, and most preferably 4 or more and 8 or less. When the alkyl chain is short, it is difficult to form a self-assembled film, and when the alkyl chain is long, water solubility is lowered and handling becomes difficult.
本発明に用いるジアミンとしては、任意の化合物を用いることが可能であるが、バイオセンサー表面に用いる場合、水溶性ジアミンが好ましい。水溶性ジアミンとしては具体的に、エチレンジアミン、テトラエチレンジアミン、オクタメチレンジアミン、デカメチレンジアミン、ピペラジン、トリエチレンジアミン、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラアミン、ジヘキサメチレントリアミン、１．４−ジアミノシクロヘキサン等の脂肪族ジアミン、パラフェニレンジアミン、メタフェニレンジアミン、パラキシリレンジアミン、メタキシリレンジアミン、４，４‘−ジアモノビフェニル、４，４’−ジアミノジフェニルメタン、４，４‘−ジアミノジフェニルケトン、４，４‘−ジアミノジフェニルスルホン酸等の芳香族ジアミンが挙げられる。バイオセンサー表面の親水性を向上させるという観点から、２つのアミノ基をエチレングリコールユニットで連結した化合物（一般式１−４）を用いることも可能である。本発明に用いるジアミンとしては、好ましくはエチレンジアミンまたは一般式１−４（一般式１−４において、ｎ及びｍは、それぞれ独立に１から２０の整数を示す）で表される化合物であり、より好ましくは、エチレンジアミンまたは1,2-ビス(アミノエトキシ)エタン（一般式１−４において、n=2,m=1）である。 As the diamine used in the present invention, any compound can be used, but when used on the biosensor surface, a water-soluble diamine is preferred. Specific examples of water-soluble diamines include aliphatic diamines such as ethylenediamine, tetraethylenediamine, octamethylenediamine, decamethylenediamine, piperazine, triethylenediamine, diethylenetriamine, triethylenetetraamine, dihexamethylenetriamine, and 1.4-diaminocyclohexane. , Paraphenylenediamine, metaphenylenediamine, paraxylylenediamine, metaxylylenediamine, 4,4'-diamonobiphenyl, 4,4'-diaminodiphenylmethane, 4,4'-diaminodiphenyl ketone, 4,4'- Aromatic diamines such as diaminodiphenylsulfonic acid can be mentioned. From the viewpoint of improving the hydrophilicity of the biosensor surface, it is also possible to use a compound (general formula 1-4 ) in which two amino groups are linked by an ethylene glycol unit. The diamine used in the present invention is preferably a compound represented by ethylenediamine or general formula 1-4 (in general formula 1-4 , n and m each independently represents an integer of 1 to 20), and more Ethylenediamine or 1,2-bis (aminoethoxy) ethane (in formula 1-4 , n = 2, m = 1) is preferable.
アミノ基を有するアルカンチオールは、単独で自己組織化膜を形成することも可能であり、また、他のアルカンチオールと混合して自己組織化膜を形成することも可能である。バイオセンサー表面に用いる場合、他のアルカンチオールとしては、生理活性物質の非特異吸着を抑制可能な化合物を用いることが好ましい。生理活性物質の非特異吸着を抑制可能な自己組織化膜に関しては、前述のWhitesides教授らにより詳細に検討されており、親水性基を有するアルカンチオールから形成された自己組織化膜が非特異吸着抑制に有効であることが報告されている（Langmuir,17,2841-2850, 5605-5620, 6336-6343 (2001)）。本発明において、アミノ基を有するアルカンチオールと混合単分子膜を形成するアルカンチオールは、前記論文に記載された化合物を好ましく用いることが可能である。非特異吸着抑制能に優れ、入手が容易であることから、アミノ基を有するアルカンチオールと混合単分子膜を形成するアルカンチオールとしては、水酸基を有するアルカンチオール（一般式１−５）あるいはエチレングルコールユニットを有するアルカンチオール（一般式１−６）（一般式１−５において、ｎは３から２０の整数を示し、一般式１−６において、ｎ及びｍは、それぞれ独立に１から２０の整数を示す）を用いることが好ましい。 The alkanethiol having an amino group can form a self-assembled film alone, or can be mixed with other alkanethiols to form a self-assembled film. When used on the biosensor surface, it is preferable to use a compound capable of suppressing nonspecific adsorption of a physiologically active substance as the other alkanethiol. The self-assembled membrane that can suppress non-specific adsorption of physiologically active substances has been studied in detail by the aforementioned Professor Whitesides et al. The self-assembled membrane formed from alkanethiol having a hydrophilic group is non-specifically adsorbed It is reported to be effective for suppression (Langmuir, 17,2841-2850, 5605-5620, 6336-6343 (2001)). In the present invention, as the alkanethiol that forms a mixed monomolecular film with an alkanethiol having an amino group, the compounds described in the above paper can be preferably used. As alkanethiol that forms a mixed monomolecular film with an alkanethiol having an amino group is excellent in non-specific adsorption inhibiting ability and is easily available, alkanethiol having a hydroxyl group (general formula 1-5 ) or ethylene group in alkanethiol (general formula 1-6) (general formula 1-5 with a call unit, n represents an integer of 3 to 20, in the general formula 1-6, n and m are from 1 to 20 independently It is preferable to use an integer.
アミノ基を有するアルカンチオールを他のアルカンチオールと混合して自己組織化膜を形成する場合、１−１〜１−３のアルキル基の繰返し数は、4以上20以下が好ましく、さらに4以上16以下が好ましく、4以上10以下が最も好ましい。また、１-５,１-６のアルキル基の繰返し数は、3以上16以下が好ましく、さらに5以上12以下が好ましく、5以上10以下が最も好ましい。 When an alkanethiol having an amino group is mixed with another alkanethiol to form a self-assembled film, the repeating number of the alkyl group of 1-1 to 1-3 is preferably 4 or more and 20 or less, and more preferably 4 or more and 16 The following is preferable, and 4 or more and 10 or less are most preferable. The number of repeating alkyl groups 1-5 and 1-6 is preferably 3 or more and 16 or less, more preferably 5 or more and 12 or less, and most preferably 5 or more and 10 or less.
本発明において、アミノ基を有するアルカンチオールと親水性基を有するアルカンチオールは、任意の割合で混合することが可能であるが、アミノ基を有するアルカンチオールの割合が少ない場合には活性化されたカルボキシル基含有ポリマーの結合量が低下し、親水性基を有するアルカンチオールの割合が少ない場合には非特異吸着抑制能が減少する。それゆえ、アミノ基を有するアルカンチオールと親水性基を有するアルカンチオールの混合比は、１／１〜１／１，０００，０００の範囲であることが好ましく、１／４〜１／１０，０００の範囲であることがより好ましく、１／１０〜１／１，０００の範囲であることがさらに好ましい。活性化されたカルボキシル基を含有するポリマーと反応する場合の立体障害低減の観点から、アミノ基を有するアルカンチオールの分子長は、親水性基を有するアルカンチオールの分子長よりも長いことが好ましい。 In the present invention, the alkanethiol having an amino group and the alkanethiol having a hydrophilic group can be mixed at an arbitrary ratio, but activated when the ratio of the alkanethiol having an amino group is small. When the binding amount of the carboxyl group-containing polymer is reduced and the proportion of alkanethiol having a hydrophilic group is small, the nonspecific adsorption inhibiting ability is reduced. Therefore, the mixing ratio of the alkanethiol having an amino group and the alkanethiol having a hydrophilic group is preferably in the range of 1/1 to 1 / 1,000,000, and preferably 1/4 to 1 / 10,000. Is more preferable, and the range of 1/10 to 1/1000 is more preferable. From the viewpoint of reducing steric hindrance when reacting with a polymer containing an activated carboxyl group, the molecular length of the alkanethiol having an amino group is preferably longer than the molecular length of the alkanethiol having a hydrophilic group.
本発明で用いるアルカンチオールは、Northwestern大学のGrzybowski教授らによる総説（Curr. Org. Chem., 8, 1763-1797(2004).）およびその引用文献に基づいて合成された化合物を用いても良く、また市販の化合物を用いてもよい。これらの化合物は、同仁化学（株）、Aldrich社、SensoPath Technologies社、Frontier Scientific Inc.社等から購入可能である。本発明においてアルカンチオールの酸化生成物であるジスルフィド化合物は、アルカンチオールと同様に用いることが可能である。 The alkanethiol used in the present invention may be a compound synthesized based on a review by Prof. Grzybowski et al. Of Northwestern University (Curr. Org. Chem., 8, 1763-1797 (2004).) And its cited references. Commercially available compounds may also be used. These compounds can be purchased from Dojindo Co., Ltd., Aldrich, SensoPath Technologies, Frontier Scientific Inc., etc. In the present invention, the disulfide compound that is an oxidation product of alkanethiol can be used in the same manner as alkanethiol.
本発明では、基板上の自己組織化単分子膜に対して、以下に記載するような疎水性高分子又は水溶性高分子を結合してもよい。 In the present invention, a hydrophobic polymer or a water-soluble polymer as described below may be bonded to the self-assembled monolayer on the substrate.
本発明で用いることができる疎水性高分子化合物は、一般的には吸水性を有しないか吸水性が低い高分子化合物であり、水への溶解度（２５℃）は好ましくは１０％以下であり、より好ましくは１％以下であり、最も好ましくは０．１％以下である。 The hydrophobic polymer compound that can be used in the present invention is generally a polymer compound that has no water absorption or low water absorption, and its solubility in water (25 ° C.) is preferably 10% or less. More preferably, it is 1% or less, and most preferably 0.1% or less.
疎水性高分子としては、具体的には、ポリアクリル酸誘導体、ポリメタクリル酸誘導体、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリブタジエン、ポリメチルペンテン、シクロオレフィンポリマー、ポリスチレン（ＰＳ）、アクリロニトリル／ブタジエン／スチレン共重合体（ＡＢＳ）、スチレン／無水マレイン酸共重合体・ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリエチレンナフタレート（ＰＥＮ）、ナイロン６、ナイロン６６、酢酸セルロース（ＴＡＣ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、変性ポリフェニレンエーテル（ｍ−ＰＰＥ）、ポリフェニレンサルファイド（ＰＰＳ）、ポリエーテルケトン（ＰＥＫ）、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、ポリスルホン（ＰＳＦ）、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、ポリフェニレンサルファイド（ＰＰＳ）、液晶ポリマー（ＬＣＰ）などを挙げることができる。これら疎水性高分子表面に、生理活性物質を化学的に固定化できる反応性基とカチオン性基とを導入した場合も、等電点以上の生理活性物質を２次元表面にプレコンセントレーションし、結合することが可能となる。 Specific examples of the hydrophobic polymer include polyacrylic acid derivatives, polymethacrylic acid derivatives, polyethylene (PE), polypropylene (PP), polybutadiene, polymethylpentene, cycloolefin polymer, polystyrene (PS), acrylonitrile / butadiene. / Styrene copolymer (ABS), styrene / maleic anhydride copolymer / polyvinyl chloride (PVC), polyethylene terephthalate (PET), polyethylene naphthalate (PEN), nylon 6, nylon 66, cellulose acetate (TAC), Polycarbonate (PC), modified polyphenylene ether (m-PPE), polyphenylene sulfide (PPS), polyether ketone (PEK), polyether ether ketone (PEEK), polysulfone (PSF), polyether Sulfone (PES), polyphenylene sulfide (PPS), and the like a liquid crystal polymer (LCP). Even when a reactive group capable of chemically immobilizing a physiologically active substance and a cationic group are introduced on the surface of these hydrophobic polymers, a physiologically active substance having an isoelectric point or higher is preconcentrated on the two-dimensional surface, It becomes possible to combine.
疎水性高分子化合物の基板へのコーティングは常法によって行うことができ、例えば、スピン塗布、エアナイフ塗布、バー塗布、ブレード塗布、スライド塗布、カーテン塗布、さらにはスプレー法、蒸着法、キャスト法、浸漬法等によって行うことができる。 Coating of the hydrophobic polymer compound on the substrate can be performed by a conventional method, for example, spin coating, air knife coating, bar coating, blade coating, slide coating, curtain coating, spraying, vapor deposition, casting, It can be performed by an immersion method or the like.
水溶性高分子としては、デキストラン誘導体、デンプン誘導体、セルロース誘導体、ゼラチン等の天然高分子、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド誘導体、ポリメチルビニルエーテル等の合成高分子等が挙げられる。先に記載した疎水性高分子も、カチオン性基の導入率が高い場合は水溶性高分子となる。バイオセンサーへの応用との観点からは、水溶性天然高分子が好ましく、デキストラン誘導体が特に好ましい。 Examples of the water-soluble polymer include natural polymers such as dextran derivatives, starch derivatives, cellulose derivatives, and gelatin, and synthetic polymers such as polyvinyl alcohol, polyethylene glycol, polyvinyl pyrrolidone, polyacrylamide derivatives, and polymethyl vinyl ether. The hydrophobic polymer described above also becomes a water-soluble polymer when the introduction rate of the cationic group is high. From the viewpoint of application to a biosensor, a water-soluble natural polymer is preferable, and a dextran derivative is particularly preferable.
表面に結合された水溶性高分子は３次元ヒドロゲルを形成する。この３次元ヒドロゲルに反応性官能基が導入された場合、生理活性物質を３次元的に固定化することが可能となることが特許文献１に記載されている。３次元的な固定化は２次元表面への固定化と比較して、生理活性物質の結合量が多くなるため、バイオセンサー用途を考えた場合、極めて有利である。このような観点から本発明では、１級または２級アミノ基を有する３次元ヒドロゲルにより、生理活性物質を固定することが好ましい。 The water-soluble polymer bound to the surface forms a three-dimensional hydrogel. Patent Document 1 describes that when a reactive functional group is introduced into this three-dimensional hydrogel, a physiologically active substance can be three-dimensionally immobilized. Three-dimensional immobilization increases the amount of binding of a physiologically active substance compared to immobilization on a two-dimensional surface, and is extremely advantageous when considering biosensor applications. From such a viewpoint, in the present invention, it is preferable to fix the physiologically active substance by a three-dimensional hydrogel having a primary or secondary amino group.
本発明では、生理活性物質を生理活性物質の等電点以上のｐＨでプレコンセントレーションさせた後に、該生理活性物質を化学的に固定化することが可能な１級または２級アミノ基を有するポリマーを使用する。 In the present invention, after preconcentrating a physiologically active substance at a pH equal to or higher than the isoelectric point of the physiologically active substance, the physiologically active substance has a primary or secondary amino group capable of chemically immobilizing the physiologically active substance. Use polymer.
本発明に用いられるポリマーに対する官能基の導入方法についても特に制約はなく、１級または２級アミノ基を有するモノマーの重合反応を行って重合体を製造してもよいし、予め重合体を製造した後にいわゆる高分子反応により、１級または２級アミノ基を導入してもよい。 The method for introducing a functional group into the polymer used in the present invention is not particularly limited, and a polymer may be produced by polymerizing a monomer having a primary or secondary amino group, or a polymer is produced in advance. Then, a primary or secondary amino group may be introduced by a so-called polymer reaction.
本発明に用いることができる１級アミノ基含有モノマーとしては、アミノメチル（メタ）アクリレート、アミノエチル（メタ）アクリレート、アミノプロピル（メタ）アクリレート、アミノブチル（メタ）アクリレート、ｐ−アミノスチレン、アリルアミン、２級アミノ基含有モノマーとしては、例えば、モノメチルアミノエチル（メタ）アクリレート、Ｎ−メチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ−エチル（メタ）アクリルアミド，Ｎ−メチロールアクリルアミド、Ｎ−（４−アニリノフェニル）メタアクリルアミド等が挙げられる。 Examples of the primary amino group-containing monomer that can be used in the present invention include aminomethyl (meth) acrylate, aminoethyl (meth) acrylate, aminopropyl (meth) acrylate, aminobutyl (meth) acrylate, p-aminostyrene, and allylamine. Examples of the secondary amino group-containing monomer include monomethylaminoethyl (meth) acrylate, N-methyl (meth) acrylamide, N-ethyl (meth) acrylamide, N-methylol acrylamide, and N- (4-anilinophenyl). And methacrylamide.
本発明に用いられるポリマーは、１級または２級アミノ基を有するモノマー以外に、他のモノマー成分が共重合されていても良い。本発明に用いられる、１級または２級アミノ基以外の、他のモノマー成分としては、以下のモノマーが挙げられる。 The polymer used in the present invention may be copolymerized with other monomer components in addition to the monomer having a primary or secondary amino group. Examples of other monomer components other than the primary or secondary amino group used in the present invention include the following monomers.
アクリル酸エステル類、メタクリル酸エステル類、エチレン性不飽和カルボン酸のアミド類：アクリルアミド、メタクリルアミド、Ｎ−アクリロイルモルホリン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸（もしくはその塩）等、芳香族単量体：スチレン、ビニルトルエン、ｐ−ｔ−ブチルスチレン、ビニルナフタレン等、その他のビニル単量体：エチレン、プロピレン、塩化ビニル、塩化ビニリデン、トリフロロエチレン、トリフロロクロロエチレン、酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル、ビニルアルコール、Ｎ−ビニルピロリドン、Ｎ−ビニルアセトアミド、アクリロニトリル、メタクリロニトリル等。ノニオン性基を有するモノマー：２−ヒドロキシエチルアクリレート、２−ヒドロキシエチルメタクリレート、ヒドロキシプロピルアクリレート、ヒドロキシプロピルメタクリレート、２−ヒドロキシ−３−クロロプロピルアクリレート、β−ヒドロキシエチル−β′−アクリロイルオキシエチルフタレート、１，４−ブチレングリコールモノアクリレート、ヒドロキシスチレン、アリルアルコール、メタアリルアルコール、イソプロペニルアルコール、１−ブテニルアルコール等。両性イオン基を有するモノマー： [２−(メタクリロイルオキシ)エチル] ジメチル−（３−スルホプロピル）アンモニウムヒドロキシド 、［２−（メタクリロイルオキシ）エチル］ホスホリルコリン等。 Acrylic esters, methacrylic esters, amides of ethylenically unsaturated carboxylic acids: acrylamide, methacrylamide, N-acryloylmorpholine, N, N-dimethylacrylamide, 2-acrylamido-2-methylpropanesulfonic acid (or its) Salt), aromatic monomers: styrene, vinyl toluene, pt-butyl styrene, vinyl naphthalene, etc. Other vinyl monomers: ethylene, propylene, vinyl chloride, vinylidene chloride, trifluoroethylene, trifluorochloro Ethylene, vinyl acetate, vinyl propionate, vinyl alcohol, N-vinylpyrrolidone, N-vinylacetamide, acrylonitrile, methacrylonitrile and the like. Monomers having a nonionic group: 2-hydroxyethyl acrylate, 2-hydroxyethyl methacrylate, hydroxypropyl acrylate, hydroxypropyl methacrylate, 2-hydroxy-3-chloropropyl acrylate, β-hydroxyethyl-β′-acryloyloxyethyl phthalate, 1,4-butylene glycol monoacrylate, hydroxystyrene, allyl alcohol, methallyl alcohol, isopropenyl alcohol, 1-butenyl alcohol and the like. Monomers having zwitterionic groups: [2- (methacryloyloxy) ethyl] dimethyl- (3-sulfopropyl) ammonium hydroxide, [2- (methacryloyloxy) ethyl] phosphorylcholine and the like.
本発明に用いられる１級または２級アミノ基を有する水溶性高分子としては、具体的には、キトサン、ポリリジン、ポリエチレンイミン、ポリビニルアミン、ポリアリルアミン等が挙げられる。 Specific examples of the water-soluble polymer having a primary or secondary amino group used in the present invention include chitosan, polylysine, polyethyleneimine, polyvinylamine, and polyallylamine.
カルボキシル基を有する水溶性高分子を活性化した後、ポリアミンと反応させることにより得られる、１級または２級アミノ基を有する水溶性高分子もまた、本発明に好ましく用いることができる。ポリアミンとしては具体的に、エチレンジアミン、テトラエチレンジアミン、オクタメチレンジアミン、デカメチレンジアミン、ピペラジン、トリエチレンジアミン、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラアミン、ジヘキサメチレントリアミン、１．４−ジアミノシクロヘキサン等の脂肪族ジアミン、パラフェニレンジアミン、メタフェニレンジアミン、パラキシリレンジアミン、メタキシリレンジアミン、４，４‘−ジアモノビフェニル、４，４’−ジアミノジフェニルメタン、４，４‘−ジアミノジフェニルケトン、４，４‘−ジアミノジフェニルスルホン酸等の芳香族ジアミン、ジエチレントリアミン、トリエチレンテトラミン、テトラエチレンペンタミン、ペンタエチレンヘキサミン、スペルミジン、スペルミン、ポリエチレンイミン等のポリアミンを好ましく用いることが可能である。バイオセンサー表面の親水性を向上させるという観点から、２つのアミノ基をエチレングリコールユニットで連結した化合物（一般式１）を用いることも可能である。 A water-soluble polymer having a primary or secondary amino group obtained by activating a water-soluble polymer having a carboxyl group and then reacting with a polyamine can also be preferably used in the present invention. Specific examples of polyamines include aliphatic diamines such as ethylenediamine, tetraethylenediamine, octamethylenediamine, decamethylenediamine, piperazine, triethylenediamine, diethylenetriamine, triethylenetetraamine, dihexamethylenetriamine, 1.4-diaminocyclohexane, para Phenylenediamine, metaphenylenediamine, paraxylylenediamine, metaxylylenediamine, 4,4′-diamonobiphenyl, 4,4′-diaminodiphenylmethane, 4,4′-diaminodiphenyl ketone, 4,4′-diaminodiphenyl Aromatic diamines such as sulfonic acid, diethylenetriamine, triethylenetetramine, tetraethylenepentamine, pentaethylenehexamine, spermidine, spermine, polyethylene It is possible to use preferably a polyamine imine. From the viewpoint of improving the hydrophilicity of the biosensor surface, it is also possible to use a compound (general formula 1) in which two amino groups are linked by an ethylene glycol unit.
本発明で用いるカルボキシル基を含有するポリマーとしては、カルボキシル基含有合成高分子およびカルボキシル基含有天然高分子を用いることが可能である。カルボキシル基含有合成高分子としては、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、およびこれらの共重合体、例えば特開昭５９−４４６１５号、特公昭５４−３４３２７号、特公昭５８−１２５７７号、特公昭５４−２５９５７号、特開昭５９−５３８３６号、特開昭５９−７１０４８号明細書に記載されているようなメタクリル酸共重合体、アクリル酸共重合体、イタコン酸共重合体、クロトン酸共重合体、マレイン酸共重合体、部分エステル化マレイン酸共重合、水酸基を有するポリマーに酸無水物を付加させたものなどが挙げられる。カルボキシル基含有天然高分子としては、天然植物からの抽出物、微生物発酵の生産物、酵素による合成物、または化学合成物の何れであってもよく、具体的には、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ヘパリン、デルマタン酸硫酸、カルボキシメチルセルロース、カルボキシエチルセルロース、セロウロン酸、カルボキシメチルキチン、カルボキシメチルデキストラン、カルボキシメチルデンプン等の多糖類、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸等のポリアミノ酸が挙げられる。カルボキシル基含有天然多糖類は、市販の化合物を用いることが可能であり、具体的には、カルボキシメチルデキストランであるＣＭＤ、ＣＭＤ−Ｌ、ＣＭＤ−Ｄ４０（名糖産業社製）、カルボキシメチルセルロースナトリウム（和光純薬社製）、アルギン酸ナトリウム（和光純薬社製）、等を挙げることができる。 As the polymer containing a carboxyl group used in the present invention, a carboxyl group-containing synthetic polymer and a carboxyl group-containing natural polymer can be used. Examples of the carboxyl group-containing synthetic polymer include polyacrylic acid, polymethacrylic acid, and copolymers thereof, such as JP-A-59-44615, JP-B-54-34327, JP-B-58-12777, and JP-B-54. No. 25957, JP-A-59-53836, JP-A-59-71048, methacrylic acid copolymer, acrylic acid copolymer, itaconic acid copolymer, crotonic acid copolymer Examples thereof include a polymer, a maleic acid copolymer, a partially esterified maleic acid copolymer, and a polymer having a hydroxyl group to which an acid anhydride is added. The carboxyl group-containing natural polymer may be any of an extract from a natural plant, a product of microbial fermentation, a synthetic product by enzyme, or a chemical synthetic product. Specifically, hyaluronic acid, chondroitin sulfate, Examples thereof include polysaccharides such as heparin, sulfuric acid dermatanate, carboxymethylcellulose, carboxyethylcellulose, ceurouronic acid, carboxymethylchitin, carboxymethyldextran and carboxymethyl starch, and polyamino acids such as polyglutamic acid and polyaspartic acid. As the carboxyl group-containing natural polysaccharide, a commercially available compound can be used. Specifically, carboxymethyldextran CMD, CMD-L, CMD-D40 (manufactured by Meisei Sangyo Co., Ltd.), carboxymethylcellulose sodium ( Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), sodium alginate (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), and the like.
カルボキシル基を含有するポリマーは、好ましくはカルボキシル基を含有する多糖類であり、より好ましくはカルボキシメチルデキストランである。 The polymer containing a carboxyl group is preferably a polysaccharide containing a carboxyl group, more preferably carboxymethyl dextran.
本発明に用いるカルボキシル基を含有するポリマーの分子量は特に制限されないが、平均分子量が１０００〜５００００００であることが好ましく、平均分子量が１００００〜２００００００であることがより好ましく、平均分子量が１０００００〜１００００００であることがさらに好ましい。この範囲より平均分子量が小さい場合には生理活性物質の固定量が小さくなってしまい、この範囲より平均分子量が大きい場合には高い溶液粘度のため取り扱いが困難となる。 Although the molecular weight of the polymer containing a carboxyl group used in the present invention is not particularly limited, the average molecular weight is preferably 1,000 to 5,000,000, more preferably 10,000 to 2,000,000, and the average molecular weight is 100,000 to 1,000,000. More preferably it is. When the average molecular weight is smaller than this range, the fixed amount of the physiologically active substance becomes small, and when the average molecular weight is larger than this range, the handling becomes difficult due to the high solution viscosity.
本発明に使用するポリマーは、水溶液中の膜厚が１ｎｍ以上300ｎｍ以下であることが好ましい。膜厚が薄いと生理活性物質固定量が減少し、またセンサー表面の水和層が薄くなるため生理活性物質自身の変性で被検体物質との相互作用が検出しにくくなる。膜厚が厚いと被検体物質が膜内に拡散する障害となり、また特にセンサー基板の親水性高分子固定面の反対側から相互作用を検出する場合は検出表面から相互作用形成部までの距離が長くなり、検出感度が低くなる。水溶液中の親水性高分子膜厚はＡＦＭ、エリプソメトリーなどで評価することができる。 The polymer used in the present invention preferably has a film thickness in an aqueous solution of 1 nm to 300 nm. If the film thickness is thin, the amount of the physiologically active substance immobilized decreases, and the hydrated layer on the sensor surface becomes thin, so that the interaction with the analyte substance becomes difficult to detect due to the denaturation of the physiologically active substance itself. When the film thickness is thick, it becomes an obstacle that the analyte substance diffuses into the film, and the distance from the detection surface to the interaction forming part is particularly large when detecting the interaction from the opposite side of the hydrophilic polymer fixing surface of the sensor substrate. Longer and lower detection sensitivity. The hydrophilic polymer film thickness in the aqueous solution can be evaluated by AFM, ellipsometry, or the like.
カルボキシル基を含有するポリマーを活性化する方法としては、公知の手法、例えば、水溶性カルボジイミドである1-(3-Dimethylaminopropyl)-3 ethylcarbodiimide（EDC）とN-Hydroxysuccinimide（NHS）により活性化する方法、EDC単独で活性化する方法、特願２００４−２３８３９６号（特開２００６−５８０７１号公報）に記載の方法（即ち、特定の構造を有するウロニウム塩、ホスホニウム塩、又はトリアジン誘導体のいずれかの化合物を用いてカルボキシル基を活性化する方法）、特願２００４−２７５０１２号（特開２００６−９０７８１号公報）に記載の方法（即ち、カルボジイミド誘導体又はその塩で活性化し、水酸基を有する含窒素ヘテロ芳香族化合物、電子吸引性基を有するフェノール誘導体又はチオール基を有する芳香族化合物のいずれかの化合物を用いてカルボキシル基を活性化する方法）等を好ましく用いることができる。これらの手法で活性化されたカルボキシル基を含有するポリマーを、アミノ基を有する基板と反応させることで、本発明のバイオセンサーを製造することが可能となる。 As a method of activating a polymer containing a carboxyl group, a known method, for example, a method of activating with water-soluble carbodiimide 1- (3-Dimethylaminopropyl) -3 ethylcarbodiimide (EDC) and N-Hydroxysuccinimide (NHS) , A method of activating by EDC alone, a method described in Japanese Patent Application No. 2004-238396 (Japanese Patent Laid-Open No. 2006-58071) (that is, any compound of uronium salt, phosphonium salt, or triazine derivative having a specific structure) A method for activating a carboxyl group using an acid), a method described in Japanese Patent Application No. 2004-275012 (Japanese Patent Application Laid-Open No. 2006-90781) (ie, a nitrogen-containing heteroaromatic having a hydroxyl group activated by a carbodiimide derivative or a salt thereof) Of aromatic compounds having thiol groups, phenol derivatives having electron withdrawing groups Things a carboxyl group can be preferably used a method) or the like to activate with. By reacting a polymer containing a carboxyl group activated by these methods with a substrate having an amino group, the biosensor of the present invention can be produced.
カルボキシル基を有する水溶性高分子のようなポリアニオンと水溶性ポリアミンのようなポリカチオンとを水中で混合した場合、水不溶性のポリイオンコンプレックスが生成することが一般的に知られている。それゆえ、本発明においてカルボキシル基を有する水溶性高分子と水溶性ポリアミンは、無溶媒あるいは非水溶媒中で反応させることが望ましい。 It is generally known that when a polyanion such as a water-soluble polymer having a carboxyl group and a polycation such as a water-soluble polyamine are mixed in water, a water-insoluble polyion complex is formed. Therefore, in the present invention, it is desirable that the water-soluble polymer having a carboxyl group and the water-soluble polyamine are reacted in a solvent-free or non-aqueous solvent.
本発明によれば、１級または２級アミノ基を有する表面に、等電点以上のｐＨを有する生理活性物質含有液を接触させた後、カルボン酸活性化剤と接触させることを含む、生理活性物質の固定化方法が提供される。本発明の上記固定化方法においては、表面に１級または２級アミノ基が導入されていることにより、等電点以上のｐＨを有する生理活性物質含有液を接触させた場合であっても、静電引力によって生理活性物質が測定チップの表面上に濃縮されるプレコンセントレーション効果を得ることができる。 According to the present invention, the method includes contacting a surface having a primary or secondary amino group with a physiologically active substance-containing liquid having a pH equal to or higher than the isoelectric point and then contacting with a carboxylic acid activator. A method for immobilizing an active substance is provided. In the above-described immobilization method of the present invention, even when a physiologically active substance-containing liquid having a pH equal to or higher than the isoelectric point is contacted by introducing a primary or secondary amino group on the surface, A preconcentration effect can be obtained in which the physiologically active substance is concentrated on the surface of the measurement chip by electrostatic attraction.
本発明で言うバイオセンサーとは最も広義に解釈され、生体分子間の相互作用を電気的信号等の信号に変換して、対象となる物質を測定・検出するセンサーを意味する。通常のバイオセンサーは、検出対象とする化学物質を認識するレセプター部位と、そこに発生する物理的変化又は化学的変化を電気信号に変換するトランスデューサー部位とから構成される。生体内には、互いに親和性のある物質として、酵素／基質、酵素／補酵素、抗原／抗体、ホルモン／レセプターなどがある。バイオセンサーでは、これら互いに親和性のある物質の一方を基板に固定化して分子認識物質として用いることによって、対応させるもう一方の物質を選択的に計測するという原理を利用している。 The biosensor referred to in the present invention is interpreted in the broadest sense, and means a sensor that measures and detects a target substance by converting an interaction between biomolecules into a signal such as an electrical signal. A normal biosensor is composed of a receptor site for recognizing a chemical substance to be detected and a transducer site for converting a physical change or chemical change generated therein into an electrical signal. In the living body, there are enzymes / substrates, enzymes / coenzymes, antigens / antibodies, hormones / receptors and the like as substances having affinity for each other. Biosensors use the principle that one of these substances having affinity with each other is immobilized on a substrate and used as a molecular recognition substance, thereby selectively measuring the other substance to be matched.
本発明のバイオセンサーでは、金属表面又は金属膜を基板として用いることができる。金属表面あるいは金属膜を構成する金属としては、例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用を考えた場合、表面プラズモン共鳴が生じ得るようなものであれば特に限定されない。好ましくは金、銀、銅、アルミニウム、白金等の自由電子金属が挙げられ、特に金が好ましい。それらの金属は単独又は組み合わせて使用することができる。また、上記基板への付着性を考慮して、基板と金属からなる層との間にクロム等からなる介在層を設けてもよい。 In the biosensor of the present invention, a metal surface or a metal film can be used as a substrate. The metal constituting the metal surface or metal film is not particularly limited as long as surface plasmon resonance can occur when, for example, a surface plasmon resonance biosensor is considered. Preferred examples include free electron metals such as gold, silver, copper, aluminum, and platinum, with gold being particularly preferred. These metals can be used alone or in combination. In consideration of adhesion to the substrate, an intervening layer made of chromium or the like may be provided between the substrate and the layer made of metal.
金属膜の膜厚は任意であるが、例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用を考えた場合、０．１ｎｍ以上５００ｎｍ以下であるのが好ましく、特に１ｎｍ以上２００ｎｍ以下であるのが好ましい。５００ｎｍを超えると、媒質の表面プラズモン現象を十分検出することができない。また、クロム等からなる介在層を設ける場合、その介在層の厚さは、０．１ｎｍ以上１０ｎｍ以下であるのが好ましい。 Although the thickness of the metal film is arbitrary, for example, when considering use for a surface plasmon resonance biosensor, the thickness is preferably 0.1 nm to 500 nm, particularly preferably 1 nm to 200 nm. If it exceeds 500 nm, the surface plasmon phenomenon of the medium cannot be sufficiently detected. Moreover, when providing the intervening layer which consists of chromium etc., it is preferable that the thickness of the intervening layer is 0.1 to 10 nm.
金属膜の形成は常法によって行えばよく、例えば、スパッタ法、蒸着法、イオンプレーティング法、電気めっき法、無電解めっき法等によって行うことができる。 The metal film may be formed by a conventional method, for example, sputtering, vapor deposition, ion plating, electroplating, electroless plating, or the like.
金属膜は好ましくは基板上に配置されている。ここで、「基板上に配置される」とは、金属膜が基板上に直接接触するように配置されている場合のほか、金属膜が基板に直接接触することなく、他の層を介して配置されている場合をも含む意味である。本発明で使用することができる基板としては例えば、表面プラズモン共鳴バイオセンサー用を考えた場合、一般的にはＢＫ７等の光学ガラス、あるいは合成樹脂、具体的にはポリメチルメタクリレート、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、シクロオレフィンポリマーなどのレーザー光に対して透明な材料からなるものが使用できる。このような基板は、好ましくは、偏光に対して異方性を示さずかつ加工性の優れた材料が望ましい。 The metal film is preferably disposed on the substrate. Here, “arranged on the substrate” means that the metal film is arranged so as to be in direct contact with the substrate, and that the metal film is not directly in contact with the substrate, but through other layers. This also includes the case where they are arranged. As a substrate that can be used in the present invention, for example, in the case of a surface plasmon resonance biosensor, generally, optical glass such as BK7, or synthetic resin, specifically polymethyl methacrylate, polyethylene terephthalate, polycarbonate A material made of a material transparent to laser light such as a cycloolefin polymer can be used. Such a substrate is preferably made of a material that does not exhibit anisotropy with respect to polarized light and has excellent processability.
上記のようにして得られたバイオセンサーにおいては、表面に存在するアミノ基を介して生理活性物質を共有結合させることによって、金属表面又は金属膜に生理活性物質を固定化することができる。 In the biosensor obtained as described above, the physiologically active substance can be immobilized on the metal surface or metal film by covalently binding the physiologically active substance via an amino group present on the surface.
本発明におけるバイオセンサー表面に対し生理活性物質を接触させることにより、バイオセンサーの表面に存在するアミノ基と生理活性物質とが共有結合するため、バイオセンサーに生理活性物質を固定化することが可能となる。 By bringing a bioactive substance into contact with the biosensor surface in the present invention, an amino group present on the biosensor surface is covalently bonded to the bioactive substance, so that the bioactive substance can be immobilized on the biosensor. It becomes.
本発明において、生理活性物質の固定化基として、ポリマーに導入する反応基は、アミノ基などの官能基の他に、例えば、ビオチン結合性タンパク（アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン等）、プロテインA、プロテインG、抗原、抗体（例えば、抗GST抗体等の公知のtag抗体）などの生理活性物質をあらかじめ固定し、この生理活性物質の上に、さらに下記に示すような生理活性物質を固定化する態様が可能である。また、ポリマーにアルカンを導入した固定化層を用いれば、脂質などの膜構造を有した生理活性物質を固定することが可能になる。また、用途に応じて、ポリマー鎖の長さ、ポリマーの厚み、ポリマーの密度、あるいは、ポリマーに導入する反応基の量を調整することにより、多様な蛋白に対応することが可能になる。またポリマーに固定基として、NTA（nitrilotriacetic acid）等などを導入すれば、金属キレートを介してHis-tagリガンド等を固定することができる。 In the present invention, the reactive group to be introduced into the polymer as an immobilizing group for a physiologically active substance is, for example, a biotin-binding protein (eg, avidin, streptavidin, neutravidin), protein A, in addition to a functional group such as an amino group. , A biologically active substance such as protein G, an antigen, and an antibody (for example, a known tag antibody such as an anti-GST antibody) is immobilized in advance, and a physiologically active substance as shown below is further immobilized on the physiologically active substance. Embodiments are possible. In addition, if an immobilization layer in which alkane is introduced into a polymer is used, a physiologically active substance having a membrane structure such as lipid can be immobilized. In addition, by adjusting the length of the polymer chain, the thickness of the polymer, the density of the polymer, or the amount of reactive groups introduced into the polymer, it is possible to deal with various proteins depending on the application. If NTA (nitrilotriacetic acid) or the like is introduced into the polymer as a fixing group, the His-tag ligand or the like can be fixed via a metal chelate.
本発明において固定される生理活性物質としては、測定対象物と相互作用するものであれば特に限定されず、例えば免疫蛋白質、酵素、微生物、核酸、低分子有機化合物、非免疫蛋白質、免疫グロブリン結合性蛋白質、糖結合性蛋白質、糖を認識する糖鎖、脂肪酸もしくは脂肪酸エステル、あるいはリガンド結合能を有するポリペプチドもしくはオリゴペプチドなどが挙げられる。 The physiologically active substance immobilized in the present invention is not particularly limited as long as it interacts with the measurement object. For example, immune protein, enzyme, microorganism, nucleic acid, low molecular organic compound, non-immune protein, immunoglobulin binding And a sugar chain, a sugar chain that recognizes sugar, a fatty acid or a fatty acid ester, or a polypeptide or oligopeptide having a ligand binding ability.
免疫蛋白質としては、測定対象物を抗原とする抗体やハプテンなどを例示することができる。抗体としては、種々の免疫グロブリン、即ちＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤを使用することができる。具体的には、測定対象物がヒト血清アルブミンであれば、抗体として抗ヒト血清アルブミン抗体を使用することができる。また、農薬、殺虫剤、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、抗生物質、麻薬、コカイン、ヘロイン、クラック等を抗原とする場合には、例えば抗アトラジン抗体、抗カナマイシン抗体、抗メタンフェタミン抗体、あるいは病原性大腸菌の中でＯ抗原26、86、55、111 、157 などに対する抗体等を使用することができる。 Examples of immunity proteins include antibodies and haptens that use the measurement target as an antigen. As the antibody, various immunoglobulins, that is, IgG, IgM, IgA, IgE, IgD can be used. Specifically, when the measurement target is human serum albumin, an anti-human serum albumin antibody can be used as the antibody. In addition, when using pesticides, insecticides, methicillin-resistant Staphylococcus aureus, antibiotics, narcotics, ***e, heroin, cracks, etc. as antigens, for example, anti-atrazine antibodies, anti-kanamycin antibodies, anti-methamphetamine antibodies, or pathogenic E. coli Among them, antibodies against O antigens 26, 86, 55, 111, 157 and the like can be used.
酵素としては、測定対象物又は測定対象物から代謝される物質に対して活性を示すものであれば、特に限定されることなく、種々の酵素、例えば酸化還元酵素、加水分解酵素、異性化酵素、脱離酵素、合成酵素等を使用することができる。具体的には、測定対象物がグルコースであれば、グルコースオキシダーゼを、測定対象物がコレステロールであれば、コレステロールオキシダーゼを使用することができる。また、農薬、殺虫剤、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、抗生物質、麻薬、コカイン、ヘロイン、クラック等を測定対象物とする場合には、それらから代謝される物質と特異的反応を示す、例えばアセチルコリンエステラーゼ、カテコールアミンエステラーゼ、ノルアドレナリンエステラーゼ、ドーパミンエステラーゼ等の酵素を使用することができる。 The enzyme is not particularly limited as long as it shows activity against the measurement object or a substance metabolized from the measurement object, and various enzymes such as oxidoreductase, hydrolase, isomerase , A desorbing enzyme, a synthesizing enzyme, etc. Specifically, if the measurement object is glucose, glucose oxidase can be used, and if the measurement object is cholesterol, cholesterol oxidase can be used. Also, when pesticides, insecticides, methicillin-resistant Staphylococcus aureus, antibiotics, narcotics, ***e, heroin, cracks, etc. are used as measurement objects, they exhibit a specific reaction with substances metabolized from them, such as acetylcholinesterase. Enzymes such as catecholamine esterase, noradrenaline esterase and dopamine esterase can be used.
微生物としては、特に限定されることなく、大腸菌をはじめとする種々の微生物を使用することができる。
核酸としては、測定の対象とする核酸と相補的にハイブリダイズするものを使用することができる。核酸は、ＤＮＡ（ｃＤＮＡを含む）、ＲＮＡのいずれも使用できる。ＤＮＡの種類は特に限定されず、天然由来のＤＮＡ、遺伝子組換え技術により調製した組換えＤＮＡ、又は化学合成ＤＮＡの何れでもよい。
低分子有機化合物としては通常の有機化学合成の方法で合成することができる任意の化合物が挙げられる。
The microorganism is not particularly limited, and various microorganisms including Escherichia coli can be used.
As the nucleic acid, one that hybridizes complementarily with the nucleic acid to be measured can be used. As the nucleic acid, either DNA (including cDNA) or RNA can be used. The type of DNA is not particularly limited, and may be any of naturally derived DNA, recombinant DNA prepared by gene recombination technology, or chemically synthesized DNA.
Examples of the low molecular weight organic compound include any compound that can be synthesized by an ordinary organic chemical synthesis method.
非免疫蛋白質としては、特に限定されることなく、例えばアビジン（ストレプトアビジン）、ビオチン又はレセプターなどを使用できる。
免疫グロブリン結合性蛋白質としては、例えばプロテインＡあるいはプロテインＧ、リウマチ因子（ＲＦ）等を使用することができる。
糖結合性蛋白質としては、レクチン等が挙げられる。
脂肪酸あるいは脂肪酸エステルとしては、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、ステアリン酸エチル、アラキジン酸エチル、ベヘン酸エチル等が挙げられる。
The non-immune protein is not particularly limited, and for example, avidin (streptavidin), biotin or a receptor can be used.
As the immunoglobulin-binding protein, for example, protein A or protein G, rheumatoid factor (RF) and the like can be used.
Examples of sugar-binding proteins include lectins.
Examples of the fatty acid or fatty acid ester include stearic acid, arachidic acid, behenic acid, ethyl stearate, ethyl arachidate, and ethyl behenate.
これらの生理活性物質は、生理活性物質を含む溶液を親水性高分子が固定された基板上に塗布し、乾燥することによって固定化することが好ましい。 These physiologically active substances are preferably immobilized by applying a solution containing the physiologically active substance onto a substrate on which a hydrophilic polymer is immobilized and drying.
生理活性物質を含む溶液（塗布液）の濃度は、基板表面に固定する生理活性物質の濃度が高い方が好ましい。生理活性物質により異なるが、０.１ｍｇ/ｍＬから１０ｍｇ/ｍＬで使用することが好ましく、さらに好ましくは１ｍｇ/ｍＬから１０ｍｇ/ｍＬである。 The concentration of the solution (coating solution) containing the physiologically active substance is preferably higher in the concentration of the physiologically active substance immobilized on the substrate surface. Although it varies depending on the physiologically active substance, it is preferably 0.1 mg / mL to 10 mg / mL, more preferably 1 mg / mL to 10 mg / mL.
生理活性物質を含む溶液の乾燥過程において、生理活性物質は塗布した溶液の外周部または、塗布液が乾固直前まで液が残った部分に析出する傾向がある。これにより基板表面に固定される生理活性物質の量に分布が発生し好ましくない。基板表面の生理活性物質固定量を均一にするため、塗布液の粘度は生理活性物質の基板表面への結合を阻害しない範囲で高くすることが好ましい。塗布液粘度を高くすることで、乾燥過程における塗布液中の生理活性物質の基板表面に対して水平方向の移動が抑えられ、結果として生理活性物質固定量のばらつきを抑えられる。乾燥過程における塗布液の粘度は０．９ｃＰ以上に保つことが好ましい。 In the drying process of a solution containing a physiologically active substance, the physiologically active substance tends to be deposited on the outer periphery of the applied solution or on the portion where the liquid remains until just before the coating solution is dried. This undesirably causes a distribution in the amount of the physiologically active substance immobilized on the substrate surface. In order to make the amount of the physiologically active substance immobilized on the substrate surface uniform, it is preferable to increase the viscosity of the coating solution as long as the binding of the physiologically active substance to the substrate surface is not inhibited. By increasing the viscosity of the coating solution, the horizontal movement of the physiologically active substance in the coating solution in the drying process with respect to the substrate surface can be suppressed, and as a result, variations in the amount of physiologically active substance fixed can be suppressed. The viscosity of the coating solution in the drying process is preferably kept at 0.9 cP or higher.
本発明の乾燥する工程とは、生理活性物質を含む溶液の塗布後、その溶液を、静置することによる自然乾燥や、加熱や送風などによって溶液が乾燥する速度を上げ、意図的に乾燥させる工程をいう。ここで、生理活性物質を含む溶液（塗布液）の乾燥速度を上げることは生理活性物質固定量のばらつきを抑えることに効果がある。乾燥速度を上げ、生理活性物質の水平方向の移動速度に対して、十分早く乾燥を終了させることで、生理活性物質が実質的に移動する前に乾燥が終了し、ばらつきを抑えることが可能となる。乾燥速度を上げる方法は特に限定されないが、塗布液温度、乾燥環境温度を上げる、赤外線、レーザーなどの照射で蒸発エネルギーを加える、送風などで乾燥時の溶媒蒸気圧を下げる、溶液を薄層塗布して塗布量に対する蒸発面積を大きくするなどの方法が挙げられる。特に、塗布液が水を含む場合、乾球温度と湿球温度差の大きい環境で乾燥させることで乾燥速度は早くなる。乾球温度と湿球温度との温度差が７℃以上の環境で乾燥させることが好ましく、さらに好ましくは１０℃以上、さらに好ましくは１３．５℃以上である。また、製造工程上、乾燥時間としては１０分以内が好ましく、より好ましくは５分以内、特に好ましくは１分以内である。 The drying step of the present invention means that after application of a solution containing a physiologically active substance, the solution is naturally dried by standing, or the solution is dried by heating or blowing, and the solution is intentionally dried. Refers to a process. Here, increasing the drying rate of a solution (coating solution) containing a physiologically active substance is effective in suppressing variations in the amount of physiologically active substance immobilized. By increasing the drying speed and finishing the drying sufficiently quickly with respect to the horizontal movement speed of the physiologically active substance, it is possible to finish the drying before the physiologically active substance substantially moves and to suppress variations. Become. The method of increasing the drying speed is not particularly limited, but the coating solution temperature and drying environment temperature are increased, the evaporation energy is applied by irradiation with infrared rays, laser, etc., the solvent vapor pressure during drying is lowered by blowing, the solution is applied in a thin layer And a method of increasing the evaporation area with respect to the coating amount. In particular, when the coating solution contains water, the drying speed is increased by drying in an environment having a large difference between the dry bulb temperature and the wet bulb temperature. It is preferable to dry in an environment where the temperature difference between the dry bulb temperature and the wet bulb temperature is 7 ° C or higher, more preferably 10 ° C or higher, and further preferably 13.5 ° C or higher. Further, in the production process, the drying time is preferably within 10 minutes, more preferably within 5 minutes, and particularly preferably within 1 minute.
生理活性物質を含む溶液を塗布する方法としては、特に塗布液を定量吐出するディスペンサーを使用する方法が挙げられる。ディスペンサーの吐出口を基板上で一定速度、一定間隔で動作させることで基板上の任意の場所に均一塗布することが可能である。ディスペンサーで塗布する場合、基板と吐出口の間隔を極力狭くし、塗布液厚みを薄くすることで生理活性物質の厚みを均一にすることができ、また乾燥速度を上げることができ、好ましい。また生理活性物質を含む溶液を塗布する好ましい方法として、スピンコートも挙げられる。この方法は、特に塗布膜厚を薄くする場合に好ましい。均一厚みの溶液を形成した後に乾燥させるため、スピンコーターは回転中の溶媒の蒸発を防ぐことが好ましい。このため、回転時に基板を密閉容器に入れておくなどの方法で、基板周辺の溶媒濃度が高い環境に保つことで、回転中の薄膜形成と薄膜形成後の乾燥速度を制御できるため、特に好ましい。これらの塗布工程後、温度・湿度を一定に保った条件下で乾燥させることが好ましい。 Examples of a method for applying a solution containing a physiologically active substance include a method using a dispenser that dispenses a coating solution in a fixed amount. By operating the discharge port of the dispenser on the substrate at a constant speed and a constant interval, it is possible to uniformly apply to any place on the substrate. In the case of applying with a dispenser, the distance between the substrate and the discharge port is made as narrow as possible, and the thickness of the physiologically active substance can be made uniform by reducing the thickness of the coating solution, and the drying speed can be increased, which is preferable. A preferred method for applying a solution containing a physiologically active substance is spin coating. This method is particularly preferable when the coating film thickness is reduced. In order to dry after forming a solution having a uniform thickness, the spin coater preferably prevents evaporation of the solvent during rotation. For this reason, it is particularly preferable because the thin film formation during the rotation and the drying speed after the thin film formation can be controlled by maintaining the environment in which the solvent concentration around the substrate is high by a method such as placing the substrate in a sealed container at the time of rotation. . After these coating steps, it is preferable to dry under conditions where the temperature and humidity are kept constant.
生理活性物質と被検体物質との相互作用を検出する場合、センサー表面の生理活性物質の固定量の変動は相互作用の定量的、速度論的評価の誤差の原因となる。この誤差を最小限に抑える目的で、生理活性物質の固定量を均一にすることが好ましい。相互作用の検出に使用される基板表面の生理活性物質の固定量のばらつきがＣＶ値（変動係数）（標準偏差／平均値）で１５％以下が好ましく、さらに好ましくは１０％以下である。ＣＶ値は、基板表面の少なくとも２点以上、好ましくは１０点以上、さらに好ましくは１００点以上の固定量から算出することができる。均一性は、生理活性物質を固定する前後のセンサー基板上の物質の量を定量することでも評価可能であるが、生理活性物質と結合することが知られている物質を蛍光標識して、この標識物質をセンサー基板に固定した後に蛍光顕微鏡などを用いて蛍光強度を測定することでも可能である。また、ＳＰＲイメージャー、エリプソメーター、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ、ＡＴＲ−ＩＲ装置などで生理活性物質の定量も可能である。 When detecting the interaction between the physiologically active substance and the analyte, the variation in the amount of the physiologically active substance immobilized on the sensor surface causes an error in the quantitative and kinetic evaluation of the interaction. For the purpose of minimizing this error, it is preferable to make the fixed amount of the physiologically active substance uniform. The variation of the fixed amount of the physiologically active substance on the substrate surface used for the detection of the interaction is preferably 15% or less, more preferably 10% or less in terms of CV value (variation coefficient) (standard deviation / average value). The CV value can be calculated from a fixed amount of at least 2 points on the substrate surface, preferably 10 points or more, more preferably 100 points or more. Uniformity can also be evaluated by quantifying the amount of the substance on the sensor substrate before and after immobilizing the physiologically active substance, but this is done by fluorescently labeling a substance known to bind to the physiologically active substance. It is also possible to measure the fluorescence intensity using a fluorescence microscope after fixing the labeling substance to the sensor substrate. In addition, physiologically active substances can be quantified using an SPR imager, ellipsometer, TOF-SIMS, ATR-IR apparatus or the like.
また、本発明において、基板上に固定化した生理活性物質の保存安定性を向上させる目的で、水素結合を形成しうる残基を有する化合物（以下、化合物Ｓとする）を使用してもよい。 In the present invention, a compound having a residue capable of forming a hydrogen bond (hereinafter referred to as Compound S) may be used for the purpose of improving the storage stability of a physiologically active substance immobilized on a substrate. .
一般に蛋白質などの生理活性物質は水溶液中で水分子が配位することで三次元構造を維持しているが、乾燥されると三次元構造を保持できず失活する。また、基板表面の親水性高分子中に担持されている場合には、乾燥されることで生理活性物質同士が接近し凝集が発生する。本発明の水素結合を形成しうる残基を有する化合物Ｓは、水分子に代って生理活性物質の三次元構造を保持することで失活を抑制、または生理活性物質を被覆して立体効果で凝集を抑制する目的で使用することができる。 In general, physiologically active substances such as proteins maintain a three-dimensional structure by coordinating water molecules in an aqueous solution. However, when dried, they cannot retain the three-dimensional structure and are deactivated. Moreover, when it is carried in the hydrophilic polymer on the surface of the substrate, the physiologically active substances come close to each other and aggregate due to drying. The compound S having a residue capable of forming a hydrogen bond according to the present invention suppresses inactivation by retaining the three-dimensional structure of the physiologically active substance instead of the water molecule, or covers the physiologically active substance to provide a steric effect. Can be used for the purpose of suppressing aggregation.
本発明において水素結合を形成しうる残基を有する化合物Ｓは、水溶液で基板上の生理活性物質を固定した層に添加することが好ましい。添加方法としては、生理活性物質との混合溶液として基板表面に塗布しても良く、生理活性物質を基板表面に固定した後オーバーコートなどによりして添加しても良い。化合物Ｓと生理活性物質との混合溶液として塗布した場合、生理活性物質の固定量ばらつきを抑えることもできる。化合物Ｓ水溶液は薄膜状態で基板に添加することが好ましい。基板上に薄膜を形成させる方法は、公知の方法を用いることが可能であるが、具体的には、エクストルージョンコート法、カーテンコート法、キャスティング法、スクリーン印刷法、スピンコート法、スプレーコート法、スライドビードコート法、スリットアンドスピン方式、スリットコート方式、ダイコート法、ディップコート法、ナイフコート法、ブレードコート法、フローコート法、ロールコート法、ワイヤバーコート方式、転写印刷法、等を用いることが可能である。膜厚制御された塗布膜を簡便に作成可能であることから、本発明において基板上に薄膜を形成させる方法としては、スプレーコート法またはスピンコート法が好ましく、スピンコート法がさらに好ましい。 In the present invention, the compound S having a residue capable of forming a hydrogen bond is preferably added to a layer in which a physiologically active substance on a substrate is fixed with an aqueous solution. As an addition method, it may be applied to the substrate surface as a mixed solution with a physiologically active substance, or may be added by overcoating after fixing the physiologically active substance on the substrate surface. When applied as a mixed solution of Compound S and a physiologically active substance, variation in the amount of the physiologically active substance immobilized can be suppressed. Compound S aqueous solution is preferably added to the substrate in a thin film state. As a method for forming a thin film on a substrate, known methods can be used. Specifically, an extrusion coating method, a curtain coating method, a casting method, a screen printing method, a spin coating method, and a spray coating method. , Slide bead coating method, slit and spin method, slit coating method, die coating method, dip coating method, knife coating method, blade coating method, flow coating method, roll coating method, wire bar coating method, transfer printing method, etc. It is possible. Since a coating film with a controlled film thickness can be easily produced, the method for forming a thin film on a substrate in the present invention is preferably a spray coating method or a spin coating method, and more preferably a spin coating method.
化合物Ｓの塗布液濃度は塗布性、生理活性物質を含む層への浸透の問題がない範囲で特に限定されないが、０．１重量％以上５重量％以下であることが好ましい。また、塗布液は、塗布性、ｐＨ調整の観点で界面活性剤、緩衝剤、有機溶剤、塩などを添加してもよい。 The concentration of the coating solution of Compound S is not particularly limited as long as there is no problem of coating properties and penetration into a layer containing a physiologically active substance, but it is preferably 0.1% by weight or more and 5% by weight or less. In addition, a surfactant, a buffering agent, an organic solvent, a salt, and the like may be added to the coating solution from the viewpoints of coating properties and pH adjustment.
水素結合を形成しうる残基を有する化合物Ｓとしては、常温常圧で不揮発性のものが好ましく、平均分子量が３５０より大きく５００万より小さいものが好ましく、さらに好ましくは１２００以上２００万以下であり、最も好ましくは１２００以上７万以下である。分子内に水酸基を含む化合物Ｓは糖類が好ましく、糖類は、単糖、多糖類でも良い。ｎ糖類の場合ｎが４以上１２００以下であることが好ましく、さらに好ましくはｎが２０以上６００以下である。 The compound S having a residue capable of forming a hydrogen bond is preferably a non-volatile compound at normal temperature and normal pressure, preferably having an average molecular weight of more than 350 and less than 5 million, more preferably 1200 or more and 2 million or less. Most preferably, it is 1200 or more and 70,000 or less. The compound S containing a hydroxyl group in the molecule is preferably a saccharide, and the saccharide may be a monosaccharide or a polysaccharide. In the case of n-saccharides, n is preferably 4 or more and 1200 or less, and more preferably n is 20 or more and 600 or less.
化合物Ｓの平均分子量が低いと基板表面で結晶化して、生理活性物質を固定した親水性高分子層の破壊および生理活性物質の三次元構造の破壊の原因となり、反対に平均分子量が高いと生理活性物質の基板への固定の障害となったり、生理活性物質を含む層に含浸できない、層分離を発生するなどの問題が発生する。 If the average molecular weight of Compound S is low, it will crystallize on the surface of the substrate, causing the destruction of the hydrophilic polymer layer to which the physiologically active substance is immobilized and the three-dimensional structure of the physiologically active substance. Problems such as an obstacle to fixing the active substance to the substrate, impregnation into a layer containing a physiologically active substance, and occurrence of layer separation occur.
基板上に固定した生理活性物質の劣化を抑制する目的で、前記水素結合を形成しうる残基を有する化合物Ｓは、デキストラン骨格、又はポリエチレンオキシド骨格を有することが好ましく、本発明の目的を達成する範囲において、どの置換基を使用してもよい。また、基板上に固定した生理活性物質の劣化を抑制する目的で、解離性基を有しないノニオン性化合物であることが好ましい。また、前記水素結合を形成しうる残基を有する化合物Ｓは水分子との親和性の高い化合物が好ましく、水とｎ-オクタノールとの分配係数ＬｏｇＰ値が１以上であることが好ましい。ＬｏｇＰ値は、ＪＩＳ規格のＺ７２６０−１０７（２０００）「分配係数（1-オクタノール/水）の測定―振とう法」などに記載の方法で測定することができる。 For the purpose of suppressing the deterioration of the physiologically active substance immobilized on the substrate, the compound S having a residue capable of forming a hydrogen bond preferably has a dextran skeleton or a polyethylene oxide skeleton, thereby achieving the object of the present invention. Any substituent may be used as long as it is within the range. Moreover, it is preferable that it is a nonionic compound which does not have a dissociable group for the purpose of suppressing deterioration of the bioactive substance fixed on the board | substrate. The compound S having a residue capable of forming a hydrogen bond is preferably a compound having a high affinity for water molecules, and the partition coefficient LogP value between water and n-octanol is preferably 1 or more. The LogP value can be measured by a method described in JIS standard Z7260-107 (2000) "Measurement of distribution coefficient (1-octanol / water)-shaking method".
具体的な水素結合を形成しうる残基を有する化合物Ｓとしては、ポリビニルアルコールなどの多価アルコール類、コラーゲン、ゼラチン、アルブミンなどのタンパク質、ヒアルロン酸、キチン、キトサン、デンプン、セルロース、アルギン酸、デキストランなど多糖類、ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシド、ポリプロピレングリコール、ポリプロピレンオキシド、プルロニックなどポリエチレンキシ-ポリプロピレンオキシド縮合物などのポリエーテル類、トゥイーン２０、トゥイーン４０、トゥイーン６０、トゥイーン８０などの２種以上の残基から成る化合物、またはこれら化合物の誘導体および重合体などが挙げられる。その内、多糖類、ポリエーテル類が好ましく、多糖類がより好ましい。具体的には、デキストラン、セルロース、トゥイーン２０、トゥイーン４０、トゥイーン６０、トゥイーン８０が好ましく用いられる。さらに、特開２００６−１７０８３２に記載の不揮発性モノマー、不揮発性水溶性オリゴマーを用いることもできる。例えば不揮発性モノマーとしては水酸基が保護基で保護されていてもよいテトロース、ペントース、ヘプトース、ヘキトース及びそのグリコキシドでも良く、メチルグルコシドや水酸基が保護基で保護されていてもよいサイクリトール類でもよい。また不揮発性水溶性オリゴマーが、式（１）、（２）または（３） -[CH2-CH(CONH2)-]n- （１） -[CH2-CH2-O-]n- （２） -[CH2-CH(OH)-]n- （３）（式（１）〜（３）中、ｎは１０〜２００のいずれかの整数を示す。）で表されるオリゴマー、水酸基が保護基で保護されていてもよいｎ糖（但し、２≦ｎ≦１０）のオリゴ糖を用いることもできる。さらに、US２００３／０１７５８２７、DE２０３０６４７６A1に記載の糖類、例えば、トレハロース、スクロース、マルトース、ラクトース、キシリトール、フルクトース、マニトール、グルコース、キシロール、マルトデキストラン、サッカロース、ポリビニルピロリドンなどを使用しても良い。また、これらの化合物Ｓは、本発明において使用している親水性高分子の基本骨格と実質同一であることが好ましい。ここで、基本骨格とは、例えば、糖の環構造のことをいい、官能基や長さが異なっていても、環構造が同一であれば、実質同一であるという。 Specific examples of the compound S having a residue capable of forming a hydrogen bond include polyhydric alcohols such as polyvinyl alcohol, proteins such as collagen, gelatin, and albumin, hyaluronic acid, chitin, chitosan, starch, cellulose, alginic acid, and dextran. Polysaccharides such as Polysaccharides, Polyethylene Glycol, Polyethylene Oxide, Polypropylene Glycol, Polypropylene Oxide, Pluronic and other Polyoxyxy-Polypropylene Oxide Condensates, Tween 20, Tween 40, Tween 60, Tween 80 and Two Residues Or a derivative and a polymer of these compounds. Of these, polysaccharides and polyethers are preferable, and polysaccharides are more preferable. Specifically, dextran, cellulose, tween 20, tween 40, tween 60, and tween 80 are preferably used. Furthermore, the non-volatile monomer and non-volatile water-soluble oligomer described in JP-A-2006-170832 can also be used. For example, the non-volatile monomer may be tetrose, pentose, heptose, hexose and its glycoxide whose hydroxyl group may be protected with a protecting group, or methyl glucoside or cyclitols whose hydroxyl group may be protected with a protecting group. In addition, the nonvolatile water-soluble oligomer is represented by the formula (1), (2) or (3)-[CH2-CH (CONH2)-] n- (1)-[CH2-CH2-O-] n- (2)- [CH2-CH (OH)-] n- (3) (in the formulas (1) to (3), n represents any integer of 10 to 200), and the hydroxyl group is a protecting group. It is also possible to use oligosaccharides of n sugars (where 2 ≦ n ≦ 10) which may be protected. Furthermore, saccharides described in US 2003/0175827, DE 20306476A1, for example, trehalose, sucrose, maltose, lactose, xylitol, fructose, mannitol, glucose, xylol, maltodextran, saccharose, polyvinylpyrrolidone, and the like may be used. These compounds S are preferably substantially the same as the basic skeleton of the hydrophilic polymer used in the present invention. Here, the basic skeleton refers to, for example, a sugar ring structure, and is substantially the same if the ring structures are the same even if the functional groups and length are different.
基板上の、水素結合を形成しうる残基を有する化合物Ｓの含有量としては、平均分子量の比で、親水性高分子の平均分子量に対する前記化合物Ｓの平均分子量の割合が０．００５以上０．２以下であることが好ましい。割合がこれよりも低い場合は化合物Ｓが結晶化しやすく、高い場合は親水性高分子層への浸透が困難であり、この範囲内に設定することでこれらの問題を解消し、生理活性物質の失活抑制効果、凝集抑制効果をより高く得ることができる。 The content of the compound S having a residue capable of forming a hydrogen bond on the substrate is a ratio of the average molecular weight, and the ratio of the average molecular weight of the compound S to the average molecular weight of the hydrophilic polymer is 0.005 or more and 0. .2 or less is preferable. When the ratio is lower than this, the compound S is easily crystallized, and when it is higher, the penetration into the hydrophilic polymer layer is difficult. By setting the ratio within this range, these problems can be solved, and the physiologically active substance The deactivation suppression effect and the aggregation suppression effect can be obtained higher.
上記のようにして生理活性物質を固定化したバイオセンサーは、当該生理活性物質と相互作用する物質の検出及び／又は測定のために使用することができる。 The biosensor on which a physiologically active substance is immobilized as described above can be used for detection and / or measurement of a substance that interacts with the physiologically active substance.
本発明では、センサー用基板に固定化されている生理活性物質と被験物質との相互作用を非電気化学的方法により検出及び／又は測定することが好ましい。非電気化学的方法としては、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定技術、水晶発振子マイクロバランス（ＱＣＭ）測定技術、金のコロイド粒子から超微粒子までの機能化表面を使用した測定技術などが挙げられる。 In the present invention, it is preferable to detect and / or measure the interaction between the physiologically active substance immobilized on the sensor substrate and the test substance by a non-electrochemical method. Non-electrochemical methods include surface plasmon resonance (SPR) measurement technology, quartz crystal microbalance (QCM) measurement technology, measurement technology using functionalized surfaces from gold colloidal particles to ultrafine particles.
本発明の好ましい態様によれば、本発明のバイオセンサーは、例えば、透明基板上に配置される金属膜を備えていることを特徴とする表面プラズモン共鳴用バイオセンサーとして用いることができる。 According to a preferred aspect of the present invention, the biosensor of the present invention can be used as a surface plasmon resonance biosensor characterized by including a metal film disposed on a transparent substrate, for example.
表面プラズモン共鳴用バイオセンサーとは、表面プラズモン共鳴バイオセンサーに使用されるバイオセンサーであって、該センサーより照射された光を透過及び反射する部分、並びに生理活性物質を固定する部分とを含む部材を言い、該センサーの本体に固着されるものであってもよく、また脱着可能なものであってもよい。 The surface plasmon resonance biosensor is a biosensor used in the surface plasmon resonance biosensor, and includes a part that transmits and reflects light emitted from the sensor, and a part that fixes a physiologically active substance. And may be fixed to the main body of the sensor or may be removable.
表面プラズモン共鳴の現象は、ガラス等の光学的に透明な物質と金属薄膜層との境界から反射された単色光の強度が、金属の出射側にある試料の屈折率に依存することによるものであり、従って、反射された単色光の強度を測定することにより、試料を分析することができる。 The phenomenon of surface plasmon resonance is due to the fact that the intensity of monochromatic light reflected from the boundary between an optically transparent substance such as glass and the metal thin film layer depends on the refractive index of the sample on the metal exit side. Yes, so the sample can be analyzed by measuring the intensity of the reflected monochromatic light.
表面プラズモンが光波によって励起される現象を利用して、被測定物質の特性を分析する表面プラズモン測定装置としては、Kretschmann配置と称される系を用いるものが挙げられる（例えば特開平６−１６７４４３号公報参照）。上記の系を用いる表面プラズモン測定装置は基本的に、例えばプリズム状に形成された誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成されて試料液などの被測定物質に接触させられる金属膜と、光ビームを発生させる光源と、上記光ビームを誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射条件が得られるように種々の角度で入射させる光学系と、上記界面で全反射した光ビームの強度を測定して表面プラズモン共鳴の状態、つまり全反射減衰の状態を検出する光検出手段とを備えてなるものである。 As a surface plasmon measuring device for analyzing the characteristics of a substance to be measured using a phenomenon in which surface plasmons are excited by light waves, there is an apparatus using a system called Kretschmann arrangement (for example, JP-A-6-167443). See the official gazette). A surface plasmon measuring apparatus using the above system basically includes a dielectric block formed in a prism shape, for example, and a metal film formed on one surface of the dielectric block and brought into contact with a substance to be measured such as a sample liquid. A light source that generates a light beam; an optical system that causes the light beam to enter the dielectric block at various angles so that a total reflection condition is obtained at an interface between the dielectric block and the metal film; and It comprises light detecting means for detecting the surface plasmon resonance state, that is, the state of total reflection attenuation by measuring the intensity of the light beam totally reflected at the interface.
なお上述のように種々の入射角を得るためには、比較的細い光ビームを入射角を変化させて上記界面に入射させてもよいし、あるいは光ビームに種々の角度で入射する成分が含まれるように、比較的太い光ビームを上記界面に収束光状態であるいは発散光状態で入射させてもよい。前者の場合は、入射した光ビームの入射角の変化に従って、反射角が変化する光ビームを、上記反射角の変化に同期して移動する小さな光検出器によって検出したり、反射角の変化方向に沿って延びるエリアセンサによって検出することができる。一方後者の場合は、種々の反射角で反射した各光ビームを全て受光できる方向に延びるエリアセンサによって検出することができる。 In order to obtain various incident angles as described above, a relatively thin light beam may be incident on the interface by changing the incident angle, or a component incident on the light beam at various angles is included. As described above, a relatively thick light beam may be incident on the interface in a convergent light state or a divergent light state. In the former case, a light beam whose reflection angle changes according to the change in the incident angle of the incident light beam is detected by a small photodetector that moves in synchronization with the change in the reflection angle, or the direction in which the reflection angle changes Can be detected by an area sensor extending along the line. On the other hand, in the latter case, it can be detected by an area sensor extending in a direction in which each light beam reflected at various reflection angles can be received.
上記構成の表面プラズモン測定装置において、光ビームを金属膜に対して全反射角以上の特定入射角で入射させると、該金属膜に接している被測定物質中に電界分布をもつエバネッセント波が生じ、このエバネッセント波によって金属膜と被測定物質との界面に表面プラズモンが励起される。エバネッセント光の波数ベクトルが表面プラズモンの波数と等しくて波数整合が成立しているとき、両者は共鳴状態となり、光のエネルギーが表面プラズモンに移行するので、誘電体ブロックと金属膜との界面で全反射した光の強度が鋭く低下する。この光強度の低下は、一般に上記光検出手段により暗線として検出される。なお上記の共鳴は、入射ビームがｐ偏光のときにだけ生じる。したがって、光ビームがｐ偏光で入射するように予め設定しておく必要がある。 In the surface plasmon measuring apparatus having the above configuration, when a light beam is incident on a metal film at a specific incident angle that is greater than the total reflection angle, an evanescent wave having an electric field distribution is generated in the measured substance in contact with the metal film. The evanescent wave excites surface plasmons at the interface between the metal film and the substance to be measured. When the wave number vector of the evanescent light is equal to the wave number of the surface plasmon and the wave number matching is established, both are in a resonance state and the energy of the light is transferred to the surface plasmon. The intensity of the reflected light decreases sharply. This decrease in light intensity is generally detected as a dark line by the light detection means. The resonance described above occurs only when the incident beam is p-polarized light. Therefore, it is necessary to set in advance so that the light beam is incident as p-polarized light.
この全反射減衰（ＡＴＲ）が生じる入射角、すなわち全反射減衰角（θＳＰ）より表面プラズモンの波数が分かると、被測定物質の誘電率が求められる。この種の表面プラズモン測定装置においては、全反射減衰角（θＳＰ）を精度良く、しかも大きなダイナミックレンジで測定することを目的として、特開平１１−３２６１９４号公報に示されるように、アレイ状の光検出手段を用いることが考えられている。この光検出手段は、複数の受光素子が所定方向に配設されてなり、前記界面において種々の反射角で全反射した光ビームの成分をそれぞれ異なる受光素子が受光する向きにして配設されたものである。 If the wave number of the surface plasmon is known from the incident angle at which this total reflection attenuation (ATR) occurs, that is, the total reflection attenuation angle (θSP), the dielectric constant of the substance to be measured can be obtained. In this type of surface plasmon measurement apparatus, as shown in Japanese Patent Application Laid-Open No. 11-326194, in order to measure the total reflection attenuation angle (θSP) with high accuracy and a large dynamic range, It is considered to use detection means. This light detection means is provided with a plurality of light receiving elements arranged in a predetermined direction, and arranged so that different light receiving elements receive light beam components totally reflected at various reflection angles at the interface. Is.
そしてその場合は、上記アレイ状の光検出手段の各受光素子が出力する光検出信号を、該受光素子の配設方向に関して微分する微分手段が設けられ、この微分手段が出力する微分値に基づいて全反射減衰角（θＳＰ）を特定し、被測定物質の屈折率に関連する特性を求めることが多い。 In that case, there is provided differential means for differentiating the light detection signals output from the light receiving elements of the arrayed light detection means with respect to the arrangement direction of the light receiving elements, and based on the differential value output by the differential means. In many cases, the total reflection attenuation angle (θSP) is specified to obtain a characteristic related to the refractive index of the substance to be measured.
また、全反射減衰（ＡＴＲ）を利用する類似の測定装置として、例えば「分光研究」第４７巻 第１号（１９９８）の第２１〜２３頁および第２６〜２７頁に記載がある漏洩モード測定装置も知られている。この漏洩モード測定装置は基本的に、例えばプリズム状に形成された誘電体ブロックと、この誘電体ブロックの一面に形成されたクラッド層と、このクラッド層の上に形成されて、試料液に接触させられる光導波層と、光ビームを発生させる光源と、上記光ビームを上記誘電体ブロックに対して、該誘電体ブロックとクラッド層との界面で全反射条件が得られるように種々の角度で入射させる光学系と、上記界面で全反射した光ビームの強度を測定して導波モードの励起状態、つまり全反射減衰状態を検出する光検出手段とを備えてなるものである。 Moreover, as a similar measuring device using total reflection attenuation (ATR), for example, “Spectroscopic Research” Vol. 47, No. 1, (1998), pages 21 to 23 and pages 26 to 27 are described. Devices are also known. This leakage mode measuring device is basically a dielectric block formed in a prism shape, for example, a clad layer formed on one surface of the dielectric block, and formed on the clad layer to be in contact with the sample liquid. Optical waveguide layer to be generated, a light source for generating a light beam, and the light beam to the dielectric block at various angles so that a total reflection condition is obtained at the interface between the dielectric block and the cladding layer. The optical system includes an incident optical system and light detection means for detecting the excitation state of the waveguide mode, that is, the total reflection attenuation state by measuring the intensity of the light beam totally reflected at the interface.
上記構成の漏洩モード測定装置において、光ビームを誘電体ブロックを通してクラッド層に対して全反射角以上の入射角で入射させると、このクラッド層を透過した後に光導波層においては、ある特定の波数を有する特定入射角の光のみが導波モードで伝搬するようになる。こうして導波モードが励起されると、入射光のほとんどが光導波層に取り込まれるので、上記界面で全反射する光の強度が鋭く低下する全反射減衰が生じる。そして導波光の波数は光導波層の上の被測定物質の屈折率に依存するので、全反射減衰が生じる上記特定入射角を知ることによって、被測定物質の屈折率や、それに関連する被測定物質の特性を分析することができる。 In the leakage mode measuring apparatus having the above-described configuration, when a light beam is incident on the cladding layer through the dielectric block at an incident angle greater than the total reflection angle, the light waveguide layer transmits a specific wave number after passing through the cladding layer. Only light having a specific incident angle having a wave length propagates in the waveguide mode. When the waveguide mode is excited in this way, most of the incident light is taken into the optical waveguide layer, resulting in total reflection attenuation in which the intensity of light totally reflected at the interface is sharply reduced. Since the wave number of guided light depends on the refractive index of the substance to be measured on the optical waveguide layer, knowing the specific incident angle at which total reflection attenuation occurs, the refractive index of the substance to be measured and the measurement object related thereto The properties of the substance can be analyzed.
なおこの漏洩モード測定装置においても、全反射減衰によって反射光に生じる暗線の位置を検出するために、前述したアレイ状の光検出手段を用いることができ、またそれと併せて前述の微分手段が適用されることも多い。 In this leakage mode measuring apparatus, the above-mentioned array-shaped light detecting means can be used to detect the position of the dark line generated in the reflected light due to the total reflection attenuation, and the above-described differentiating means is applied in conjunction therewith. Often done.
また、上述した表面プラズモン測定装置や漏洩モード測定装置は、創薬研究分野等において、所望のセンシング物質に結合する特定物質を見いだすランダムスクリーニングへ使用されることがあり、この場合には前記薄膜層（表面プラズモン測定装置の場合は金属膜であり、漏洩モード測定装置の場合はクラッド層および光導波層）上に上記被測定物質としてセンシング物質を固定し、該センシング物質上に種々の被検体が溶媒に溶かされた試料液を添加し、所定時間が経過する毎に前述の全反射減衰角（θＳＰ）の角度を測定している。 In addition, the surface plasmon measurement device and the leakage mode measurement device described above may be used for random screening to find a specific substance that binds to a desired sensing substance in the field of drug discovery research. In this case, the thin film layer A sensing substance is fixed on the sensing substance on the sensing substance (a metal film in the case of a surface plasmon measuring apparatus, a clad layer and an optical waveguide layer in the case of a leakage mode measuring apparatus), and various analytes are placed on the sensing substance. A sample solution dissolved in a solvent is added, and the total reflection attenuation angle (θSP) is measured every time a predetermined time elapses.
試料液中の被検体が、センシング物質と結合するものであれば、この結合によりセンシング物質の屈折率が時間経過に伴って変化する。したがって、所定時間経過毎に上記全反射減衰角（θＳＰ）を測定し、該全反射減衰角（θＳＰ）の角度に変化が生じているか否か測定することにより、被検体とセンシング物質の結合状態を測定し、その結果に基づいて被検体がセンシング物質と結合する特定物質であるか否かを判定することができる。このような特定物質とセンシング物質との組み合わせとしては、例えば抗原と抗体、あるいは抗体と抗体が挙げられる。具体的には、ウサギ抗ヒトＩｇＧ抗体をセンシング物質として薄膜層の表面に固定し、ヒトＩgＧ抗体を特定物質として用いることができる。 If the analyte in the sample liquid binds to the sensing substance, the refractive index of the sensing substance changes with time due to this binding. Therefore, by measuring the total reflection attenuation angle (θSP) every predetermined time and measuring whether or not the total reflection attenuation angle (θSP) has changed, the binding state of the analyte and the sensing substance is determined. It is possible to determine whether or not the analyte is a specific substance that binds to the sensing substance based on the result. Examples of the combination of the specific substance and the sensing substance include an antigen and an antibody, or an antibody and an antibody. Specifically, a rabbit anti-human IgG antibody can be immobilized on the surface of the thin film layer as a sensing substance, and a human IgG antibody can be used as the specific substance.
なお、被検体とセンシング物質の結合状態を測定するためには、全反射減衰（θＳＰ）の角度そのものを必ずしも検出する必要はない。例えばセンシング物質に試料液を添加し、その後の全反射減衰角（θＳＰ）の角度変化量を測定して、その角度変化量の大小に基づいて結合状態を測定することもできる。前述したアレイ状の光検出手段と微分手段を全反射減衰を利用した測定装置に適用する場合であれば、微分値の変化量は、全反射減衰角（θＳＰ）の角度変化量を反映しているため、微分値の変化量に基づいて、センシング物質と被検体との結合状態を測定することができる（本出願人による特開２００３−１０６９２６参照）。このような全反射減衰を利用した測定方法および装置においては、底面に予め成された薄膜層上にセンシング物質が固定されたカップ状あるいはシャーレ状の測定チップに、溶媒と被検体からなる試料液を滴下供給して、上述した全反射減衰角（θＳＰ）の角度変化量の測定を行っている。 Note that in order to measure the binding state between the subject and the sensing substance, it is not always necessary to detect the angle of total reflection attenuation (θSP) itself. For example, a sample solution can be added to the sensing substance, and the amount of change in the total reflection attenuation angle (θSP) thereafter can be measured, and the binding state can be measured based on the magnitude of the angle change. If the above-described arrayed light detecting means and differentiating means are applied to a measuring device using total reflection attenuation, the change amount of the differential value reflects the angle change amount of the total reflection attenuation angle (θSP). Therefore, the binding state between the sensing substance and the analyte can be measured based on the amount of change in the differential value (see Japanese Patent Application Laid-Open No. 2003-106926 by the present applicant). In such a measurement method and apparatus using total reflection attenuation, a sample liquid consisting of a solvent and an analyte is placed on a cup-shaped or petri-shaped measuring chip in which a sensing substance is fixed on a thin film layer formed in advance on the bottom surface. The amount of change in angle of the total reflection attenuation angle (θSP) described above is measured.
さらに、ターンテーブル等に搭載された複数個の測定チップの測定を順次行うことにより、多数の試料についての測定を短時間で行うことができる全反射減衰を利用した測定装置が、特開２００１−３３０５６０号公報に記載されている。 Furthermore, a measuring apparatus using total reflection attenuation capable of measuring a large number of samples in a short time by sequentially measuring a plurality of measuring chips mounted on a turntable or the like is disclosed in JP-A-2001-2001. No. 330560.
また、本発明のバイオセンサーは、例えば基板表面に導波路構造を保持した、屈折率変化を導波路を用いて検出するバイオセンサーとして用いることができる。この場合、基板表面の導波構造物は、回折格子と場合によっては付加層とを有している、この導波構造物は、薄い誘電層からなる平面的な導波体から成る。導波体に集光された光線は全反射によりこの薄い層内に導かれる。この導かれる光波（以降モードと呼ぶ）の伝播速度は、Ｃ／Ｎの値をとる。ここでＣは、真空中での光速であり、Ｎは導波体内を導かれるモードの有効屈折率である。有効屈折率Ｎは、一面では導波体の構成により、他面では薄い導波層に隣接する媒体の屈折率により決まる。光波の伝導は、薄い平面層内のみでなく、別の導波構造物、特にストリップ状の導波体によっても行われる。その場合は、導波構造物はストリップ状のフィルムの形状にされる。有効屈折率Ｎの変化は、導波層に隣接する媒体の変化と導波層自身もしくは導波層に隣接する付加層の屈折率および厚さの変化とにより生じることがバイオセンサーにとって重要な要素である。 The biosensor of the present invention can be used as a biosensor that detects a change in refractive index using a waveguide, for example, having a waveguide structure on the substrate surface. In this case, the waveguide structure on the surface of the substrate has a diffraction grating and possibly an additional layer. The waveguide structure consists of a planar waveguide made of a thin dielectric layer. Light rays collected in the waveguide are guided into this thin layer by total reflection. The propagation speed of the guided light wave (hereinafter referred to as mode) takes the value of C / N. Here, C is the speed of light in vacuum, and N is the effective refractive index of the mode guided in the waveguide. The effective refractive index N is determined by the configuration of the waveguide on one side and the refractive index of the medium adjacent to the thin waveguide layer on the other side. Light wave conduction is performed not only in a thin planar layer, but also by another waveguide structure, in particular a strip-shaped waveguide. In that case, the waveguide structure is in the form of a strip-like film. An important factor for a biosensor is that the change in the effective refractive index N is caused by a change in the medium adjacent to the waveguiding layer and a change in the refractive index and thickness of the waveguiding layer itself or an additional layer adjacent to the waveguiding layer. It is.
この方式のバイオセンサーの構成については、例えば特公平６−２７７０３号公報４ページ４８行目から１４ページ１５行目および第１図から第８図、米国特許第 6,829,073号のcolumn6の31行目からcolumn7の47行目および第9図A,Bに記載されている。 Regarding the configuration of the biosensor of this system, for example, from Japanese Patent Publication No. 6-27703, page 4, line 48 to page 14, line 15 and FIG. 1 to FIG. 8, US Pat. No. 6,829,073, column 6, line 31 It is described in the 47th line of column7 and FIGS. 9A and B.
例えば、一つの実施形態として、薄層が平面状の導波路層が基材（たとえばパイレックス（登録商標）・ガラス）上に設けられている構造がある。導波路層と基材とは、一緒にいわゆる導波体を形成する。導波路層は、たとえば酸化物層（ＳｉＯ２，ＳｎＯ２、Ｔａ２Ｏ５，ＴｉＯ２，ＴｉＯ２-ＳｉＯ２，ＨｆＯ２，ＺｒＯ２，Ａｌ２Ｏ３，Ｓｉ３Ｎ４，ＨｆＯＮ，ＳｉＯＮ，酸化スカンジウムまたはこれらの混合物）、プラスチック層（例えばポリスチレン、ポリエチレン、ポリカーボネートなど）、など多層の積層体が可能である。光線が全反射により導波路層内を伝播するには、導波路層の屈折率が隣接媒体（たとえば基材や後述の付加層）の屈折率より大でなければならない。基材もしくは測定物質に向いた導波路層表面もしくは導波路層体積内には、回折格子が配置されている。回折格子は、型押し、ホログラフィまたはその他の方法によって基板内に形成することができる。次いでより高い屈折率を有する薄い導波路膜を回折格子の上表面に被覆する。回折格子は導波路層への入射光線を集束したり、既に導波路層内を導かれているモードを放出したり、そのモードの一部を進行方向へ透過させ、一部を反射させたりする機能を持つ。導波路層は、格子域を付加層でカバーしておく。付加層は必要に応じて多層膜とすることができる。この付加層は、測定物質に含まれている物質の選択的検知を可能にする機能を持たせることができる。好ましい態様として付加層の最表面に、検知機能を持つ層を設けることができる。このような検知機能を持つ層として、生理活性物質を固定化し得る層を用いることができる。 For example, as one embodiment, there is a structure in which a waveguide layer having a flat thin layer is provided on a base material (for example, Pyrex (registered trademark) glass). The waveguide layer and the substrate together form a so-called waveguide. The waveguide layer can be, for example, an oxide layer (SiO2, SnO2, Ta2O5, TiO2, TiO2-SiO2, HfO2, ZrO2, Al2O3, Si3N4, HfON, SiON, scandium oxide or a mixture thereof), a plastic layer (for example, polystyrene, polyethylene, A multilayer laminate such as polycarbonate) is possible. In order for light rays to propagate through the waveguide layer by total reflection, the refractive index of the waveguide layer must be greater than the refractive index of an adjacent medium (for example, a base material or an additional layer described later). A diffraction grating is disposed on the surface of the waveguide layer or the volume of the waveguide layer facing the substrate or the measurement substance. The diffraction grating can be formed in the substrate by embossing, holography or other methods. A thin waveguide film having a higher refractive index is then coated on the upper surface of the diffraction grating. The diffraction grating focuses incident light to the waveguide layer, emits a mode already guided in the waveguide layer, transmits part of the mode in the traveling direction, and reflects part of the mode. Has function. The waveguide layer covers the grating region with an additional layer. The additional layer can be a multilayer film as required. The additional layer can have a function that enables selective detection of a substance contained in the measurement substance. As a preferred embodiment, a layer having a detection function can be provided on the outermost surface of the additional layer. As a layer having such a detection function, a layer capable of immobilizing a physiologically active substance can be used.
別の実施形態として、回折格子導波路のアレイがマイクロプレートのウェル内に組み込まれる形態も可能である（特表2007-501432）。すなわち回折格子導波路がマイクロプレートのウェル底面にアレイ状に配列されていれば、スループットの高い薬物または化学物質のスクリーニングを可能にすることができる。 As another embodiment, a configuration in which an array of diffraction grating waveguides is incorporated in a well of a microplate is also possible (Japanese Patent Publication No. 2007-501432). That is, if the diffraction grating waveguides are arranged in an array on the bottom surface of the well of the microplate, it is possible to screen a drug or chemical substance with high throughput.
回折格子導波路は、回折格子導波路の上層（検知領域）上の生理活性物質検出を可能にするために、入射光線、および反射光を検出して屈折特性の変化を検出する。この目的のため、１つまたはそれより多くの光源（例えば、レーザ、ダイオード）及び１つまたはそれより多くの検出器（例えば、分光計、ＣＣＤカメラまたはその他の光検出器）を用いることができる。屈折率変化を測定するための方法として、２つの異なる動作モード−分光法、及び角度法がある。分光法においては、入射光として広帯域ビームが回折格子導波路に送られ、反射光が集められて、例えば分光計で測定される。共鳴波長（ピーク）のスペクトル位置を観測することにより、回折格子導波路の表面またはその近傍での屈折率変化すなわち結合を測定することができる。また、角度法においては、公称上単一波長の光がある範囲の照射角を生じるように集束されて、回折格子導波路内に向けられる。反射光がＣＣＤカメラまたはその他の光検出器によって測定される。回折格子導波路によって反射された共鳴角の位置を測定することにより、回折格子導波路の表面またはその近傍での屈折率変化すなわち結合を測定することができる。 In order to enable detection of a physiologically active substance on the upper layer (detection region) of the diffraction grating waveguide, the diffraction grating waveguide detects incident light and reflected light to detect a change in refractive characteristics. For this purpose, one or more light sources (eg lasers, diodes) and one or more detectors (eg spectrometers, CCD cameras or other photodetectors) can be used. . There are two different modes of operation—spectroscopy and angle methods for measuring refractive index changes. In spectroscopy, a broadband beam is sent as incident light to a diffraction grating waveguide and the reflected light is collected and measured, for example, with a spectrometer. By observing the spectral position of the resonance wavelength (peak), the refractive index change, that is, the coupling at or near the surface of the diffraction grating waveguide can be measured. Also, in the angle method, nominally single wavelength light is focused to produce a range of illumination angles and directed into the diffraction grating waveguide. The reflected light is measured by a CCD camera or other photodetector. By measuring the position of the resonance angle reflected by the diffraction grating waveguide, it is possible to measure the refractive index change, ie, coupling, at or near the surface of the diffraction grating waveguide.
以下の実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。 The following examples further illustrate the present invention, but the scope of the present invention is not limited to these examples.
実施例１：
本実施例は、タンパク質を固定するためのセンサーチップの作製に関するものである。
（１）試料１（比較例）の作成
カルボキシメチルデキストランが結合した表面として、Biacore社センサーチップCM-5（research grade）を、そのまま用いた。
Example 1:
This example relates to the production of a sensor chip for immobilizing proteins.
(1) Preparation of Sample 1 (Comparative Example) Biacore sensor chip CM-5 (research grade) was used as it was as the surface to which carboxymethyldextran was bound.
（２）試料２（本発明）の作成
2.8mM のHODhbt(3,4-ジヒドロ-3-ヒドロキシ-4-オキソ-1,2,3-ベンゾトリアジン)水溶液と0.4M のEDC水溶液の1:1混合溶液100μlを、Biacore社センサーチップCM-5（research grade）表面に接触させ、室温で10分間反応させた。水洗後、真空乾燥機を用いて室温で10分間乾燥させた。この表面に対し、1,2-ビス（2-アミノエトキシ）エタン100μlを接触させ、室温で10分間反応させた後、水洗することで、目的表面を得た。
(2) Preparation of sample 2 (present invention)
100 μl of a 1: 1 mixture of 2.8 mM HODhbt (3,4-dihydro-3-hydroxy-4-oxo-1,2,3-benzotriazine) aqueous solution and 0.4 M EDC aqueous solution was added to the Biacore sensor chip CM- 5 (research grade) surface was contacted and allowed to react at room temperature for 10 minutes. After washing with water, it was dried at room temperature for 10 minutes using a vacuum dryer. 100 μl of 1,2-bis (2-aminoethoxy) ethane was brought into contact with this surface, reacted at room temperature for 10 minutes, and then washed with water to obtain the target surface.
実施例２：
本実施例は、1,2-ビス（2-アミノエトキシ）エタンで修飾された表面（試料２）に対する、等電点以上のｐＨにおけるタンパク質のプレコンセントレーションに関するものである。タンパク質としては、ペプシン（和光純薬社製）、BSA（Bovine Serum Albumin：SIGMA社製）、CA（Carbonic Anhydrase：SIGMA社製）を用いた。
Example 2:
This example relates to protein preconcentration at a pH above the isoelectric point for a surface modified with 1,2-bis (2-aminoethoxy) ethane (sample 2). Pepsin (manufactured by Wako Pure Chemical Industries), BSA (Bovine Serum Albumin: manufactured by SIGMA), and CA (Carbonic Anhydrase: manufactured by SIGMA) were used as proteins.
実施例１で作製した試料１（比較例）及び試料２（本発明）をBiacore社製の表面プラズモン共鳴装置であるBiacore3000にセットし、タンパク溶液（pH7.4, 1.0mg/ml）を５分間流した場合のプレコンセントレーションについて検討した。得られたセンサーグラムを図１〜図３に示す。 Sample 1 (Comparative Example) and Sample 2 (Invention) prepared in Example 1 are set in a Biacore 3000 surface plasmon resonance device manufactured by Biacore, and a protein solution (pH 7.4, 1.0 mg / ml) is placed for 5 minutes. The preconcentration in the case of flowing was examined. The obtained sensorgram is shown in FIGS.
カルボキシメチルデキストランが結合している試料１に対しては、いずれのタンパク質の場合も、試料１に対しては全くプレコンセントレーションは観察されないのに対し、本発明の試料２に対してはプレコンセントレーションが観察され、その程度は、ペプシン（7520RU）、BSA（6688RU）、CA（1958RU）であることが確認された。１級アミノ基を有する本発明の表面により、等電点以上のpHにおけるＣＡのプレコンセントレーションが可能であることが証明された。 For sample 1 to which carboxymethyldextran is bound, no preconcentration is observed for sample 1 for any protein, whereas for sample 2 of the present invention, no preconcentration is observed. Observed to be pepsin (7520RU), BSA (6688RU), CA (1958RU). The surface of the present invention having a primary amino group proved that CA preconcentration at a pH above the isoelectric point is possible.
実施例３
本実施例は、１級アミノ基を有する表面にプレコンセントレートされたタンパク質の固定に関するものである。Biacore3000を用い、ペプシン（1mg/ml、pH7.4）を５分間プレコンセントレートさせた試料２に対しカルボン酸活性化剤であるＥＤＣ（０．４Ｍ）／ＮＨＳ（０．１Ｍ）水溶液を接触させずに洗浄したサンプル（試料３）、および、ＥＤＣ（０．４Ｍ）／ＮＨＳ（０．１Ｍ）水溶液を５分間接触させた後に洗浄したサンプル（試料４）に対するペプシン固定量を検討した。洗浄は、1％EDTA水溶液（1分×２回）およびグリシン緩衝液（pH1.5、Biacore社製）の注入（各１分×２回）により行った。得られた結果を図４に示す。
Example 3
This example relates to the immobilization of proteins preconcentrated on a surface having primary amino groups. Using Biacore 3000, sample 2 which was preconcentrated with pepsin (1 mg / ml, pH 7.4) for 5 minutes was brought into contact with EDC (0.4 M) / NHS (0.1 M) aqueous solution as a carboxylic acid activator. The amount of pepsin immobilized on the sample washed without cleaning (Sample 3) and the sample washed after contacting the EDC (0.4M) / NHS (0.1M) aqueous solution for 5 minutes was examined. Washing was performed by injecting 1% EDTA aqueous solution (1 minute × twice) and glycine buffer (pH 1.5, manufactured by Biacore) (each 1 minute × twice). The obtained results are shown in FIG.
カルボン酸活性化剤を接触させずに洗浄した試料４の表面からは、プレコンセントレートされたペプシンが洗浄後には解離することが確認された。一方、カルボン酸活性化剤を接触させた試料５の表面には、洗浄後もペプシンが6000RU 程度結合していることが認められた。１級アミノ基を有するポリマーを結合した固体基板に対し、等電点以上のpHにおいてタンパク質をプレコンセントレーションさせた後、カルボン酸活性化剤と接触させることにより、アミノ基を有するポリマーとタンパク質とを結合させることが可能であることが証明された。 From the surface of the sample 4 washed without contact with the carboxylic acid activator, it was confirmed that the preconcentrated pepsin was dissociated after washing. On the other hand, it was confirmed that about 6000 RU of pepsin was bound to the surface of the sample 5 contacted with the carboxylic acid activator even after washing. After preconcentrating the protein at a pH equal to or higher than the isoelectric point to a solid substrate to which a polymer having a primary amino group is bonded, the polymer having the amino group and the protein are contacted with a carboxylic acid activator. It was proved possible to combine them.
実施例４
本実施例は、1,2-ビス（2-アミノエトキシ）エタン以外のポリアミンで修飾されたセンサーチップの作製に関するものである。1,2-ビス(2-アミノエトキシエタン)を、表１に示すポリアミンに変更した以外は、試料２の作成と同様の操作を行うことで、試料５〜９を作成した。
Example 4
This example relates to the production of a sensor chip modified with a polyamine other than 1,2-bis (2-aminoethoxy) ethane. Samples 5 to 9 were prepared by performing the same operations as in the preparation of Sample 2, except that 1,2-bis (2-aminoethoxyethane) was changed to the polyamine shown in Table 1.
実施例５
本実施例は、実施例４で作成されたセンサーチップに対する、タンパク質の荷電濃縮に関するものである。実施例２で示した方法で、試料５〜試料９に対するＢＳＡ（pH7.4, 0.1mg/ml）のプレコンセントレーションの程度を検討した。得られた結果を、図５に要約する。
Example 5
This example relates to charge concentration of protein with respect to the sensor chip prepared in Example 4. With the method shown in Example 2, the degree of preconcentration of BSA (pH 7.4, 0.1 mg / ml) for Samples 5 to 9 was examined. The results obtained are summarized in FIG.
ポリアミンとして1,2-ビス(2-アミノエトキシエタン)を結合した試料２のみならず、エチレンジアミンを結合した試料５、ジエチレントリアミンを結合した試料６、トリエチレンテトラミンを結合した試料７、テトラエチレンペンタミンを結合した試料８、ペンタエチレンヘキサミンを結合した試料９についても、ＢＳＡの等電点以上であるｐＨ７．４の条件下でプレコンセントレーションが観察され、その程度はポリアミンの種類に依存することが証明された。 Not only sample 2 with 1,2-bis (2-aminoethoxyethane) bonded as polyamine, but also sample 5 with ethylenediamine, sample 6 with diethylenetriamine, sample 7 with triethylenetetramine, tetraethylenepentamine In sample 8 bound to benzene and sample 9 bound to pentaethylenehexamine, preconcentration was observed under the condition of pH 7.4, which is higher than the isoelectric point of BSA, and the extent depends on the type of polyamine. Proven.
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