JP4565247B2 - 高速液体クロマトグラフィーシステム - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は固定相中に酸化還元反応場を設けた高速液体クロマトグラフィーシステム及びこれを用いた酸化還元性物質の分離定量法に関する。
【0002】
【従来の技術】
高速液体クロマトグラフィー(HPLC)は優れた分離分析法であり、無機化合物及び有機化合物を問わず広く利用されている。しかし、多成分混合物中の微量成分の分離及び定量に関しては必らずしも容易でない場合があり、新しい分離選択性を有するシステムの構築が求められている。目的の化合物に対する特異的な化学反応を利用することは、高い選択性を得るのに有効な方法の一つであり、これまであらかじめ誘導体化を行う方法、固定相あるいは移動相に反応試薬を導入して保持を特異的に高める方法、反応の平衡を試薬濃度によって制御して高度な分離を目指す、いわゆる「二次的化学平衡(Secondary chemical equilibra:SCE)の導入」による方法が用いられてきている。このうちSCEとして化学反応を利用する方法は、一つの反応で対象となる化合物の範囲が広いことから利用価値が高い。しかし、原理的に酸塩基反応のような反応速度の大きな反応以外は利用できないという欠点があり、酸化還元反応のような反応速度の小さい反応には応用できなかった。
【0003】
【発明が解決しようとする課題】
従って本発明の目的は、反応速度の小さい酸化還元反応を利用した高速誘導体化HPLCシステムを構築し、SCEと同等の分離選択性を実現することにある。
【0004】
【課題を解決するための手段】
そこで本発明者は多孔質グラファイトの酸化還元触媒機能に着目して種々検討してきたところ、通常のHPLC用充填剤を充填した2つのカラムの中間に多孔質グラファイトを充填したカラムを配設すれば、通常のHPLC用充填剤による分離機能と、多孔質グラファイトの酸化還元触媒機能とが効率良く機能し、従来分離が困難であった酸化還元性物質が良好に分離できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【0005】
すなわち、本発明は、固定相として、HPLC用充填剤を充填した2つのカラムの間に多孔質グラファイトを充填したカラムを設けたことを特徴とするHPLCシステムを提供するものである。
また本発明は、当該HPLCシステムを用いることを特徴とする酸化還元性物質の分離定量法を提供するものである。
更に本発明は、HPLC用充填剤を充填した2つのカラムの間に多孔質グラファイトを充填したカラムを設けたことを特徴とするHPLC用固定相を提供するものである。
【0006】
【発明の実施の形態】
本発明のHPLCシステムに用いる固定相は、通常のHPLC用充填剤を充填した2つのカラムの間に多孔質グラファイトを充填したカラムを設けてなる。ここで、多孔質グラファイトとしては、大きな表面積と高い耐圧性を有するものが好ましく、表面積30〜100cm2/g、細孔直径20〜500Åのものがより好ましい。当該多孔質グラファイトとしては、石油ピッチ、合成高分子などを高温で焼成して得られたものがいずれも使用できる。また、多孔質グラファイトの形状は、粒状、繊維状、ディスク状等のいずれでもよい。
【0007】
また、当該多孔質グラファイト充填カラムの両側に設けられるカラムに充填されるHPLC用充填剤は、被検対象により選択され、ゲル濾過用充填剤、疎水クロマトグラフィー用充填剤、イオン交換クロマトグラフィー用充填剤、分配クロマトグラフィー用充填剤等を用いることができる。具体的には、シリカ系充填剤、アルミナ系充填剤、ポリマー系充填剤等を用いることができる。シリカ系充填剤としては、多孔性シリカゲル、アルキル基を結合したシリカゲル(オクチルシリル化シリカゲル、オクタデシルシリル化シリカゲル等)のほかフェニル基やアミノ基を結合したシリカゲル等が挙げられる。ポリマー系充填剤としては、ポリスチレンゲル、ポリビニルアルコールゲル、ポリヒドロキシメタアクリレートゲルやそれらにイオン交換基を修飾したイオン交換樹脂等が挙げられる。このほか、ヒドロキシアパタイトやチタニア、ジルコニアなどの無機系充填剤も用いることができる。
【0008】
2つのHPLC用充填剤を充填したカラムには、同一の充填剤を用いてもよいし、相互に異なる充填剤を用いてもよい。
【0009】
また、前記2つのHPLC用充填剤を充填したカラムの上流側には、更に前記の多孔質グラファイト充填カラムを配置してもよい。かくすることにより、目的物質の化学種(酸化状態)をそろえることができる。
【0010】
上記のようなシステムを用いることにより、通常のHPLCカラムによる分離が、酸化還元反応に基づく化学種変換機能により特異的な選択性を有するようになり、酸化還元物質の分離が可能になる。この機能について、遷移金属の分離を例にして説明する。すなわち、銅、鉄、コバルト、ニッケル、ビスマス等の遷移金属混合物にEDTAを反応させて錯体を生成させ、これを従来の逆相イオン対モードHPLCに付すと、コバルトの2価および3価イオンの錯体のピークはそれぞれFe3+とNi2+のピークと重なってしまい、良好な分離は不可能である(図3参照)。これに対し、コバルトをすべて2価イオンにした後にEDTA錯体とした金属混合物を、2つのHPLCカラムの間に酸化剤(過酸化水素)で処理した多孔質グラファイトカラムを配置したHPLCシステムに付すと、前段の分離カラムを2価錯体として通過したコバルトがグラファイトカラムで酸化されて、後段の分離カラムでは3価錯体として溶出する。そのため、前段ではFe3+と後段ではNi2+と完全に分離される(図4参照)。これらの遷移金属の分離は通常のHPLCカラムのみでは不可能である。また、多孔質グラファイトカラムのみを用いた場合には、酸化還元機能と溶質保持機能の両方を多孔質グラファイトカラムに依存することになるが、両者は独立ではないため、分離の制御が極めて複雑になる。したがって、本発明のように分離場と酸化還元反応場を分離して組み合わせることにより、高度でかつ設計が容易な分離分析システムが可能になる。
【0011】
ここで、多孔質グラファイト充填カラムをあらかじめ還元処理しておけば、このカラム内で還元反応を行なわせることができ、一方あらかじめ酸化処理しておけばこのカラム内で酸化反応を行なわせることができる。そして、この酸化処理及び還元処理の強さを制御することによって、このカラム内での酸化反応及び還元反応を制御することができる。また、用いる還元剤及び酸化剤の種類を変えることにより、反応の強さを制御することができる。還元剤の例としては亜硫酸ナトリウム、塩化ヒドロキシルアンモニウム、アスコルビン酸などが、酸化剤の例としては過酸化水素などが挙げられる。
【0012】
酸化処理および還元処理は多孔質グラファイトカラムに電位を印加することによっても行うことができる。すなわち多孔質グラファイト充填剤をカラムに詰め、これを電極とするか、または多孔質グラファイトディスクを電極として電位を印加する。この電位をポテンショスタットを用いて調節することにより、酸化反応および還元反応の進行を制御することができる。
【0013】
本発明のHPLCシステムは、前記の固定相を用いる以外は通常のHPLCと同様に適宜選択することができる。すなわち、本発明のシステムは、逆相HPLC、イオン対HPLC、順相HPLC、イオン交換HPLC、サイズ排除HPLC、疎水性相互作用HPLCなどいずれにも適用可能である。従って溶離液も、水、各種有機溶媒から適宜選択できる。更に検出手段に関しても、紫外吸光検出、屈折率検出、蛍光検出等が使用できる。
【0014】
本発明のHPLCシステムは、酸化還元反応を利用するものであるため、酸化還元性物質の分離定量に好適である。当該酸化還元物質には、各種の金属(希土類金属を含む遷移金属)をはじめとする無機化合物や多くの有機化合物が含まれるので、対象試料としては金属材料、鉱石、無機成分含有試薬や酸化還元酵素、カテコールアミン等の生体関連物質等が挙げられる。
【0015】
【実施例】
次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明は何らこれに限定されるものではない。
【0016】
実施例1
2つのオクタデシルシリル化シリカゲル(ODS)充填カラムの間に多孔質グラファイト充填カラムを設けた。すなわち、ODS(Capcell Pak C18 UG120,3μm)を充填したカラム(4.6×100nm)を2本用意した。また、多孔質グラファイト(BL−01,3.5μm)を充填したカラム(4.6×10mm)を用意した。ODS充填カラムのみを用いて図1に示すHPLCシステムを構築した。また、ODS充填カラムの間に多孔質グラファイト充填カラムを設けカラムシステムを構築した。このカラムシステムを用いて、図2に示すHPLCシステムを構築した。試料として、コバルト(0.1mM)、ビスマス(0.1mM)、鉄(0.1mM)、ニッケル(0.1mM)及び銅(0.1mM)をEDTAでキレート化した水溶液を用いた。カラムをあらかじめ0.1mMセチルトリメチルアンモニウムブロミドで処理し、溶離液として0.1M酢酸バッファ(pH5)を用い、流速0.6mL/minの条件で分析した。その結果、ODSカラムのみを用いた場合には、図3に示すように、コバルトがCo3+とCo2+とに分離し、Co3+がFe3+のピークと重なり、一方Co2+がNi2+のピークと重なってしまい、コバルトは他の金属と分離できなかった。
一方、本発明の固定相を用いた場合には、図4に示すようにコバルトを、他の金属と完全に分離することができた。
【0017】
【発明の効果】
本発明のHPLCシステムを用いれば従来分離が困難であった酸化還元性物質が良好かつ簡便に分離定量できる。
【図面の簡単な説明】
【図1】ODS充填カラムのみを用いたHPLCシステムを示す概略図である。
【図2】本発明の固定相を用いたHPLCシステムの一例を示す概略図である。
【図3】図1のHPLCシステムを用いた遷移金属の分離結果を示す図である。
【図4】図2のHPLCシステムを用いた遷移金属の分離結果を示す図である。
Claims (7)
- 固定相として、高速液体クロマトグラフィー用充填剤を充填した2つのカラムの間に多孔質グラファイトを充填したカラムを設けたことを特徴とする高速液体クロマトグラフィーシステム。
- 上流側の高速液体クロマトグラフィー用充填剤を充填したカラムの上流側に、更に多孔質グラファイトを充填したカラムを設けてなる請求項1記載のシステム。
- 多孔質グラファイトを充填したカラムが、使用前に酸化処理又は還元処理されていることを特徴とする請求項1又は2記載のシステム。
- 請求項1〜3のいずれか1項記載のシステムを用いることを特徴とする酸化還元性物質の分離定量法。
- 高速液体クロマトグラフィー用充填剤を充填した2つのカラムの間に多孔質グラファイトを充填したカラムを設けたことを特徴とする高速液体クロマトグラフィー用固定相。
- 上流側の高速液体クロマトグラフィー用充填剤を充填したカラムの上流側に、更に多孔質グラファイトを充填したカラムを設けてなる請求項5記載の固定相。
- 多孔質グラファイトを充填したカラムが、使用前に酸化処理又は還元処理されていることを特徴とする請求項1又は2記載の固定相。
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