JP4565247B2

JP4565247B2 - High performance liquid chromatography system

Info

Publication number: JP4565247B2
Application number: JP2000252015A
Authority: JP
Inventors: 雅美澁川
Original assignee: Nihon University
Current assignee: Nihon University
Priority date: 2000-08-23
Filing date: 2000-08-23
Publication date: 2010-10-20
Anticipated expiration: 2020-08-23
Also published as: JP2002062286A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は固定相中に酸化還元反応場を設けた高速液体クロマトグラフィーシステム及びこれを用いた酸化還元性物質の分離定量法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）は優れた分離分析法であり、無機化合物及び有機化合物を問わず広く利用されている。しかし、多成分混合物中の微量成分の分離及び定量に関しては必らずしも容易でない場合があり、新しい分離選択性を有するシステムの構築が求められている。目的の化合物に対する特異的な化学反応を利用することは、高い選択性を得るのに有効な方法の一つであり、これまであらかじめ誘導体化を行う方法、固定相あるいは移動相に反応試薬を導入して保持を特異的に高める方法、反応の平衡を試薬濃度によって制御して高度な分離を目指す、いわゆる「二次的化学平衡（Secondary chemical equilibra:SCE）の導入」による方法が用いられてきている。このうちＳＣＥとして化学反応を利用する方法は、一つの反応で対象となる化合物の範囲が広いことから利用価値が高い。しかし、原理的に酸塩基反応のような反応速度の大きな反応以外は利用できないという欠点があり、酸化還元反応のような反応速度の小さい反応には応用できなかった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
従って本発明の目的は、反応速度の小さい酸化還元反応を利用した高速誘導体化ＨＰＬＣシステムを構築し、ＳＣＥと同等の分離選択性を実現することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
そこで本発明者は多孔質グラファイトの酸化還元触媒機能に着目して種々検討してきたところ、通常のＨＰＬＣ用充填剤を充填した２つのカラムの中間に多孔質グラファイトを充填したカラムを配設すれば、通常のＨＰＬＣ用充填剤による分離機能と、多孔質グラファイトの酸化還元触媒機能とが効率良く機能し、従来分離が困難であった酸化還元性物質が良好に分離できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００５】
すなわち、本発明は、固定相として、ＨＰＬＣ用充填剤を充填した２つのカラムの間に多孔質グラファイトを充填したカラムを設けたことを特徴とするＨＰＬＣシステムを提供するものである。
また本発明は、当該ＨＰＬＣシステムを用いることを特徴とする酸化還元性物質の分離定量法を提供するものである。
更に本発明は、ＨＰＬＣ用充填剤を充填した２つのカラムの間に多孔質グラファイトを充填したカラムを設けたことを特徴とするＨＰＬＣ用固定相を提供するものである。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明のＨＰＬＣシステムに用いる固定相は、通常のＨＰＬＣ用充填剤を充填した２つのカラムの間に多孔質グラファイトを充填したカラムを設けてなる。ここで、多孔質グラファイトとしては、大きな表面積と高い耐圧性を有するものが好ましく、表面積３０〜１００cm²／ｇ、細孔直径２０〜５００Åのものがより好ましい。当該多孔質グラファイトとしては、石油ピッチ、合成高分子などを高温で焼成して得られたものがいずれも使用できる。また、多孔質グラファイトの形状は、粒状、繊維状、ディスク状等のいずれでもよい。
【０００７】
また、当該多孔質グラファイト充填カラムの両側に設けられるカラムに充填されるＨＰＬＣ用充填剤は、被検対象により選択され、ゲル濾過用充填剤、疎水クロマトグラフィー用充填剤、イオン交換クロマトグラフィー用充填剤、分配クロマトグラフィー用充填剤等を用いることができる。具体的には、シリカ系充填剤、アルミナ系充填剤、ポリマー系充填剤等を用いることができる。シリカ系充填剤としては、多孔性シリカゲル、アルキル基を結合したシリカゲル（オクチルシリル化シリカゲル、オクタデシルシリル化シリカゲル等）のほかフェニル基やアミノ基を結合したシリカゲル等が挙げられる。ポリマー系充填剤としては、ポリスチレンゲル、ポリビニルアルコールゲル、ポリヒドロキシメタアクリレートゲルやそれらにイオン交換基を修飾したイオン交換樹脂等が挙げられる。このほか、ヒドロキシアパタイトやチタニア、ジルコニアなどの無機系充填剤も用いることができる。
【０００８】
２つのＨＰＬＣ用充填剤を充填したカラムには、同一の充填剤を用いてもよいし、相互に異なる充填剤を用いてもよい。
【０００９】
また、前記２つのＨＰＬＣ用充填剤を充填したカラムの上流側には、更に前記の多孔質グラファイト充填カラムを配置してもよい。かくすることにより、目的物質の化学種（酸化状態）をそろえることができる。
【００１０】
上記のようなシステムを用いることにより、通常のＨＰＬＣカラムによる分離が、酸化還元反応に基づく化学種変換機能により特異的な選択性を有するようになり、酸化還元物質の分離が可能になる。この機能について、遷移金属の分離を例にして説明する。すなわち、銅、鉄、コバルト、ニッケル、ビスマス等の遷移金属混合物にＥＤＴＡを反応させて錯体を生成させ、これを従来の逆相イオン対モードＨＰＬＣに付すと、コバルトの２価および３価イオンの錯体のピークはそれぞれＦｅ³⁺とＮｉ²⁺のピークと重なってしまい、良好な分離は不可能である（図３参照）。これに対し、コバルトをすべて２価イオンにした後にＥＤＴＡ錯体とした金属混合物を、２つのＨＰＬＣカラムの間に酸化剤（過酸化水素）で処理した多孔質グラファイトカラムを配置したＨＰＬＣシステムに付すと、前段の分離カラムを２価錯体として通過したコバルトがグラファイトカラムで酸化されて、後段の分離カラムでは３価錯体として溶出する。そのため、前段ではＦｅ³⁺と後段ではＮｉ²⁺と完全に分離される（図４参照）。これらの遷移金属の分離は通常のＨＰＬＣカラムのみでは不可能である。また、多孔質グラファイトカラムのみを用いた場合には、酸化還元機能と溶質保持機能の両方を多孔質グラファイトカラムに依存することになるが、両者は独立ではないため、分離の制御が極めて複雑になる。したがって、本発明のように分離場と酸化還元反応場を分離して組み合わせることにより、高度でかつ設計が容易な分離分析システムが可能になる。
【００１１】
ここで、多孔質グラファイト充填カラムをあらかじめ還元処理しておけば、このカラム内で還元反応を行なわせることができ、一方あらかじめ酸化処理しておけばこのカラム内で酸化反応を行なわせることができる。そして、この酸化処理及び還元処理の強さを制御することによって、このカラム内での酸化反応及び還元反応を制御することができる。また、用いる還元剤及び酸化剤の種類を変えることにより、反応の強さを制御することができる。還元剤の例としては亜硫酸ナトリウム、塩化ヒドロキシルアンモニウム、アスコルビン酸などが、酸化剤の例としては過酸化水素などが挙げられる。
【００１２】
酸化処理および還元処理は多孔質グラファイトカラムに電位を印加することによっても行うことができる。すなわち多孔質グラファイト充填剤をカラムに詰め、これを電極とするか、または多孔質グラファイトディスクを電極として電位を印加する。この電位をポテンショスタットを用いて調節することにより、酸化反応および還元反応の進行を制御することができる。
【００１３】
本発明のＨＰＬＣシステムは、前記の固定相を用いる以外は通常のＨＰＬＣと同様に適宜選択することができる。すなわち、本発明のシステムは、逆相ＨＰＬＣ、イオン対ＨＰＬＣ、順相ＨＰＬＣ、イオン交換ＨＰＬＣ、サイズ排除ＨＰＬＣ、疎水性相互作用ＨＰＬＣなどいずれにも適用可能である。従って溶離液も、水、各種有機溶媒から適宜選択できる。更に検出手段に関しても、紫外吸光検出、屈折率検出、蛍光検出等が使用できる。
【００１４】
本発明のＨＰＬＣシステムは、酸化還元反応を利用するものであるため、酸化還元性物質の分離定量に好適である。当該酸化還元物質には、各種の金属（希土類金属を含む遷移金属）をはじめとする無機化合物や多くの有機化合物が含まれるので、対象試料としては金属材料、鉱石、無機成分含有試薬や酸化還元酵素、カテコールアミン等の生体関連物質等が挙げられる。
【００１５】
【実施例】
次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明は何らこれに限定されるものではない。
【００１６】
実施例１
２つのオクタデシルシリル化シリカゲル（ＯＤＳ）充填カラムの間に多孔質グラファイト充填カラムを設けた。すなわち、ＯＤＳ（Capcell Pak C18 UG120,3μm）を充填したカラム（４．６×１００nm）を２本用意した。また、多孔質グラファイト（ＢＬ−０１，３．５μm）を充填したカラム（４．６×１０mm）を用意した。ＯＤＳ充填カラムのみを用いて図１に示すＨＰＬＣシステムを構築した。また、ＯＤＳ充填カラムの間に多孔質グラファイト充填カラムを設けカラムシステムを構築した。このカラムシステムを用いて、図２に示すＨＰＬＣシステムを構築した。試料として、コバルト（０．１mM）、ビスマス（０．１mM）、鉄（０．１mM）、ニッケル（０．１mM）及び銅（０．１mM）をＥＤＴＡでキレート化した水溶液を用いた。カラムをあらかじめ０．１mMセチルトリメチルアンモニウムブロミドで処理し、溶離液として０．１Ｍ酢酸バッファ（pH５）を用い、流速０．６mL／minの条件で分析した。その結果、ＯＤＳカラムのみを用いた場合には、図３に示すように、コバルトがＣｏ³⁺とＣｏ²⁺とに分離し、Ｃｏ³⁺がＦｅ³⁺のピークと重なり、一方Ｃｏ²⁺がＮｉ²⁺のピークと重なってしまい、コバルトは他の金属と分離できなかった。
一方、本発明の固定相を用いた場合には、図４に示すようにコバルトを、他の金属と完全に分離することができた。
【００１７】
【発明の効果】
本発明のＨＰＬＣシステムを用いれば従来分離が困難であった酸化還元性物質が良好かつ簡便に分離定量できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＯＤＳ充填カラムのみを用いたＨＰＬＣシステムを示す概略図である。
【図２】本発明の固定相を用いたＨＰＬＣシステムの一例を示す概略図である。
【図３】図１のＨＰＬＣシステムを用いた遷移金属の分離結果を示す図である。
【図４】図２のＨＰＬＣシステムを用いた遷移金属の分離結果を示す図である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a high performance liquid chromatography system provided with a redox reaction field in a stationary phase, and a method for separating and quantifying redox substances using the same.
[0002]
[Prior art]
High performance liquid chromatography (HPLC) is an excellent separation analysis method, and is widely used regardless of inorganic compounds and organic compounds. However, separation and quantification of trace components in a multi-component mixture may not always be easy, and there is a demand for construction of a system having new separation selectivity. Utilizing a specific chemical reaction for the target compound is one of the effective methods for obtaining high selectivity. Previously, a derivatization method, a reaction reagent was introduced into the stationary phase or mobile phase. The method of specifically increasing retention and the so-called “introduction of secondary chemical equilibra (SCE)” aiming at advanced separation by controlling the equilibrium of the reaction by the reagent concentration have been used. Yes. Among these, the method of using a chemical reaction as SCE has a high utility value because the range of compounds targeted by one reaction is wide. However, in principle, there is a drawback that it can not be used except for a reaction with a high reaction rate such as an acid-base reaction, and it cannot be applied to a reaction with a low reaction rate such as a redox reaction.
[0003]
[Problems to be solved by the invention]
Accordingly, an object of the present invention is to construct a high-speed derivatization HPLC system using a redox reaction having a low reaction rate, and to realize separation selectivity equivalent to that of SCE.
[0004]
[Means for Solving the Problems]
Therefore, the present inventor has made various studies paying attention to the redox catalyst function of porous graphite, and if a column packed with porous graphite is arranged between two columns packed with a normal packing material for HPLC. The present invention was completed by finding that the separation function using a normal HPLC packing material and the redox catalyst function of porous graphite function efficiently, and the redox substances that were difficult to separate can be separated well. It came to do.
[0005]
That is, the present invention provides an HPLC system characterized in that a column filled with porous graphite is provided between two columns packed with a packing material for HPLC as a stationary phase.
The present invention also provides a method for separating and quantifying redox substances characterized by using the HPLC system.
Furthermore, the present invention provides a stationary phase for HPLC, wherein a column filled with porous graphite is provided between two columns packed with a packing material for HPLC.
[0006]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The stationary phase used in the HPLC system of the present invention comprises a column packed with porous graphite between two columns packed with a normal HPLC packing material. Here, the porous graphite preferably has a large surface area and high pressure resistance, and more preferably has a surface area of 30 to 100 cm ² / g and a pore diameter of 20 to 500 mm. As the porous graphite, any of those obtained by firing petroleum pitch, synthetic polymer or the like at a high temperature can be used. Further, the shape of the porous graphite may be any of granular, fibrous, disk-like and the like.
[0007]
In addition, the packing material for HPLC packed in the columns provided on both sides of the porous graphite packed column is selected according to the test object, and the packing material for gel filtration, the packing material for hydrophobic chromatography, the packing for ion exchange chromatography. Agents, fillers for partition chromatography, and the like can be used. Specifically, silica-based fillers, alumina-based fillers, polymer-based fillers, and the like can be used. Examples of the silica filler include porous silica gel, silica gel bonded with an alkyl group (octylsilylated silica gel, octadecylsilylated silica gel, etc.), and silica gel bonded with a phenyl group or an amino group. Examples of the polymer filler include polystyrene gel, polyvinyl alcohol gel, polyhydroxymethacrylate gel, and ion exchange resins in which ion exchange groups are modified. In addition, inorganic fillers such as hydroxyapatite, titania and zirconia can also be used.
[0008]
In the column packed with two HPLC packing materials, the same packing material may be used, or different packing materials may be used.
[0009]
Further, the porous graphite packed column may be further arranged on the upstream side of the column packed with the two HPLC packing materials. In this way, the chemical species (oxidation state) of the target substance can be aligned.
[0010]
By using the system as described above, separation by a normal HPLC column has a specific selectivity due to a chemical species conversion function based on a redox reaction, and a redox substance can be separated. This function will be described by taking transition metal separation as an example. That is, EDTA is reacted with a transition metal mixture such as copper, iron, cobalt, nickel, bismuth and the like to form a complex, which is subjected to conventional reversed-phase ion-pair mode HPLC. Complex peaks overlap with Fe ³⁺ and Ni ²⁺ peaks, respectively, and good separation is impossible (see FIG. 3). In contrast, when a metal mixture in which all cobalt is converted to divalent ions and then converted into an EDTA complex is applied to an HPLC system in which a porous graphite column treated with an oxidizing agent (hydrogen peroxide) is disposed between two HPLC columns. Cobalt that has passed through the former separation column as a divalent complex is oxidized by the graphite column and eluted as a trivalent complex in the latter separation column. Therefore, it is completely separated from Fe ³⁺ in the former stage and Ni ^{2+ in the} latter stage (see FIG. 4). Separation of these transition metals is not possible only with ordinary HPLC columns. In addition, when only a porous graphite column is used, both the redox function and the solute retention function depend on the porous graphite column, but since both are not independent, the control of separation is extremely complicated. Become. Therefore, by separating and combining the separation field and the oxidation-reduction reaction field as in the present invention, a separation analysis system that is sophisticated and easy to design becomes possible.
[0011]
Here, if the porous graphite-filled column is subjected to a reduction treatment in advance, the reduction reaction can be carried out in this column, whereas if the oxidation treatment is carried out in advance, the oxidation reaction can be carried out in this column. . And the oxidation reaction and the reduction reaction in this column can be controlled by controlling the strength of the oxidation treatment and the reduction treatment. In addition, the strength of the reaction can be controlled by changing the types of reducing agent and oxidizing agent used. Examples of the reducing agent include sodium sulfite, hydroxylammonium chloride, ascorbic acid and the like, and examples of the oxidizing agent include hydrogen peroxide and the like.
[0012]
The oxidation treatment and the reduction treatment can also be performed by applying a potential to the porous graphite column. That is, a porous graphite filler is packed in a column and used as an electrode, or a potential is applied using a porous graphite disk as an electrode. By adjusting this potential using a potentiostat, the progress of the oxidation reaction and the reduction reaction can be controlled.
[0013]
The HPLC system of the present invention can be appropriately selected in the same manner as normal HPLC except that the above stationary phase is used. That is, the system of the present invention can be applied to any of reverse phase HPLC, ion pair HPLC, normal phase HPLC, ion exchange HPLC, size exclusion HPLC, hydrophobic interaction HPLC, and the like. Therefore, the eluent can also be appropriately selected from water and various organic solvents. Further, with respect to the detection means, ultraviolet absorption detection, refractive index detection, fluorescence detection and the like can be used.
[0014]
Since the HPLC system of the present invention utilizes a redox reaction, it is suitable for separation and quantification of redox substances. Since the redox substances include inorganic compounds and many organic compounds including various metals (transition metals including rare earth metals), target samples include metal materials, ores, inorganic component-containing reagents and redox Examples thereof include bio-related substances such as enzymes and catecholamines.
[0015]
【Example】
EXAMPLES Next, although an Example is given and this invention is demonstrated further in detail, this invention is not limited to this at all.
[0016]
Example 1
A porous graphite packed column was installed between two octadecyl silylated silica gel (ODS) packed columns. That is, two columns (4.6 × 100 nm) packed with ODS (Capcell Pak C18 UG120, 3 μm) were prepared. A column (4.6 × 10 mm) packed with porous graphite (BL-01, 3.5 μm) was prepared. The HPLC system shown in FIG. 1 was constructed using only an ODS packed column. A column system was constructed by providing a porous graphite packed column between ODS packed columns. The HPLC system shown in FIG. 2 was constructed using this column system. As a sample, an aqueous solution in which cobalt (0.1 mM), bismuth (0.1 mM), iron (0.1 mM), nickel (0.1 mM) and copper (0.1 mM) were chelated with EDTA was used. The column was pretreated with 0.1 mM cetyltrimethylammonium bromide, and 0.1 M acetate buffer (pH 5) was used as an eluent, and analysis was performed under conditions of a flow rate of 0.6 mL / min. As a result, when only the ODS column was used, as shown in FIG. 3, cobalt was separated into Co ³⁺ and Co ^2+, and Co ³⁺ overlapped with the Fe ³⁺ peak, while Co ²⁺ ^{Overlapped with} the peak of Ni ²⁺ and cobalt could not be separated from other metals.
On the other hand, when the stationary phase of the present invention was used, cobalt could be completely separated from other metals as shown in FIG.
[0017]
【The invention's effect】
By using the HPLC system of the present invention, redox substances that have been difficult to separate can be separated and quantified easily and easily.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a schematic diagram showing an HPLC system using only an ODS packed column.
FIG. 2 is a schematic diagram showing an example of an HPLC system using the stationary phase of the present invention.
FIG. 3 is a diagram showing the results of separation of transition metals using the HPLC system of FIG.
4 is a diagram showing the results of separation of transition metals using the HPLC system of FIG. 2. FIG.

Claims

固定相として、高速液体クロマトグラフィー用充填剤を充填した２つのカラムの間に多孔質グラファイトを充填したカラムを設けたことを特徴とする高速液体クロマトグラフィーシステム。A high-performance liquid chromatography system comprising a column filled with porous graphite between two columns packed with a packing material for high-performance liquid chromatography as a stationary phase.

上流側の高速液体クロマトグラフィー用充填剤を充填したカラムの上流側に、更に多孔質グラファイトを充填したカラムを設けてなる請求項１記載のシステム。2. The system according to claim 1, wherein a column filled with porous graphite is further provided on the upstream side of the column packed with the upstream high-performance liquid chromatography packing material.

多孔質グラファイトを充填したカラムが、使用前に酸化処理又は還元処理されていることを特徴とする請求項１又は２記載のシステム。The system according to claim 1 or 2, wherein the column filled with porous graphite is oxidized or reduced before use.

請求項１〜３のいずれか１項記載のシステムを用いることを特徴とする酸化還元性物質の分離定量法。A method for separating and quantifying a redox substance using the system according to any one of claims 1 to 3.

高速液体クロマトグラフィー用充填剤を充填した２つのカラムの間に多孔質グラファイトを充填したカラムを設けたことを特徴とする高速液体クロマトグラフィー用固定相。A stationary phase for high-performance liquid chromatography, wherein a column filled with porous graphite is provided between two columns packed with a packing material for high-performance liquid chromatography.

上流側の高速液体クロマトグラフィー用充填剤を充填したカラムの上流側に、更に多孔質グラファイトを充填したカラムを設けてなる請求項５記載の固定相。The stationary phase according to claim 5, wherein a column filled with porous graphite is further provided on the upstream side of the column filled with the upstream high-performance liquid chromatography packing material.

多孔質グラファイトを充填したカラムが、使用前に酸化処理又は還元処理されていることを特徴とする請求項１又は２記載の固定相。The stationary phase according to claim 1 or 2, wherein the column filled with porous graphite is oxidized or reduced before use.