JPH0815244A - アルミニウム測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 安価でコンパクトな装置を使用し、簡便かつ
短時間に測定を行うことができ、そして検出感度が高く
ごく微量のアルミニウムを精度良く測定することができ
る、アルミニウムのクロマトグラフィーによる測定方法
を提供する。 【構成】 高速液体クロマトグラフィー等のクロマトグ
ラフィーによるアルミニウムの測定において、界面活性
剤を含有する移動相を用いて測定を行う。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、簡便かつ高精度に測定
を行うことができるアルミニウムのクロマトグラフィー
による測定方法に関するものであって、例えば生体試
料、飲食物、飲料水等に含まれるアルミニウムの測定に
有用であり、臨床検査分野の血液透析患者の血液中アル
ミニウム濃度の測定等に特に有用なものである。

【０００２】

【従来の技術】アルミニウムは地球表層では、酸素、ケ
イ素の次に多い元素である。そして、生体中には微量で
あるが一定の濃度で含まれており、例えばヒト健常者の
血清中には３．７〜４９μｇ／ｌ（ｐｐｂ）の濃度で含
まれている。〔真鍋，日本臨牀増刊（上巻），４７，７
４２（１９８９）〕

【０００３】現在、疾病とアルミニウムの関連が明らか
になりつつある。血液透析患者では血液中アルミニウム
濃度が高値となることが報告され、長期血液透析を行っ
た患者に頻発する痴呆症は、脳に蓄積されたアルミニウ
ムによって引き起こされると考えられており、またアル
ミニウムと脳症、脳軟化症及び貧血との関連も指摘され
ており、更にアルツハイマー病とアルミニウムの関連も
盛んに示唆されている。〔Ｍ．Ｇｉｎｋｅｌ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，３６，６５８（１９９
０），Ｃ．Ｍａｒｔｙｎ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅ
ｔ，８６２９，５９（１９８９），Ａ．Ａｌｆｒｅｙ
ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓ．Ａｍｅｒ．Ｓｏｃ．Ａｒｔ
ｉｆ．Ｏｒｇａｎｓ．，１８，２５７（１９７２），
Ａ．Ａｌｆｒｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．
Ｊ．Ｍｅｄ．，２９４，１８４（１９７６），Ｇ．Ｄｕ
ｎｅａ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅ
ｄ．，８８，５０２（１９７８），Ｖ．Ｒｏｚａｓ ｅ
ｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．，１３
８，１３７５（１９７８），Ｊ．Ｐｒｉｏｒ ｅｔ ａ
ｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．，６７，５８３（１９７
９），川原ら，臨床成人病，２３，４４７（１９９
３）〕

【０００４】実際、血液透析患者については、血液中の
アルミニウム濃度の測定が頻繁に行われており、この血
液中のアルミニウム濃度を測定して監視することが、血
液透析患者の健康管理のうえでは必須のこととなってい
る。

【０００５】このように生体試料中のアルミニウムを測
定することは、疾病の研究、疾病の診断、健康状態の管
理等の医学や生命科学の分野において重要な意義を持つ
ものである。

【０００６】また、前記の疾病や健康管理とアルミニウ
ムとの関係にかんがみて、食品、飲料、飲料水及び環境
中のアルミニウムを測定することも重要となってきてい
る。

【０００７】従来、微量のアルミニウムの測定には主に
フレームレス原子吸光装置（電気炉原子吸光装置）が用
いられてきた。〔Ｆ．Ａｌｄｅｒｍａｎ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｃｌｉｎ・Ｃｈｅｍ．，２６，２５８（１９８
０），Ｋ．Ｗｒｏｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｎａ
ｌ．Ａｔ．Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．，８，９１５（１９９
３），Ａ．Ｐｉｎｅａｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｌｉｎ．，５０，５７７（１９９２）〕

【０００８】ところが、このフレームレス原子吸光装置
によるアルミニウムの測定方法は、下記の欠点を有す
る。 フレームレス原子吸光装置は、大変高価であり、ま
た広いスペースを必要とし、配管や換気装置が必要で設
置場所が限定される。 フレームレス原子吸光装置は、試料溶液を原子化す
る炭素炉が測定のたびに消耗し、約１００回測定するた
びに交換しなければならず、煩雑であり費用もかかる。 フレームレス原子吸光装置による測定は、電力消費
量が非常に大きいので、ランニングコストがかさむ。

【０００９】本発明の発明者の一人である四ツ柳とその
グループは、このフレームレス原子吸光装置による測定
方法が有する欠点を克服する測定方法として、液体クロ
マトグラフィーによるアルミニウムの測定方法の検討を
進めてきた。その結果、下記の手順よりなるイオン対逆
相分配高速液体クロマトグラフィーによる生体試料中の
アルミニウムの測定方法を確立した。 血清試料０．４ｍｌを塩酸で加水分解し、更にメタ
ノールを添加後遠心分離をして除タンパク処理を行う。 その上清をキレート試薬の２，２’−ジヒドロキシ
アゾベンゼン（ＤＨＡＢ）溶液、対イオンとしてのテト
ラメチルアンモニウムヒドロキシド（ＴＭＡＨ）溶液、
及びトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸緩衝
液と混合し、７０℃で３０分間反応させる。 冷却後、反応液の１００μｌをオクタデシルシラン
（ＯＤＳ）カラムを装着した高速液体クロマトグラフィ
ー（ＨＰＬＣ）装置に注入し、５１０ｎｍでの吸光度を
測定する。〔四ツ柳ら，臨床化学，２１，１１３（１９
９２）〕

【００１０】この測定方法は、汎用されているＯＤＳカ
ラムと高速液体クロマトグラフィー装置を用いてアルミ
ニウムの測定を行う測定方法であり、特殊な装置を使用
せずに安価に測定を行うことができる方法である。

【００１１】しかしながら、この測定方法では、血清試
料などのタンパク質等の高分子物質を含む試料の測定に
おいては、カラムをタンパク質等の高分子物質による分
離能低下から保護するため及びアルミニウムの分離又は
検出がタンパク質等の高分子物質により妨害されないた
めの前処理としての除タンパク処理を必ず必要とし、更
に除タンパク処理後の試料中のアルミニウムとキレート
試薬を反応させるのに７０℃で３０分間必要であり、そ
の後冷却を行ってから測定試料を高速液体クロマトグラ
フィー装置に注入して測定を行わなければならず、１回
の測定に長い時間（約６０分間）を必要とし、また操作
も非常に煩雑であるという難点を有していた。また、測
定感度はフレームレス原子吸光測定装置と同程度であっ
て、ごく微量のアルミニウムを測定することができず
（測定感度１０μｇ／ｌ）、測定精度も良くないという
難点をも有するものであった。

【００１２】なお、本発明の発明者の一人である四ツ柳
とそのグループにおける液体クロマトグラフィーによる
アルミニウムの測定方法の研究において、アルミニウム
の信号標識化物質である８−ヒドロキシキノリンを水溶
液に溶解させるのに、界面活性剤を添加すると溶解性が
向上することを見い出したが、この場合でも移動相には
界面活性剤を含有させてはおらず、本発明とは目的、構
成及び効果とも全く異なるものである。

【００１３】

【発明が解決しようとする課題】前記のように、従来の
アルミニウムの測定方法であるフレームレス原子吸光装
置による測定方法においては、大変高価で大きな測定装
置が必要であり、かつ消耗部品の交換が必要であるた
め、煩雑であり費用がかかるものであった。また、ＯＤ
Ｓカラムと高速液体クロマトグラフィー装置を用いる測
定方法においては、前処理としての除タンパク処理操作
や加熱反応操作そして冷却操作のために長時間の測定時
間が必要であり、操作が煩雑であり、そして結果として
測定の費用がかかるものであった。更に検出感度が低い
ために、ごく微量のアルミニウムを測定することができ
ず、測定精度も良くないものであった。

【００１４】本発明者らは、これらの従来のアルミニウ
ム測定方法が有する欠点の解消を目指して鋭意研究を行
った結果、アルミニウムのクロマトグラフィーによる測
定方法において、移動相に界面活性剤を含有させること
により、タンパク質等の高分子物質を含む試料において
も除タンパク処理を行わずに測定が行えること及び高感
度かつ高精度に測定が行えることを見い出した。そし
て、高速液体クロマトグラフィー装置及びそのカラム等
の現在汎用されている安価でコンパクトな装置や器具を
使用し、除タンパク処理操作、加熱反応操作及び冷却操
作を必要とせずに簡便かつ短時間に測定を行うことがで
き、そして検出感度が高く、ごく微量のアルミニウムを
精度良く測定することができ、かつランニングコストが
低いアルミニウムの測定方法である本発明を完成するに
到った。

【００１５】

【課題を解決するための手段】本発明は以下の発明を包
含する。 （１）界面活性剤を含有する移動相を用いることを特徴
とするアルミニウムのクロマトグラフィーによる測定方
法、（２）クロマトグラフィーが液体クロマトグラフィ
ーである前記（１）の測定方法、（３）アルミニウムが
生体試料中に含まれるアルミニウムである前記（１）及
び（２）の測定方法、（４）界面活性剤がドデシル硫酸
ナトリウムである前記（１）ないし（３）の測定方法。

【００１６】アルミニウムは単体、イオン及び化合物等
の種々の形態を取り、また遊離又はキャリアーに結合し
た状態等で存在し、そして様々な物に含まれて存在して
いるが、本発明により測定されるアルミニウムは特に限
定されるものではなく、直接又は処理を行うことにより
クロマトグラフィーにかけることが可能なものであれば
対象となる。

【００１７】本発明におけるクロマトグラフィーとして
は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、オープ
ンカラムによる液体クロマトグラフィー、電気泳動法及
びキャピラリー電気泳動法等の、測定試料を移動相（展
開剤）により固定相中を移動させ、測定試料中の各成分
の移動速度の差により、これらを相互に分離する方法を
用いることができる。なお、移動相は高速液体クロマト
グラフィー及びオープンカラムによる液体クロマトグラ
フィーでは溶離液とも呼ばれ、また電気泳動法およびキ
ャピラリー電気泳動法では泳動緩衝液とも呼ばれている
が、本発明における移動相はこれらをも包含するもので
ある。

【００１８】また、本発明におけるクロマトグラフィー
による測定方法としては、前記のクロマトグラフィーに
より分離した測定試料中の成分を、その成分に由来する
光学的信号、電気的信号又は放射化学的信号等の信号を
検出装置により又は目視により検出することにより、定
性的又は定量的に測定を行う測定方法を用いることがで
きる。

【００１９】本発明における界面活性剤としては、陰イ
オン界面活性剤、陽イオン界面活性剤、両性界面活性剤
及び非イオン界面活性剤のいずれをも用いることができ
る。

【００２０】以下、本発明のより詳細な説明を行う。本
発明では前記したように、種々の形態をとり、かつ様々
な物に含有されるアルミニウムを測定することが可能で
ある。本発明は微量のアルミニウムをも迅速、簡便、か
つ高感度に測定することを特徴とするものであるので、
生体試料、食肉、野菜、穀物、果物、水産物、加工食
品、飲料及び飲料水等の微量のアルミニウムが含まれる
可能性があるもの（測定対象物）に含有されるアルミニ
ウムの測定に特に有効なものである。例えば、生体試料
としては、ヒト又は動物の血液、血清、血漿、尿、大
便、***、髄液、唾液、汗、涙、腹水、羊水、脳等の臓
器、毛髪や皮膚や爪や筋肉若しくは神経等の組織及び細
胞等が本発明に適用することができるものである。

【００２１】本発明においては、クロマトグラフィーに
直接かける測定試料は液体である必要があるので、測定
対象物が液体でない場合には、抽出処理又は可溶化処理
等の前処理を公知の方法に従って行ない、アルミニウム
を液体中に含有させるようにして、これを測定試料とす
る。

【００２２】また、本発明の特徴の一つとして、測定試
料中にタンパク質が存在していても測定を行うことがで
き、除タンパク処理操作が不必要であることを挙げるこ
とができるが、例え本発明において除タンパク処理を行
っても測定値に悪影響を及ぼすことはない。

【００２３】本発明は、前記したように種々のクロマト
グラフィーに適用可能である。高速液体クロマトグラフ
ィー及びオープンカラムによる液体クロマトグラフィー
等の液体クロマトグラフィーは、基本的には固定相とし
ての分離カラム、移動相及び送液ポンプにより構成さ
れ、これに検出装置又は測定試料インジェクターを組み
合わせることもできる。なお、送液ポンプ及び測定試料
インジェクターは、測定を行う測定試料の容量、固定相
の容量及び移動相の移動速度等の条件に応じて適当なも
のを使用すればよい。

【００２４】本発明を液体クロマトグラフィーにより実
施する場合には、オクタデシルシラン（ＯＤＳ）カラム
等の公知の逆相クロマトグラフィーカラム、バイオプテ
ィックＡＶ−１カラム（ＧＬサイエンス社製）等のタン
パク質被覆化ＯＤＳカラム及びカプセルバックＭＦ ｐ
ｈ−１カラム（資生堂社製）等の親水性基と疎水性基を
併せ持つ担体よりなるカラム等を固定相として用いるこ
とができる。特にこの親水性基と疎水性基を併せ持つ担
体よりなるカラムを用いた場合には、測定試料中のアル
ミニウムとタンパク質をより鮮明に分離することができ
好ましい。

【００２５】電気泳動法及びキャピラリー電気泳動法で
は、ポリアクリルアミドゲル及びアガロースゲル等の公
知の電気泳動用担体を固定相として用いることができ
る。

【００２６】移動相の組成及びその移動速度は、固定相
の種類、固定相の容量及び分離したアルミニウムの測定
方法に応じて、適当な組成及び移動速度を選択すれば良
いが、界面活性剤を含有することは必須である。例え
ば、本発明を逆相系のカラムを用いた液体クロマトグラ
フィーにより実施する場合には、アセトニトリル、酢酸
等の有機溶媒を０〜５０％の範囲で、Ｎ，Ｎ−ビス（２
−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸
〔ＢＥＳ〕若しくはトリス（ヒドロキシメチル）アミノ
メタン等の公知の緩衝剤を０．００１〜０．５Ｍかつｐ
Ｈ４．０〜９．０の範囲で、水を０〜９５％の範囲で、
ＥＤＴＡ等のキレート剤を０．０１〜５００ｍＭの範囲
で、そしてアジ化ナトリウム等の防腐剤、アルミニウム
の検出のための試薬、又は対イオンを移動相中に含有さ
せることができる。また、移動相の組成を時間的に変化
させても良い。

【００２７】そして、高速液体クロマトグラフィーによ
る場合は、例えば０．１〜１０．０ｍｌ／分の範囲内
で、またオープンカラムによる液体クロマトグラフィー
の場合は、例えば０．０１〜５．０ｍｌ／分の範囲内で
移動相の移動速度を設定すれば良い。

【００２８】移動相に含有させる界面活性剤は、界面活
性作用を有する物質であれば良く、例えば表１に記した
構造よりなる界面活性剤を用いることができる。

【００２９】

【表１】

【００３０】これらの界面活性剤として、対応する市販
の界面活性剤を用いることができるが、市販品の例とし
ては、陰イオン界面活性剤のドデシル硫酸ナトリウム
（和光純薬工業社製）、非イオン界面活性剤のトライト
ン Ｘ−１００（ポリエチレングリコール−モノ−ｐ−
オクチルフェニルエーテル（ｎ＝１０）、東京化成社
製）、ＰＯＮＰＥ−２０（東京化成社製）及び陽イオン
界面活性剤のＣＡ−２３３０（日光ケミカル社製）等が
挙げられる。これらの界面活性剤を移動相中に含有させ
る濃度は、分離能や感度等の条件に応じて適宜設定すれ
ば良い。

【００３１】本発明におけるクロマトグラフィーによる
測定方法においては、前記のクロマトグラフィーにより
分離した測定試料中のアルミニウムを、アルミニウム自
体又はアルミニウムと結合した信号物質の光学的信号、
電気的信号又は放射化学的信号等の信号を、検出装置に
より又は目視により検出することにより、定性的又は定
量的にアルミニウムの測定を行うことができる。

【００３２】この分離したアルミニウムに由来する信号
の検出は、クロマトグラフィーの移動相の流路中にアル
ミニウムが存在する間に、目視により又はこの流路中に
配置した検出装置により行うことができる。

【００３３】また、クロマトグラフィーより移動相を分
別して収集し、このフラクションを目視により又は検出
装置にかけることにより検出を行うこともできる。

【００３４】分離したアルミニウム自体の信号を検出す
る方法は、例えばＩＣＰ−発光分析法等の検出装置によ
り検出する方法が適用できる。

【００３５】分離したアルミニウムと結合した信号物質
の信号を検出する方法においては、紫外部吸光、可視部
吸光、赤外部吸光、蛍光、発光若しくは屈折率変化等の
光学的信号、電気化学的検出装置により検出される電気
的信号又は放射線よりなる放射化学的信号等の信号を有
しかつアルミニウムと結合する物質をアルミニウムと結
合させるか、これらの光学的信号、電気的信号又は放射
化学的信号等の信号がアルミニウムと結合することによ
り発生又は変化するものである信号を有しかつアルミニ
ウムと結合する物質をアルミニウムと結合させることに
よりアルミニウムの信号標識化を行うことができる。

【００３６】このアルミニウムの信号標識化の時期は、
測定試料をクロマトグラフィーにかける前、クロマトグ
ラフィーにかけている間又は、クロマトグラフィーにか
けた後のいずれをも選択することができる。つまり、本
発明におけるクロマトグラフィーによる測定方法は、プ
レカラム法、速度論的識別モードによるプレカラム法、
オンカラム法、又はポストカラム法のいずれによっても
実施することができるものである。〔壹岐ら、ドージン
ニュース、４８、３（１９８９）参照〕

【００３７】前記の光学的信号、電気的信号又は放射化
学的信号等の信号を有しかつアルミニウムと結合する物
質及び光学的信号、電気的信号又は放射化学的信号等の
信号がアルミニウムと結合することにより発生又は変化
するものである信号を有しかつアルミニウムと結合する
物質は、これらの性質を有する物質であれば特に限定さ
れるものではない。これらの信号を有する物質の例を表
２に示す。

【００３８】

【表２】

【００３９】これらの信号を有する物質と測定試料中の
アルミニウムの結合、つまり測定試料中のアルミニウム
の信号標識化は、測定しようとするアルミニウムの形
態、信号を有する物質及び信号標識化時期等に応じて公
知の方法より選択して操作を行えばよい。

【００４０】測定試料を高速液体クロマトグラフィー、
オープンカラムによる液体クロマトグラフィー、電気泳
動法及びキャピラリー電気泳動法等のクロマトグラフィ
ーにかけて分離を行う方法は、公知の方法及び操作によ
り行えばよい。そして、測定試料中のアルミニウムの定
性的測定は、まず前記のようにして検出した信号をアル
ミニウムを含有する標準試料の信号のリテンションタイ
ム又は移動度等と対比することにより、分離したアルミ
ニウムに由来する信号を同定することができる。

【００４１】定量的測定を行う場合には更に、得られた
クロマトグラム上のこの分離したアルミニウムに由来す
る信号（ピーク）の高さ又は面積等を濃度既知のアルミ
ニウムを含有する標準試料のものと比較し計算すること
により、定量値を求めればよい。また、検出装置よりの
電気信号を基に定量値を算出してもよい。

【００４２】なお、本発明においては、測定対象物中の
アルミニウムの測定に誤差を与える測定対象物外よりの
アルミニウムの混入を防ぐように十分に注意して実施を
することが望ましい。これには、試薬等は不純物として
のアルミニウムが含まれていない高純度試薬を用いるこ
と、水は２回蒸留を行った純度の高いものを用いるこ
と、容器及び器具は酸で洗浄してアルミニウムを除いた
合成樹脂製のものを用いること及び環境中からのアルミ
ニウムの混入を防ぐように注意して実施すること等が考
えられる。

【００４３】以下、ヒト血清中のアルミニウムの測定を
行う場合の説明を行う。まず、ヒト血清試料３００μｌ
に１Ｎ塩酸５０μｌを加えてｐＨを３以下とすることに
より、アルミニウムを主にトランスフェリンから成るア
ルミニウム結合性成分から解離させる。次に０．００５
Ｍの８−ヒドロキシキノリンを含む２０％アセトニトリ
ル水溶液２５０μｌをこれに加えて、遊離したアルミニ
ウムの８−ヒドロキシキノリンによる信号標識化を行
う。そして、２．５ＭのＮ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシ
エチル）−２−アミノエタンスルホン酸緩衝液（ｐＨ
７．０）２００μｌをこれに添加混合し、０．５０μｍ
のフィルターでろ過したものを測定試料とする。固定相
として親水性基と疎水性基を併せ持つ担体よりなるカラ
ムであるカプセルパックＭＦ ｐｈ−１ Ｓ−５（４．
６ｍｍ×１５０ｍｍ）カラムを用い、移動相として流速
１．０ｍｌ／分である１５％のアセトニトリル、１０ｍ
Ｍのドデシル硫酸ナトリウム及び０．１ｍＭのＥＤＴＡ
２ナトリウムを含む０．１Ｍ Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒド
ロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸緩衝液
（ｐＨ７．０）を用いる高速液体クロマトグラフィーに
この測定試料１００μｌを注入する。検出は励起波長３
７０ｎｍ、輻射波長５０４ｎｍでの蛍光強度の検出を固
定相カラムの後に配置した蛍光検出装置で行う。検出し
た蛍光強度の信号を記録用紙に記録させクロマトグラム
を得るとともに、検出した蛍光強度の各信号（ピーク）
の積分値（面積）を求め、これとアルミニウム濃度既知
の標準試料の値との比較により、測定試料中のアルミニ
ウムの定量値の算出を行う。

【００４４】

【実施例】以下、実施例により本発明をより具体的に詳
述するが、本発明はこの実施例によって何ら限定される
ものではない。

【００４５】実施例１ アルミニウムの測定 高速液体クロマトグラフィーにより、ヒト血清中に含有
されるアルミニウムの測定を行った。 （１） １ｇ／ｌ（１，０００ｐｐｍ）のアルミニウム
標準液（ＡｌＣｌ_３、和光純薬工業社製、原子吸光分析
用）を０．０１Ｎとした塩酸（関東化学社製、超高純度
試薬）で希釈して、アルミニウム濃度を２５０μｇ／ｌ
とした。 （２） ヒト血清０．９ｍｌに（１）で調製した２５０
μｇ／ｌのアルミニウム溶液０．１ｍｌを添加して、ア
ルミニウム濃度を２５μｇ／ｌ増加させた試料（アルミ
ニウム添加血清試料）を調製した。 （３） また、（１）で調製した２５０μｇ／ｌのアル
ミニウム溶液０．１ｍｌを０．０１Ｎ塩酸０．９ｍｌに
添加して、アルミニウム濃度２５μｇ／ｌの試料（アル
ミニウム試料）を調製した。更に、（２）のヒト血清
０．９ｍｌに０．０１Ｎ塩酸０．１ｍｌを加えたものを
調製して試料（血清試料）とした。 （４） （２）及び（３）で調製した３種類の試料（ア
ルミニウム添加血清試料、アルミニウム試料及び血清試
料）それそれの３００μｌに１Ｎとした塩酸（関東化学
社製、超高純度試薬）５０μｌを加え混合し、次に０．
００５Ｍの８−ヒドロキシキノリン（関東化学社製）を
含む２０％アセトニトリル（ナカライテクス社製、試薬
特級）水溶液２５０μｌを加えて混合して、更に２．５
Ｍ Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミ
ノエタンスルホン酸緩衝液〔ｐＨ７．０〕（同仁化学研
究所社製）２００μｌを添加し混合した。これらをそれ
ぞれ０．５０μｍのフィルターであるサンプレップＬＣ
Ｒ１３−ＬＨ（ミリポア社製）でろ過して、３種類の測
定試料を調製した。 （５） 固定相としてカプセルパックＭＦ ｐｈ−１
Ｓ−５〔４．６ｍｍ×１５０ｍｍ〕カラム（資生堂社
製）を用い、移動相として１５％のアセトニトリル、１
０ｍＭのドデシル硫酸ナトリウム（和光純薬工業社製、
主化学用）及び０．１ｍＭのＥＤＴＡ２ナトリウム（同
仁化学研究所社製、試薬特級）を含む０．１Ｍ Ｎ，Ｎ
−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンス
ルホン酸緩衝液〔ｐＨ７．０〕を流速１．０ｍｌ／分で
用い、そしてＰＵ−９８０型ポンプ（日本分光社製）及
びＦＰ−９２０型蛍光検出器（日本分光社製）を使用す
る高速液体クロマトグラフィーに、（４）の３種類の測
定試料それぞれを１００μｌ注入して測定を行った。な
お、蛍光強度の検出は、励起波長３７０ｎｍ、輻射波長
５０４ｎｍで行った。これらの３種類の試料の測定のク
ロマトグラムを図１に示した。

【００４６】

【図１】

【００４７】なお、これらの図において、横軸はリテン
シヨンタイムを示し、縦軸は蛍光強度を示す。そして、
これらの図のクロマトグラムにおいて、リテンシヨンタ
イムが約１７分であるピーク（信号）がアルミニウム由
来のものであり、約８分のピーク（信号）が遊離の８−
ヒドロキシキノリンのものであることが標準物質のクロ
マトグラムより確かめられている。

【００４８】これらの図より、アルミニウム試料、アル
ミニウム添加血清試料及び血清試料のいずれの試料にお
いても、アルミニウム由来のピーク（信号）が他の血清
成分由来のピーク（信号）と明確に分離され、かつ収れ
んした高感度のピーク（信号）が得られることがわか
る。つまり、本発明によりアルミニウムを精度よく、か
つ高感度に測定できることがわかる。そして、本発明に
より生体試料等のタンパク質などの高分子物質を含む測
定対象物中のアルミニウムも、除タンパク処理を行うこ
となしに、簡便に測定が行えることが示された。

【００４９】なお、本実施例において、（２）及び
（３）で調製した試料中のアルミニウムの測定に要した
時間は２０分間であった。また、本実施例において使用
した器具及び容器は、テフロン製等の合成樹脂製のもの
を用い、その使用前に０．１Ｎ硝酸にて十分洗浄した
後、蒸留操作を２回行った蒸留水にて洗浄した後使用し
た。そして、水は蒸留操作を２回行った蒸留水を使用し
た。

【００５０】実施例２ 移動相中の界面活性剤の分離能
への効果 移動相に界面活性剤を含有させることによる、クロマト
グラフィーにおけるアルミニウムと他の成分との分離能
についての効果を検討した。移動相として界面活性剤で
あるドデシル硫酸ナトリウムのみを除いた、１５％のア
セトニトリル及び０．１ｍＭのＥＤＴＡ２ナトリウムを
含む０．１Ｍ Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）
−２−アミノエタンスルホン酸緩衝液〔ｐＨ７．０〕を
も調製して、別に測定を行うことと、試料として血清試
料のみを測定すること以外は、実施例１と同様にして測
定を行った。これらの測定のクロマトグラムを図２に示
した。

【００５１】

【図２】

【００５２】なお、これらの図において、横軸はリテン
シヨンタイムを示し、縦軸は蛍光強度を示す。そして、
これらの図の界面活性剤を含有しない移動相でのクロマ
トグラムにおいては、リテンシヨンタイムが約２４分の
ピーク（信号）は血清由来成分のものであり、約２５分
のピーク（信号）はアルミニウム由来のものであること
が標準物質のクロマトグラムより確かめられている。ま
た、界面活性剤を含有する移動相でのクロマトグラムに
おいては、リテンシヨンタイムが約１７分であるピーク
（信号）は、アルミニウム由来のものであることが標準
物質のクロマトグラムより確かめられている。

【００５３】これらの図より、界面活性剤を含有する移
動相を用いる本発明は、界面活性剤を移動相に含有させ
ない場合に比べて、アルミニウムに由来するピーク（信
号）が他の成分由来のピーク（信号）と明確に分離され
分離能が向上し、かつピーク（信号）の高さ及び面積が
増大し感度が上昇していることがわかる。つまり、これ
からも本発明はアルミニウムを精度よく、かつ高感度に
測定できることがわかる。そして本発明は、生体試料等
のタンパク質などの高分子物質を含む測定対象物中のア
ルミニウムの測定においても、タンパク質等の成分によ
り測定が妨害され測定値が影響を受けることなく、正確
な測定値が得られることが示された。

【００５４】実施例３ 移動相中の界面活性剤の感度へ
の効果 移動相に界面活性剤を含有させることによる、アルミニ
ウムの検出信号の感度への効果を検討した。界面活性剤
であるドデシル硫酸ナトリウムの濃度がそれぞれ０ｍ
Ｍ、５ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ及び５０ｍ
Ｍである、１５％のアセトニトリル及び０．１ｍＭのＥ
ＤＴＡ２ナトリウムを含む０．１Ｍ Ｎ，Ｎ−ビス（２
−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸緩
衝液〔ｐＨ７．０〕を調製し、これらを移動相として測
定を行うこと、及び試料としてアルミニウム濃度２７μ
ｇ／ｌの試料（アルミニウム試料）と０．０１Ｎ塩酸の
みからなる試料（塩酸ブランク試料）のみを測定するこ
と以外は、実施例１と同様にして測定を行った。これら
の測定の結果を図３に示した。

【００５５】

【図３】

【００５６】なお、この図において、横軸は移動相中の
ドデシル硫酸ナトリウムの濃度を示し、縦軸はアルミニ
ウム試料におけるアルミニウムに由来するピーク（信
号）の面積から、塩酸ブランク試料における同じリテン
シヨンタイムのピーク（信号）の面積を引いたものを示
す。この図より、移動相中の界面活性剤濃度が上昇する
につれ、アルミニウムの検出信号も増大することがわか
る。よって、移動相に界面活性剤を含有させることによ
り、高感度にアルミニウムの測定を行うことができ、こ
れによりごく微量のアルミニウムを測定することが可能
となったことが示された。

【００５７】実施例４ 移動相に含有させた各種界面活
性剤の感度への効果。 移動相に各種の界面活性剤を含有させた時の、アルミニ
ウムの検出信号の感度への効果を検討した。非イオン界
面活性剤であるトライトン Ｘ−１００〔ポリエチレン
グリコール−モノ−ｐ−オクチルフェニルエーテル（ｎ
＝１０）、東京化成社製〕並びにＰＯＮＰＥ−２０（東
京化成社製）、陽イオン界面活性剤であるＣＡ−２３３
０（日光ケミカル社製）及び陰イオン界面活性剤である
ドデシル硫酸ナトリウム（和光純薬工業社製、生化学
用）をそれぞれ１．５％の濃度で、１５％のアセトニト
リル及び０．１ｍＭのＥＤＴＡ２ナトリウムを含む０．
１Ｍ Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−ア
ミノエタンスルホン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に含有させ
て移動相を調製した。また、界面活性剤を含まない１５
％のアセトニトリル及び０．１ｍＭのＥＤＴＡ２ナトリ
ウムを含む０．１Ｍ Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエ
チル）−２−アミノエタンスルホン酸緩衝液（ｐＨ７．
０）よりなる移動相を調製して対照とした。これらの５
種類の移動相をそれぞれ用いて測定を行うこと、試料と
してアルミニウム濃度を２５μｇ／ｌ増加させたヒト血
清試料（アルミニウム添加血清試料）のみを測定するこ
と、アルミニウムに結合した８−ヒドロキシキノリンの
吸光度の検出をＵＶ−９７０型吸光度検出器（日本分光
社製）により、対照の場合及びドデシル硫酸ナトリウム
を含有する移動相の場合は３６５ｎｍにて、またトライ
トン Ｘ−１００を含有する移動相の場合、ＰＯＮＰＥ
−２０を含有する移動相の場合及びＣＡ−２３３０を含
有する移動相の場合は３７０ｎｍにて行うこと、更にア
ルミニウムに結合した８−ヒドロキシキノリンの蛍光強
度の検出をＦＰ−９２０型蛍光検出器（日本分光社製）
により、対照の場合は励起波長３７０ｎｍ、輻射波長５
０７ｎｍにて、トライトン Ｘ−１００を含有する移動
相の場合及びＰＯＮＰＥ−２０を含有する移動相の場合
は励起波長３７７ｎｍ、幅射波長５０６ｎｍにて、ＣＡ
−２３３０を含有する移動相の場合は励起波長３７９ｎ
ｍ、輻射波長５０８ｎｍにて、そしてドデシル硫酸ナト
リウムを含有する移動相の場合は励起波長３７４ｎｍ、
輻射波長４９９ｎｍにて行うこと以外は、実施例１と同
様にして測定を行った。これらの測定の結果を表３に示
した。

【００５８】

【表３】

【００５９】この表より、各種の界面活性剤をそれぞれ
含有する移動相での測定は、界面活性剤を含有しない移
動相での測定に比べてアルミニウムの検出信号が増加し
ており、よって高感度に測定が行え、ごく微量のアルミ
ニウムの測定が可能となることがわかる。また、本発明
は非イオン界面活性剤、陽イオン界面活性剤及び陰イオ
ン界面活性剤等の種々の界面活性剤において達成され、
効果が得られることが示された。

【００６０】実施例５ 直線性の検討 本発明によるアルミニウムの測定における直線性につい
て検討を行った。１ｇ／ｌのアルミニウム標準液（Ａｌ
Ｃｌ_３、和光純薬工業社製、原子吸光分析用）を、０．
０１Ｎとした塩酸（関東化学社製、超高純度試薬）で希
釈して、アルミニウム濃度がそれそれ５０μｇ／ｌ、１
００μｇ／ｌ、１５０μｇ／ｌ、２００μｇ／ｌ、２５
０μｇ／ｌ及び５００μｇ／ｌの試料（アルミニウム試
料）を調製すること、及びこれら６種類の試料と０．０
１Ｎ塩酸のみからなる試料（塩酸ブランク試料）の計７
種類の試料の測定を行うこと以外は、実施例１と同様に
して測定を行った。これらの測定の結果を図４に示し
た。

【００６１】

【図４】

【００６２】なお、この図において、横軸は試料中のア
ルミニウムの濃度を示し、縦軸はアルミニウム試料にお
けるアルミニウムに由来するピーク（信号）の面積か
ら、塩酸ブランク試料における同じリテンシヨンタイム
のピーク（信号）の面積を引いたものを示す。この図よ
り、本発明によるアルミニウムの測定においては、０μ
ｇ／ｌから少なくとも５００μｇ／ｌまでは直線性があ
ることがわかり、これより本発明では広範囲な濃度域に
おいて測定が行え、かつこのような広い濃度域で正確に
そして精度よく測定が行えることが示された。また、本
発明によるアルミニウムの測定における測定の下限は、
本発明が１μｇ／ｌのアルミニウムを含む試料を精度良
く測定することができることから、少なくとも１μｇ／
ｌ以下である。

【００６３】実施例６ 再現性の検討 本発明によるアルミニウムの測定における同時再現性に
ついて検討を行った。１ｇ／ｌのアルミニウム標準液
（ＡｌＣｌ_３、和光純薬工業社製、原子吸光分析用）を
０．０１Ｎとした塩酸（関東化学社製、超高純度試薬）
で希釈して調製したアルミニウム濃度２７μｇ／ｌの試
料（アルミニウム試料）、ヒト血清よりなる試料（血清
試料）及び０．０１Ｎ塩酸のみからなる試料（塩酸ブラ
ンク試料）の３種類の試料をそれぞれ５回ずつ測定する
こと以外は、実施例１と同様にして測定を行った。この
測定の結果を表４に示した。

【００６４】

【表４】

【００６５】なお、この表における数値は、アルミニウ
ム試料及び血清試料においてはアルミニウムに由来する
ピーク（信号）の面積を示し、塩酸ブランク試料におい
てはそれと同じリテンシヨンタイムのピーク（信号）の
面積を示す。この表より、本発明によるアルミニウムの
測定においては、変動係数（Ｃ．Ｖ．）が最大でも５．
９８％であることから、再現性よく測定が行えることが
わかる。そして、タンパク質等の高分子物質を含む複雑
な組成の試料においても、非常に精度良く測定が行え、
実用上全く問題のないことが示された。

【００６６】実施例７ 添加回収試験 本発明によるアルミニウムの測定における、血清試料で
の添加回収試験について検討を行った。 （１） １ｇ／ｌのアルミニウム標準液（ＡｌＣｌ_３、
和光純薬工業社製、原子吸光分析用）を０．０１Ｎとし
た塩酸（関東化学社製、超高純度試薬）で希釈して、ア
ルミニウム濃度を２５０μｇ／ｌとした。 （２） アルミニウム濃度８μｇ／ｌのヒト血清０．９
ｍｌに（１）で調製した２５０μｇ／ｌのアルミニウム
溶液０．１ｍｌを添加して、アルミニウム濃度を２５μ
ｇ／ｌ増加させた試料（アルミニウム添加血清試料）を
調製した。 （３） そして、（１）で調製した２５０μｇ／ｌのア
ルミニウム溶液０．１ｍｌを０．０１Ｎ塩酸０．９ｍｌ
に添加して、アルミニウム濃度２５μｇ／ｌの試料（ア
ルミニウム試料）を調製した。更に、（２）のヒト血清
０．９ｍｌに０．０１Ｎ塩酸０．１ｍｌを加えたものを
調製して試料（血清試料）とした。また、０．０１Ｎ塩
酸のみからなる試料（塩酸ブランク試料）及び２回蒸留
を行った蒸留水のみからなる試料（水ブランク試料）も
調製した。 （４） （２）及び（３）で調製した５種類の試料（ア
ルミニウム添加血清試料、アルミニウム試料、血清試
料、塩酸ブランク試料及び水ブランク試料）それぞれを
実施例１の（４）及び（５）の操作に従って測定した。
これらの測定の結果を表５に示した。

【００６７】

【表５】

【００６８】なお、この表において、アルミニウム試料
においてはアルミニウムに由来するピーク（信号）の面
積から塩酸ブランク試料の同じリテンションタイムのピ
ーク（信号）の面積を引いたものを示し、アルミニウム
添加血清試料及び血清試料においてはそれぞれのアルミ
ニウムに由来するピーク（信号）の面積から水ブランク
試料の同じリテンシヨンタイムのピーク（信号）の面積
を引いたものを示す。この表より、本発明によるアルミ
ニウムの測定においては、ヒト血清の試料の測定でもほ
ぼ計算値どおりの測定値が得られることがわかり、これ
によりタンパク質等の高分子物質を含む複雑な組成の血
清の試料においても、その組成成分の妨害を受けずに正
確に測定が行えることが確かめられた。

【００６９】実施例８ 従来法との測定値の比較 従来法である、界面活性剤を含有しない移動相を用いる
高速液体クロマトグラフィーによるアルミニウムの測定
方法〔四ツ柳ら，臨床化学，２１，１１３（１９９２）
参照〕と測定値を比較した。 （１） ４種類のヒト血清を用意し、このうち３種類の
血清それぞれに１ｇ／ｌのアルミニウム標準液（ＡｌＣ
ｌ_３、和光純薬工業社製、原子吸光分析用）を微量添加
して、アルミニウム濃度の異なる４種類の血清試料を得
た。 （２） これらの４種類の血清試料を試料として測定を
行うこと以外は、実施例１と同様にして測定を行った。 （３） また、（１）の４種類の血清試料を試料とし
て、界面活性剤を含有しない移動相を用いる従来法によ
り測定を行った。なお、測定の操作は、前記の文献の記
載と同様にして行った。そして、血清試料中のアルミニ
ウム濃度は、２５μｇ／ｌのアルミニウム試料の面積値
に基づいて算出した。これらの測定の結果を表６に示し
た。

【００７０】

【表６】

【００７１】この表より、本発明による血清試料のアル
ミニウムの測定値が、フレームレス原子吸光法と良好な
相関を示す従来法での測定値とほぼ一致することがわか
り、これにより本発明での測定値が正確であることが確
かめられ、そして本発明が直ちに実用できるものである
ことが確認された。

【００７２】

【発明の効果】本発明は、高速液体クロマトグラフィー
装置及びそのカラム等の現在汎用されている安価であ
り、かつコンパクトで移動が容易な装置や器具を使用
し、除タンパク処理操作、加熱反応操作及び冷却操作等
の繁雑な操作を必要とせずに、簡便かつ短時間（約２０
分間）に測定を行うことができ、そして検出感度が高く
（１μｇ／ｌ）、ごく微量のアルミニウムを精度良く測
定することができ、またタンパク質等の高分子物質を含
む複雑な組成の試料の測定においても測定値が影響を受
けることなく正確な測定が行え、更にランニングコスト
が低いという特色ある利点を有する有用なアルミニウム
の測定方法である。

【図面の簡単な説明】

【図１】３種類の試料の測定を行ったクロマトグラムで
ある。

【図２】移動相中の界面活性剤の分離能への効果を示し
たクロマトグラムである。

【図３】移動相中の界面活性剤の感度への効果を示した
グラフである。

【図４】直線性を示したグラフである。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 界面活性剤を含有する移動相を用いるこ
   とを特徴とするアルミニウムのクロマトグラフィーによ
   る測定方法。
2. 【請求項２】 クロマトグラフィーが液体クロマトグラ
   フィーである請求項１記載の測定方法。
3. 【請求項３】 アルミニウムが生体試料中に含まれるア
   ルミニウムである請求項１及び請求項２記載の測定方
   法。
4. 【請求項４】 界面活性剤がドデシル硫酸ナトリウムで
   ある請求項１ないし請求項３記載の測定方法。