JP4558944B2 - 共焦点顕微鏡検査装置および方法 - Google Patents

Description

【０００１】
本発明は、共焦点顕微鏡検査装置および検査方法に関し、特に、実時間結像を実施することができる共焦点顕微鏡検査装置に関する。
【０００２】
共焦点顕微鏡システムは、最初、結像中の物体を横切るように回折制限光点（diffraction limited spot of light）を走査することによって、ほぼ純粋な共焦点像を生成するように構成されていた。物体の個々の走査点から反射した光を一連の光検出器によって順次受け取ることによって、物体の二次元共焦点像を徐々に形成した。そのような共焦点システムは、レーザなどの非常に高輝度の光源が必要であると共に、物体の表面全体を走査するのに掛かる時間のため、実時間結像を容易に実施できないという欠点を有する。
【０００３】
より最近の開発では、実時間結像を可能にするために、共焦点像を生成する速度を高める仕様に、焦点が向けられている。国際特許出願公開第ＷＯ９７／３１２８２号公報には、共焦点像および非共焦点像の結合像を生成するために、マスクを使用する共焦点顕微鏡が記載されている。その後、非共焦点像を結合像から減算することによって、ほぼ純粋な共焦点像を得る。国際特許出願公開第ＷＯ９７／３１２８２号公報のマスクは、異なった個別領域からなり、第１領域が入射光をほぼ透過し、パターン化されておらず、第２領域は、例えば不規則列に並んだ入射光不透過スポットでパターン化されている。第１領域を通過した光が物体を照明することによって、物体の通常像（conventional image）が生成される。他方、第２領域を通過した光は、物体の表面にマスクのパターンを生成し、これによって物体の共焦点像および非共焦点像の結合像が生成される。マスクを旋回させて、マスクの第１および第２領域が照明を物体に交互に透過し、それによって物体の交互像が生成される。次に、交互像を互いに減算して、通常像を結合像から取り除くことによって、共焦点像だけを残す。
【０００４】
共焦点顕微鏡の別の理論構造が、１９９８年３月のジャーナル・オブ・マイクロスコーピーの第１８９巻、Ｐｔ３に掲載されているバーバー（Verveer）他の「プログラム可能アレイ顕微鏡（ＰＡＭ）における共焦点蛍光結像の理論」と題する論文に記載されている。この論文に記載されているプログラム可能アレイ顕微鏡は、デジタルマイクロミラー装置（ＤＭＤ）の形の空間光変調器（ＳＬＭ）からなる。空間光変調器の個々のピクセルをプログラムすることによって、任意の共役照明パターンを生成し、検出開口および２つの個別のカメラを使用し、一方を空間光変調器の活動（オン）中のマイクロミラーを観察して物体から共焦点反射光を受け取るように配置し、１つは不作動（オフ）中のマイクロミラーを観察して、物体の非共役像を受け取るように配置されている。しかし、この理論構造を作動モデルに発展させるには、大きな問題点が立ちはだかり、この構造を納得できるように作動させることができなかった。
【０００５】
本発明は、物体の実時間結像を可能にすると共に、現在のシステムで一般的に可能であるものより小さい雑音しか含まない像を生成する改良型共焦点顕微鏡検査装置を提供しようとしている。
【０００６】
本発明は、試験体に光を送る手段と、試験体に入射する光をコード化すると共に、試験体からの光を解読することによって、非共焦点像に重なった共焦点像からなる試験体の第１像を生成する少なくとも１つのマスクと、上記第１像を検出する検出手段とを含む共焦点顕微鏡検査装置であって、さらに、試験体への、または試験体からの光を上記少なくとも１つのマスクのコード化に対して逆にコード化することによって、共焦点像を取り除いた非共焦点像からなる試験体の第２像を生成するコード化手段を含むことを特徴とする共焦点顕微鏡検査装置を提供している。
【０００７】
理想的には、第１および第２像を使用して試験体の共焦点像を生成する分析手段が設けられている。
【０００８】
好適な実施形態では、試験体に入射する光をコード化すると共に、試験体からの光を解読する単一のマスクが設けられている。コード化手段は、マスクの一方の表面上の反射性パターンで構成することができる。
【０００９】
顕微鏡検査装置は、１つまたは複数の光源を含むことができる。特に、マスクの各側を照明するために、２つの光源を設けてもよい。さらに、検出手段は、第１および第２像の両方を検出してもよい。
【００１０】
代替的に、第２像を検出する第２検出手段を設けてもよく、第１および第２検出手段は、マスクの反対側部に配置される。第２検出手段は、上記反射性パターンから反射された光を受け取るように配置することができる。
【００１１】
マスクは、等間隔の光透過ストライプおよび光遮断ストライプで、またはランダムパターンでパターン化することができる。また、マスクは、装置の光軸を中心に回転するように取り付けることができる。
【００１２】
別の態様では、本発明は、第１光源から照明を行う段階と、１つまたは複数のマスクによって、試験体に入射する光のコード化および試験体からの光の解読を行う段階と、非共焦点像に重なった共焦点像からなる試験体の第１像を生成する段階と、該第１像を検出する段階とを含む共焦点顕微鏡検査方法であって、試験体への、または試験体からの光を１つまたは複数のマスクのコード化に対して逆にコード化する段階と、共焦点像を取り除いた非共焦点像からなる試験体の第２像を生成する段階とを含むことを特徴とする共焦点顕微鏡検査方法を提供している。
【００１３】
理想的には、本方法は、さらに、上記第１および第２像から共焦点像を生成する段階を含む。好ましくは、第２像を第１像から減算することによって、共焦点像を取り出す。
【００１４】
好適な実施形態では、試験体に入射する光をコード化すると共に、試験体からの光を解読するために単一のマスクが使用される。また、第２像は、上記単一マスクの一方の表面上の反射性パターンから光を反射することによって生成することができる。マスクは、回転可能でもよい。
【００１５】
次に、添付図面を参照しながら、例示として本発明の実施形態を説明する。
【００１６】
実時間共焦点像の生成に使用するのに適した顕微鏡検査装置が図１に示されている。顕微鏡検査装置は、第１光源１および協働するコリメーティングレンズ２と、第１光源１からの光を対物レンズ４に通して取付台５上に支持された物体Ｏまたは試験体へ向かわせるビームスプリッタ３とを含む。ビームスプリッタ３は、図１に示されているように、セミシルバーメッキミラー（semi-silvered mirror）にすることができる。あるいは、スプリアス反射の影響を最小限に抑えるために、偏光ビームスプリッタをマスク６および物体Ｏ間に配置された四分の一波長板と組み合わせて使用してもよい。蛍光顕微鏡検査の場合、ダイクロイックビームスプリッタを使用するのが好都合であろう。
【００１７】
ビームスプリッタ３と対物レンズ４との間に、顕微鏡検査装置の主光軸Ｘを横切るようにマスク６が設けられ、マスクの第１表面６ａが第１光源１によって照明される。マスク６は、第１光源１からの光をマスクの平面上で空間的に変調する所定パターンでコード化されている。変調は、強度、位相または偏光変調でもよい。以下の説明では、強度変調について説明するが、強度または位相わたり（intensity or phase throughout）の代わりに偏光を用いてもよいことは理解されるであろう。マスク６は、それの第１表面６ａから反対側の第２表面６ｂまでの全体に延在する透明および不透明のパターンを有する。パターンは、マスクの第１および第２表面のほとんど総てを覆っている。例えば、図１に示されているように、パターンは、ほぼ不透明の材料の規則的ストライプを、ほぼ透明の材料のストライプで隔てた形にすることができる。あるいは、パターンを一連の小スポットか、全く不規則なパターンで形成してもよい。マスクの個々の点すなわちピクセル間の相互相関をほぼゼロにするために、時間シフト相補形ゴレイ系列（time-shifted complementary Golay sequences）などの有限長さ２進時間系列（finite length binary time sequences）を使用し、セット内の系列の数を系列長さに制限することによって、パターンを決定することができる。図１に示されたマスクの場合、顕微鏡検査装置の光バジェット（light budget）を最大にするために、透明および不透明パターンの割合が１：１であることが好ましい。比が１：１以外である場合、パターンによる透過／遮断光の差を共焦点像の取り出しに用いられる正規化係数（normalization factors）によって調節しなければならない。マスク６のパターンの寸法は、パターンを物体Ｏ上で確実に解像できる程度に顕微鏡検査装置の光学配置によって決定される。
【００１８】
マスク６は、その法線が顕微鏡検査装置の主光軸Ｘに対して小さい角度、例えば、２〜３度をなすようにして取り付けられる。角度が十分に小さければ、それは物体上のマスクパターンの最終結像に僅かな影響を与えるだけである。マスクのパターンが固定されている場合、好ましくはマスクは、それの法線を中心に回転可能に軸（図示せず）に取り付けられる。しかし、マスク６に用いるパターンの形式に応じて、特に、空間光変調器（ＳＬＭ）をマスクとして使用した場合などで、パターンを周期的に変化させることができる場合、マスク６は、回転できないように固定してもよい。
【００１９】
ビームスプリッタ３は、第１光源１からの光をマスク６に向かって反射すると共に、マスク６からの光をカメラ７へ進めることができるように配置されている。カメラ７は、好ましくはＣＣＤカメラであるが、単一列の光検出器などの別の二次元像検出器を用いてもよい。
【００２０】
第２光源８および協働するコリメーティングレンズ９も、顕微鏡検査装置の主光軸から外れた位置に設けられて、マスクの、物体Ｏに面する第２表面６ｂを照明することができる。マスクの第２表面６ｂは、マスクの第１表面の不透明パターンとほぼ同一の反射パターンを備えている。好ましくは、マスクの不透明パターンがマスクの厚さ方向全体に延在している場合、不透明パターンが少なくともマスクの第２表面６ｂで反射するようにする。このようにして、反射パターンが、第１光源１からの光をコード化する不透明パターンと同一になるようにすることができる。このため、マスク６の第２表面６ｂは、第２光源８からの光に対して反射パターンを与える。
【００２１】
図１に示された顕微鏡検査装置では、理想的には第１および第２光源１、８がマスク６をほぼ同一強度で照明する。しかし、必要ならば、２つの光源の強度の差を調節するために、共焦点像の取り出し中に所定の正規化係数を用いることもできる。図１は、２つの個別の光源を示しているが、代りにマスク６の第１および第２表面のいずれかを照明するように向きを変更できる単一の光源を使用してもよい。これは、マスクの照明の一致を確保できるという利点を有する。
【００２２】
光源は、好ましくは発光ダイオード（ＬＥＤ）の形をしている。しかし、電球、アークランプまたはレーザなどの別の光源を用いてもよい。生物サンプルの蛍光結像を実施しようとする場合、アークランプが特に望ましい。
【００２３】
使用する場合、物体Ｏを第１および第２光源１および８で交互に照明する。第１光源１からの光の場合、光がビームスプリッタ３で反射されて、マスク６を通過する時にマスク６によってコード化される。このため、光は、物体Ｏの所定平面にマスクの不透明パターン像を形成する。コード化された光は、次に、物体Ｏによって反射されてマスク６を通ってビームスプリッタ３に戻る。反射光がマスク６を通って戻る時、光がマスクのパターンによって解読される。解読光は、次に、ビームスプリッタ３を通り過ぎてカメラ７に達する。
【００２４】
このため、カメラ７で捕らえられる、第１または陽画像と呼ばれる像は、通常像Ｉ_convが共焦点像Ｉ_confと重なった結合像であり、共焦点像は、物体上の焦点面で合焦されてマスク６によって正確に解読されたコード化光から生成される。他方、第２光源８からの光は、マスク６の第２表面６ｂの反射パターンによって物体Ｏに反射されて、物体Ｏの焦点面上に不透明パターンの逆画像（reverse image）を生成する。このため、第２光源８からの光のコード化は、第１光源１からの光のコード化の逆である。反射パターンによってコード化された光は、物体Ｏによって反射されてマスク６の第２表面６ｂに戻り、それからカメラ７へ進む。このため、カメラ７で捕らえられる、第２または陰画像と呼ばれる像は、共焦点像がマスクによってカメラ７に送られていないため、通常像Ｉ_convから共焦点像Ｉ_confを引いたものである。
【００２５】
第１および第２光源を使用して生成された陽画および陰画像は、次に、アナライザ１０へ送られ、それは陰画像を陽画像から減算する、すなわち（Ｉ_conv＋Ｉ_conf）−（Ｉ_conv−Ｉ_conf）これによって得られた像２Ｉ_confは、従来の共焦点顕微鏡システムを使用して生成された共焦点像の２倍の強度を有する共焦点像である。これによって、上記の顕微鏡検査装置および検査方法を使用して生成された共焦点像の信号対雑音比は、大幅に増加する。陽画および陰画像を加えることによって、通常像Ｉ_convもアナライザ１０から取り出すことができる。通常像は、特に、結像中の物体の周囲の誘導（navigating around the object）に特に有用である。前述したように、照明ビームの強度の差を調節するために必要な場合、陽画および陰画像を正規化することができる。
【００２６】
もちろん、実時間結像が必要で、物体の陽画および陰画の交互像が生成される場合、各陽画像および各陰画像は、時間的に隣り合ったもので、２度使用することができる。このため、顕微鏡検査装置は、動的システムの共焦点結像に特に適している。
【００２７】
図５ａは、偏光ビームスプリッタと光源としてのＬＥＤとを使用した図１に示されている顕微鏡検査装置および検査方法を使用した半導体トランジスタの陽画像（Ｉ_conv＋Ｉ_conf）である。図５ｂは、同一焦点面での同トランジスタの陰画像（Ｉ_conv−Ｉ_conf）である。図５ｃには、図５ａおよび図５ｂの陽画および陰画像から取り出された共焦点像が示され、図５ｄは、取り出された通常像を示している。上記顕微鏡検査装置が特に鮮明で強烈な共焦点像を生成できることが、図５ｃから直ちに明らかになるであろう。図６ａ〜図６ｄは、それぞれ第２焦点面での同トランジスタのさらなる陽画、陰画、共焦点および通常像である。
【００２８】
図５および図６に示されている像は、各々の幅が約８０μｍである透明および不透明交互ストライプを有する回転ディスクを使用して生成された。マスクは、その法線が顕微鏡検査装置の光軸に対して約１０°の角度をなすように配置した。例えば、２５Ｈｚのビデオ率（video rate）で共焦点画像を生成するために、２５／２Ｈｚの周波数で各光源を作動させた。もちろん、必要ならば、もっと高速で、または実時間結像が必要がない場合には、遥かに低速で、物体を照明することもできる。物体の照明を制御するために、使用する光源の形式に応じて、光源自体を所望速度でオン・オフさせてもよいが、光源の出力を遮断してもよい。ディスクを高速で回転させることによって、像を統合してストライプパターンを平均化することができるので、ディスク上のストライプパターンを最終的な陽画および陰画像から取り除くことができる。
【００２９】
図２に示されている変更形顕微鏡検査装置では、２つの光源の代わりに単一光源１が使用されている。先行実施形態と同様に、マスクの第２表面６ｂは反射性であり、マスクの法線が、顕微鏡検査装置の主光軸Ｘに対して小さい角度、例えば、２°〜１５°をなすように設定されている。しかし、この場合、第２光源の代わりに、第２カメラ１１が設けられている。先行のものと同様に、陽画像が第１カメラ７によって記録されるが、陰画像は、マスク６の第２表面から反射された光から第２カメラ１１によって同時に記録される。両像は、アナライザ１０へ送られ、そこで陽画および陰画像から共焦点像が取り出される。この構造は、両像が同時に生成され、そのために共焦点像をほぼ２倍の速度で生成できるという利点を有する。また、総ての使用可能な光が第１および第２カメラのいずれかによって記録されるので、光バジェットが最大になる。しかし、この構造は、２光源システムと比較して整合がより困難になる。
【００３０】
図３には、２つの光源を使用したさらなる変更実施形態が示されている。この実施形態は、カメラ７がマスクの第２表面６ｂから反射した像だけを受け取るように移動している点を除いて、第１実施形態と同様である。この構造では、第１光源１が陰画像を生成し、陽画像を生成するのは、マスクの、カメラ７と同一側の第２光源８である。図４には、顕微鏡検査装置が２つのカメラ７および１１を含む点で図２と同様な第４実施形態が示されている。この変更構造では、第１カメラ７が陰画像を受け取り、マスク６の、光源８と同一側の第２カメラ１１が陽画像を受け取る。
【００３１】
ここでは、物体の二次元共焦点像の生成について説明してきたが、三次元像を構成するために使用される様々な焦点面で複数の二次元共焦点像を生成することによって、上記の顕微鏡検査装置および方法を使用して三次元共焦点像を生成できることは理解されるであろう。
【００３２】
上記の顕微鏡検査装置および検査方法は、共焦点像が必要なほとんどの状況に適していることは明らかである。しかし、本顕微鏡検査装置および検査方法は、生物学的処理の実時間結像や、半導体チップなどの品質検査に特に適している。全体的に物体によって反射される光について説明してきたが、多くの場合、物体は高い反射性を有しておらず、その場合、物体から散乱した光を使用して共焦点像を取り出す。また、生物学的処理の結像では、入射光が物体によって反射されるのではなく、むしろ等価蛍光パターンを誘発するために使用される。入射光は、上記のようにコード化され、生物材料に入射するこの光パターンが蛍光発光を誘発する。次に、生物材料によって発生した蛍光光パターンを解読して、陽画および陰画像を生成し、それらを減算することによって、上記とまったく同様にして共焦点像を取り出すことができる。
【００３３】
また、共焦点顕微鏡検査装置は、従来型顕微鏡にコード化マスクと第２光源または第２カメラのいずれかとを追加することによっても実施される。
【００３４】
もちろん、本発明の精神から逸脱することなく、光学素子の変更配置、特に変更または追加レンズ配置を用いることができることは理解されるであろう。さらに、ここではパターン化反射表面を有する単一マスクで説明しているが、２つ以上の透光性マスクを用いて、それらのマスクの１つがその他のマスクの１つのパターンと逆のパターンを有するようにしてもよいことは明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明による共焦点顕微鏡検査装置の第１実施形態の概略図である。
【図２】 本発明による共焦点顕微鏡検査装置の第２実施形態の概略図である。
【図３】 本発明による共焦点顕微鏡検査装置の第３実施形態の概略図である。
【図４】 本発明による共焦点顕微鏡検査装置の第４実施形態の概略図である。
【図５ａ】 図１の装置を使用して生成された第１焦点面でのトランジスタの共焦点像および通常像の結合像である。
【図５ｂ】 図１の装置を使用して生成された第１焦点面でのトランジスタの共焦点像および通常像の結合像である。
【図５ｃ】 図５ａおよび図５ｂの像から取り出された共焦点像および通常像である。
【図５ｄ】 図５ａおよび図５ｂの像から取り出された共焦点像および通常像である。
【図６ａ】 図１の装置を使用して生成された第２焦点面でのトランジスタの共焦点像および通常像の結合像である。
【図６ｂ】 図１の装置を使用して生成された第２焦点面でのトランジスタの共焦点像および通常像の結合像である。
【図６ｃ】 図６ａおよび図６ｂの像から取り出された共焦点像および通常像である。
【図６ｄ】 図６ａおよび図６ｂの像から取り出された共焦点像および通常像である。

Claims (14)

1. 試験体に光を送る手段と、
   前記試験体に入射する光をコード化すると共に、前記試験体からの光を解読するための、第１表面に不透明パターンを有するマスクと、
   前記試験体の像を検出する１つまたは複数の像検出器とを含む共焦点顕微鏡検査装置であって、
   前記マスクは、第２表面に反射性パターンを有し、
   該反射性パターンが前記マスクの前記第１表面上の前記不透明パターンとほぼ同一であることによって、
   前記マスクの前記第１表面を透過してコード化された光および第２表面で反射してコード化された光の一方が、非共焦点像に重なった共焦点像からなる前記試験体の第１像を生成し、
   前記マスクの前記第１表面を透過してコード化された光および第２表面で反射してコード化された光の他方が、共焦点像を取り除いた非共焦点像からなる前記試験体の第２像を生成する
   ことを特徴とする共焦点顕微鏡検査装置。
2. さらに、前記第１および第２像を使用して前記試験体の共焦点像を生成する分析手段を含む請求項１記載の共焦点顕微鏡検査装置。
3. 前記試験体に入射する光をコード化すると共に、前記試験体からの光を解読する単一のマスクを含む請求項１または２記載の共焦点顕微鏡検査装置。
4. 前記コード化手段は、前記マスクの一方の表面上の反射性パターンからなる請求項３記載の共焦点顕微鏡検査装置。
5. 単一の像検出器が、第１および第２像を検出する請求項５記載の共焦点顕微鏡検査装置。
6. さらに、前記第２像を検出する第２検出手段を含み、前記第１および第２像検出手段は、前記マスクの反対側部に配置されている請求項４記載の共焦点顕微鏡検査装置。
7. 前記１つまたは複数の像検出器は、ＣＣＤカメラである先行する請求項の内のいずれか１項記載の共焦点顕微鏡検査装置。
8. さらに、第２像を検出する第２検出手段を含み、前記第１および第２検出手段は、前記マスクの反対側部に配置されている請求項４記載の共焦点顕微鏡検査装置。
9. 前記第２検出手段は、前記反射性パターンから反射された光を受け取るように配置されている請求項８記載の共焦点顕微鏡検査装置。
10. 前記検出手段は、ＣＣＤカメラである先行する請求項の内のいずれか１項記載の共焦点顕微鏡検査装置。
11. 第１光源から照明を行う段階と、
    第１表面に不透明パターンを有するマスクによって、試験体に入射する光のコード化および前記試験体からの光の解読を行う段階と、
    前記試験体の像を検出する段階とを含む共焦点顕微鏡検査方法であって、
    前記マスクは、前記マスクの前記第１表面上の前記不透明パターンとほぼ同一である反射性パターンを第２表面に有しており、
    さらに、前記マスクの前記第１表面を透過してコード化された光または第２表面で反射してコード化された光の一方によって、非共焦点像に重なった共焦点像からなる前記試験体の第１像を生成する段階と、
    前記マスクの前記第１表面を透過してコード化された光または第２表面で反射してコード化された光の他方によって共焦点像を取り除いた非共焦点像からなる前記試験体の第２像を生成する段階と
    を含むことを特徴とする共焦点顕微鏡検査方法。
12. さらに、前記第１および第２像から共焦点像を取り出す段階を含む請求項１１記載の共焦点顕微鏡検査方法。
13. 前記第２像を前記第１像から減算することによって、前記共焦点像を取り出す請求項１２記載の共焦点顕微鏡検査装置。
14. 前記マスクは、回転する請求項１１乃至１３の内のいずれか１項記載の共焦点顕微鏡検査方法。

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