JP4534138B2 - 核酸増幅反応における高度好熱菌由来タンパク質の活性化方法およびその利用 - Google Patents
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Description
そこで、本発明は以上の実情を鑑みて、本発明者らの以前の方法を改良し、PCR全サイクルにおいて、RecAを活性化し、その生物学的機能を維持できる方法を提供することを目的とする。ひいては、かかるRecAの生物学的機能の維持することで、より特異的かつ効率的に非特異的な増幅を抑制して所望の核酸のみを増幅できる核酸増幅方法並びに核酸増幅用キットを提供することを目的とする。
ヌクレオチド5´−三リン酸(ただし、前記ヌクレオチド5´−三リン酸はデオキシヌクレオチド5´−三リン酸およびヌクレオチド5´−O−3−チオ三リン酸ではない)を添加して反応を行うことによって前記RecAタンパク質を活性化する、ポリメラーゼ連鎖反応中における高度好熱菌由来RecAタンパク質の活性化方法を提供する。
そして、好ましくは前記ヌクレオチド5´−三リン酸が、アデノシン5´−三リン酸、ウリジン5´−三リン酸、グアノシン5´−三リン酸およびシチジン5´−三リン酸からなる群から選択され、特に好ましくは、前記ヌクレオチド5´−三リン酸がアデノシン5´−三リン酸である。
更に、前記高度好熱菌由来RecAタンパク質がサーマス・サーモフィラス(Thermus thermophilus)由来RecAタンパク質であることが好ましい。
そして、好ましくは、前記ヌクレオチド5´−三リン酸が、アデノシン5´−三リン酸、ウリジン5´−三リン酸、グアノシン5´−三リン酸およびシチジン5´−三リン酸からなる群から選択され、更に好ましくは、前記ヌクレオチド5´−三リン酸がアデノシン5´−三リン酸である。
好ましくは、前記標的核酸が阻止的または抑制的2次構造の区域を有する。
アデニン、チミン、グアニンおよびシトシンの夫々に対応する4種類のデオキシヌクレオチド5´−三リン酸、
高度好熱菌由来のRecAタンパク質と、
ヌクレオチド5´−三リン酸(ただし、前記ヌクレオチド5´−三リン酸は、デオキシヌクレオチド5´三リン酸およびヌクレオチド5´−O−3−チオ三リン酸ではない)と、を有する核酸増幅用キットである。
そして、好ましくは、前記ヌクレオチド5´−三リン酸が、アデノシン5´−三リン酸、ウリジン5´−三リン酸、グアノシン5´−三リン酸およびシチジン5´−三リン酸からなる群から選択され、特に好ましくは、前記ヌクレオチド5´−三リン酸が、アデノシン5´−三リン酸である。
更に、前記高度好熱菌由来のRecAタンパク質がサーマス・サーモフィラス(Thermus thermophilus)由来RecAタンパク質であることが好ましい。
したがって、上述した本発明の活性方法を利用する本発明の核酸増幅方法により、ミスプライミングをより効果的に抑制することができ、その結果、非特異的な増幅を抑制することが可能となる。その結果、より効率的かつ特異的な核酸増幅が可能となる。
例えば、GC含量が高い鋳型核酸や短い繰り返し配列を有する鋳型核酸等を挙げられる。これらは、熱変性により一本鎖となると高次構造を生じ核酸増幅の際の阻害要因となっていた。本発明の方法によれば、NTPによりその生物学的機能が良好に保持されたRecAが鋳型核酸に結合する。それにより、このような高次構造が解き、効率的に鋳型核酸を増幅することができる。
(1)鋳型核酸の熱変性
(2)プライマーのアニーリング
(3)耐熱性ポリメラーゼによる伸長反応
(1)鋳型核酸の熱変性
二本鎖核酸を加熱により、変性させ一本鎖に解離させる。好ましくは、92〜98℃で10〜60秒行われる。また、長いDNA領域を増幅する場合には、鋳型DNAの分解を防止するため、一番初めの熱変性のみを低温度(例えば、92℃程度)に設定することができる。
温度を下げることにより上記(1)において熱変性され一本鎖となった鋳型核酸とプライマーとのハイブリッドを形成する。アニーリングは、好ましくは30〜60秒間行われる。また、アニーリング温度はプライマーに用いるオリゴヌクレオチドのTmを推定し、このTmをアニーリング温度として設定することが好ましい。通常は、50〜70℃で行われる。
耐熱性ポリメラーゼによりプライマーからの核酸鎖の伸長反応が3´末端において行われる。伸長反応温度は、耐熱性ポリメラーゼの種類に応じて、適宜設定されるものであるが、65〜75℃で行うことが好ましい。また、伸長時間は、標的配列が1kb以下のときは1分程度で十分であり、それより長い場合には、1kbにつき1分の割合で長くすることが好ましい。
本発明の核酸増幅方法は、様々なPCRの変法に利用可能である。たとえば、アダプター付加PCR、アレル特異的増幅法(MASA法)、非対称PCR、逆PCR(IPCR)、逆転写PCR(RT−PCR)、一本鎖DNA高次構造多型PCR(PCR−SSCP法)、アービトラリリーポリメラーゼ連鎖反応(AP−PCR)、RACE、マルチプレックスPCR(multiplex PCR)等が挙げられる。しかしながら、これらに限定するものではなく、あらゆるPCRの変法に利用可能である。
下記の実験で使用した試薬について説明する。
鋳型としてヒトゲノムDNA(Promega社製:Human genomic DNA カタログ番号G3041)を使用した。
DNAポリメラーゼは、rTaq−HSポリメラーゼ(Takara−Bio社製)、ExTaq−HSポリメラーゼ(Takara−Bio社製)若しくはT.th.DNAポリメラーゼ(Applied Biosystems社製:製品番号N8080187)を使用した。
RecAとして、サーモス・サーモフィラス由来のRecA(以下、T.th.RecAと略する。)を使用した。T.th.RecAは、Masui R, Mikawa T, Kato R, Kuramitsu S.著、Characterization of the oligomeric states of RecA protein: monomeric RecA protein can form a nucleoprotein filament.,Biochemistry.1998年10月20日、第37巻、第42号、第14788〜14797頁の記載を参照して本発明の発明者が調製したものを使用した。
また、ATP、GTP、UTP並びにCTPはRoche Diagnostics社製( 製品番号1277057)を使用した。
プライマーセット1:
5’-ACAATGGGCTCACTCACCC (配列認識番号1)
5’-CTAAGACCAATGGATAGCTG (配列認識番号2)
定義:Human DNA sequence from clone RP11-392N11 on
chromosome 9
GenBank Acc. No. AL359181
プライマーセット2:
5’-GCTCAGCATGGTGGTGGCATAA-3’(配列認識番号3)
5’-CCTCATACCTTCCCCCCCATTT-3’(配列認識番号4)
定義:Homo sapiens CYP21 gene
GenBank Acc. No. M12792 M23280
プライマーセット3:
5’-GACTACTCTAGCGACTGTCCATCTC-3’(配列認識番号5)
5’-GACAGCCACCAGATCCAATC-3’(配列認識番号6)
定義:Human S100 protein beta-subunit gene
GenBank Acc. No. M59486
プライマーセット4:
5’-AACCTCACAACCTTGGCTGA-3’(配列認識番号7)
5’-TTCACAACTTAAGATTTGGC-3’(配列認識番号8)
定義:Homo sapiens chromosome 8
GenBank Acc. No. AC103819
プライマーセット5:
5’-AGGCAACTAGGATGGTGTGG-3’(配列認識番号9)
5’-CAGGGAGCGTGTCCATAGG-3’(配列認識番号10)
定義:Homo sapiens glyceraldehyde-3-phosphate
dehydrogenase (GAPD) gene
GenBank Acc. No. AY340484
プライマーセット6:
5’-CTGCTGAAAGAGATGCGGTGG-3’(配列認識番号11)
5’-AGGAAAACAGCCCAAGGGACAG-3’(配列認識番号12)
定義:Human beta globin region on chromosome 11.
GenBank Acc. No. U01317
プライマーセット7:
5’-CACATCAATGTTGTTGTTT-3’(配列認識番号13)
5’-TTCCTTGTCTCCCCAAGTTC-3’(配列認識番号14)
定義:Homo sapiens chromosome 11, clone RP11-1205H24
GenBank Acc. No. AC129505
プライマーセット8:
5’-ACTTTGTTCTGAGCCTCACA-3’(配列認識番号15)
5’-GTTGCCCAATCGCCCCTCTC-3’(配列認識番号16)
定義:Homo sapiens transferrin (TF) gene
GenBank Acc. No. AY308797
プライマーセット9:
5’-AACCTGACTAGAAAAGCTAT-3’(配列認識番号17)
5’-GAATGAGTGGTTAATTAATT-3’(配列認識番号18)
定義:Homo sapiens clone NGR0524 mitochondrion, partial genome.
GenBank Acc. No. AF465941
プライマーセット10:
5’-CTCTA GCGACTGTCC ATCTC-3’(配列認識番号19)
5’-GACAG CCACCAGATC CAATC-3’(配列認識番号20)
定義:Human S100 protein beta-subunit gene
GenBank Acc. No. M59486
プライマーセット11:
5’-GACTACTCTA GCGACTGTCC ATCTC-3’(配列認識番号21)
5’-GACTGGACAG CCACCAGATC CAATC-3’(配列認識番号22)
定義:Human S100 protein beta-subunit gene
GenBank Acc. No. M59486
プライマーセット12:
5’-TTAAA GACTACTCTA GCGACTGTCC ATCTC-3’(配列認識番号23)
5’-CATTA GACTGGACAG CCACCAGATC CAATC-3’(配列認識番号24)
定義:Human S100 protein beta-subunit gene
GenBank Acc. No. M59486
プライマーセット13:
5’-GTGGATTAAA GACTACTCTA GCGACTGTCC ATCTC-3’
(配列認識番号25)
5’-TATCCCATTA GACTGGACAG CCACCAGATC CAATC-3’
(配列認識番号26)
定義:Human S100 protein beta-subunit gene
GenBank Acc. No. M59486
プライマーセット14:
5’-GTTGT GTGGATTAAA GACTACTCTA GCGACTGTCC ATCTC-3’
(配列認識番号27)
5’-AATCT TATCCCATTA GACTGGACAG CCACCAGATC CAATC-3’
(配列認識番号28)
定義:Human S100 protein beta-subunit gene
GenBank Acc. No. M59486
プライマーセット15:
5’-TTCCTGTTGT GTGGATTAAA GACTACTCTA GCGACTGTCC ATCTC-3’
(配列認識番号29)
5’-GTTTTAATCT TATCCCATTA GACTGGACAG CCACCAGATC CAATC-3’
(配列認識番号30)
定義:Human S100 protein beta-subunit gene
GenBank Acc. No. M59486
プライマーセット16:
5’-GCAGC TTTCATGGGC ACTGT-3’(配列認識番号31)
5’-CAGGG CTGGACTGAC ATTTG-3’(配列認識番号32)
定義:Homo sapiens blue cone opsin gene
GenBank Acc. No. L32835
プライマーセット17:
5’-TCCAGGCAGC TTTCATGGGC ACTGT-3’(配列認識番号33)
5’-AGAGACAGGG CTGGACTGAC ATTTG-3’(配列認識番号34)
定義:Homo sapiens blue cone opsin gene
GenBank Acc. No. L32835
プライマーセット18:
5’-CTACC TCCAGGCAGC TTTCATGGGC ACTGT-3’(配列認識番号35)
5’-CACAG AGAGACAGGG CTGGACTGAC ATTTG-3’(配列認識番号36)
定義:Homo sapiens blue cone opsin gene
GenBank Acc. No. L32835
プライマーセット19:
5’-GCCTTCTACC TCCAGGCAGC TTTCATGGGC ACTGT-3’
(配列認識番号37)
5’-GYAAGCACAG AGAGACAGGG CTGGACTGAC ATTTG-3’
(配列認識番号38)
定義:Homo sapiens blue cone opsin gene
GenBank Acc. No. L32835
プライマーセット20:
5’-TCTGG GCCTTCTACC TCCAGGCAGC TTTCATGGGC ACTGT-3’
(配列認識番号39)
5’-GTGGA GYAAGCACAG AGAGACAGGG CTGGACTGAC ATTTG-3’
(配列認識番号40)
定義:Homo sapiens blue cone opsin gene
GenBank Acc. No. L32835
プライマーセット21:
5’-CCCTGTCTGG GCCTTCTACC TCCAGGCAGC TTTCATGGGC ACTGT-3’
(配列認識番号41)
5’-ATCGGGTGGA GYAAGCACAG AGAGACAGGG CTGGACTGAC ATTTG-3’
(配列認識番号42)
定義:Homo sapiens blue cone opsin gene
GenBank Acc. No. L32835
プライマーセット22:
5’-CCCACGATCAATGCCATCAACT-3’(配列認識番号43)
5’-CGGTGAGAGGCACTGCCAGATT-3’(配列認識番号44)
定義:Homo sapiens chromosome 10 clone RP11-124L5
GenBank Acc. No. AC022389
プライマーセット23:
5’-GCTCGCTTTCTTGCTGTCCAAT-3’(配列認識番号45)
5’-GCCCTTCATAATATCCCCCAGTTT-3’(配列認識番号46)
定義:Human beta globin region on chromosome 11.
GenBank Acc. No. U01317
プライマーセット24:
5’-GTCCTTCCCCCGCTGGAAAC-3’(配列認識番号47)
5’-GCAGCAGAGATCATCGCGCC-3’(配列認識番号48)
定義:Homo sapiens MYC gene
GenBank Acc. No. X00364
プライマーセット25:
5’-GTGGGGGTGCTGGGAGTTTGT-3’(配列認識番号49)
5’-TCGGACAGAAACATGGGTCTGAA-3’(配列認識番号50)
定義:Homo sapiens neural retinal-specific leucine zipper protein (NRL) gene
GenBank Acc. No. U95012
プライマーセット26:
5’-GGTGCTCAGAACCCCCACAATC-3’(配列認識番号51)
5’-CCTACCGACCCCATTCCACTCT-3’(配列認識番号52)
定義:Homo sapiens growth hormone locus on chromosome 17.
GenBank Acc. No. NG_001334
プライマーセット27:
5’-CACAGATTTCCAAGGATGCGCTG-3’(配列認識番号53)
5’-CGTGCTCTGTTCCAGACTTG-3’(配列認識番号54)
定義:Homo sapiens interleukin 9 receptor (IL9R) gene
GenBank Acc. No. AY071830
プライマーセット28:
5’-CGTCTGGCGATTGCTCCAAATG-3’(配列認識番号55)
5’-GGGCAGTTGTGATCCATGAGAA-3’(配列認識番号56)
定義:Homo sapiens SVMT gene for synaptic vesicle monoamine transporter
GenBank Acc. No. AB044401
プライマーセット29:
5’-GGCTTGCACCAGCTTAGGAAAG-3’(配列認識番号57)
5’-CGTTAGGCATAATCAGTGGGATAGT-3’(配列認識番号58)
定義:Homo sapiens chromosome 11
GenBank Acc. No. AC129505
プライマーセット30:
5’-GCCTCTGATTCCTCACTGATTGCTCT-3’(配列認識番号59)
5’-TGTCAACCACCCTTAACCCCTCC-3’(配列認識番号60)
定義:Homo sapiens p53 gene
GenBank Acc. No. X54156
プライマーセット31:
5’-TTGGAGGGGTGGGTGAGTCAAG-3’(配列認識番号61)
5’-GGAGGGGTGGGGGTTAATGGTTA-3’(配列認識番号62)
定義:Human hepatocyte nuclear factor 4-alpha gene
GenBank Acc. No. U72959
プライマーセット32:
5’-GGAACAAGACACGGCTGGGTT-3’(配列認識番号63)
5’-AGCAAGGCAGGGCAGGCAAGT-3’(配列認識番号64)
定義:Human midkine gene
GenBank Acc. No. D10604
プライマーセット33:
5’-CGGTCCCATTCTCAGGGAATCT-3’(配列認識番号65)
5’-GCCCAGAGGAAGAAGAAGGAAA-3’(配列認識番号66)
定義:Human rhodopsin gene
GenBank Acc. No. U49742
PCR反応液組成によりT.th.RecAのパフォーマンスに与える影響を確認すると共に、ATPの存在によりT.th.RecAタンパク質のパフォーマンスが保持できることを確認した。
ヒトゲノムDNAを鋳型として、プライマーセット1を用いてPCR増幅反応を行った。PCR反応液は以下に示す4種類を調製した。詳細には、反応液Aは、緩衝液として1×rTaq buffer(Takara−Bio社製)を使用したものであり、反応液Bは、反応液Aに更にT.th.RecAを添加したものである。反応液Cは、緩衝液として、Taq buffer(Takara−Bio社製)を用い、T.th.RecAを添加したものである。そして、反応液Dは、反応液Aに更にT.th.RecAとATPを添加したものである。各反応液の組成は以下の通りである。なお、DNAポリメラーゼはrTaq−HSポリメラーゼ(Takara−Bio社製)を用いた。
0.8μM(最終濃度) プライマーセット
25ng 鋳型DNA
0.7unit DNAポリメラーゼ
0.2mM(最終濃度) dNTP混合物
1.5mM(最終濃度) 酢酸、塩化若しくは硫酸マグネシウム
以上を含むよう、1×rTaq buffer に混合して、全量25μlとした。
0.8μM(最終濃度) プライマーセット
25ng 鋳型DNA
0.7unit DNAポリメラーゼ
0.2mM(最終濃度) dNTP混合物
1.5mM(最終濃度) 酢酸、塩化若しくは硫酸マグネシウム
0.4μg T.th.RecA
以上を含むよう、1×rTaq bufferに混合して、全量25μlとした。
0.8μM(最終濃度) プライマーセット
25ng 鋳型DNA
0.7unit DNAポリメラーゼ
0.2mM(最終濃度) dNTP混合物
1.5mM(最終濃度) 酢酸、塩化若しくは硫酸マグネシウム
0.4μg T.th.RecA
以上を含むよう、1×Taq bufferに混合して、全量25μlとした。
0.8μM(最終濃度) プライマーセット
25ng 鋳型DNA
0.7unit DNAポリメラーゼ
0.2mM(最終濃度) dNTP混合物
1.5mM(最終濃度) 酢酸、塩化若しくは硫酸マグネシウム
0.4μg T.th.RecA
400μM ATP
以上を含むよう、1×rTaq buffer(Takara−Bio社製)に混合して、全量25μlとした。
結果を図1に示す。
レーン1〜6は、rTaq Buffer中でT.th.RecA並びにATPのいずれをも添加せず、夫々プライマーセット1、2、3、4、5、6により増幅反応を行なった結果を示す(反応液A)。
レーン7〜12は、rTaq Buffer中でATPを添加せずT.th.RecAのみを添加し、夫々プライマーセット1、2、3、4、5、6により増幅反応を行なった結果を示す(反応液B)。
レーン13〜18は、Taq Buffer中でT.th.RecAのみを添加し、夫々プライマーセット1、2、3、4、5、6により増幅反応を行なった結果を示す(反応液C)。
レーン19〜24は、rTaq Buffer中でT.th.RecAとATPとを添加し、夫々プライマーセット1、2、3、4、5、6により増幅反応を行なった結果を示す(反応液D)。
また、ATPとT.th.RecAを添加して増幅した場合(レーン19〜24)、同一のPCR反応液中でT.th.RecAのみの存在下でPCR増幅を行なった場合(レーン7〜12)を比較した。その結果、ATPとT.th.RecAの存在によりPCR増幅に際して非特異的増幅を顕著に軽減できることが確認された。
ATPの存在により、PCR中におけるT.th.RecAのパフォーマンス低下を改善できることを増幅サイクルの経過観察を行うことにより確認した。
ヒトゲノムDNAを鋳型として、プライマーセット7を用いてPCR増幅反応を行った。PCR反応液は以下に示す2種類を調製した。詳細には、反応液Eは、T.th.RecAのみを添加したものである。反応液Fは、T.th.RecAに加えてATPを添加したものである。各反応液の組成は以下の通りである。なお、DNAポリメラーゼはrTaq−HSポリメラーゼを用いた。
0.8μM(最終濃度) プライマーセット
25ng 鋳型DNA
0.7unit DNAポリメラーゼ
0.2mM(最終濃度) dNTP混合物
1.5mM(最終濃度) 酢酸、塩化若しくは硫酸マグネシウム
0.4μg T.th.RecA
以上を含むよう、1×Taq buffer(Takara−Bio社製)に混合して、全量25μlとした。
0.8μM(最終濃度) プライマーセット
25ng 鋳型DNA
0.7unit DNAポリメラーゼ
0.2mM(最終濃度) dNTP混合物
1.5mM(最終濃度) 酢酸、塩化若しくは硫酸マグネシウム
0.4μg T.th.RecA
400μM ATP
以上を含むよう、1×Taq buffer(Takara−Bio社製)に混合して、全量25μlとした。
上記の実験結果を図2に示す。
レーン1〜3は、ATPを添加せずT.th.RecAのみを添加して、夫々プライマーセット7、8、9を使用して28サイクルの増幅反応を行った結果を示す(反応液E)。
レーン4〜6は、T.th.RecAとATPとを添加して、夫々プライマーセット7、8、9を使用して28サイクルの増幅反応を行った結果を示す(反応液F)。
レーン7〜9は、ATPを添加せずT.th.RecAのみを添加して、夫々プライマーセット7、8、9を使用して32サイクルの増幅反応を行った結果を示す(反応液E)。
レーン10〜12は、T.th.RecAとATPとを添加して、夫々プライマーセット7、8、9を使用して32サイクルの増幅反応を行った結果を示す(反応液F)。
レーン13〜15は、ATPを添加せずT.th.RecAのみを添加して、夫々プライマーセット7、8、9を使用して36サイクルの増幅反応を行った結果を示す(反応液E)。
レーン16〜18は、T.th.RecAとATPとを添加して、夫々プライマーセット7、8、9を使用して36サイクルの増幅反応を行った結果を示す(反応液F)。
一方、ATPを添加することにより、そのような非特異的な増幅を抑制する事ができる事が確認された(レーン1〜3とレーン4〜6の比較、レーン7〜9とレーン10〜12の比較、レーン13〜15とレーン16〜18の比較)。そして、サイクル数が増しても非特異的な増幅を効果的に抑制できる事が確認された(レーン4〜6、レーン10〜12と、レーン16〜18との比較)。
T.th.RecAとATPにより、ExTaq ポリメラーゼでの増幅においても非特異的増幅を低減する効果を奏せれることを確認した。
ヒトゲノムDNAを鋳型として、プライマーセット1を用いてPCR増幅反応を行った。PCR反応液は以下に示す2種類を調製した。詳細には、反応液Gは、T.th.RecA並びにATPいずれも添加しない一般的なPCR反応液組成である(コントロール)。反応液Hは、反応液Gに更にT.th.RecA並びにATPを添加したものである。各反応液の組成は以下の通りである。なお、DNAポリメラーゼはExTaq−HSポリメラーゼを用いた。
0.8μM(最終濃度) プライマーセット
25ng 鋳型DNA
0.7unit DNAポリメラーゼ
0.2mM(最終濃度) dNTP混合物
1.5mM(最終濃度) 酢酸、塩化若しくは硫酸マグネシウム
以上を含むよう、1×Taq buffer(Takara−Bio社製)に混合して、全量25μlとした。
0.8μM(最終濃度) プライマーセット
25ng 鋳型DNA
0.7unit DNAポリメラーゼ
0.2mM(最終濃度) dNTP混合物
1.5mM(最終濃度) 酢酸、塩化若しくは硫酸マグネシウム
0.4μg T.th.RecA
400μM ATP
以上を含むよう、1×Taq buffer(Takara−Bio社製)に混合して、全量25μlとした。
上記の実験結果を図3に示す。
レーン1〜7は、T.th.RecAおよびATPのいずれをも添加せず、夫々プライマーセット1、2、3、4、5、6、8を使用して一般的なPCR反応液中で増幅反応を行った結果を示す(コントロール:反応液G)。
レーン8〜14は、T.th.RecAおよびATPを添加して、夫々プライマーセット1、2、3、4、5、6、8を使用して増幅反応を行った結果を示す(反応液H)。
以上の結果から、DNAポリメラーゼの種類に依存せず、T.th.RecAとATPを添加することにより、DNAポリメラーゼの非特異的増幅を抑制でき標的核酸のみを特異的に増幅できることが判明した。
種々のヌクレオチド5´三リン酸によっても、ATPと同様にT.th.RecAの安定化を図れることを、種々のヌクレオチド5´三リン酸とT.th.RecAの存在下でPCR増幅を行うことにより確認した。
ヒトゲノムDNAを鋳型として、プライマーセット1を用いてPCR増幅反応を行った。PCR反応液は以下に示す7種類を調製した。詳細には、反応液Iは、一般的なPCR反応溶液であり、T.th.RecAもヌクレオチド5´−三リン酸のいずれをも添加せず調製したものである(コントロール)。反応液Jは、反応液IにT.th.RecAを添加して調製したものである。そして反応液K、L、M、Nは夫々、反応液JにGTP、ATP、UTP、CTPを添加して調製したものである。また、反応液Oは、反応液IにATPのみを添加したものであり、T.th.RecAを添加せず調製されたものである。各反応液の組成は以下の通りである。なお、DNAポリメラーゼはrTaq−HSポリメラーゼを用いた。
0.8μM(最終濃度) プライマーセット
25ng 鋳型DNA
0.7unit DNAポリメラーゼ
0.2mM(最終濃度) dNTP混合物
1.5mM(最終濃度) 酢酸、塩化若しくは硫酸マグネシウム
以上を含むよう、rTaq bufferに混合して、全量25μlとした。
0.8μM(最終濃度) プライマーセット
25ng 鋳型DNA
0.7unit DNAポリメラーゼ
0.2mM(最終濃度) dNTP混合物
1.5mM(最終濃度) 酢酸、塩化若しくは硫酸マグネシウム
0.4μg T.th.RecA
以上を含むよう、1×rTaq buffer(Takara−Bio社製)に混合して、全量25μlとした。
0.8μM(最終濃度) プライマーセット
25ng 鋳型DNA
0.7unit DNAポリメラーゼ
0.2mM(最終濃度) dNTP混合物
1.5mM(最終濃度) 酢酸、塩化若しくは硫酸マグネシウム
0.4μg T.th.RecA
400μM GTP
以上を含むよう、1×rTaq buffer(Takara−Bio社製)に混合して、全量25μlとした。
0.8μM(最終濃度) プライマーセット
25ng 鋳型DNA
0.7unit DNAポリメラーゼ
0.2mM(最終濃度) dNTP混合物
1.5mM(最終濃度) 酢酸、塩化若しくは硫酸マグネシウム
0.4μg T.th.RecA
400μM ATP
以上を含むよう、1×rTaq buffer(Takara−Bio社製)に混合して、全量25μlとした。
0.8μM(最終濃度) プライマーセット
25ng 鋳型DNA
0.7unit DNAポリメラーゼ
0.2mM(最終濃度) dNTP混合物
1.5mM(最終濃度) 酢酸、塩化若しくは硫酸マグネシウム
0.4μg T.th.RecA
400μM UTP
以上を含むよう、1×rTaq buffer(Takara−Bio社製)に混合して、全量25μlとした。
0.8μM(最終濃度) プライマーセット
25ng 鋳型DNA
0.7unit DNAポリメラーゼ
0.2mM(最終濃度) dNTP混合物
1.5mM(最終濃度) 酢酸、塩化若しくは硫酸マグネシウム
0.4μg T.th.RecA
400μM CTP
以上を含むよう、1×rTaq buffer(Takara−Bio社製)に混合して、全量25μlとした。
0.8μM(最終濃度) プライマーセット
25ng 鋳型DNA
0.7unit DNAポリメラーゼ
0.2mM(最終濃度) dNTP混合物
1.5mM(最終濃度) 酢酸、塩化若しくは硫酸マグネシウム
400μM ATP
以上を含むよう、1×rTaq buffer(Takara−Bio社製)に混合して、全量25μlとした。
上記の実験結果を図4に示す。
レーン1〜7は、T.th.RecAおよびNTPのいずれをも添加せず、夫々プライマーセット1、2、3、4、5、6、8を使用して一般的なPCR反応液中で増幅反応を行った結果を示す(コントロール:反応液I)。
レーン8〜14は、いずれのNTPをも添加せずT.th.RecAのみを添加して、夫々プライマーセット1、2、3、4、5、6、8を使用して増幅反応を行った結果を示す(反応液J)。
レーン15〜21は、T.th.RecAとGTPを添加して、夫々プライマーセット1、2、3、4、5、6、8を使用して増幅反応を行った結果を示す(反応液K)。
レーン22〜28は、T.th.RecAとATPとを添加して、夫々プライマーセット1、2、3、4、5、6、8を使用して増幅反応を行った結果を示す(反応液L)。
レーン29〜35は、T.th.RecAとUTPとを添加して、夫々プライマーセット1、2、3、4、5、6、8を使用して増幅反応を行った結果を示す(反応液M)。
レーン36〜42は、T.th.RecAとCTPとを添加して、夫々プライマーセット1、2、3、4、5、6、8を使用して増幅反応を行った結果を示す(反応液N)。
レーン43〜49は、T.th.RecAを添加せずATPのみを添加して、夫々プライマーセット1、2、3、4、5、6、8を使用して増幅反応を行った結果を示す(反応液O)。
また、同様の結果が、GTPとT.th.RecAを添加した場合(レーン15〜21およびレーン8〜14の比較)、UTPとT.th.RecAを添加した場合(レーン29〜35およびレーン8〜14の比較)、CTPとT.th.RecAを添加した場合(レーン36〜42およびレーン8〜14の比較)にも確認された。
なかでも、ATPとT.th.RecAの組合せが最も非特異的な増幅を抑制することが認められた。
しかしながら、ATP単独では、非特異的な増幅を抑制できなかった(レーン43〜49)。そして、ATP単独ではT.th.RecAとATPのいずれを添加しなかった場合と同程度の非特異的な増幅産物の産生が確認された(レーン43〜49とレーン1〜7の比較)。
してみると、ATPと同様、GTP、CTP、UTP等のヌクレオチド5´リン酸もT.th.RecAを活性化でき、その機能の安定化に重要な役割を果すことが判明した。これによりRecAの外的要因、特には熱に対する生物学的機能の安定性を向上させ、RecAの有する生物活性を活性化することができるものと考えられる。
使用するプライマーの塩基長による、T.th.RecAおよびATPの存在下でのPCR増幅に対する効果を検討した。
ヒトゲノムDNAを鋳型として、種々の長さのプライマーセットを用いてPCR増幅反応を行った。ここで、使用したプライマーセットの長さは、プライマーセット10、11、12、13、14および15、夫々、20、25、30、35、40および45塩基長であった。また、PCR反応液は以下に示す2種類を調製した。詳細には、反応液Pは、T.th.RecAおよびATPを添加して調製したものであり、そして、反応液Qは、ATPを添加しないことを除いては反応液Pと同様に調製した。各反応液の組成は以下の通りである。なお、DNAポリメラーゼはExTaq−HSポリメラーゼ(Takara−Bio社製)を用いた。
0.6μM(最終濃度) プライマーセット
20ng 鋳型DNA
0.7unit DNAポリメラーゼ
0.2mM(最終濃度) dNTP混合物
1.5mM(最終濃度) 酢酸、塩化若しくは硫酸マグネシウム
0.4μg T.th.RecA
0.4mM(最終濃度) ATP
以上を含むよう、1×ExTaq bufferに混合して、全量25μlとした。
0.6μM(最終濃度) プライマーセット
20ng 鋳型DNA
0.7unit DNAポリメラーゼ
0.4mM(最終濃度) dNTP混合物
1.5mM(最終濃度) 酢酸、塩化若しくは硫酸マグネシウム
0.4μg T.th.RecA
以上を含むよう、1×ExTaq bufferに混合して、全量25μlとした。
結果を図5に示す。
レーン1〜6は、T.th.RecA並びにATPを添加して、夫々プライマーセット10、11、12、13、14および15を用いて増幅反応を行なった結果を示す(反応液P)。
レーン7〜12は、ATPを添加せずT.th.RecAのみを添加し、夫々プライマーセット10、11、12、13、14および15を用いて増幅反応を行なった結果を示す(反応液Q)。
実施例5に続き、使用するプライマーの塩基長による、T.th.RecAおよびATP存在でのPCR増幅に対する効果を検討した。
ヒトゲノムDNAを鋳型として、種々の長さのプライマーセットを用いてPCR増幅反応を行った。ここで、使用したプライマーの長さは、プライマーセット16、17、18、19、20および21が、夫々、20、25、30、35、40、45塩基長であった。また、PCR反応液として、実施例5で使用したものと同じものを使用した。詳細には、反応液Pは、T.th.RecAとATPを添加して調製したものであり、そして、反応液Qは、ATPを添加しないことを除いては反応液Pと同様に調製した。なお、DNAポリメラーゼはExTaq−HSポリメラーゼ(Takara−Bio社製)を用いた。そして、PCR反応を実施例5と同じ条件下で行なった後、実施例5の手順に従って電気泳動並びに泳動ゲルの染色を行ない、写真撮影を行った。
結果を図6に示す。
レーン1〜6は、T.th.RecA並びにATPを添加して、夫々プライマーセット16、17、18、19、20および21を用いて増幅反応を行なった結果を示す(反応液P)。
レーン7〜12は、T.th.RecAのみを添加し、夫々プライマーセット16、17、18、19、20および21を用いて増幅反応を行なった結果を示す(反応液Q)。
T.th.DNAポリメラーゼを用いたPCR増幅における、T.th.RecAおよびATPとの組合せに対する影響を検討した。
ヒトゲノムDNAを鋳型として、プライマーセット1を用いてT.th.DNAポリメラーゼによるPCR増幅反応を行った。PCR反応液は以下に示す5種類を調製した。詳細には、反応液Rは、T.th.RecAとATPを添加して調製したものである。そして、反応液Sは、ATPを添加しないことを除いては反応液Rと同様に調製した。また、反応液Tは、T.th.RecAとATPを添加しないことを除いては反応液Rと同様に調製したものであり、一般的なPCR反応液組成を示す。そして、反応液Uは、T.th.RecAとATPを添加しない代わりにT.th.RecA storage bufferを添加したことを除いては反応液Rと同様に調製した。更に反応液VはT.th.RecAを添加しないことを除いては反応液Rと同様に調製した。各反応液の組成は以下の通りである。
0.6μM(最終濃度) プライマーセット
20ng 鋳型DNA
0.5unit DNAポリメラーゼ
0.2mM(最終濃度) dNTP混合物
1.5mM(最終濃度) 酢酸、塩化若しくは硫酸マグネシウム
0.4μg T.th.RecA
0.4mM(最終濃度) ATP
以上を含むよう、1×T.th.DNA Polymerase buffer(製造業者名)に混合して、全量25μlとした。
0.6μM(最終濃度) プライマーセット
20ng 鋳型DNA
0.5unit DNAポリメラーゼ
0.2mM(最終濃度) dNTP混合物
1.5mM(最終濃度) 酢酸、塩化若しくは硫酸マグネシウム
0.4μg T.th.RecA
以上を含むよう、1×T.th.DNA Polymerase buffer(製造業者名)に混合して、全量25μlとした。
0.6μM(最終濃度) プライマーセット
20ng 鋳型DNA
0.5unit DNAポリメラーゼ
0.2mM(最終濃度) dNTP混合物
1.5mM(最終濃度) 酢酸、塩化若しくは硫酸マグネシウム
以上を含むよう、1×T.th.DNA Polymerase buffer(製造業者名)に混合して、全量25μlとした。
0.6μM(最終濃度) プライマーセット
20ng 鋳型DNA
0.5unit DNAポリメラーゼ
0.2mM(最終濃度) dNTP混合物
1.5mM(最終濃度) 酢酸、塩化若しくは硫酸マグネシウム
0.1μl T.th.RecA storage buffer
以上を含むよう、1×T.th.DNA Polymerase buffer(製造業者名)に混合して、全量25μlとした。
1.5M KCl
50mM Tris−HCl(pH7.5)
1.0mM EDTA
0.5mM DTT
50%グリセロール
0.6μM(最終濃度) プライマーセット
20ng 鋳型DNA
0.5unit DNAポリメラーゼ
0.2mM(最終濃度) dNTP混合物
1.5mM(最終濃度) 酢酸、塩化若しくは硫酸マグネシウム
0.4mM(最終濃度) ATP
以上を含むよう、1×T.th.DNA Polymerase buffer(製造業者名)に混合して、全量25μlとした。
結果を図7に示す。
いずれもT.th.DNAポリメラーゼによるPCR増幅を行なった結果を示す。
そして、レーン1〜7は、T.th.RecA並びにATPを添加して、夫々プライマーセット1、2、3、4、5、6および8を用いて増幅反応を行なった結果を示す(反応液R)。
レーン8〜14は、ATPを添加せずT.th.RecAのみを添加して、夫々プライマーセット1、2、3、4、5、6および8を用いて増幅反応を行なった結果を示す(反応液S)。
レーン15〜21は、T.th.RecA及びATPのいずれをも添加せず、夫々プライマーセット1、2、3、4、5、6および8を用いて増幅反応を行なった結果を示す(反応液T)。
レーン22〜28は、T.th.RecA及びATPのいずれをも添加せずにT.th.RecA storage bufferを添加して、夫々プライマーセット1、2、3、4、5、6および8を用いて増幅反応を行なった結果を示す(反応液U)。
レーン29〜35は、T.th.RecAを添加せずATPのみを添加して、夫々プライマーセット1、2、3、4、5、6および8を用いて増幅反応を行なった結果を示す(反応液V)。
T.th.DNAポリメラーゼを用いたPCR増幅におけるT.th.RecAおよびATPとの組合せに対する影響、並びに、マルチプレックスPCRにおける影響を検討した。
ヒトゲノムDNAを鋳型として、T.th.DNAポリメラーゼを用いたPCR増幅反応を行った。ここで使用したプライマーセットは、プライマーセット22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、1および2であった。また、これらのプライマーセットをすべて1の反応系に添加して増幅するマルチプレックスPCRをも行なった。そして、反応液は以下に示す2種類を調製した。詳細には、反応液Wは、T.th.RecAとATPを添加したものである。そして、反応液Xは、T.th.RecAとATPを添加せずにT.th.RecA storage bufferを添加したことを除いては反応液Wと同様に調製した。
0.6μM(最終濃度) プライマーセット
20ng 鋳型DNA
0.5unit DNAポリメラーゼ
0.2mM(最終濃度) dNTP混合物
1.5mM(最終濃度) 酢酸、塩化若しくは硫酸マグネシウム
0.4μg T.th.RecA
0.4mM(最終濃度) ATP
以上を含むよう、1×T.th.DNA Polymerase buffer(製造業者名)に混合して、全量25μlとした。
0.6μM(最終濃度) プライマーセット
20ng 鋳型DNA
0.5unit DNAポリメラーゼ
0.2mM(最終濃度) dNTP混合物
1.5mM(最終濃度) 酢酸マグネシウム
0.1μl T.th.RecA storage buffer
以上を含むよう、1×T.th.DNA Polymerase Buffer(Applied Biosystems社製:製品番号N8080187)に混合して、全量25μlとした。ここで使用したT.th.RecA storage bufferは実施例7において使用したものと同じものであった。
結果を図8に示す。
いずれもT.th.DNAポリメラーゼによるPCR増幅を行なった結果を示す。
レーン1〜14は、T.th.RecA並びにATPを添加して、夫々プライマーセット22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、1および2を用いて増幅反応を行なった結果を示す(反応液W)。
そして、レーン15は、T.th.RecA並びにATPの存在下で上記プライマーセット全部を添加して1の反応系で増幅反応を行なったマルチプレックスPCRの結果を示す(反応液W)。
レーン16〜29は、T.th.RecAstorage buffer存在下で夫々プライマーセット22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、1および2を用いて増幅反応を行なった結果を示す(反応液X)。
そして、レーン30は、T.th.RecA storage buffer存在下で上記プライマーセット全部を添加して1の反応系で増幅反応を行なったマルチプレックスPCRの結果を示す(反応液X)。
また、T.th.RecAとATPの双方の存在下でマルチプレックスPCRを行なった場合、夫々プライマーセットに対応する標的配列が特異的に増幅されていることが確認された(レーン15、対応する標的配列に関してはレーン1〜14)。一方、T.th.RecAとATPの不在下においては、非特異的な増幅産物の産生を抑制できず、マルチプレックスPCRの精度が低下することが確認された(レーン30)。
Claims (9)
- ポリメラーゼ連鎖反応を、サーマス・サーモフィラス(Thermus thermophilus)由来のRecAタンパク質およびヌクレオチド5´−三リン酸の存在下で行なうことにより標的核酸を増幅する核酸増幅方法であって、前記ヌクレオチド5´−三リン酸が、アデノシン5´−三リン酸、ウリジン5´−三リン酸、グアノシン5´−三リン酸およびシチジン5´−三リン酸からなる群から選択されるものであり、ただし、デオキシヌクレオチド5´−三リン酸及びヌクレオチド5´−O−3−チオ三リン酸ではない、核酸増幅方法。
- 前記ヌクレオチド5´−三リン酸が、アデノシン5´−三リン酸である請求項1に記載の核酸増幅方法。
- 前記ヌクレオチド5´−三リン酸が、ウリジン5´−三リン酸、グアノシン5´−三リン酸およびシチジン5´−三リン酸からなる群から選択されるものである請求項1に記載の核酸増幅方法。
- 前記標的核酸が阻止的または抑制的2次構造の区域を有する請求項1〜3のいずれか一項に記載の核酸増幅方法。
- 前記ポリメラーゼ連鎖反応がマルチプレックス−ポリメラーゼ連鎖反応である請求項1〜4のいずれか一項に記載の核酸増幅方法。
- 耐熱性DNAポリメラーゼ、
アデニン、チミン、グアニンおよびシトシンの夫々に対応する4種類のデオキシヌクレオチド5´−三リン酸、
サーマス・サーモフィラス(Thermus thermophilus)由来のRecAタンパク質と、
ヌクレオチド5´−三リン酸と、を含む核酸を増幅するための核酸増幅用キットであって、
前記ヌクレオチド5´−三リン酸が、アデノシン5´−三リン酸、ウリジン5´−三リン酸、グアノシン5´−三リン酸およびシチジン5´−三リン酸からなる群から選択されるものであり、ただし、デオキシヌクレオチド5´−三リン酸及びヌクレオチド5´−O−3−チオ三リン酸ではない、核酸増幅用キット。 - 前記ヌクレオチド5´−三リン酸が、アデノシン5´−三リン酸である請求項6に記載の核酸増幅用キット。
- 前記ヌクレオチド5´−三リン酸が、ウリジン5´−三リン酸、グアノシン5´−三リン酸およびシチジン5´−三リン酸からなる群から選択されるものである請求項6に記載の核酸増幅用キット。
- 前記核酸の増幅がマルチプレックス−ポリメラーゼ連鎖反応に基づく請求項6〜8のいずれか一項に記載の核酸増幅用キット。
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