JP4503617B2 - アゴニスト抗trkC抗体および該抗体を用いる方法 - Google Patents
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Description
本出願は、仮出願米国第60/532,592号、2003年12月23日出願に優先権を請求し、該出願は完全に本明細書に援用される。
本発明は、アゴニスト抗trkC抗体およびポリペプチドに関する。本発明は、感覚性ニューロパシーなどの疾患の治療および/または予防における、こうした抗体およびポリペプチドの使用にさらに関する。
該当なし。
ニューロトロフィンは、小型ホモ二量体タンパク質のファミリーであり、神経系の発生および維持に重大な役割を果たす。ニューロトロフィン・ファミリーのメンバーには、神経成長因子(NGF)、脳由来神経栄養因子(BDNF)、ニューロトロフィン−3(NT−3)、ニューロトロフィン−4/5(NT−4/5)、ニューロトロフィン−6(NT−6)、およびニューロトロフィン−7(NT−7)が含まれる。ニューロトロフィンは、他のポリペプチド増殖因子と同様、細胞表面受容体との相互作用を通じて、ターゲット細胞に影響を及ぼす。現在の知識によると、2種類の膜貫通糖タンパク質がニューロトロフィン類の受容体として働く。ニューロトロフィン応答性ニューロンは、p75NTRまたはp75とも称され、2x10−9MのKDでNGF、BDNF、NT−3およびNT−4/5に結合する、共通の低分子量(65〜80kDa)低親和性受容体(LNGFR);並びに高分子量(130〜150kDa)高親和性(10−11M範囲のKD)受容体を所持し、これらは受容体チロシンキナーゼのtrkファミリーのメンバーである。trk受容体ファミリーの同定されたメンバーは、trkA、trkB、およびtrkCである。
本明細書に開示する発明は、trkC受容体に対するアゴニスト抗体に関する。したがって、1つの側面において、本発明は、ヒトおよびげっ歯類のtrkC受容体(「trkC」)に特異的に結合する、ヒト化し、そして親和性成熟させた抗体、A5である。A5の重鎖および軽鎖の可変領域のアミノ酸配列を、それぞれ、図1A(配列番号1)および図1B(配列番号2)に示す。抗体A5の相補性決定領域(CDR)部分(ChothiaおよびKabatのCDRを含む)を、図1Aおよび図1Bに図式的に示す。A5重鎖および軽鎖のアミノ酸配列、並びに個々の拡張(extended)CDRのアミノ酸配列もまた、以下に示す(以下の「抗体配列」を参照されたい)。
別の側面において、本発明は、本明細書に開示するポリヌクレオチドのいずれかを含むベクター(発現ベクターおよびクローニングベクターを含む)および宿主細胞を提供する。
本明細書開示の本発明は、trkCに結合する抗体およびポリペプチド(A5など)、およびこれらの抗体を作成し、そして用いる方法を提供する。いくつかの態様において、本発明は、trkC受容体(「trkC」)に結合するヒト化抗体、A5、およびこの抗体を作成し、そして用いる方法を提供する。本発明はまた、trkCに結合するA5ポリペプチド(抗体を含む)、並びにA5抗体および/またはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも提供する。
本発明の実施は、別に示さない限り、当該技術分野の技術内にある、分子生物学(組換え技術を含む)、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の慣用的技術を使用するであろう。こうした技術は、Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 第2版(Sambrookら, 1989)Cold Spring Harbor Press;Oligonucleotide Synthesis(M.J. Gait監修、1984);Methods in Molecular Biology, Humana Press;Cell Biology:A Laboratory Notebook(J.E. Cellis監修, 1998)Academic Press;Animal Cell Culture(R.I. Freshney監修、1987);Introduction to Cell and Tissue Culture(J.P. MatherおよびP.E. Roberts, 1998)Plenum Press;Cell and Tissue Culture:Laboratory Procedures(A. Doyle, J.B. Griffiths、およびD.G. Newell監修, 1993−1998)J. Wiley and Sons;Methods in Enzymology(Academic Press, Inc.);Handbook of Experimental Immunology(D.M. WeirおよびC.C. Blackwell監修);Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.M. MillerおよびM.P. Calos監修, 1987);Current Protocols in Molecular Biology(F.M. Ausubelら監修, 1987);PCR:The Polymerase Chain Reaction(Mullisら監修, 1994);Current Protocols in Immunology(J.E. Coliganら監修, 1991);Short Protocols in Molecular Biology(Wiley and Sons, 1999);Immunobiology(C.A. JanewayおよびP. Travers, 1997);Antibodies(P. Finch, 1997);Antibodies:a practical approach(D. Catty監修, IRL Press, 1988−1989);Monoclonal antibodies:a practical approach(P. ShepherdおよびC. Dean監修, Oxford University Press, 2000);Using antibodies:a laboratory manual(E. HarlowおよびD. Lane(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999);The Antibodies(M. ZanettiおよびJ.D. Capra監修, Harwood Academic Publishers, 1995)などの文献に、完全に説明されている。
「抗体」は、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチド等のターゲットに特異的に結合することが可能な免疫グロブリン分子であり、該免疫グロブリン分子の可変領域に位置する、少なくとも1つの抗原認識部位を通じて、ターゲットに結合する。本明細書において、該用語は、損なわれていない(intact)ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体だけでなく、その断片(Fab、Fab’、F(ab’)2、Fvなど)、一本鎖(ScFv)、その突然変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、および抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の他のいずれかの修飾立体配置も含む。抗体には、IgG、IgA、またはIgM(またはそのサブクラス)などのいかなるクラスの抗体も含まれ、そして抗体は特定のクラスのものである必要はない。重鎖定常ドメインの抗体アミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンを異なるクラスに割り当てることも可能である。免疫グロブリンには、5つの主なクラス:IgA、IgD、IgE、IgG、およびIgMがあり、そしてこれらのいくつかをサブクラス(アイソタイプ)、例えばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1およびIgA2にさらに分けることも可能である。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、およびミューと称される。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および三次元立体配置が周知である。
本明細書において、「trkC」は、チロシンキナーゼ・スーパーファミリーのメンバーである、trkC受容体ポリペプチドを指す。trkCは、限定されるわけではないが、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、霊長類、およびげっ歯類(マウスおよびラットを含む)を含む哺乳動物種いずれかの天然trkC受容体を含む。全長天然trkCの細胞外ドメインは、多様な他のタンパク質において同定された相同な構造またはそうでなければ類似の構造に関連して定義されてきている。これらのドメインは、成熟trkC受容体のN末端から始まって:1)アミノ酸1〜アミノ酸48に渡る第一のシステインリッチドメイン;2)アミノ酸49〜アミノ酸120に渡るロイシンリッチドメイン;3)アミノ酸121〜アミノ酸177に渡る第二のシステインリッチドメイン;4)およそアミノ酸196〜アミノ酸257に渡る第一の免疫グロブリン様ドメイン;および5)およそアミノ酸288〜アミノ酸351に渡る第二の免疫グロブリン様ドメインと称されている。例えば、PCT公報第WO 0198361号を参照されたい。trkC受容体の細胞外ドメインのドメイン構造もまた、結晶構造を参照することによって、以下のように称されてきている:アミノ酸1〜アミノ酸47のドメイン1;アミノ酸48〜アミノ酸130のドメイン2;アミノ酸131〜アミノ酸177のドメイン3;アミノ酸178〜アミノ酸165のドメイン4;およびアミノ酸166〜アミノ酸381のドメイン5。例えば、PCT WO 01/98361;Urferら J. Biol. Chem. 273:5829−5840(1998)を参照されたい。やはり含まれるのは、trkCの変異体であり、この例には、限定されるわけではないが、キナーゼドメインを欠く変異体(Sheltonら, J. Neurosci. 15(1):477−491, 1995)、および修飾キナーゼドメインを含む変異体(Sheltonら, J. Neurosci. 15(1):477−491, 1995)が含まれる。
用語「KD」は、本明細書において、抗体−抗原相互作用の解離定数を指すよう意図される。
本発明は、薬剤組成物を含む組成物であって、本明細書記載の抗trkCアゴニスト抗体(A5抗体など)またはポリペプチド;並びに該抗体(A5抗体など)またはポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチドを含む。本明細書において、組成物は、trkCに結合する1以上の抗体またはポリペプチド(抗体であることもまたないことも可能である)、および/またはtrkCに結合する1以上の抗体またはポリペプチドをコードする配列を含む1以上のポリヌクレオチドを含む。これらの組成物は、当該技術分野に周知の、緩衝剤を含む薬学的に許容しうる賦形剤などの適切な賦形剤をさらに含むことも可能である。
本発明の抗体およびポリペプチドは、以下の特性のいずれか(1以上)によって特徴付けられる:(a)trkC受容体に結合する;(b)trkC受容体の1以上のエピトープに結合する;(c)trkC受容体に結合してtrkC受容体を活性化し、そして/またはtrkCシグナル伝達機能によって仲介される1以上の下流経路を活性化する;(d)trkC受容体に結合して、trkC受容体を活性化し、そして感覚性ニューロパシー(タキソール誘導性感覚性ニューロパシーなど)の1以上の症状を治療するか、予防するか、逆転させるか、または改善する;(e)trkBまたはtrkAに結合せず、そして/またはこれらを活性化しない;(f)好ましい薬物動態学的特性および生物学的利用能特性を示す。
A5抗体および関連抗体(本明細書記載)はまた、Sadickら, Exp. Cell Res.(1997)234:354−361に記載されるようなキナーゼ受容体活性化アッセイ(KIRA)によって評価した際、ヒトtrkCを活性化し、そしてin vitroニューロン生存アッセイによって評価した際、ラットtrkCを活性化する強い能力も示す。図3および図4に示すように、A5は、ヒトおよびげっ歯類両方のtrkCの強力なアゴニストである。
本発明はまた、これらの抗体またはポリペプチドのいずれかを作成する方法も提供する。当該技術分野に知られる方法によって、本発明の抗体を作成することも可能である。抗体のタンパク質分解的分解または他の分解によって、上述のように組換え法によって(すなわち単一または融合ポリペプチド)、あるいは化学合成によって、ポリペプチドを産生することも可能である。抗体のポリペプチド、特に約50アミノ酸までのより短いポリペプチドは、化学合成によって、好都合に作成される。化学合成法は、当該技術分野に知られ、そして商業的に利用可能である。例えば、固相法を使用する自動化ポリペプチド合成装置によって、A5抗体を産生することも可能である。米国特許第5,807,715号;第4,816,567号;および第6,331,415号も参照されたい。
(1)疎水性:ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile;
(2)中性親水性:Cys、Ser、Thr;
(3)酸性:Asp、Glu;
(4)塩基性:Asn、Gln、His、Lys、Arg;
(5)鎖配向に影響を及ぼす残基:Gly、Pro;および
(6)芳香族:Trp、Tyr、Phe。
抗体の適切なコンホメーションの維持に関与していないシステイン残基のいずれかを、一般的にはセリンで置換して、分子の酸化安定性を改善し、そして異常な架橋を防止することもまた可能である。逆に、システイン結合(単数または複数)を抗体に付加して、特に抗体がFv断片などの抗体断片である場合に、安定性を改善することも可能である。
本発明はまた、本発明の抗体およびポリペプチド(図1Aおよび図1Bに示す軽鎖および重鎖の可変領域のポリペプチド配列を含む抗体を含む)をコードする単離ポリヌクレオチド、並びに該ポリヌクレオチドを含むベクターおよび宿主細胞も提供する。
こうした配列いずれかに相補的なポリヌクレオチドもまた、本発明に含まれる。ポリヌクレオチドは、一本鎖(コードまたはアンチセンス)または二本鎖であることも可能であるし、そしてDNA分子(ゲノム、cDNAまたは合成分子)またはRNA分子であることも可能である。RNA分子には、イントロンを含有し、そして一対一様式でDNA分子に対応するHnRNA分子、およびイントロンを含有しないmRNA分子が含まれる。さらなるコード配列または非コード配列が、本発明のポリヌクレオチド内に存在することも可能であるが、存在する必要はなく、そしてポリヌクレオチドは、他の分子および/または支持物質に結合することも可能であるが、結合する必要はない。
trkCに結合する抗体A5を用いて、trkCまたはtrkC断片の存在または非存在を同定するかまたは検出することも可能である。簡単にするため、一般的に、A5または抗体への言及を行い、これらの方法が、本明細書記載のtrkC結合態様(ポリペプチドなど)のいずれにも適用されることを理解するものとする。検出は、一般的に、trkCに結合する本明細書記載の抗体と、生物学的試料を接触させ、そしてtrkCおよびtrkCに特異的に結合する抗体(例えばA5)の間で複合体を形成させることを伴う。こうした複合体の形成は、in vitroであることもまたはin vivoであることも可能である。用語「検出」は、本明細書において、対照と比較した、または比較しない、定性的および/または定量的検出(レベルを測定する)を含む。
本発明の抗体およびポリペプチドを、改変されたかまたは異常なtrkC発現(いくつかの態様において、(正常試料に比較して)増加したかまたは減少したtrkC発現、並びに/あるいは不適切な発現、例えば、通常はtrkC発現を欠く組織(単数または複数)および/または細胞(単数または複数)における発現の存在、または通常trkC発現を所持する組織(単数または複数)または細胞(単数または複数)におけるtrkC発現の非存在)と関連する疾患、状態、または障害の検出、診断および監視に使用可能である。例えば、trkC発現腫瘍が当該技術分野に知られ、そしてこれには、未分化神経外胚葉性腫瘍(PNET)、ユーイング肉腫細胞、膵臓癌および甲状腺髄様癌が含まれる。本発明の抗体およびポリペプチドはさらに、例えば、trkCに対する、改変されたかまたは異常な感受性または反応性に関連する疾患における、trkC発現の検出にも有用である。したがって、いくつかの態様において、本発明は、改変されたかまたは異常なtrkC発現を有すると推測される個体の標本(試料)を、本発明の抗体またはポリペプチドと接触させ、そしてtrkCレベルが、対照または比較標本のものと異なるかどうかを決定することを含む。
療法目的のため、抗体またはポリペプチド(A5など)を用いる方法
抗体A5は、trkCの生物学的活性を活性化するのに有用である。このアゴニスト活性は、感覚性ニューロパシーまたは神経変性疾患と関連する病理学的状態の治療に、あるいは損傷を受けた神経細胞の修復に有用であると考えられる。ニューロパシーは、例えば、限定なしに大径線維感覚性ニューロパシーを含む、末梢ニューロパシーであることも可能である。いくつかの態様において、感覚性ニューロパシー、例えば大径線維感覚性ニューロパシー、例えばタキソール誘導性感覚性ニューロパシー、シスプラチン誘導性感覚性ニューロパシー、またはピリドキシン誘導性ニューロパシーを患う個体に、本明細書記載のA5または他の抗体あるいはポリペプチドでの治療を施す。一般的に、これらの態様において、有効量を個体に投与する。
A5またはA5断片(例えばFab、Fab’、F(ab’)2、Fv、Fcなど)、例えば一本鎖(ScFv)、これらの突然変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、および必要な特異性の抗原trkC認識部位を含むA5の他の修飾立体配置いずれかの多様な配合物を投与に用いることも可能である。いくつかの態様において、A5抗体またはA5の多様な配合物をそのまま(neat)投与することも可能である。他の態様において、A5またはA5の多様な配合物(本明細書記載の組成物態様いずれかを含む)および薬学的に許容しうる賦形剤が投与され、そしてこれらは多様な配合にあることも可能である。薬学的に許容しうる賦形剤は、当該技術分野に知られ、そして薬理学的有効物質の投与を容易にする、比較的不活性な物質である。例えば、賦形剤は、形またはコンシステンシーを与えるか、あるいは希釈剤として作用することも可能である。適切な賦形剤には、限定されるわけではないが、安定化剤、湿潤剤および乳化剤、モル浸透圧濃度を変化させる塩、被包剤、緩衝剤、および皮膚浸透増進剤が含まれる。非経口および経口薬剤搬送のための賦形剤、並びに配合物が、Remington, The Science and Practice of Pharmacy 第20版 Mack Publishing(2000)に示される。
アゴニスト抗trkC抗体の投与
適切な経路いずれかを介して、アゴニスト抗trkC抗体(またはポリペプチド)を個体に投与することも可能である。本明細書記載の実施例は、限定することを意図せず、利用可能な技術の例示を意図することが、当業者には明らかであるはずである。簡単にするため、一般的に、A5または抗体への言及を行い、これらの方法が、trkC結合態様のいずれにも適用されることを理解するものとする。したがって、いくつかの態様において、静脈内投与などの既知の方法にしたがって、例えばボーラス(bolus)として、または一定期間に渡る連続注入によって、筋内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、動脈内、舌下、滑膜内、吹送を介した、クモ膜下内、経口、吸入または局所的経路によって、アゴニスト抗trkC抗体を個体に投与する。投与は全身性、例えば静脈内投与であることも、または局所性であることも可能である。ジェット噴霧器および超音波噴霧器を含む、液体配合物用の商業的に入手可能な噴霧器は、投与に有用である。液体配合物は直接噴霧可能であり、そして凍結乾燥粉末は、再構成後、噴霧可能である。あるいは、フルオロカーボン配合物および定量吸入器を用いて、アゴニスト抗trkC抗体をエアロゾル化することも可能であるし、また凍結乾燥し、そして粉砕した粉末として吸入することも可能である。
本発明の抗体、ポリペプチド、およびポリヌクレオチドを含むキット
本発明はまた、検出および/または療法で使用するための抗体またはポリペプチドを含むキットも提供する。したがって、いくつかの態様において、キットは抗体A5を含む。いくつかの態様において、キットは、本明細書記載の抗体またはポリペプチドいずれかを含む。
(実施例1)
マウス・モノクローナル抗体2256のヒト化および親和性成熟
A.一般的な方法
本実施例では以下の一般的な方法を用いた。
抗体の発現は、Barbas(2001)Phage display:a laboratory manual, ニューヨーク州コールドスプリングハーバー, Cold Spring Harbor Laboratory Press 2.10.ページ Vector pComb3X)に記載されるものと類似のIPTG誘導性lacZプロモーターの調節下にあったが、以下のさらなるドメイン:ヒト・カッパ軽鎖定常ドメインおよびIgG2aヒト免疫グロブリンのCH1定常ドメインの付加および発現を含むように修飾した。Igガンマ−2鎖C領域、タンパク質寄託番号P01859;免疫グロブリン・カッパ軽鎖(ホモサピエンス(homosapiens))、タンパク質寄託番号CAA09181。
96ウェルプレート中のFabの小規模発現を以下のように行った。Fabライブラリーを形質転換した大腸菌から出発して、コロニーを摘み取って、マスタープレート(寒天LB+アンピシリン(50μg/ml)+2%グルコース)および作業プレート(2ml/ウェル、1.5mlのLB+アンピシリン(50μg/ml)+2%グルコースを含有する96ウェル/プレート)の両方に接種した。両方のプレートを30℃で8〜12時間増殖させた。マスタープレートを4℃で保存し、そして作業プレート由来の細胞を5000rpmでペレットにし、そして1mlのLB+アンピシリン(50μg/ml)+1mM IPTGに再懸濁してFabの発現を誘導した。30℃で5時間の発現時間後に遠心分離によって細胞を採取し、次いで、500μlの緩衝液HBS−P(100mM HEPES緩衝液pH7.4、150mM NaCl、0.005% P20)に再懸濁した。1周期の凍結(−80℃)、次いで37℃の融解によって、HBS−P再懸濁細胞の溶解を達成した。細胞溶解物を5000rpmで30分間遠心分離して、Fabを含有する上清から細胞破片を分離した。次いで、上清をBIAcoreプラズモン共鳴装置に注入して、各Fabの親和性情報を得た。Fabを発現するクローンをマスタープレートからレスキューして、DNAを配列決定し、そして以下に記載するように、大規模Fab産生および詳細な性質決定を行った。
詳細な動力学パラメーターを得るため、Fabを発現させ、そして大規模培養物から精製した。200mlのLB+アンピシリン(50μg/ml)+2%グルコースを含有する三角フラスコに、選択したFab発現大腸菌クローンからの一晩培養物5mlを接種した。1.0のOD550nmが達成されるまでクローンを30℃でインキュベーションし、そして次いで200mlのLB+アンピシリン(50μg/ml)+1mM IPTGの培地に交換することによって誘導した。30℃で5時間発現させた後、遠心分離によって細胞をペレットにし、次いで、10ml PBS(pH8.0)に再懸濁した。2周期の凍結/融解(それぞれ−80℃および37℃)によって、細胞の溶解を達成した。細胞溶解物の上清を、PBS、pH8で平衡化したNi−NTAスーパーフロー・セファロース(Qiagen、カリフォルニア州バレンシア)カラム上に装填し、次いで5カラム体積のPBS、pH8で洗浄した。個々のFabが、PBS(pH8)+300mMイミダゾールを用いて、異なる分画に溶出された。Fabを含有する分画をプールし、そしてPBS中で透析し、次いで、親和性性質決定前に、ELISAによって定量化した。
全長抗体を発現するため、重鎖および軽鎖の可変領域を哺乳動物発現ベクターにクローニングし、そしてリポフェクタミンを用い、一過性発現のため、HEK293細胞にトランスフェクションした。標準法を用い、プロテインAを用いて抗体を精製した。
BIAcore 3000TM表面プラズモン共鳴(SPR)系(BIAcore, INC、ニュージャージー州ピスカタウェイ)を用いて、抗trkC Fabおよびモノクローナル抗体の親和性を決定した。供給者の指示にしたがって、N−エチル−N’−(3−ジメチルアミノプロピル)−カルボジイミド塩酸(EDC)およびN−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)を用いてCM5チップを活性化した。ヒトまたはラットのtrkC−Fc融合タンパク質を10mM酢酸ナトリウムpH5.0に希釈し、そして0.005mg/mlの濃度で活性化チップ上に注入した。個々のチップチャネルを渡る多様なフロー時間を用いて、2つの範囲の抗原密度:詳細な動力学研究用の200〜400応答単位(RU)およびスクリーニングアッセイ用の500〜1000RUを達成した。チップをエタノールアミンでブロッキングした。再生研究によって、Pierce溶出緩衝液(製品番号21004、Pierce Biotechnology、イリノイ州ロックフォード)および4M NaCl(2:1)の混合物は、結合したFabを有効に除去しながら、200回の注入に渡って、チップ上のhtrkC活性を維持することが示された。すべてのBIAcoreアッセイに関して、HBS−EP緩衝液(0.01M HEPES、pH7.4、0.15 NaCl、3mM EDTA、0.005%界面活性剤P20)をランニング緩衝液として用いた。精製Fab試料の連続希釈(0.1〜10x概算KD)を100μl/分で1分間注入し、そして2時間までの解離時間を許容する。既知の濃度のFab(アミノ酸解析によって決定)を標準として用いて、ELISAおよび/またはSDS−PAGE電気泳動によって、Fabタンパク質の濃度を決定する。BIAevaluationプログラムを用いて、データを1:1ラングミュア結合モデルに適合させることによって(Karlsson, R. Roos, H. Fagerstam, L. Petersson, B.(1994). Methods Enzymology 6.99−110)、動力学会合速度(kon)および解離速度(koff)を同時に得る。koff/konとして、平衡解離定数(KD)値を計算する。
スクリーニングBIAcoreアッセイを最適化して、ライブラリー由来のFabクローンの親和性を決定した。小規模培養溶解物の上清を、50μl/分で2分間注入した。BIAevaluationソフトウェアを用いて、単一指数関数解離速度(koff)の決定に、5分間の解離時間を用いた。確認のため試料を注入し、そしてよりよいkoff値を得るため、45分間までの解離時間を許容した。改善された(より遅い)koff値を示すクローンを大規模に発現させ、そして精製したタンパク質に対して、完全動力学パラメーター、konおよびkoffを決定した。該アッセイは、およそ2倍以上の親和性の相違を検出可能であった。
ヒト化および親和性成熟のため、マウス・モノクローナルtrkCアゴニスト抗体2256を選択した。PTC/US01/20153(WO 01/98361 A2)を参照されたい。Mab2256は、BIAcore表面プラズモン共鳴を用いて決定した際、およそ62nMのヒトtrkCに対する結合親和性を有する。Mab2256は、ヒトtrkCを用いたKIRAアッセイを用いてアッセイした際、およそ40nMのEC50を有し、そして本明細書に記載するようなラット三叉ニューロン生存アッセイを用いてアッセイした際、およそ5nMのEC50を有する。
2=ヒト軽鎖アクセプター生殖系列配列O8のフレームワーク配列に比較して、置換突然変異体を示す。
3=ヒト重鎖アクセプター生殖系列配列VH1−46のフレームワーク配列に比較して、置換突然変異体を示す。
表中の「men」は:mx10nを意味する。
C.ヒト化し、そして親和性成熟させた抗体A5の性質決定
抗体A5を全長IgGとして発現させ、そしてSadickら, Exp. Cell Res.(1997)234:354−361に記載されるようなKIRAによって、ヒトTrkCに対するアゴニスト活性を測定し、そして以下のプロトコルに記載するように行うニューロン生存アッセイによって、ラットTrkCに対するアゴニスト活性を測定した。図3および図4は、抗体A5がヒトおよびげっ歯類のTrkCに対して強力なアゴニストであったことを示す。ニューロン生存における、げっ歯類TrkCに対してのA5に関するEC50は0.001nMであり、一方、2256に関しては5nMであり、これらの抗体間の親和性の相違とよく一致した。
三叉神経節は、顔領域に神経を分布させる皮膚感覚ニューロンで構成される。これらのニューロンは、神経節形成の初期段階では、BDNFおよびNT3に補助され、そしてより後期の段階では、NGFに補助される。E12胚から得た三叉神経節ニューロンは、NT3に補助され、したがって該神経栄養因子を飽和濃度にしておくと、培養48時間まで、生存は100%近い。NT3の非存在下では、48時間までに5%未満のニューロンしか生存しない。したがって、E12三叉ニューロンの生存は、TrkCアゴニスト抗体のアゴニスト活性を評価する感受性アッセイである。
ピリドキシン誘導性ニューロパシーに対する抗体A5の影響
治療プロトコル。実験開始時に150〜200gの体重であった、成体オス・スプレーグ・ドーリーラットに対して、そして認可された研究室動物飼育および使用プロトコルにしたがって、この実験を行った。各治療群に6〜8匹の動物を用いた。注射直前に再蒸留水中100mg/mlにしたピリドキシン(PDX、Sigma、ミズーリ州セントルイス)を注射することによってニューロパシーを誘導し、そして1日2回8日間、腹腔内注射によって、400mg/kgで投与を行った。A5治療動物には、PDX治療開始3日前、腹腔内注射によってA5(5mg/kg)を投与し、そしてA5の最初の用量の1週間後、再び投与した。ベクター治療動物には、中毒開始3日前に、両後肢の足底表面に、ベクターQL2HNT3(1x109pfu/ml)25μlを単回皮下接種した。ベクターQL2HNT3は、NT−3のコード配列を含有する、複製不適合の単純疱疹ウイルスゲノムに基づくベクターであり、そしてin vivoでラット後根神経節の感覚ニューロンに形質導入することが可能であり、そしてこれらのニューロンにおいてNT−3を発現させることが可能である。Chattopadhyayら, Ann. Neurol. 51:19−27(2002)。対照には、未治療動物(対照)および他の治療はまったく受けずにPDXに中毒させた動物(PDX)が含まれた。
シスプラチン誘導性ニューロパシーに対する抗体A5の影響
治療プロトコル。実験開始時体重180〜200gのメス・ウィスターラット(Harlan、イタリア・コッレッツァーナ)に対して実験を行った。コンピュータが生成するランダム選択によって、動物を異なる群に分け、そして各治療群に対して8匹の動物を用いた。週2回4週間の2mg/kgシスプラチン(CDDP)(Bristol Meyer Squibbs、無菌生理食塩水中0.5mg/ml)腹腔内(ip)注射によって、ニューロパシーを誘導した。第1群の動物(対照)は未治療であった。第2群の動物には、週2回4週間2mg/kgのCDDPをip注射した。第3群の動物には、週2回4週間2mg/kgのCDDPをip注射し、そして7日ごとに2mg/kgの抗体2256を皮下(sc)注射した。第4群の動物には、週2回4週間2mg/kgのCDDPをip注射し、そして7日ごとに10mg/kgの抗体2256を皮下注射した。第5群の動物には、週2回4週間2mg/kgのCDDPをip注射し、そして7日ごとに2mg/kgの抗体A5を皮下注射した。第6群の動物には、週2回4週間2mg/kgのCDDPをip注射し、そして7日ごとに10mg/kgの抗体A5を皮下注射した。
生物学的物質の寄託
以下の物質をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、10801 University Boulevard, Manassas, Virginia, USA(ATCC)に寄託した:
Claims (11)
- 重鎖可変領域が配列番号1からなり、そして軽鎖可変領域が配列番号2の配列からなる、アゴニスト抗trkC抗体。
- 重鎖が配列番号28の配列からなり、そして軽鎖が配列番号29の配列からなる、アゴニスト抗trkC抗体。
- 重鎖可変領域が
配列番号1の配列、または、
配列番号1において以下の
(i) 配列番号4のCDR1領域;
(ii) 配列番号5のCDR2領域;および
(iii)配列番号6のCDR3領域
のいずれの領域も除いた配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された配列
からなり、
軽鎖可変領域が、
配列番号2の配列、または、
配列番号2において以下の
(i) 配列番号7のCDR1領域;
(ii) 配列番号8のCDR2領域;および
(iii)配列番号9のCDR3領域
のいずれの領域も除いた配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された配列
からなり、
5nM未満のK D でヒトtrkCに結合する、
アゴニスト抗trkC抗体。 - 請求項1〜3のいずれかのアゴニスト抗trkC抗体をコードする核酸。
- アゴニスト抗trkC抗体の重鎖可変領域をコードする配列番号12の配列、およびアゴニスト抗trkC抗体の軽鎖可変領域をコードする配列番号10の配列を含む、請求項4の核酸。
- アゴニスト抗trkC抗体の重鎖をコードする配列番号13の配列、およびアゴニスト抗trkC抗体の軽鎖をコードする配列番号11の配列を含む、請求項5の核酸。
- 請求項4の核酸を含むベクター。
- 請求項4の核酸を含む宿主細胞。
- (a)請求項1〜3のいずれかのアゴニスト抗trkC抗体の有効量および(b)薬学的に許容しうる賦形剤を含む、薬剤組成物。
- 請求項1〜3のいずれかのアゴニスト抗trkC抗体を含むキット。
- アゴニスト抗trkC抗体を作成する方法であって、請求項1〜3のいずれかのアゴニスト抗trkC抗体をコードするポリヌクレオチドを、宿主細胞において発現させることを含む、前記方法。
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