KR20140102710A - 인간 성장 호르몬 수용체 길항제 항체 및 그의 사용 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 성장 호르몬 수용체 (GHR)에 결합하는 길항 항체를 제공한다. 본 발명은 추가로, 이들 항체를 사용하여 IGF-1 수준을 감소시키고/거나, 과량의 IGF-1과 연관된 질환을 치료 및/또는 예방하는, 예컨대 말단비대증, 거인증, 암, 당뇨병성 신병증, 관절염 및 폐 염증을 치료하는 치료 방법에 관한 것이다.

Description

인간 성장 호르몬 수용체 길항제 항체 및 그의 사용 방법 {HUMAN GROWTH HORMONE RECEPTOR ANTAGONIST ANTIBODIES AND METHODS OF USE THEREOF}

본 발명은 인간 성장 호르몬 수용체 (GHR)의 활성에 대해 길항작용을 하는 항체, 예를 들어 전장 항체 또는 그의 항원-결합 부분에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 길항제 GHR 항체를 포함하는 조성물, 및 의약으로서 이들 항체를 사용하는 방법에 관한 것이다. 길항제 GHR 항체는 혈장 및/또는 조직 중 IGF-1 수준을 저하시키기 위해 치료적으로 사용될 수 있고, 암, 당뇨병성 신병증, 관절염, 폐 염증, 및 말단비대증 및 거인증을 비롯한 성장 장애의 예방 및/또는 치료에 사용될 수 있다.

성장 호르몬 (소마토트로핀) (GH)은 뇌하수체 전엽에서 합성되고 그에 의해 분비되는 22 kDa 단백질이다. 문헌 [Kopchick et al., 2002, Endocrine Reviews, 23(5):623-646]. GH는 조직에 직접적으로 작용하는 것, 및 간 및 다른 조직에 의한 인슐린-유사 성장 인자-1 (IGF-1)의 방출을 자극하는 것 둘 다에 의해 성장의 중요한 내분비 조절제로서 기능한다. 문헌 [Okada et al., 2001, Trends in Molecular Medicine 7(3):126-132]. 결국, IGF-1은 조직에 작용하여 신체 성장을 자극한다.

GH는 내재적 티로신 키나제 활성을 갖지 않는 단일 통과 막횡단 단백질인 성장 호르몬 수용체 (GHR)를 통해 신호를 전달한다. 성장 호르몬 수용체 (GHR)는 부류 1 시토카인 수용체이다. 문헌 [Waters et al., 2006, Journal of Molecular Endocrinology, 36, 1-7]. GHR 신호전달은 적어도 3가지 주요 경로인 STAT, MAPK 및 PI3-키나제/Akt의 역할을 포함한다. GHR 신호전달에 대한 최신 이해는, 수용체 서브유닛의 리간드-유도된 재배열에 의한 신호 전달과 함께, GHR이 구성적 동종이량체로 존재한다는 것이다. 문헌 [Brown, R. J. et al., 2005, Nature Struct. Mol. Biol. 12:814-821]. 현재로서, GH 결합이 불활성의 이량체화 전 GHR을 그의 활성 신호전달 입체형태로 전환시키는 메카니즘은 불확실하다. 문헌 [Yang et al., 2008, Mol. Endocrinol 22(4):978-988]. 이량체화된 GHR과 GH의 상호작용은 각각 구별되는 친화도를 갖는 GH 상의 2개의 비대칭 결합 부위에 의해 매개된다. 문헌 [Yang et al., 2008].

GHR은 편재하여 분포되어 있다. 최초로는 간 조직에서 확인되었지만, 이들은 간, 골, 신장, 지방, 근육, 눈, 뇌 및 심장, 뿐만 아니라 B 세포, 림프구, 비장 및 흉선과 같은 면역 조직에도 존재하는 것으로 공지되어 있다. GHR 길항제, 예컨대 페그비소만트 (소마베르트(SOMAVERT)®)는, 예를 들어 말단비대증을 치료하기 위한 약물로 사용하기 위해 개발되었다 (문헌 [Kopchick et al., 2002]).

비정상적으로 높은 GH 수준은 다수의 장애와 연관되어 왔다. GH의 높은 수준에 의해 직접적으로 유발되는 2종의 고전적 장애는 말단비대증 및 거인증이다. 말단비대증과 연관된 변화는 체모가 거칠어지는 것, 피부가 두꺼워지고 어두워지는 것, 환자가 과도한 발한 및 악취성 체취를 빈번히 호소하게 하는 피지선 및 한선의 비대 및 과다활성, 하악골의 과도성장, 낮은 음성을 유발하는 후두의 연골성 증식, 및 혀의 비대를 포함한다. 또한, 이들 환자에서의 과량의 GH는 괴사 및 미란을 겪을 수 있는 관절 연골의 증식, 및 말초 신경병증을 유발하는 신경내 섬유성 증식을 일으킨다. 과량의 GH는 또한 포스페이트의 세뇨관 재흡수를 증가시켜 경도 고인산혈증을 유발한다. 이들 증상 중 다수는 거인증을 앓는 환자에서도 또한 나타난다.

말단비대증 및 거인증에 대한 최신 치료는 전형적으로 뇌하수체의 파괴 또는 약물 치료를 통해 혈장 및/또는 조직 중 IGF-1 수준을 저하시키는 것을 목표로 한다. GH-매개 장애, 예컨대 말단비대증 및 거인증에서의 IGF-1의 역할은 널리 인지되어 있다. 문헌 [Melmed et al., 1994, Amer. J. Med. 97:468-473].

말단비대증 및 거인증에 대한 최신 치료는 뇌하수체 절제, 방사선 치료, 브로모크립틴 메실레이트, 소마토스타틴 유사체 및 페그비소만트를 포함한다. 뇌하수체 절제는 외과적 절차이며, 임의의 외과적 절차와 같이 사망률을 비롯한 합병증의 상당한 위험과 연관되어 있다. 뇌하수체의 방사선 치료와 연관된 위험도 또한 마찬가지로 존재한다. 또한, 방사선 치료의 효능은 수년 동안 지연될 수 있다. 추가로, 이들 치료 양식은 GH를 생산하는 뇌하수체의 해당 부분에 대해 특이적이지 않으며, 인접 조직에도 마찬가지로 유해한 영향을 미칠 수 있다. 브로모크립틴 메실레이트는 GH의 생산을 저해하는 도파민 유사 약물이다. 최근, 장기간-작용 소마토스타틴 유사체인 옥트레오티드가 또한 수술, 방사선 및/또는 브로모크립틴 메실레이트에 불응성인 말단비대증 및 거인증을 앓는 환자를 치료하는데 사용되어 왔다. 소마토스타틴 유사체는 장기적으로 인슐린 분비를 억제하며, 인슐린 저항성, 인슐린 분비 장애 및 당뇨병의 위험 증가와 연관되어 있다. 문헌 [Baldelli et al., 2003, Clin. Endocrinol. (Oxf). 59(4):492-499]. 페그비소만트는 재조합적으로 생산된 PEG화 인간 GH 유사체를 포함하는 GH 길항제이다. 페그비소만트로의 치료는 현재 매일 피하로 투여하는 것을 포함한다.

항-인간 GHR 항체가 기재된 바 있을지라도, 인간 및 비-인간 영장류 GHR 둘 다에 특이적으로 결합하고, 높은 친화도를 갖고, 높은 특이성을 가지며, 강력한 길항 활성을 갖는 모노클로날 항체를 확인하기는 어려웠다.

비-인간 영장류 GHR에도 또한 특이적으로 결합하는 인간 GHR에 대한 고친화도 길항 항체는 탁월한 치료제를 만들어낼 것이다. 시노몰구스 원숭이 GHR에 대한 결합과 커플링된 고친화도 결합은 인슐린 분비에 영향을 미치지 않으면서 페그비소만트와 비교시 감소된 투여 빈도를 갖는 치료제를 생성하며, 이는 영장류에서의 이들 결합 도메인의 안전성, 활성 및/또는 약동학적 프로파일의 전임상 평가에 사용될 수 있고, 동일한 형태로 인간에서 약물로서 사용될 수도 있다. 본 발명은 인간 GHR과 선택적으로 상호작용하고 그 기능을 억제하며, 또한 시노몰구스 원숭이 GHR에 특이적으로 결합하는 길항제 항체에 관한 것이다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 GHR과 상호작용하며, 개체에게 투여될 때 개체의 혈장 및/또는 조직 중 IGF-1 수준을 저하시키는 단리된 길항제 항체를 제공한다. 항체는, 예를 들어 모노클로날 항체 또는 인간, 인간화 또는 키메라 항체일 수 있다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 인간 및 시노몰구스 원숭이 GHR에 특이적으로 결합하며, 대상체에게 투여될 때 상기 대상체의 혈중 IGF-1 수준을 저하시키는 단리된 GHR 길항제 항체를 제공한다.

일부 실시양태에서, GHR 길항제 항체는 인간 GHR에의 결합에 대해 모노클로날 항체 SS1과 경쟁하는 항원 결합 영역을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, GHR 길항제 항체는 모노클로날 항체 SS1에 의해 인식되는 인간 GHR 상의 에피토프와 동일하거나 또는 중첩되는 에피토프를 인식할 수 있다. 일부 실시양태에서, GHR 길항제 항체는 약 10 nM 미만의 평형 해리 상수로 인간 GHR에 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 항체는 약 250 nM 미만, 약 100 nM 미만, 또는 약 10 nM 미만의 평형 해리 상수로 인간 GHR에 결합할 수 있다.

일부 실시양태에서, GHR 길항제 항체는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 GHR에 특이적으로 결합하며, 서열 1, 15 또는 16의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) 상보성 결정 영역 1 (CDR1), 서열 114 또는 115의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 서열 118의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3, 서열 99의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL) CDR1, 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열 106의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 단리된 GHR 길항제 항체를 제공한다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 성장 호르몬 수용체 (GHR)에 특이적으로 결합하며, 서열 8의 VH 서열의 VH 상보성 결정 영역 1 (CDR1), VH CDR2 및 VH CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH); 및 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하는 단리된 GHR 길항제 항체를 제공한다.

일부 실시양태에서, VL은 서열 7의 VL 서열의 CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3을 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 항체는 서열 1, 15 또는 16의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR1, 서열 2 또는 17의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 서열 3의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3, 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR1, 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열 6의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 항체는 서열 8의 아미노산 서열, 또는 CDR 내에 있지 않은 잔기에 1개 또는 여러 개의 보존적 아미노산 치환을 갖는 그의 변이체를 포함하는 VH, 및 서열 7의 아미노산 서열, 또는 CDR 내에 있지 않은 아미노산에 1개 또는 여러 개의 아미노산 치환을 갖는 그의 변이체를 포함하는 VL을 포함할 수 있다.

일부 실시양태에서, 항체는 면역학적으로 불활성인 불변 영역을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체는 IgG₂, IgG_{2Δ a}, IgG₄, IgG_{4Δ b}, IgG_4Δc, IgG₄ S228P, IgG_{4Δ b} S228P 및 IgG_{4Δ c} S228P로 이루어진 군으로부터 선택되는 이소형을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 불변 영역은 비-글리코실화 Fc일 수 있다.

일부 실시양태에서, 항체는 서열 134 또는 133의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열 135의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함할 수 있다.

본 발명은 또한 본원에 기재된 임의의 GHR 길항제 항체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 본원에 기재된 임의의 GHR 길항제 항체를 재조합적으로 생산하는 세포주를 제공한다.

본 발명은 또한 본원에 기재된 임의의 GHR 길항제 항체를 코딩하는 핵산을 제공한다. 본 발명은 또한 본원에 기재된 임의의 GHR 길항제 항체의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산을 제공한다.

본 발명은 또한 유효량의 본원에 기재된 임의의 GHR 길항제 항체를 포함하는 키트를 제공한다.

또한, 인간 및 시노몰구스 원숭이 GHR에 특이적으로 결합하는 항체를 확인하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 방법은 인간 GHR에 특이적으로 결합하는 항체를 서열 145의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드와 접촉시키고, 폴리펩티드에 대한 항체의 결합을 결정하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 서열 145의 아미노산 서열에 특이적으로 결합하는 항체를 선택하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 결합의 결정은, 예를 들어 ELISA, 바이오센서 또는 친화도 칼럼을 이용하여 수행될 수 있다.

또한, 혈중 인슐린-유사 성장 인자-1 (IGF-1) 수준의 감소를 필요로 하는 개체에게 치료 유효량의 본원에 기재된 임의의 GHR 길항제 항체를 투여하는 것을 포함하는, 상기 개체의 혈중 인슐린-유사 성장 인자-1 (IGF-1)의 수준을 감소시키는 방법이 제공된다. 또한, 혈중 IGF-1 수준의 감소를 필요로 하는 개체의 혈중 IGF-1 수준을 감소시키는데 사용하기 위한 GHR 길항제 항체가 제공된다. 일부 실시양태에서, IGF-1의 수준은 투여 전의 IGF-1 수준과 비교시 적어도 약 40% 감소된다. 일부 실시양태에서, IGF-1의 수준은 투여 전의 IGF-1 수준과 비교시 적어도 약 60% 감소된다.

일부 실시양태에서, GHR 길항제 항체는 비경구로 투여될 수 있다.

또한, 과도한 IGF-1 발현과 연관된 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 본원에 기재된 임의의 GHR 길항제 항체를 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 과도한 IGF-1 발현과 연관된 질환을 치료하는 방법이 제공된다. 또한, 과량의 IGF-1과 연관된 질환의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 GHR 길항제 항체가 제공된다. 일부 실시양태에서, 질환은 말단비대증이다. 일부 실시양태에서, 질환은 거인증이다. 일부 실시양태에서, 질환은 당뇨병성 신병증이다. 일부 실시양태에서, 질환은 관절염이다. 일부 실시양태에서, 질환은 폐 염증이다.

일부 실시양태에서, 질환은 암이다. 일부 실시양태에서, 암은 방광암, 유방암, 자궁경부암, 결장암, 위암, 교모세포종, 두경부암, 신장암, 구강암, 난소암, 췌장암, 전립선암, 피부암, 백혈병, 림프종 및 다발성 골수종으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 피부암은, 예를 들어 흑색종일 수 있다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 종양 성장 또는 진행의 억제를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 본원에 기재된 임의의 GHR 길항제 항체를 투여하는 것을 포함하는, 종양을 앓는 개체에서 종양 성장 또는 진행을 억제하는 방법을 제공한다. 또한, 종양을 앓는 개체에서 종양 성장 또는 진행을 억제하는데 사용하기 위한 GHR 길항제 항체가 제공된다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 암 세포의 전이의 억제를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 본원에 기재된 임의의 GHR 길항제 항체를 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 암 세포의 전이를 억제하는 방법을 제공한다. 또한, 암 세포의 전이를 억제하는데 사용하기 위한 GHR 길항제 항체가 제공된다.

일부 실시양태에서, 본 발명은 종양 퇴행의 유도를 필요로 하는 대상체에게 본원에 기재된 임의의 GHR 길항제 항체를 투여하는 것을 포함하는, 종양을 앓는 개체에서 종양 퇴행을 유도하는 방법을 제공한다. 또한, 종양 퇴행을 유도하는데 사용하기 위한 GHR 길항제 항체가 제공된다.

본 발명은 GH와의 상호작용을 비롯한 세포외 GHR의 기능에 대해 길항작용을 하는 항체, 펩티드 및 압타머에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 길항제 GHR 항체를 제조하는 방법, 이들 항체를 포함하는 조성물, 및 이들 항체를 의약으로서 사용하는 방법에 관한 것이다. 길항제 GHR 항체는 혈장 IGF-1 수준을 저하시키는데 사용될 수 있으며, 예를 들어 거인증, 말단비대증, 당뇨병성 신병증, 관절염, 폐 염증 및 특정 암을 비롯한 GH-관련 장애의 예방 및/또는 치료에 사용될 수 있다.

일반적 기술

본 발명의 실시는, 달리 나타내지 않는 한 당업계 기술범위 내에 있는 분자 생물학 (재조합 기술 포함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학 및 면역학의 통상의 기술을 이용할 것이다. 이러한 기술은 다음과 같은 문헌에 상세하게 설명되어 있다: 문헌 [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook et al., 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., 1993-1998) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C.A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practical approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J.D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995)].

정의

하기 용어는, 달리 나타내지 않는 한, 하기 의미를 갖는 것으로 이해될 것이다: 용어 "단리된 분자" (분자는, 예를 들어 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 또는 항체임)는 그의 유래 기원 또는 공급원에 의해 (1) 그의 천연 상태에서 동반되는 자연적으로 회합되는 성분과 회합되지 않거나, (2) 동일한 종으로부터의 다른 분자가 실질적으로 없거나, (3) 상이한 종으로부터의 세포에 의해 발현되거나, 또는 (4) 천연에서 발생하지 않는 분자이다. 따라서, 화학적으로 합성되거나, 또는 자신이 자연적으로 유래되는 세포와 상이한 세포 시스템에서 합성되는 분자는 자신의 자연적으로 회합되는 성분으로부터 "단리"될 것이다. 당업계에 널리 공지된 정제 기술을 이용하여, 단리에 의해 자연적으로 회합된 성분이 분자에 실질적으로 없게 할 수 있다. 당업계에 널리 공지된 다수의 수단에 의해 분자 순도 또는 균질성을 검정할 수 있다. 예를 들어, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 이용하고 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 폴리펩티드를 가시화하도록 겔을 염색하여 폴리펩티드 샘플의 순도를 검정할 수 있다. 특정 목적을 위해, HPLC 또는 정제를 위해 당업계에 널리 공지된 다른 수단을 이용함으로써 보다 고도의 분할이 제공될 수 있다.

"항체"는 이뮤노글로불린 분자의 가변 영역에 위치하는 적어도 1개의 항원 인식 부위를 통해 표적, 예컨대 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, 지질, 폴리펩티드 등에 특이적으로 결합할 수 있는 이뮤노글로불린 분자이다. 본원에 사용된 상기 용어는 무손상 폴리클로날 또는 모노클로날 항체, 뿐만 아니라 달리 명시되지 않는 한, 특이적 결합에 대해 무손상 항체와 경쟁하는 그의 임의의 항원 결합 부분, 달리 명시되지 않는 한, 항원 결합 부분을 포함하는 융합 단백질, 및 항원 인식 부위를 포함하는 임의의 다른 변형된 형상의 이뮤노글로불린 분자를 포괄한다. 항원 결합 부분은, 예를 들어 비제한적으로 Fab, Fab', F(ab')₂, Fd, Fv, 도메인 항체 (dAb, 예를 들어 상어 및 낙타류 항체), 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하는 단편, 단일 쇄 가변 단편 항체 (ScFv), 맥시바디, 미니바디, 인트라바디, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, v-NAR 및 비스-scFv, 및 적어도 폴리펩티드에 특이적 항원 결합을 부여하기에 충분한 이뮤노글로불린의 일부분을 함유하는 폴리펩티드를 포함한다. 항체는 임의의 부류의 항체, 예컨대 IgG, IgA 또는 IgM (또는 그의 하위부류)을 포함하며, 항체가 임의의 특정한 부류일 필요는 없다. 항체의 중쇄의 불변 영역의 아미노산 서열에 따라, 이뮤노글로불린은 상이한 부류로 배정될 수 있다. 5가지 주요 부류의 이뮤노글로불린: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 존재하고, 이들 중 몇몇은 하위부류 (이소형), 예를 들어 IgG₁, IgG₂, IgG₃, IgG₄, IgA₁ 및 IgA₂로 추가로 분류될 수 있다. 이뮤노글로불린의 상이한 부류에 상응하는 중쇄 불변 영역은 각각 알파, 델타, 엡실론, 감마 및 뮤로 지칭된다. 상이한 부류의 이뮤노글로불린의 서브유닛 구조 및 3차원 형상은 널리 공지되어 있다.

항체의 "가변 영역"은 단독 또는 조합된 항체 경쇄의 가변 영역 또는 항체 중쇄의 가변 영역을 지칭한다. 당업계에 공지된 바와 같이, 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 각각 초가변 영역으로도 또한 공지된 3개의 상보성 결정 영역 (CDR)에 의해 연결되어 있는 4개의 프레임워크 영역 (FR)으로 구성되고, 이는 항체의 항원 결합 부위를 형성하는데 기여한다. 대상 가변 영역의 변이체가 바람직한 경우에, 특히 CDR 영역 외부 (즉, 프레임워크 영역 내)에 아미노산 잔기 치환을 갖는 것이 바람직한 경우에, 대상 가변 영역과 동일한 정규 부류 중 CDR1 및 CDR2 서열을 포함하는 다른 항체의 가변 영역과 대상 가변 영역을 비교함으로써 적절한 아미노산 치환, 바람직하게는 보존적 아미노산 치환을 확인할 수 있다 (문헌 [Chothia and Lesk, J Mol Biol 196(4): 901-917, 1987]).

당업계에 공지된 바와 같이, 항체의 "불변 영역"은 단독 또는 조합된 항체 경쇄의 불변 영역 또는 항체 중쇄의 불변 영역을 지칭한다.

가변 도메인의 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"은 카바트(Kabat) 정의, 코티아(Chothia) 정의, 카바트 및 코티아 둘 다의 누적 정의, 확장형, AbM, 접촉 및/또는 입체형태적 정의 또는 당업계에 널리 공지된 임의의 CDR 결정 방법에 따라 확인되는 가변 영역 내의 아미노산 잔기이다. 항체 CDR은 카바트 등에 의해 최초로 정의된 초가변 영역으로서 확인될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Kabat et al., 1992, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, NIH, Washington D.C.]을 참조한다. CDR의 위치는 또한 코티아 등에 의해 최초로 기재된 루프 구조로서 확인될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Chothia et al., 1989, Nature 342:877-883]을 참조한다. CDR을 확인하는 다른 접근법으로는 카바트와 코티아의 절충안으로서, 옥스포드 몰레큘라(Oxford Molecular)의 AbM 항체 모델링 소프트웨어 (현재 엑셀리스(Accelrys)®)를 이용하여 유도된 "AbM 정의", 또는 문헌 [MacCallum et al., 1996, J. Mol. Biol., 262:732-745]에 제시되어 있는, 관찰된 항원 접촉에 기초한 CDR의 "접촉 정의"를 포함한다. 본원에서 CDR의 "입체형태적 정의"로 지칭되는 또 다른 접근법에서, CDR의 위치는 엔탈피에 의해 항원 결합에 기여하는 잔기로서 확인될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Makabe et al., 2008, Journal of Biological Chemistry, 283:1156-1166]을 참조한다. 또 다른 CDR 경계 정의는 상기 접근법 중 하나를 엄격히 따르지 않을 수 있고, 그럼에도 불구하고, 이들이 특정한 잔기 또는 잔기의 군이 항원 결합에 유의하게 영향을 미치지 않는다는 예측 또는 실험적 발견에 비추어 보다 짧아지거나 보다 길어질 수 있을지라도, 적어도 카바트 CDR의 일부와 중첩될 것이다. 본원에 사용된 CDR은 접근법의 조합을 비롯하여 당업계에 공지된 임의의 접근법에 의해 정의된 CDR을 지칭할 수 있다. 본원에서 사용되는 방법은 이들 접근법 중 임의의 것에 따라 정의된 CDR을 활용할 수 있다. 1개 초과의 CDR을 함유하는 임의의 주어진 실시양태의 경우에, CDR은 카바트, 코티아, 확장형, AbM, 접촉 및/또는 입체형태적 정의 중 임의의 것에 따라 정의될 수 있다.

용어 "모노클로날 항체" (Mab)는 그를 제조하는 방법이 아닌, 예를 들어 임의의 진핵, 원핵 또는 파지 클론을 비롯하여 단일 카피 또는 클론으로부터 유래된 항체를 지칭한다. 바람직하게는, 본 발명의 모노클로날 항체는 동종이거나 또는 실질적으로 동종인 집단으로 존재한다.

본원에 사용된 "인간화" 항체는 비-인간 이뮤노글로불린으로부터 유래된 최소한의 서열을 함유하는 키메라 이뮤노글로불린, 이뮤노글로불린 쇄, 또는 그의 단편 (예컨대, Fv, Fab, Fab', F(ab')₂ 또는 항원의 다른 항원-결합 하위서열)인, 비-인간 (예를 들어, 뮤린) 항체 형태를 지칭한다. 바람직하게는, 인간화 항체는 수용자의 CDR로부터의 잔기가 목적하는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 비-인간 종 (공여자 항체), 예컨대 마우스, 래트 또는 토끼의 CDR로부터의 잔기에 의해 대체된 인간 이뮤노글로불린 (수용자 항체)을 포함한다.

"인간 항체"는 인간에 의해 생산된 항체의 것에 상응하는 아미노산 서열을 보유하고/거나 본원에 개시된 바와 같은 인간 항체의 제조 기술 중 임의의 것을 이용하여 제조된 것이다. 인간 항체의 상기 정의는 구체적으로 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화 항체를 배제한다.

용어 "키메라 항체"는 가변 영역 서열이 하나의 종으로부터 유래되고 불변 영역 서열은 또 다른 종으로부터 유래된 항체, 예컨대 가변 영역 서열은 마우스 항체로부터 유래되고 불변 영역 서열은 인간 항체로부터 유래된 항체를 지칭하는 것으로 의도된다.

용어 "에피토프"는 하나 이상의 항체의 항원-결합 영역에서 항체에 의해 인식되고, 항체에 의해 결합이 이루어질 수 있는 분자의 일부를 지칭한다. 에피토프는 대개 분자, 예컨대 아미노산 또는 당 측쇄의 표면 그룹화로 이루어져 있고, 특정의 3차원 구조적 특성 뿐만 아니라 특정의 전하 특성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 에피토프는 단백질 에피토프일 수 있다. 단백질 에피토프는 선형 또는 입체형태적일 수 있다. 선형 에피토프에 있어서, 단백질 및 상호작용하는 분자 (예컨대, 항체) 사이의 모든 상호작용 지점은 상기 단백질의 1차 아미노산 서열을 따라 선형적으로 존재한다. "비선형 에피토프" 또는 "입체형태적 에피토프"는 에피토프에 특이적인 항체가 결합하는 항원성 단백질 내의 불연속 폴리펩티드 (또는 아미노산)를 포함한다. 본원에 사용된 용어 "항원성 에피토프"는 당업계에 널리 공지된 임의의 방법, 예를 들어 통상의 면역검정에 의해 측정시, 항체가 특이적으로 결합할 수 있는 폴리펩티드의 일부로서 정의된다. 항원 상의 목적 에피토프가 결정되면, 예를 들어 본 발명에 기재된 기술을 이용하여 그 에피토프에 대한 항체를 생성할 수 있다. 다르게는, 발견 과정 동안, 항체의 생성 및 특성화에 의해 바람직한 에피토프에 대한 정보를 도출할 수 있다. 이어서, 이러한 정보로부터, 동일한 에피토프에의 결합에 대해 항체들을 경쟁적으로 스크리닝할 수 있다. 이를 달성하기 위한 접근법은 GHR에의 결합에 대해 서로 경쟁 또는 교차-경쟁하는 항체, 예를 들어 항원에의 결합에 대해 경쟁하는 항체를 발견하기 위한 경쟁 및 교차-경쟁 연구를 수행하는 것이다.

본원에 사용된 용어 "GHR"는 임의의 형태의 GHR, 및 GHR의 활성 중 적어도 일부를 보유하는 그의 변이체를 지칭한다. 인간 GHR에 대한 구체적인 언급에 의한 것과 같이 달리 나타내지 않는 한, GHR은 포유동물 종, 예를 들어 인간, 개, 고양이, 말 및 소의 모든 천연 서열의 GHR을 포함한다. 한 예시적인 GHR은 진뱅크 등록 번호 AAA52555 (서열 140)로서 찾아볼 수 있다.

본원에 사용된 "GHR 길항제 항체"는 GHR 신호전달에 의해 매개되는 GHR 생물학적 활성 및/또는 하류 경로(들)를 억제할 수 있는 항체를 지칭한다. GHR 길항제 항체는 GHR 생물학적 활성, 예컨대 GHR 신호전달에 의해 매개되는 하류 경로, 예컨대 GH 상호작용 및/또는 GH에 대한 세포 반응의 유도를 (유의한 정도를 포함하는 임의의 정도로) 차단하거나, 길항작용을 하거나, 저해하거나 또는 감소시키는 항체를 포괄한다. 본 발명의 목적상, 용어 "GHR 길항제 항체"는 GHR 자체, GHR 생물학적 활성 (임의의 측면의 인슐린-유사 성장 인자-1 (IGF-1) 발현을 매개하는 그의 능력을 포함하지만 이에 제한되지는 않음), 또는 생물학적 활성의 결과가 임의의 의미있는 정도로 실질적으로 무효화되거나, 감소되거나 또는 중화되는 것인, 모든 앞서 확인된 용어, 제목 및 기능적 상태 및 특성을 포괄하는 것으로 명확하게 이해될 것이다. 일부 실시양태에서, GHR 길항제 항체는 GHR에 결합하여 GH와의 상호작용을 방지한다. 일부 실시양태에서, GHR 길항제 항체는 GHR에 결합하여 GHR 이량체화를 방지한다. GHR 길항제 항체의 예는 본원에 제공되어 있다.

본원에 사용된 용어 "임상적으로 의미있는"은 인간에서는 혈청 IGF-1 수준의 적어도 15% 감소, 또는 마우스에서는 총 혈청 IGF-1의 적어도 15% 감소를 의미한다. 혈장 또는 혈청 중의 측정치가 혈중 수준의 측정치에 대한 대용값으로 기능할 수 있음이 명백하다.

용어 "폴리펩티드", "올리고펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 바람직하게는 비교적 짧은 (예를 들어, 10-100개 아미노산) 임의의 길이의 아미노산 쇄를 지칭하기 위해 본원에서 상호호환적으로 사용된다. 쇄는 선형 또는 분지형일 수 있고, 이것은 변형된 아미노산을 포함할 수 있고/거나, 비-아미노산에 의해 중단될 수 있다. 상기 용어는 또한 자연적으로 또는 개재에 의해 변형된 아미노산 쇄를 포괄한다 (예를 들어, 디술피드 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 임의의 다른 조작 또는 변형, 예컨대 표지 성분과의 접합). 또한 상기 정의에는, 예를 들어 하나 이상의 아미노산 유사체 (예를 들어, 비천연 아미노산 등 포함) 뿐만 아니라 당업계에 공지된 다른 변형을 함유하는 폴리펩티드가 포함된다. 폴리펩티드는 단일 쇄 또는 회합된 쇄로서 발생할 수 있는 것으로 이해된다.

당업계에 공지된 바와 같이, 본원에서 상호호환적으로 사용되는 "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 임의의 길이의 뉴클레오티드 쇄를 지칭하며, DNA 및 RNA를 포함한다. 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 변형된 뉴클레오티드 또는 염기 및/또는 그의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 폴리머라제에 의해 쇄 내로 혼입될 수 있는 임의의 기질일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드, 예컨대 메틸화 뉴클레오티드 및 그의 유사체를 포함할 수 있다. 뉴클레오티드 구조에 대한 변형이 존재하는 경우에, 이러한 변형은 쇄의 어셈블리 전에 또는 후에 부여될 수 있다. 뉴클레오티드의 서열은 비-뉴클레오티드 성분에 의해 중단될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는, 예컨대 표지 성분과의 접합에 의해, 중합 후에 추가로 변형될 수 있다. 다른 유형의 변형은, 예를 들어 "캡", 1개 이상의 자연 발생 뉴클레오티드의 유사체로의 치환, 뉴클레오티드간 변형, 예컨대 예를 들어 비하전된 연결을 갖는 것 (예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포아미데이트, 카르바메이트 등) 및 하전된 연결을 갖는 것 (예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등), 펜던트 모이어티, 예를 들어 단백질 (예를 들어, 뉴클레아제, 독소, 항체, 신호 펩티드, 폴리-L-리신 등)을 함유하는 것, 인터칼레이터 (예를 들어, 아크리딘, 프소랄렌 등)가 있는 것, 킬레이트화제 (예를 들어, 금속, 방사성 금속, 붕소, 산화성 금속 등)를 함유하는 것, 알킬화제를 함유하는 것, 변형된 연결이 있는 것 (예를 들어, 알파 아노머 핵산 등), 뿐만 아니라 비변형된 형태의 폴리뉴클레오티드(들)를 포함한다. 추가로, 당에 본래 존재하는 임의의 히드록실 기는, 예를 들어 포스포네이트 기, 포스페이트 기에 의해 대체되거나, 표준 보호기에 의해 보호되거나, 또는 추가의 뉴클레오티드에 대한 추가의 연결을 제조하기 위해 활성화될 수 있거나, 또는 고체 지지체에 접합될 수 있다. 5' 및 3' 말단 OH가 인산화되거나 또는 아민 또는 1 내지 20개의 탄소 원자의 유기 캡핑 기 모이어티로 치환될 수 있다. 다른 히드록실이 또한 표준 보호기로 유도체화될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 또한, 예를 들어 2'-O-메틸-, 2'-O-알릴, 2'-플루오로- 또는 2'-아지도-리보스, 카르보시클릭 당 유사체, 알파- 또는 베타-아노머 당, 에피머 당, 예컨대 아라비노스, 크실로스 또는 릭소스, 피라노스 당, 푸라노스 당, 세도헵툴로스, 비-시클릭 유사체 및 무염기성 뉴클레오시드 유사체, 예컨대 메틸 리보시드를 비롯하여, 일반적으로 당업계에 공지된 유사한 형태의 리보스 또는 데옥시리보스 당을 함유할 수 있다. 1개 이상의 포스포디에스테르 연결이 대안적인 연결 기로 대체될 수 있다. 이러한 대안적인 연결 기는 포스페이트가 P(O)S ("티오에이트"), P(S)S ("디티오에이트"), (O)NR₂ ("아미데이트"), P(O)R, P(O)OR', CO 또는 CH₂ ("포름아세탈")로 대체된 실시양태를 포함하지만 이에 제한되지는 않으며, 여기서 각각의 R 또는 R'는 독립적으로 H 또는 임의로 에테르 (-O-) 연결을 함유하는 치환되거나 비치환된 알킬 (1-20 C), 아릴, 알케닐, 시클로알킬, 시클로알케닐 또는 아르알킬이다. 폴리뉴클레오티드 내의 모든 연결이 동일할 필요는 없다. 상기 기재는 RNA 및 DNA를 비롯하여 본원에서 언급되는 모든 폴리뉴클레오티드에 적용된다.

본원에 사용된 항체는 본원에서 실시예 2에 개시된 방법에 의해 측정시 평형 해리 상수가 20 nM 이하, 바람직하게는 약 6 nM 미만, 보다 바람직하게는 약 1 nM 미만, 가장 바람직하게는 약 0.2 nM 미만인 경우에 GHR과 "상호작용한다".

에피토프에 "우선적으로 결합"하거나 "특이적으로 결합" (본원에서 상호호환적으로 사용됨)하는 항체는 당업계에서 널리 이해되는 용어이고, 이러한 특이적 또는 우선적 결합을 측정하는 방법도 또한 당업계에 널리 공지되어 있다. 대체 세포 또는 물질보다 특정한 세포 또는 물질과 보다 빈번하게, 보다 급속하게, 보다 큰 지속력으로, 및/또는 보다 큰 친화도로 반응하거나 회합하는 경우에, 분자는 "특이적 결합" 또는 "우선적 결합"을 나타내는 것으로 언급된다. 항체는 다른 물질에 결합하는 것보다 큰 친화도, 결합력으로, 보다 용이하게, 및/또는 보다 큰 지속력으로 결합하는 경우에, 표적에 "특이적으로 결합"하거나 "우선적으로 결합"한다. 예를 들어, GHR 에피토프에 특이적으로 또는 우선적으로 결합하는 항체는 다른 GHR 에피토프 또는 비-GHR 에피토프와의 결합에 비해 이 에피토프에 보다 큰 친화도, 결합력으로, 보다 용이하게 및/또는 보다 큰 지속력으로 결합하는 항체이다. 또한, 상기 정의는, 예를 들어 제1 표적에 특이적으로 또는 우선적으로 결합하는 항체 (또는 잔기 또는 에피토프)는 제2 표적에 특이적으로 또는 우선적으로 결합할 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다는 것으로 해석되는 것으로 이해된다. 따라서, "특이적 결합" 또는 "우선적 결합"은 배타적 결합을 (포함할 수는 있지만) 반드시 필요로 하지는 않는다. 일반적으로, 반드시 그러한 것은 아니지만, 결합에 대한 언급은 우선적 결합을 의미한다.

본원에 사용된 "실질적으로 순수한"은 적어도 50% 순수한 (즉, 오염물 없음), 보다 바람직하게는 적어도 90% 순수한, 보다 바람직하게는 적어도 95% 순수한, 보다 더 바람직하게는 적어도 98% 순수한, 가장 바람직하게는 적어도 99% 순수한 물질을 지칭한다.

"숙주 세포"는 폴리뉴클레오티드 삽입물의 도입을 위한 벡터(들)의 수용자일 수 있거나 수용자였던 개별 세포 또는 세포 배양물을 포함한다. 숙주 세포는 단일 숙주 세포의 자손을 포함하고, 상기 자손은 자연적, 우연적 또는 계획적인 돌연변이로 인해 반드시 본래 모 세포와 완전하게 동일 (형태적으로 또는 게놈 DNA 상보성에서)할 필요는 없을 수 있다. 숙주 세포는 본 발명의 폴리뉴클레오티드(들)로 생체내 형질감염된 세포를 포함한다.

당업계에 공지된 바와 같이, 용어 "Fc 영역"은 이뮤노글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하기 위해 사용된다. "Fc 영역"은 천연 서열 Fc 영역 또는 변이체 Fc 영역일 수 있다. 이뮤노글로불린 중쇄의 Fc 영역의 경계는 달라질 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 일반적으로 위치 Cys226에서의 아미노산 잔기로부터, 또는 Pro230으로부터 그의 카르복실-말단까지의 범위로 경계지어진다. Fc 영역 내 잔기의 넘버링은 카바트에서와 같이 EU 인덱스의 넘버링이다. 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991]. 이뮤노글로불린의 Fc 영역은 일반적으로 2개의 불변 도메인, CH2 및 CH3을 포함한다. 당업계에 공지되어 있는 바와 같이, Fc 영역은 이량체 또는 단량체 형태로 존재할 수 있다. 당업계에 공지되어 있는 바와 같이, Fc 영역은 이량체 또는 단량체 형태로 존재할 수 있다.

당업계에 사용된 바와 같이, "Fc 수용체" 및 "FcR"은 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 기재한다. 바람직한 FcR은 천연 서열 인간 FcR이다. 추가로, 바람직한 FcR은 IgG 항체에 결합하는 것 (감마 수용체)이고, 이러한 수용체의 대립유전자 변이체 및 선택적으로 스플라이싱된 형태를 비롯하여 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII 하위부류의 수용체를 포함한다. FcγRII 수용체는 FcγRIIA ("활성화 수용체") 및 FcγRIIB ("억제 수용체")를 포함하며, 이들은 주로 그의 세포질 도메인에서 차이가 나는 유사한 아미노산 서열을 갖는다. FcR은 문헌 [Ravetch and Kinet, 1991, Ann. Rev. Immunol., 9:457-92; Capel et al., 1994, Immunomethods, 4:25-34; 및 de Haas et al., 1995, J. Lab. Clin. Med., 126:330-41]에 리뷰되어 있다. "FcR"은 또한 신생아 수용체 FcRn을 포함하는데, 이는 모계 IgG의 태아로의 전달을 담당한다 ([Guyer et al., 1976, J. Immunol., 117:587; 및 Kim et al., 1994, J. Immunol., 24:249]).

항체와 관련하여 본원에 사용된 용어 "경쟁하다"는 제1 항체 또는 그의 항원-결합 부분이 제2 항체 또는 그의 항원-결합 부분의 결합과 충분히 유사한 방식으로 에피토프에 결합하여, 상기 제1 항체와 그의 동족 에피토프의 결합이 제2 항체 부재 하의 제1 항체의 결합과 비교시 제2 항체의 존재 하에 검출가능하게 감소되는 것을 의미한다. 제2 항체가 그의 에피토프에 결합하는 것이 또한 제1 항체의 존재 하에 검출가능하게 감소되는 상황도 가능하지만, 반드시 그러할 필요는 없다. 즉, 제2 항체는 제1 항체가 그의 각각의 에피토프에 결합하는 것을 억제하지 않으면서 제1 항체는 제2 항체가 그의 에피토프에 결합하는 것을 억제할 수 있다. 그러나, 각각의 항체가 동일한 정도, 보다 큰 정도, 또는 보다 적은 정도의 여부와 상관없이 다른 항체와 그의 동족 에피토프 또는 리간드의 결합을 검출가능하게 억제하는 경우에, 이러한 항체들은 이들의 각각의 에피토프(들)의 결합에 대해 서로 "교차-경쟁"하는 것으로 언급된다. 경쟁 및 교차-경쟁 항체가 둘 다 본 발명에 포괄된다. 이러한 경쟁 또는 교차-경쟁이 일어나는 메카니즘 (예를 들어, 입체 장애, 입체형태 변화 또는 공통적인 에피토프 또는 그의 일부에 대한 결합)과는 상관없이, 당업자는 본원에 제공되는 교시에 기반하여 본원에 개시된 방법에 이러한 경쟁 및/또는 교차-경쟁 항체가 포괄되며 유용할 수 있음을 알 것이다.

"기능적 Fc 영역"은 천연 서열 Fc 영역의 적어도 하나의 이펙터 기능을 갖는다. 예시적인 "이펙터 기능"은 C1q 결합; 보체 의존성 세포독성; Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개 세포독성; 식세포작용; 세포 표면 수용체 (예를 들어, B 세포 수용체)의 하향-조절 등을 포함한다. 이러한 이펙터 기능에는 일반적으로 Fc 영역이 결합 도메인 (예를 들어, 항체 가변 도메인)과 조합될 것이 요구되고, 이러한 항체 이펙터 기능을 평가하기 위해 당업계에 공지된 다양한 검정을 이용하여 평가할 수 있다.

"천연 서열 Fc 영역"은 자연에서 발견되는 Fc 영역의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함한다. "변이체 Fc 영역"은 적어도 하나의 아미노산 변형으로 인해 천연 서열 Fc 영역의 아미노산과 상이하지만 천연 서열 Fc 영역의 적어도 하나의 이펙터 기능은 유지하는 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 변이체 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역 또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역과 비교시 1개 이상의 아미노산 치환, 예를 들어 약 1개 내지 약 10개의 아미노산 치환을 갖고, 바람직하게는 천연 서열 Fc 영역 또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역 내에 약 1개 내지 약 5개의 아미노산 치환을 갖는다. 본원에서의 변이체 Fc 영역은 바람직하게는 천연 서열 Fc 영역 및/또는 모 폴리펩티드의 Fc 영역과 적어도 약 80%의 서열 동일성, 가장 바람직하게는 이와 적어도 약 90%의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 이와 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%의 서열 동일성을 가질 것이다.

본원에 사용된 "치료"는 유익하거나 또는 목적하는 임상 결과를 얻기 위한 접근법이다. 본 발명의 목적상, 유익하거나 또는 목적하는 임상 결과는 하기 중 하나 이상을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다: 과도한 GH 생산으로부터 유래하는 이상 IGF-1 수준의 발생률 감소 또는 개선, 및 말단비대증, 거인증 또는 암의 하나 이상의 증상의 발생률 감소 또는 개선. GH의 과도한 생산은, 예를 들어 뇌하수체 선종, 또는 또 다른 비-뇌하수체 종양, 예컨대 폐, 췌장, 부신 또는 뇌의 다른 부분의 종양에 의해 유발된다.

"발생률 감소"는 중증도 감소 (이러한 상태에 일반적으로 사용되는 다른 약물 및/또는 요법의 필요성 및/또는 그의 양 (예를 들어, 그에 대한 노출)의 감소를 포함할 수 있음), 지속기간 감소 및/또는 빈도 감소 중 임의의 것을 의미한다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 개체는 치료에 대한 반응과 관련하여 다양할 수 있고, 따라서 예를 들어 "발생률을 감소시키는 방법"은 알파-독소 길항제 항체의 투여가 특정한 개체에서의 이러한 발생률 감소를 유발할 가능성이 있다는 합리적인 예상에 기반하여 이를 투여하는 것을 반영한다.

"개선"은 GHR 길항제 항체를 투여하지 않은 경우와 비교시 하나 이상의 증상이 감소되거나 개선된 것을 의미한다. "개선"은 또한 증상의 지속기간의 단축 또는 감소를 포함한다.

본원에 사용된 바와 같은, 약물, 화합물 또는 제약 조성물의 "유효 투여량" 또는 "유효량"은 임의의 하나 이상의 유익하거나 또는 목적하는 결과를 발생시키기에 충분한 양이다. 예방적 사용의 경우에, 유익하거나 또는 목적하는 결과는 위험의 제거 또는 감소, 중증도의 감소, 또는 질환 (질환의 생화학적, 조직학적 및/또는 거동적 증상, 질환의 발생 동안 나타나는 그의 합병증 및 중간 병적 표현형 포함)의 발생 지연을 포함한다. 치료적 사용의 경우에, 유익하거나 또는 목적하는 결과는 혈청 IGF-1 수준 또는 말단비대증, 거인증 또는 암의 하나 이상의 증상을 감소시키는 것, 상기 질환을 치료하는데 요구되는 다른 의약의 용량을 감소시키는 것, 또 다른 의약의 효과를 증진시키는 것, 및/또는 환자의 질환의 진행을 지연시키는 것과 같은 임상 결과를 포함한다. 유효 투여량은 1회 이상의 투여로 투여될 수 있다. 본 발명의 목적상, 약물, 화합물 또는 제약 조성물의 유효 투여량은 예방적 또는 치유적 치료를 직접적으로 또는 간접적으로 달성하기에 충분한 양이다. 임상적 문맥에서 이해되는 바와 같이, 약물, 화합물 또는 제약 조성물의 유효 투여량은 또 다른 약물, 화합물 또는 제약 조성물과 함께 달성되거나 달성되지 않을 수 있다. 따라서, "유효 투여량"은 하나 이상의 치료제의 투여와 관련하여 고려될 수 있고, 단일 작용제는 하나 이상의 다른 작용제와 관련하여 바람직한 결과가 달성될 수 있거나 달성된다면 유효량으로 주어진 것으로 간주될 수 있다.

"개체" 또는 "대상체"는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간이다. 포유동물은 또한 가축, 경주용 동물, 애완동물, 영장류, 말, 개, 고양이, 마우스 및 래트를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

본원에 사용된 "벡터"는 숙주 세포 내에 하나 이상의 관심 유전자(들) 또는 서열(들)을 전달할 수 있는, 바람직하게는 이를 발현시킬 수 있는 구축물을 의미한다. 벡터의 예는 바이러스 벡터, 네이키드 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 플라스미드, 코스미드 또는 파지 벡터, 양이온성 축합제와 회합된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 리포솜에 캡슐화된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 및 특정 진핵 세포, 예컨대 생산자 세포를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.

본원에 사용된 "발현 제어 서열"은 핵산의 전사를 지시하는 핵산 서열을 의미한다. 발현 제어 서열은 프로모터, 예컨대 구성적 또는 유도성 프로모터, 또는 인핸서일 수 있다. 발현 제어 서열은 전사될 핵산 서열에 작동가능하게 연결된다.

본원에 사용된 "제약상 허용되는 담체" 또는 "제약상 허용되는 부형제"는 활성 성분과 조합되는 경우에 상기 성분이 생물학적 활성을 보유하고 대상체의 면역계와 비-반응성이도록 하는 임의의 물질을 포함한다. 그 예는 표준 제약 담체, 예컨대 포스페이트 완충 염수 용액, 물, 에멀젼, 예컨대 수중유 에멀젼, 및 다양한 유형의 습윤제 중 임의의 것을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 에어로졸 또는 비경구 투여에 바람직한 희석제는 포스페이트 완충 염수 (PBS) 또는 통상의 (0.9%) 염수이다. 상기 담체를 포함하는 조성물은 널리 공지된 전형적인 방법에 의해 제제화된다 (예를 들어, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990; 및 Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing, 2000] 참조).

본원에 사용된 용어 "k_on"은 항원에 대한 항체의 결합에 대한 속도 상수를 지칭한다. 구체적으로, 속도 상수 (k_on 및 k_off) 및 평형 해리 상수는 전장 및/또는 Fab 항체 단편 (즉, 1가) 및 GHR을 사용하여 측정된다.

본원에 사용된 용어 "k_off"는 항체/항원 복합체로부터의 항체의 해리에 대한 속도 상수를 지칭한다.

본원에 사용된 용어 "K_D"는 항체-항원 상호작용의 평형 해리 상수를 지칭한다.

본원에서 "약" 값 또는 파라미터에 대한 언급은 그 값 또는 파라미터 자체에 대한 실시양태를 포함(하고 이를 기재)한다. 예를 들어, "약 X"를 언급하는 기재는 "X"의 기재를 포함한다. 수치 범위는 그 범위를 규정하는 숫자를 포함한다.

실시양태가 표현 "포함하는"을 사용하여 본원에 기재된 경우에, "~로 이루어진" 및/또는 "~로 본질적으로 이루어진"과 관련하여 기재된 다른 유사한 실시양태가 또한 제공되는 것으로 이해된다.

본 발명의 측면 또는 실시양태를 마쿠쉬 군 또는 다른 대안적 그룹화의 방법으로 기재한 경우에, 본 발명은 전체로서 열거한 전체 군 뿐만 아니라 군의 각 구성원을 개별적으로, 및 주요 군의 모든 가능한 하위군 뿐만 아니라 하나 이상의 군 구성원이 없는 주요 군을 포괄한다. 본 발명은 또한 본 발명의 특허청구범위에서 하나 이상의 임의의 군 구성원이 명시적으로 배제된 것도 고려한다.

달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 전문 과학 용어는 본 발명이 속하는 업계의 통상의 기술자가 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 상충되는 경우에, 정의를 비롯하여 본 명세서가 우선될 것이다. 본 명세서 및 특허청구범위 전반에 걸쳐, 용어 "포함하다", 또는 "포함한다" 또는 "포함하는"과 같은 변형은 언급된 정수 또는 정수 군을 포함하지만, 임의의 다른 정수 또는 정수 군은 배제시키지 않는다는 것을 의미하는 것으로 이해될 것이다. 문맥에서 달리 요구되지 않는 한, 단수의 용어는 복수를 포함할 것이고, 복수의 용어는 단수를 포함할 것이다. 용어 "예를 들어"에 이어지는 임의의 예(들)는 완전하거나 또는 제한적인 것으로 의도되지 않는다.

예시적인 방법 및 물질이 본원에 기재되어 있지만, 본원에 기재된 것과 유사하거나 동일한 방법 및 물질도 또한 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있다. 물질, 방법 및 예는 단지 예시적인 것이며 제한적인 것으로 의도되지 않는다.

과도한 IGF-1과 연관된 장애를 예방 또는 치료하는 방법

한 측면에서, 본 발명은 개체에게 유효량의 GHR 길항제 항체를 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 과도한 IGF-1과 연관된 장애의 적어도 하나의 증상을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 장애는 말단비대증이다. 다른 실시양태에서, 장애는 거인증이다. 다른 실시양태에서, 장애는 암이다.

일부 실시양태에서, 방법은 과도한 IGF-1과 연관된 질환에 대한 위험이 있는 개체를 확인하는 것을 포함할 수 있다. 추가로, 방법은 과도한 IGF-1과 연관된 질환에 대한 위험 인자에 대해 개체를 평가하거나, 과도한 IGF-1과 연관된 질환의 증상에 대해 개체를 평가하거나, 또는 과도한 IGF-1과 연관된 질환을 앓는 개체를 진단하는 것을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 방법은 질환이 말단비대증, 거인증 또는 암인 실시 단계를 포함할 수 있다.

유리하게는, 상기 항체의 치료적 투여는 보다 낮은 혈중 IGF-1을 유발한다. 바람직하게는, 혈중 IGF-1은 투여 전보다 적어도 약 10% 더 낮다. 보다 바람직하게는, 혈중 IGF-1은 항체의 투여 전보다 적어도 약 15% 더 낮다. 보다 바람직하게는, 혈중 IGF-1은 항체의 투여 전보다 적어도 약 20% 더 낮다. 보다 더 바람직하게는, 혈중 IGF-1은 항체의 투여 전보다 적어도 30% 더 낮다. 유리하게는, 혈중 IGF-1은 항체의 투여 전보다 적어도 40% 더 낮다. 보다 유리하게는, 혈중 IGF-1은 항체의 투여 전보다 적어도 50% 더 낮다. 매우 바람직하게는, 혈중 IGF-1은 항체의 투여 전보다 적어도 60% 더 낮다. 가장 바람직하게는, 혈중 IGF-1은 항체의 투여 전보다 적어도 70% 더 낮다.

일부 실시양태에서, GHR 길항제 항체의 치료적 투여는 유리하게는 말단비대증의 하나 이상의 증상, 예컨대 예를 들어 비제한적으로 과도한 IGF-1 수준, 다량의 발한, 악취성 체취, 두꺼워지는 피부, 어두워지는 피부, 지성 피부, 국소 피부 외성장 (피부 태그), 피로, 근육 약화, 비대된 성대 및 부비강 및/또는 후두의 연골성 증식으로 인한 낮은 음성, 중증 코골이, 수면 무호흡, 시각 장애, 두통, 비대된 혀, 요통, 관절에서의 통증, 관절에서의 제한된 운동성, 월경 주기 불규칙성, 감소된 성욕, 발기 기능장애, 비대된 손, 비대된 발, 보다 크고 넓어진 안면 특징, 하악의 돌출로 인해 하치가 상치 위로 연장되는 것 (주걱턱), 비대된 간, 비대된 심장, 비대된 신장, 비대된 비장, 증가된 흉부 크기 (술통형 가슴), 증가된 거친 체모, 음식 중 당의 부적절한 처리, 당뇨병, 고혈압, 증가된 소변 중 칼슘, 신장 결석, 담석, 갑상선의 종창 (갑상선종), 심장 질환, 관절염, 결장에서의 전암성 성장 (폴립), 손목 터널 증후군, 뇌하수체저하증, 자궁 유섬유종, 신경내 섬유성 증식에 기인한 말초 신경병증, 증식된 관절 연골의 괴사/미란, 고인산혈증 및 척수 압축의 발생률 감소 및/또는 개선을 일으킨다.

말단비대증을 앓고 있는 개체는 GHR 길항제 항체로 치료될 수 있다. GHR 길항제 항체 요법에 적합한 개체는 당업계에 널리 공지된 말단비대증의 임상 기준 및 예후 지시자를 사용하여 선택된다. 말단비대증의 진단 또는 평가는 당업계에 널리 확립되어 있다. 말단비대증 중증도의 평가는, 당업계에 공지된 시험, 예컨대 예를 들어 비제한적으로 혈중 IGF-1 수준의 측정, 경구 글루코스 시험접종 전후의 성장 호르몬의 측정, 및 뇌하수체 종양을 검출하기 위한 뇌의 자기 공명 영상화 (MRI)에 기반하여 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 말단비대증 및/또는 말단비대증의 증상의 개선, 제어, 발생률 감소, 또는 그의 발병 또는 진행의 지연은 혈중 IGF-1 수준을 시험함으로써 측정된다.

일부 실시양태에서, GHR 길항제 항체의 치료적 투여는 유리하게는 거인증의 하나 이상의 증상, 예컨대 예를 들어 비제한적으로 과도한 IGF-1 수준, 키의 과도한 성장, 과도한 근육 성장, 과도한 기관 성장, 지연된 사춘기, 복시, 주변시 곤란, 전두부 돌출, 돌출된 턱, 두통, 증가된 발한, 불규칙한 월경, 큰 손, 큰 발, 두꺼운 손가락, 두꺼운 발가락, 모유의 방출, 안면 특징의 두꺼워짐, 허약, 부신 기능부전, 요붕증, 생식선기능저하증 및 갑상선기능저하증의 발생률 감소 및/또는 개선을 일으킨다.

거인증을 앓고 있는 개체는 GHR 길항제 항체로 치료될 수 있다. GHR 길항제 항체 요법에 적합한 개체는 당업계에 널리 공지된 거인증의 임상 기준 및 예후 지시자를 사용하여 선택된다. 거인증의 진단 또는 평가는 당업계에 널리 확립되어 있다. 거인증 중증도의 평가는 당업계에 공지된 시험, 예컨대 예를 들어 비제한적으로 뇌하수체 종양을 검출하기 위한 머리의 컴퓨터 단층촬영 (CT) 또는 MRI 스캔, 경구 글루코스 시험접종 전후의 성장 호르몬의 측정, 혈중 프로락틴 수준의 측정, 혈중 IGF-1 수준의 측정, 혈중 코르티솔 수준의 측정, 혈중 에스트라디올 수준의 측정, 혈중 테스토스테론 수준의 측정, 및 갑상선 호르몬 수준의 측정에 기반하여 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 거인증 및/또는 거인증의 증상의 개선, 제어, 발생률 감소 또는 그의 발병 또는 진행의 지연은 혈중 IGF-1 수준을 측정함으로써 측정된다.

본원에 기재된 모든 방법과 관련하여, GHR 길항제 항체에 대한 언급은 또한 하나 이상의 추가 작용제를 포함하는 조성물을 포함한다. 이들 조성물은 당업계에 공지된 적합한 부형제, 예컨대 제약상 허용되는 부형제, 예컨대 완충제를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명은 단독으로 사용될 수 있거나, 또는 다른 통상의 치료 방법과 조합되어 사용될 수 있다.

GHR 길항제 항체는 임의의 적합한 경로를 통해 개체에게 투여될 수 있다. 본원에 기재된 예는 이용가능한 기술을 제한하려는 것이 아니라 예시하기 위한 것임이 당업자에게 명백할 것이다. 따라서, 일부 실시양태에서, GHR 길항제 항체는 공지된 방법에 따라, 예컨대 정맥내 투여, 예를 들어 볼루스로서 또는 소정 기간에 걸친 연속 주입에 의해, 근육내, 복강내, 뇌척수내, 경피, 피하, 관절내, 설하, 척수강내, 취입, 활막내, 경구, 흡입 또는 국소 경로를 통해 개체에게 투여된다. 투여는 전신성, 예를 들어 정맥내 투여일 수 있거나, 또는 국소화될 수 있다. 제트 네뷸라이저 및 초음파 네뷸라이저를 비롯하여 액체 제제를 위한 상업적으로 입수가능한 네뷸라이저가 투여에 유용하다. 액체 제제는 직접 분무될 수 있고, 동결건조 분말은 재구성 후에 분무될 수 있다. 다르게는, GHR 길항제 항체는 플루오로카본 제제 및 계량 용량 흡입기를 이용하여 에어로졸화될 수 있거나, 동결건조 및 분쇄된 분말로서 흡입될 수 있다.

일부 실시양태에서, GHR 길항제 항체는 부위-특이적 또는 표적화된 국부 전달 기술을 통해 투여된다. 부위-특이적 또는 표적화된 국부 전달 기술의 예는 GHR 길항제 항체의 다양한 이식가능한 데포 공급원 또는 국부 전달 카테터, 예컨대 주입 카테터, 유치 카테터, 또는 바늘 카테터, 합성 이식편, 외피 랩, 션트 및 스텐트 또는 다른 이식가능한 장치, 부위 특이적 담체, 직접 주사, 또는 직접 적용을 포함한다. 예를 들어, PCT 공개 번호 WO 00/53211 및 미국 특허 번호 5,981,568을 참조한다.

GHR 길항제 항체의 다양한 제제가 투여를 위해 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, GHR 길항제 항체는 그 자체로 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, GHR 길항제 항체 및 제약상 허용되는 부형제는 다양한 제제 중에 존재할 수 있다. 제약상 허용되는 부형제는 당업계에 공지되어 있고, 약리학상 유효한 물질의 투여를 용이하게 하는 상대적으로 불활성인 물질이다. 예를 들어, 부형제는 형태 또는 점조도를 제공할 수 있거나, 또는 희석제로서 작용할 수 있다. 적합한 부형제는 안정화제, 습윤제 및 유화제, 오스몰농도를 변화시키는 염, 캡슐화제, 완충제 및 피부 침투 증진제를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 경구 및 비경구 약물 전달을 위한 부형제 및 또한 제제는 문헌 [Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing (2000)]에 제시되어 있다.

일부 실시양태에서, 이들 작용제는 주사에 의한 (예를 들어, 복강내로, 정맥내로, 피하로, 근육내로 등의) 투여를 위해 제제화된다. 따라서, 이러한 제제들은 제약상 허용되는 비히클, 예컨대 염수, 링거액, 덱스트로스 용액 등과 조합될 수 있다. 특정힌 투여 요법, 즉 용량, 시기 및 반복 횟수는 특정한 개체 및 그 개체의 병력에 따라 달라질 것이다.

GHR 길항제 항체는 주사 (예를 들어, 복강내로, 정맥내로, 피하로, 근육내로 등)를 비롯한 임의의 적합한 방법을 이용하여 투여될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, GHR 항체는 또한 흡입을 통해 투여될 수 있다. 일반적으로, GHR 항체의 투여를 위해, 초기 후보 투여량은 약 2 mg/kg일 수 있다. 본 발명의 목적상, 전형적인 1일 투여량은 상기 언급된 인자에 따라 3 μg/kg 내지 30 μg/kg 내지 300 μg/kg 내지 3 mg/kg, 내지 30 mg/kg, 내지 100 mg/kg 또는 그 초과의 대략 임의의 범위일 수 있다. 예를 들어, 약 1 mg/kg, 약 2.5 mg/kg, 약 5 mg/kg, 약 10 mg/kg 및 약 25 mg/kg의 투여량이 사용될 수 있다. 수일 이상에 걸친 반복 투여의 경우에, 상태에 따라 목적하는 증상의 저해가 발생할 때까지 또는 예를 들어 혈중 IGF-1 수준을 감소시키기에 충분한 치료 수준이 달성될 때까지 치료가 지속된다. 예시적인 투여 요법은 GHR 항체를 초기 용량 약 2 mg/kg으로 투여한 후에 매주 유지 용량 약 1 mg/kg으로 투여하거나 격주로 유지 용량 약 1 mg/kg으로 투여하는 것을 포함한다. 그러나, 진료의가 달성하고자 하는 약동학적 붕괴 패턴에 따라 다른 투여 요법이 유용할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 매주 1 내지 4회 투여하는 것이 고려된다. 다른 실시양태에서, 매달 1회 또는 2개월마다 또는 3개월마다 1회 투여하는 것이 고려된다. 이러한 요법의 진행은 통상의 기술 및 검정에 의해 용이하게 모니터링된다. 투여 요법 (사용된 GHR 길항제 항체 포함)은 시간 경과에 따라 달라질 수 있다.

본 발명의 목적상, GHR 길항제 항체의 적절한 투여량은 사용된 GHR 길항제 항체 (또는 그의 조성물), 치료할 증상의 유형 및 중증도, 작용제가 예방 목적 또는 치료 목적으로 투여되는지의 여부, 선행 요법, 환자의 임상 병력 및 작용제에 대한 반응, 환자의 혈중 IGF-1 수준, IGF-1에 대한 환자의 합성률 및 클리어런스율, 투여된 작용제에 대한 환자의 클리어런스율, 및 담당의의 판단에 따라 달라질 것이다. 전형적으로 임상의는 목적하는 결과를 달성하는 투여량에 도달할 때까지 GHR 길항제 항체를 투여할 것이다. 용량 및/또는 빈도는 치료 과정에 따라 달라질 수 있다. 일반적으로, 반감기와 같은 실험적인 고려사항이 투여량을 결정하는데 기여할 것이다. 예를 들어, 인간 면역계와 상용성인 항체, 예컨대 인간화 항체 또는 완전 인간 항체를 사용하여, 항체의 반감기를 연장하고 항체가 숙주의 면역계에 의해 공격받는 것을 방지할 수 있다. 투여 빈도는 요법의 진행에 따라 결정 및 조정될 수 있고, 반드시는 아니지만, 일반적으로 증상, 예를 들어 과도한 IGF-1 수준의 치료 및/또는 억제 및/또는 개선 및/또는 지연에 기반한다. 다르게는, GHR 길항제 항체의 지속적인 연속 방출 제제가 적절할 수 있다. 지속 방출을 달성하기 위한 다양한 제제 및 장치가 당업계에 공지되어 있다.

한 실시양태에서, 길항제 항체의 투여량은 길항제 항체가 1회 이상 투여된 개체에서 실험적으로 결정될 수 있다. GHR 길항제 항체의 투여량을 증가시키면서 개체에게 제공한다. 효능을 평가하기 위해, 질환의 지시자를 조사할 수 있다.

본 발명의 방법에 따른 GHR 길항제 항체의 투여는, 예를 들어 수용자의 생리학적 상태, 투여의 목적이 치료 또는 예방인지의 여부, 및 숙련된 진료의에게 알려져 있는 다른 인자들에 따라, 연속적 또는 간헐적일 수 있다. GHR 길항제 항체의 투여는 본질적으로 사전선택된 기간에 걸쳐 연속적일 수 있거나, 또는 일련의 간격을 둔 투여일 수 있다.

일부 실시양태에서, 1종 초과의 길항제 항체가 존재할 수 있다. 적어도 1종, 적어도 2종, 적어도 3종, 적어도 4종, 적어도 5종 또는 그 초과의 길항제 항체 및/또는 펩티드가 존재할 수 있다. 일반적으로, 이러한 GHR 길항제 항체들은 서로 불리한 영향을 미치지 않는 상보적 활성을 갖는다. GHR 길항제 항체는 또한 다른 GHR 길항제 또는 GH 길항제와 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 하기 GHR 길항제 중 하나 이상이 사용될 수 있다: GHR에 지시된 안티-센스 분자 (GHR을 코딩하는 핵산에 지시된 안티-센스 분자를 포함함), GHR 억제 화합물 (예를 들어, 페그비소만트), 및 GHR 구조 유사체. GHR 길항제 항체는 또한 제제의 유효성을 증진시키고/거나 보완하는 작용을 하는 다른 작용제와 함께 사용될 수 있다.

본 발명에 따라 사용된 GHR 길항제 항체의 치료 제제는 목적하는 정도의 순도를 갖는 항체를 임의적인 제약상 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제 (문헌 [Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing (2000)])와 혼합함으로써, 동결건조된 제제 또는 수용액의 형태로 저장용으로 제조된다. 허용되는 담체, 부형제, 또는 안정화제는 사용된 용량 및 농도에서 수용자에게 비독성이고, 완충제, 예컨대 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기 산; 염, 예컨대 염화나트륨; 아스코르브산 및 메티오닌을 비롯한 항산화제; 보존제 (예컨대, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥사놀; 3-펜타놀; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 이뮤노글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 모노사카라이드, 디사카라이드, 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 비롯한 다른 탄수화물; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대-이온, 예컨대 나트륨; 금속 착물 (예를 들어, Zn-단백질 착물); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예컨대 트윈(TWEEN)™, 플루로닉스(PLURONICS)™ 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함할 수 있다.

GHR 길항제 항체를 함유하는 리포솜은 문헌 [Epstein, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688 (1985); Hwang, et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 77:4030 (1980)]; 및 미국 특허 번호 4,485,045 및 4,544,545에 기재된 바와 같은 당업계에 공지된 방법에 의해 제조된다. 순환 시간이 증진된 리포솜은 미국 특허 번호 5,013,556에 개시되어 있다. 특히 유용한 리포솜은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유도체화 포스파티딜에탄올아민 (PEG-PE)을 포함하는 지질 조성물을 사용한 역상 증발 방법에 의해 생성될 수 있다. 리포솜을 규정된 기공 크기의 필터를 통해 압출하여 목적 직경을 갖는 리포솜을 생성한다.

활성 성분은 또한, 예를 들어 코아세르베이션 기술 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어 각각 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐에, 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포솜, 알부민 마이크로구체, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐)에, 또는 마크로에멀젼에 포획될 수 있다. 이러한 기술은 문헌 [Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing (2000)]에 개시되어 있다.

지속-방출 제제를 제조할 수 있다. 지속-방출 제제의 적합한 예는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하고, 이 매트릭스는 성형품, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐의 형태이다. 지속-방출 매트릭스의 예는 폴리에스테르, 히드로겔 (예를 들어, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알콜)), 폴리락티드 (미국 특허 번호 3,773,919), L-글루탐산 및 7 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예컨대 루프론 데포(LUPRON DEPOT)™ (락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤리드 아세테이트로 이루어진 주사가능한 마이크로구체), 수크로스 아세테이트 이소부티레이트 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산을 포함한다.

생체내 투여에 사용될 제제는 멸균되어야 한다. 이는, 예를 들어 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성된다. 치료적 GHR 길항제 항체 조성물은 일반적으로 멸균 접근 포트를 갖는 용기, 예를 들어 피하 주사 바늘이 관통가능한 마개가 있는 정맥내 용액 백 또는 바이알에 넣는다.

본 발명에 따른 조성물은 단위 투여 형태, 예컨대 정제, 환제, 캡슐제, 분말, 과립, 용액 또는 현탁액, 또는 좌제로, 경구, 비경구 또는 직장 투여, 또는 흡입 또는 취입에 의해 투여될 수 있다.

고체 조성물, 예컨대 정제를 제조하기 위해, 주요 활성 성분은 제약상 담체, 예를 들어 통상의 정제화 성분, 예컨대 옥수수 전분, 락토스, 수크로스, 소르비톨, 활석, 스테아르산, 스테아르산마그네슘, 인산이칼슘 또는 검, 및 다른 제약상 희석제, 예를 들어 물과 혼합되어 본 발명의 화합물 또는 그의 비-독성 제약상 허용되는 염의 균질 혼합물을 함유하는 고체 예비제제 조성물을 형성한다. 이들 예비 제제 조성물이 균질한 것으로서 지칭되는 경우에, 이는 활성 성분이 조성물에 고르게 분포되어 있어서 상기 조성물이 정제, 환제 및 캡슐제와 같은 동일한 유효 단위 투여 형태로 용이하게 세분될 수 있음을 의미한다. 이 고체 예비제제 조성물은 그 후, 본 발명의 활성 성분 0.1 내지 약 500 mg을 함유하는 상기 기재된 유형의 단위 투여 형태로 세분된다. 신규 조성물의 정제 또는 환제는 코팅되거나, 그렇지 않으면 배합되어 지속 작용의 이점을 제공하는 투여 형태를 제공할 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 환제는 내부 투여 및 외부 투여 성분을 포함할 수 있고, 외부 투여 성분은 내부 투여 성분 상의 외피의 형태일 수 있다. 2개의 성분은 위에서의 붕해에 저항하는데 도움을 주고, 내부 성분이 십이지장으로 손상 없이 통과하게 허용하거나 또는 방출이 지연되게 하는 장용 층에 의해 분리될 수 있다. 다양한 물질이 이러한 장용 층 또는 코팅에 사용될 수 있고, 이러한 물질은 다수의 중합체성 산, 및 쉘락, 세틸 알콜 및 셀룰로스 아세테이트와 같은 물질과 중합체성 산과의 혼합물을 포함한다.

적합한 표면-활성제는 특히, 비-이온성 작용제, 예컨대 폴리옥시에틸렌소르비탄 (예를 들어, 트윈™ 20, 40, 60, 80 또는 85) 및 다른 소르비탄 (예를 들어, 스판(Span)™ 20, 40, 60, 80 또는 85)을 포함한다. 표면-활성제를 갖는 조성물은 편리하게 0.05 내지 5% 표면-활성제를 포함할 것이고, 0.1 내지 2.5%일 수 있다. 필요한 경우에, 다른 성분, 예를 들어 만니톨 또는 다른 제약상 허용되는 비히클이 첨가될 수 있다는 것이 이해될 것이다.

적합한 에멀젼은 상업적으로 입수가능한 지방 에멀젼, 예컨대 인트라리피드(Intralipid)™, 리포신(Liposyn)™, 인포누트롤(Infonutrol)™, 리포푼딘(Lipofundin)™ 및 리피피산(Lipiphysan)™을 사용하여 제조될 수 있다. 활성 성분은 미리-혼합된 에멀젼 조성물 중 용해될 수 있거나, 또는 다르게는 오일 (예를 들어, 대두 오일, 홍화 오일, 목화씨 오일, 참깨 오일, 옥수수 오일 또는 아몬드 오일) 및 인지질 (예를 들어, 난(egg) 인지질, 대두 인지질 또는 대두 레시틴) 및 물과 혼합하여 형성된 에멀젼 중에서 용해될 수 있다. 에멀젼의 등장성을 조정하기 위해, 다른 성분, 예를 들어 글리세롤 또는 글루코스를 첨가할 수 있는 것으로 이해될 것이다. 적합한 에멀젼은 전형적으로 최대 20%의 오일, 예를 들어 5 내지 20%의 오일을 함유할 것이다. 지방 에멀젼은 0.1 내지 1.0 μm, 특히 0.1 내지 0.5 μm의 지방 액적을 포함하고, 5.5 내지 8.0 범위의 pH를 갖는다.

에멀젼 조성물은 GHR 길항제 항체를 인트라리피드™ 또는 그의 성분 (대두 오일, 난 인지질, 글리세롤 및 물)과 혼합하여 제조될 수 있다.

흡입 또는 취입을 위한 조성물은 제약상 허용되는 수성 또는 유기 용매 또는 그의 혼합물 중 용액 및 현탁액, 및 분말을 포함한다. 액체 또는 고체 조성물은 상기 기재된 바와 같은 적합한 제약상 허용되는 부형제를 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 국부 또는 전신 효과를 위해 구강 또는 비강 호흡 경로에 의해 투여된다. 바람직하게는 멸균 제약상 허용되는 용매 중의 조성물은 기체를 이용하여 분무될 수 있다. 분무된 용액은 분무 장치로부터 직접 호흡될 수 있거나, 또는 분무 장치가 페이스 마스크, 텐트 또는 간헐성 양압 호흡 기계에 부착될 수 있다. 용액, 현탁액 또는 분말 조성물은 제제를 적절한 방식으로 전달하는 장치로부터 바람직하게는 경구로 또는 비내로 투여될 수 있다.

GHR 길항제 항체

본 발명의 방법은 GHR 생물학적 활성, 예컨대 GHR 신호전달에 의해 매개되는 하류 경로를 차단하거나, 저해하거나 또는 감소시키는 (유의하게 감소시키는 것 포함) GHR 길항제 항체를 사용한다. GHR 길항제 항체는 하기 특성 중 임의의 하나 이상을 나타내어야 한다: (a) GHR에 결합하고; (b) GHR 이량체화를 차단하고; (c) GH와의 GHR 상호작용을 차단하고; (d) GHR-매개 STAT5 인산화 및/또는 다른 하류 신호전달 사건을 차단하거나 또는 감소시키고; (e) GHR-매개 IGF-1 발현을 차단하거나 또는 감소시키고; (f) 아직 확인되지 않은 인자와의 GHR 상호작용을 차단한다.

본 발명의 목적상, 상기 항체는 바람직하게는 GHR 신호전달 기능 및 GH 상호작용을 억제하는 방식으로 GHR과 반응한다. 일부 실시양태에서, GHR 길항제 항체는 인간 및 비-인간 영장류 GHR을 특이적으로 인식한다. 일부 실시양태에서, GHR 길항제 항체는 인간 및 비-인간 영장류 GHR에 결합한다.

본 발명에 유용한 항체는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 항체 단편 (예를 들어, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fc 등), 키메라 항체, 이중특이적 항체, 이종접합체 항체, 단일 쇄 (ScFv), 그의 돌연변이체, 항체 부분을 포함하는 융합 단백질 (예를 들어, 도메인 항체), 인간화 항체, 및 항체의 글리코실화 변이체, 항체의 아미노산 서열 변이체, 및 공유적으로 변형된 항체를 비롯한 필요한 특이성의 항원 인식 부위를 포함하는 임의의 다른 변형된 형상의 이뮤노글로불린 분자를 포함할 수 있다. 항체는 뮤린, 래트, 인간, 또는 임의의 다른 기원일 수 있다 (키메라 또는 인간화 항체 포함).

일부 실시양태에서, GHR 길항제 항체는 모노클로날 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간화 또는 인간 항체이다.

GHR 길항제 항체는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 인간 및 마우스 항체의 생산을 위한 일반적 기술은 당업계에 공지되어 있고/거나 본원에 기재되어 있다.

GHR 길항제 항체 및 그의 단편은 당업계에 공지된 방법을 이용하여 확인되거나 또는 특성화될 수 있고, 여기서 GHR 생물학적 활성의 감소, 개선 또는 중화가 검출되고/거나 측정된다. 일부 실시양태에서, GHR 길항제 항체는 후보 작용제를 GHR과 함께 인큐베이션하고, 결합 및/또는 GHR의 생물학적 활성의 동반 감소 또는 중화를 모니터링함으로써 확인된다. 결합 검정은 정제된 GHR 폴리펩티드(들)를 사용하거나 GHR 폴리펩티드(들)를 자연적으로 발현하거나 이를 발현하도록 형질감염된 세포를 사용하여 수행될 수 있다. 한 실시양태에서, 결합 검정은 경쟁적 결합 검정이고, 여기서 GHR 결합에 대해 공지된 GHR 길항제와 경쟁하는 후보 항체의 능력이 평가된다. 검정은 ELISA 포맷을 비롯한 다양한 포맷으로 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, GHR 길항제 항체는 후보 항체를 GHR과 함께 인큐베이션하고, 결합을 모니터링함으로써 확인된다. 일부 실시양태에서, STAT5 인산화가 GHR 길항제 항체를 확인하는데 사용된다. 예를 들어, 후보 항체를 GHR을 발현하는 세포와 함께 인큐베이션하고, 동반되는 STAT5 인산화를 모니터링한다.

초기 확인에 이어서, 후보 GHR 길항제 항체의 활성은 표적 생물학적 활성을 시험하는 것으로 공지된 생물검정에 의해 추가로 확인되고 정제될 수 있다. 다르게는, 생물검정을 이용하여 후보물질을 직접 스크리닝할 수 있다. GHR 길항제 항체를 확인하고 특성화하는 방법의 일부가 실시예에 상세하게 기재되어 있다.

본 발명의 GHR 길항제 항체는 하기 특성 중 하나 이상을 나타낸다: (a) GHR에 결합하고; (b) GHR 이량체화를 차단하고; (c) GH와의 GHR 상호작용을 차단하고; (d) GHR-매개 STAT5 인산화를 차단하거나 또는 감소시키고; (e) GHR-매개 IGF-1 발현을 차단하거나 또는 감소시키고; (f) 아직 확인되지 않은 인자와의 GHR 상호작용을 차단한다. 바람직하게는, GHR 항체는 이들 특징 중 2개 이상을 갖는다. 보다 바람직하게는, 항체는 상기 특징 중 3개 이상을 갖는다. 보다 바람직하게는, 항체는 상기 특징 중 4개 이상을 갖는다. 보다 바람직하게는, 항체는 상기 특징 중 5개 이상을 갖는다. 가장 바람직하게는, 항체는 모든 6개의 특성을 갖는다.

GHR 길항제 항체는 당업계에 널리 공지된 방법을 이용하여 특성화될 수 있다. 예를 들어, 한 방법은 이것이 결합하는 에피토프를 확인하는 것, 또는 "에피토프 맵핑"이다. 예를 들어, 문헌 [Chapter 11 of Harlow and Lane, Using Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1999]에 기재된 바와 같이, 항체-항원 복합체의 결정 구조 규명, 경쟁 검정, 유전자 단편 발현 검정, 및 합성 펩티드-기반 검정을 비롯하여 단백질 상에서 에피토프의 위치를 맵핑하고 특성화하는 당업계에 공지된 많은 방법이 존재한다. 추가적인 예에서, 에피토프 맵핑이 GHR 길항제 항체가 결합하는 서열을 결정하는데 사용될 수 있다. 에피토프 맵핑은 다양한 공급업체, 예를 들어 펩스캔 시스템즈(Pepscan Systems; 네덜란드 8219 피에이치 렐리스타드 에델헤르트벡 15)로부터 상업적으로 입수가능하다. 에피토프는 선형 에피토프, 즉 아미노산의 단일 스트레치 내에 함유된 것일 수 있거나, 또는 반드시 단일 스트레치 내에 함유된 것은 아닐 수 있는 아미노산의 3차원 상호작용에 의해 형성된 입체형태적 에피토프일 수 있다. 다양한 길이의 펩티드 (예를 들어, 4-6개 이상의 아미노산 길이)가 단리되거나 합성될 수 있고 (예를 들어, 재조합적으로), GHR 길항제 항체와의 결합 검정을 위해 사용될 수 있다. 또 다른 예에서, GHR 길항제 항체가 결합하는 에피토프는, GHR 서열로부터 유도된 중첩 펩티드를 사용하여 GHR 길항제 항체에 의한 결합을 결정함으로써 전체적인 스크리닝에 의해 결정할 수 있다. 유전자 단편 발현 검정에 따르면, GHR을 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 무작위로 또는 특이적 유전자 구축물에 의해 단편화하고, GHR의 발현된 단편의 시험될 항체와의 반응성을 결정한다. 유전자 단편은, 예를 들어 방사성 아미노산의 존재하에 PCR에 의해 생성된 후 시험관내에서 전사되고 단백질로 번역될 수 있다. 그 다음, 방사성 표지된 GHR 단편에의 항체의 결합을 면역침전 및 겔 전기영동에 의해 결정한다. 특정 에피토프는 또한 파지 입자의 표면 상에 디스플레이된 무작위 펩티드 서열의 큰 라이브러리 (파지 라이브러리)를 사용하여 확인할 수 있다. 다르게는, 중첩 펩티드 단편의 한정된 라이브러리를 시험 항체와의 결합에 대해 간단한 결합 검정에서 시험할 수 있다. 추가의 예에서, 항원의 돌연변이유발, 도메인 스와핑 실험 및 알라닌 스캐닝 돌연변이유발을 수행하여, 에피토프 결합에 요구되고/거나 충분하고/거나 필요한 잔기를 확인할 수 있다. 예를 들어, GHR 폴리펩티드의 다양한 단편이 또 다른 종으로부터의, 또는 밀접하게 관련되었지만 항원성이 다른 GHR로부터의 서열로 대체 (스와핑)된 돌연변이체 GHR을 사용하여 도메인 스와핑 실험을 수행할 수 있다. 돌연변이체 GHR에 대한 항체의 결합을 평가함으로써, 항체 결합에 대한 특정한 GHR 단편의 중요성을 평가할 수 있다.

GHR 길항제 항체를 특성화하는데 사용될 수 있는 또 다른 방법은 동일 항원, 즉 GHR 상의 다양한 단편에 결합하는 것으로 공지된 다른 항체와의 경쟁 검정을 이용하여, GHR 길항제 항체가 다른 항체와 동일한 에피토프에 결합하는지의 여부를 결정하는 것이다. 경쟁 검정은 당업자에게 공지되어 있다.

GHR에 대한 GHR 길항제 항체의 결합 친화도 (K_D)는 약 0.001 내지 약 200 nM일 수 있다. 일부 실시양태에서, 결합 친화도는 약 200 nM, 약 100 nM, 약 50 nM, 약 10 nM, 약 1 nM, 약 500 pM, 약 100 pM, 약 60 pM, 약 50 pM, 약 20 pM, 약 15 pM, 약 10 pM, 약 5 pM, 약 2 pM, 또는 약 1 pM 중 임의의 값이다. 일부 실시양태에서, 결합 친화도는 약 250 nM, 약 200 nM, 약 100 nM, 약 50 nM, 약 10 nM, 약 1 nM, 약 500 pM, 약 100 pM, 약 50 pM, 약 20 pM, 약 10 pM, 약 5 pM, 또는 약 2 pM 중 임의의 값 미만이다.

GHR에 대한 항체의 결합 친화도를 결정하는 한가지 방법은 항체의 단작용성 Fab 단편의 결합 친화도를 측정하는 것이다. 단작용성 Fab 단편을 수득하기 위해, 항체 (예를 들어, IgG)를 파파인으로 절단시키거나 재조합 방식으로 발현시킬 수 있다. 항체의 Fab 단편의 친화도는 HBS-EP 러닝 완충제 (0.01M HEPES, pH 7.4, 0.15 NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% v/v 계면활성제 P20)를 사용하여 미리 고정화시킨 스트렙타비딘 센서 칩 (SA)이 장착된 표면 플라즈몬 공명 (비아코어3000(Biacore3000)™ 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 시스템, 비아코어, 인크(Biacore, INC), 뉴저지주 피스카타웨이)으로 측정할 수 있다. 비오티닐화 GHR을 0.5 μg/mL 미만의 농도로 HBS-EP 완충제 중에 희석하고, 가변 접촉 시간을 이용하여 개별 칩 채널을 따라 주입함으로써 상세한 동역학적 연구를 위한 50-200 반응 단위 (RU) 또는 스크리닝 검정을 위한 800-1,000 RU의 2가지 항원 밀도 범위를 달성할 수 있다. 재생 연구는 200회 주입에 걸쳐 칩 상에서 GHR의 활성을 유지하면서 25% v/v 에탄올 중 25 mM NaOH가 결합 Fab를 효과적으로 제거하는 것을 나타내었다. 전형적으로, 정제된 Fab 샘플의 연속 희석물 (0.1-10x 추정 K_D의 스패닝 농도)을 100 μL/분으로 1분 동안 주입하고, 2시간 이하의 해리 시간을 허용한다. Fab 단백질의 농도는 공지된 농도 (아미노산 분석에 의해 결정됨)의 Fab를 표준물로 사용하여 ELISA 및/또는 SDS-PAGE 전기영동에 의해 결정한다. 동역학적 결합 속도 (k_on) 및 해리 속도 (k_off)는 비아이밸류에이션(BIAevaluation) 프로그램을 사용하여 1:1 랭뮤어(Langmuir) 결합 모델 (문헌 [Karlsson, R. Roos, H. Fagerstam, L. Petersson, B. (1994). Methods Enzymology 6. 99-110])에 전체적으로 데이터를 적합시킴으로써 동시에 수득된다. 평형 해리 상수 (K_D) 값은 k_off/k_on으로 계산한다. 상기 프로토콜은 임의의 GHR, 예컨대 인간 GHR, 시노몰구스 원숭이 (시노) GHR 및 마우스 GHR, 뿐만 아니라 상이한 형태의 GHR에 대한 항체의 결합 친화도를 결정하는데 사용하기에 적합하다. 항체의 결합 친화도는 일반적으로 25℃에서 측정하지만, 37℃에서도 또한 측정할 수 있다.

따라서, 본 발명은 하기 중 임의의 것, 또는 하기 표 1에서 찾아볼 수 있는 바와 같은 부분적 경쇄 서열 및 부분적 중쇄 서열을 갖는 항체를 포함하는 조성물 (제약 조성물 포함)을 제공한다. 표 1에서, 밑줄표시된 서열은 카바트에 따른 CDR 서열이고, 볼드체인 서열은 코티아에 따른 CDR 서열이다. 인간 GHR에 대한 항체의 결합 친화도를 비아코어™ 분석에 의해 결정하였고, 표 1에 나타내었다.

<표 1>

본 발명은 또한 GHR에 대한 항체의 CDR 부분을 제공한다. CDR 영역의 결정은 충분히 당업계의 기술범위 내에 있다. 일부 실시양태에서, CDR은 카바트 및 코티아 CDR의 조합 (또한, "조합형 CDR" 또는 "확장형 CDR"이라고도 불림)일 수 있다는 것이 이해된다. 일부 실시양태에서, CDR은 카바트 CDR이다. 다른 실시양태에서, CDR은 코티아 CDR이다. 다른 실시양태에서, CDR은 확장형, AbM, 입체형태적 또는 접촉 CDR이다. 다시 말해, 하나 초과의 CDR을 갖는 실시양태에서, CDR은 카바트, 코티아, 확장형, AbM, 입체형태적, 접촉 CDR 또는 그의 조합 중 임의의 것일 수 있다.

하기 표 2는 본원에 제공된 GHR 길항제 항체의 CDR 서열 및 결합 친화도의 예를 제공한다. 결합 친화도는 별표 (*)로 표시된 경우를 제외하고는 25℃에서 측정하였다. 별표는 37℃에서 측정한 결합 친화도를 나타낸다.

<표 2> GHR 길항제 항체 및 카바트 (밑줄표시) 및 코티아 (볼드체)에 따른 항원-결합 CDR 서열 및 결합 친화도 (K_D)

본 발명은 또한 이들 항체 또는 폴리펩티드 중 임의의 것을 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명의 항체는 당업계에 공지된 절차에 의해 제조될 수 있다. 폴리펩티드는 항체의 단백질분해 또는 다른 분해에 의해, 상기 기재된 바와 같은 재조합 방법에 의해 (즉, 단일 또는 융합 폴리펩티드), 또는 화학적 합성에 의해 생성될 수 있다. 항체의 폴리펩티드, 특히 최대 약 50개 아미노산의 보다 짧은 폴리펩티드는 화학적 합성에 의해 편리하게 제조된다. 화학적 합성 방법은 당업계에 공지되어 있고, 상업적으로 이용가능하다. 예를 들어, 항체는 고체 상 방법을 이용하여 자동화된 폴리펩티드 합성기에 의해 생성될 수 있다. 또한, 미국 특허 번호 5,807,715; 4,816,567; 및 6,331,415를 참조한다.

일부 실시양태에서, 항체는 파지 디스플레이 기술에 의해 제조 및 선택될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,565,332; 5,580,717; 5,733,743; 및 6,265,150; 및 문헌 [Winter et al., Annu. Rev. Immunol. 12:433-455, 1994]을 참조한다. 다르게는, 파지 디스플레이 기술 (문헌 [McCafferty et al., Nature 348:552-553, 1990])은 비면역화된 공여자로부터의 이뮤노글로불린 가변 (V) 도메인 유전자 레퍼토리로부터 시험관내에서 인간 항체 및 항체 단편을 생성하기 위해 이용될 수 있다. 상기 기술에 따라, 항체 V 도메인 유전자를 필라멘트형 박테리오파지, 예컨대 M13 또는 fd의 주요 또는 소수의 코트 단백질 유전자 내로 인-프레임으로 클로닝하고, 파지 입자의 표면 상에 기능적 항체 단편으로서 디스플레이한다. 필라멘트형 입자는 파지 게놈의 단일-가닥 DNA 카피를 함유하기 때문에, 항체의 기능적 특성을 기반으로 한 선택은 또한 해당 특성을 나타내는 항체를 코딩하는 유전자의 선택을 일으킨다. 따라서, 파지는 B 세포의 특성의 일부를 모방한다. 파지 디스플레이는 다양한 포맷으로 수행될 수 있고; 리뷰에 대해서는, 예를 들어 문헌 [Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571, 1993]을 참조한다. V-유전자 절편의 여러 공급원이 파지 디스플레이에 사용될 수 있다. 문헌 [Clackson et al., Nature 352:624-628, 1991]은 면역화된 마우스의 비장으로부터 유래된 V 유전자의 작은 무작위 조합의 라이브러리로부터 다양한 배열의 항-옥사졸론 항체를 단리하였다. 비면역화된 인간 공여자로부터의 V 유전자의 레퍼토리가 구축될 수 있고, 다양한 배열의 항원 (자가-항원 포함)에 대한 항체는 본질적으로 문헌 [Mark et al., J. Mol. Biol. 222:581-597, 1991, 또는 Griffith et al., EMBO J. 12:725-734, 1993]에 의해 기재된 기술에 따라 단리될 수 있다. 천연 면역 반응에서, 항체 유전자는 높은 비율로 돌연변이를 축적한다 (체세포 과다돌연변이). 도입된 변화 중 일부는 보다 높은 친화도를 부여할 것이고, 고-친화도 표면 이뮤노글로불린을 디스플레이하는 B 세포가 후속 항원 시험접종 동안 우선적으로 복제 및 분화된다. "쇄 셔플링"으로 공지되어 있는 기술을 이용함으로써 상기 천연 과정이 모방될 수 있다 (문헌 [Marks et al., Bio/Technol. 10:779-783, 1992]). 상기 방법에서, 파지 디스플레이에 의해 수득된 "1차" 인간 항체의 친화도는, 비면역화된 공여자로부터 수득된 V 도메인 유전자의 자연 발생 변이체 (레퍼토리)의 레퍼토리로 중쇄 및 경쇄 V 영역 유전자를 순차적으로 대체함으로써 향상시킬 수 있다. 이러한 기술은 친화도가 pM-nM 범위인 항체 및 항체 단편이 생성되도록 한다. 초대형 파지 항체 레퍼토리 ("모든 라이브러리의 어머니(the mother-of-all libraries)"로 또한 공지됨)를 제조하기 위한 전략이 문헌 [Waterhouse et al., Nucl. Acids Res. 21:2265-2266, 1993]에 기재된 바 있다. 유전자 셔플링은 또한 설치류 항체로부터 인간 항체를 유도하는데 사용될 수 있고, 이때 인간 항체는 출발 설치류 항체와 유사한 친화도 및 특이성을 갖는다. "에피토프 임프린팅"으로도 지칭되는 상기 방법에 따르면, 파지 디스플레이 기법에 의해 수득된 설치류 항체의 중쇄 또는 경쇄 V 도메인 유전자가 인간 V 도메인 유전자의 레퍼토리로 대체되어, 설치류-인간 키메라가 생성된다. 항원에 기반하여 선택한 결과로서, 기능적 항원-결합 부위가 복원될 수 있는 인간 가변 영역이 단리되고, 즉 에피토프가 파트너의 선택을 좌우 (임프린팅)한다. 남아있는 설치류 V 도메인을 대체하기 위해 방법이 반복되는 경우에, 인간 항체가 수득된다 (PCT 공개 번호 WO 93/06213 참조). CDR 이식에 의한 설치류 항체의 전통적인 인간화와는 달리, 이러한 기술은 설치류 기원의 프레임워크 또는 CDR 잔기가 없는 완전 인간 항체를 제공한다.

일부 실시양태에서, 항체는 하이브리도마 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 인간을 비롯한 임의의 포유동물 대상체 또는 이들로부터의 항체 생성 세포는 인간을 비롯한 포유동물의 하이브리도마 세포주의 생성을 위한 기초로 작용하도록 조작될 수 있다고 여겨진다. 본원에 추가로 기재된 바와 같이, 숙주 동물 면역화의 경로 및 스케줄은 일반적으로 항체 자극 및 생성에 관한 확립된 통상의 기술을 따른다. 전형적으로, 본원에 기재된 것을 포함하여, 소정량의 면역원이 숙주 동물에게 복강내로, 근육내로, 경구로, 피하로, 족저내로 및/또는 피내로 접종된다.

하이브리도마는 문헌 [Kohler, B. and Milstein, C., 1975, Nature 256:495-497]의 일반 체세포 하이브리드화 기술을 이용하거나 또는 문헌 [Buck, D. W., et al., In Vitro, 18:377-381, 1982]에 의해 변형된 바와 같이 림프구 및 불멸화된 골수 세포로부터 제조될 수 있다. X63-Ag8.653 및 솔크 인스티튜트의 셀 디스트리뷰션 센터(Salk Institute, Cell Distribution Center; 미국 캘리포니아주 샌디에고)의 것을 포함하지만 이에 제한되지는 않는 입수가능한 골수종 세포주를 혼성화에 사용할 수 있다. 일반적으로, 이러한 기술은 폴리에틸렌 글리콜과 같은 융합원을 사용하거나 당업자에게 널리 공지된 전기적 수단에 의해 골수종 세포 및 림프구 세포를 융합시키는 것을 동반한다. 융합 후, 세포를 융합 배지로부터 분리하고, 선택 성장 배지, 예컨대 하이포크산틴-아미노프테린-티미딘 (HAT) 배지 중에서 성장시켜 혼성화되지 않은 모 세포를 제거한다. 혈청이 보충되거나 혈청이 보충되지 않은, 본원에 기재된 임의의 배지가 모노클로날 항체를 분비하는 하이브리도마를 배양하는데 사용될 수 있다. 세포 융합 기술에 대한 또 다른 대안으로서, EBV 불멸화된 B 세포가 본 발명의 GHR 모노클로날 항체를 생산하기 위해 사용될 수 있다. 하이브리도마 또는 다른 불멸화된 B 세포는 확대되고, 서브클로닝되고, 필요한 경우에는 상청액이 전형적인 면역검정 절차에 의해 항-면역원 활성에 대해 검정된다 (예를 들어, 방사성면역검정, 효소 면역검정, 또는 형광 면역검정).

항체의 공급원으로서 사용될 수 있는 하이브리도마는 GHR에 대해 특이적인 모노클로날 항체 또는 그의 일부분을 생산하는 모 하이브리도마의 자손 세포인 모든 유도체를 포함한다.

이러한 항체를 생성하는 하이브리도마는 공지된 절차를 이용하여 시험관내 또는 생체내 성장시킬 수 있다. 원하는 경우에, 통상의 이뮤노글로불린 정제 절차, 예컨대 황산암모늄 침전, 겔 전기영동, 투석, 크로마토그래피 및 한외여과에 의해 모노클로날 항체를 배양 배지 또는 체액으로부터 단리할 수 있다. 바람직하지 않은 활성이 존재하는 경우에, 이것은 예를 들어 고체 상에 부착된 면역원으로 이루어진 흡착제상에 제제를 운행시키고, 목적 항체를 면역원으로부터 용출 또는 방출시킴으로써 제거할 수 있다. 이관능성 작용제 또는 유도체화제, 예를 들어 말레이미도벤조일 술포숙신이미드 에스테르 (시스테인 잔기를 통한 접합), N-히드록시숙신이미드 (리신 잔기를 통함), 글루타르알데히드, 숙신산 무수물, SOCl₂, 또는 R¹N=C=NR (여기서, R 및 R¹은 상이한 알킬 기임)을 사용하여 숙주 동물을 GHR 폴리펩티드, 또는 면역화될 종들에서 면역성인 단백질, 예를 들어 키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin), 혈청 알부민, 소 티로글로불린, 또는 대두 트립신 억제제에 접합된 표적 아미노산 서열을 함유하는 단편으로 면역화시킴으로써 항체 (예를 들어, 모노클로날 항체)의 집단을 수득할 수 있다.

원하는 경우에, 관심 GHR 길항제 항체 (모노클로날 또는 폴리클로날)는 서열분석될 수 있고, 폴리뉴클레오티드 서열은 그 후, 발현 또는 증식을 위해 벡터로 클로닝될 수 있다. 관심 항체를 코딩하는 서열은 숙주 세포 내의 벡터 내에 유지될 수 있고, 이후에 숙주 세포를 추후의 사용을 위해 증식 및 동결시킬 수 있다. 세포 배양물 중 재조합 모노클로날 항체의 생성은 당업계에 공지된 수단에 의해 B 세포로부터의 항체 유전자를 클로닝하여 수행될 수 있다. 예를 들어 문헌 [Tiller et al., 2008, J. Immunol. Methods 329, 112]; 미국 특허 번호 7,314,622를 참조한다.

일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 서열은 항체를 "인간화"하거나 항체의 친화도 또는 다른 특성을 개선하기 위한 유전자 조작에 사용될 수 있다. 항체는 또한, 예를 들어 개, 고양이, 영장류, 말 및 소에서의 사용을 위해 맞춤화될 수 있다.

일부 실시양태에서, 완전 인간 항체는 특이적 인간 이뮤노글로불린 단백질을 발현하도록 조작된 상업적으로 입수가능한 마우스를 사용하여 수득될 수 있다. 보다 바람직한 (예를 들어, 완전 인간 항체) 또는 보다 강한 면역 반응을 생성하도록 고안된 트랜스제닉 동물이 또한 인간화 또는 인간 항체의 생성을 위해 사용될 수 있다. 이러한 기술의 예는 아브게닉스, 인크.(Abgenix, Inc.; 캘리포니아주 프레몬트)의 제노마우스(Xenomouse)™ 및 메다렉스, 인크.(Medarex, Inc.; 뉴저지주 프린스턴)의 HuMAb-마우스® 및 TC 마우스™이다.

먼저 숙주 동물로부터 항체 및 항체 생성 세포를 단리하여 유전자 서열을 수득하고, 유전자 서열을 사용하여 숙주 세포 (예를 들어, CHO 세포)에서 항체를 재조합 방식으로 발현시킴으로써 항체를 재조합 방식으로 제조할 수 있다. 이용될 수 있는 또 다른 방법은 식물 (예를 들어, 담배) 또는 트랜스제닉 우유에서 항체 서열을 발현시키는 것이다. 식물 또는 우유에서 항체를 재조합 방식으로 발현시키는 방법이 개시된 바 있다. 예를 들어, 문헌 [Peeters, et al. Vaccine 19:2756, 2001; Lonberg, N. and D. Huszar Int. Rev. Immunol 13:65, 1995; 및 Pollock, et al., J Immunol Methods 231:147, 1999]을 참조한다. 항체의 유도체 (예를 들어, 인간화, 단일 쇄 등)를 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있다.

면역검정 및 유동 세포측정 분류 기술, 예컨대 형광 활성화 세포 분류 (FACS)가 또한 GHR에 대해 특이적인 항체를 단리하기 위해 이용될 수 있다.

통상의 절차를 이용하여 (예를 들어, 모노클로날 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여) 모노클로날 항체를 코딩하는 DNA가 용이하게 단리되고 서열분석된다. 하이브리도마 세포는 이러한 DNA의 바람직한 공급원으로 제공된다. 일단 단리되면, DNA를 발현 벡터 (예컨대, PCT 공개 번호 WO 87/04462에 개시된 발현 벡터) 내에 배치할 수 있고, 이후에 달리 이뮤노글로불린 단백질을 생성하지 않는 숙주 세포, 예컨대 이. 콜라이(E. coli) 세포, 원숭이 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 골수종 세포로 형질감염시켜 재조합 숙주 세포에서 모노클로날 항체의 합성을 달성한다. 예를 들어, PCT 공개 번호 WO 87/04462를 참조한다. DNA는 또한, 예를 들어 상동성 뮤린 서열 대신에 인간 중쇄 및 경쇄 불변 영역에 대한 코딩 서열을 대체하거나 (문헌 [Morrison et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 81:6851, 1984]) 또는 비-이뮤노글로불린 폴리펩티드에 대한 코딩 서열의 모두 또는 일부를 이뮤노글로불린 코딩 서열에 대해 공유적으로 연결하여 변형될 수 있다. 이러한 방식으로, 본원에서의 GHR 모노클로날 항체의 결합 특이성을 갖는 "키메라" 또는 "하이브리드" 항체가 제조된다.

항체 단편은 단백질분해 또는 항체의 다른 분해에 의해, 상기 기재된 바와 같은 재조합 방법에 의해 (즉, 단일 또는 융합 폴리펩티드), 또는 화학적 합성에 의해 생성될 수 있다. 항체의 폴리펩티드, 특히 최대 약 50개 아미노산의 보다 짧은 폴리펩티드는 화학적 합성에 의해 편리하게 제조된다. 화학적 합성 방법은 당업계에 공지되어 있고, 상업적으로 이용가능하다. 예를 들어, 항체는 고체 상 방법을 이용하여 자동화된 폴리펩티드 합성기에 의해 생성될 수 있다. 또한, 미국 특허 번호 5,807,715; 4,816,567; 및 6,331,415를 참조한다.

일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 항체 SS1, SS3, SS4, TM1 또는 TM9의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역을 코딩하는 서열을 포함한다. 관심 항체를 코딩하는 서열은 숙주 세포 내의 벡터 내에 유지될 수 있고, 이후에 숙주 세포를 추후의 사용을 위해 증식 및 동결시킬 수 있다. 벡터 (발현 벡터 포함) 및 숙주 세포는 본원에 추가로 기재되어 있다.

본 발명은 친화도 성숙 실시양태를 포함한다. 예를 들어, 친화도 성숙 항체는 당업계에 공지된 절차에 의해 생성될 수 있다 (문헌 [Marks et al., 1992, Bio/Technology, 10:779-783; Barbas et al., 1994, Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813; Schier et al., 1995, Gene, 169:147-155; Yelton et al., 1995, J. Immunol., 155:1994-2004; Jackson et al., 1995, J. Immunol., 154(7):3310-9; Hawkins et al., 1992, J. Mol. Biol., 226:889-896] 및 PCT 공개 번호 WO 2004/058184).

하기 방법이 항체의 친화도를 조정하고 CDR을 특성화하기 위해 이용될 수 있다. "라이브러리 스캐닝 돌연변이유발"로 명명되는, 항체의 CDR을 특성화하고/거나 폴리펩티드, 예컨대 항체의 결합 친화도를 변경 (예컨대, 개선)하는 하나의 방법. 일반적으로, 라이브러리 스캐닝 돌연변이유발은 다음과 같이 수행한다. CDR 내의 1개 이상의 아미노산 위치가 당업계에 인지된 방법을 이용하여 2개 이상 (예컨대, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개)의 아미노산으로 대체된다. 이것으로 클론의 소형 라이브러리가 생성되는데 (일부 실시양태에서, 분석되는 모든 아미노산 위치마다 하나씩), 각각은 2개 이상의 구성원의 복합도를 갖는다 (2개 이상의 아미노산이 모든 위치마다 치환되는 경우). 일반적으로, 라이브러리는 또한 천연 (치환되지 않은) 아미노산을 포함하는 클론을 포함한다. 각 라이브러리로부터 적은 수의 클론, 예를 들어 약 20-80개의 클론 (라이브러리의 복합도에 따라 달라짐)을 표적 폴리펩티드 (또는 다른 결합 표적)에 대한 결합 친화도에 대해 스크리닝하고, 결합이 증가되었거나 동일하거나 감소되었거나 또는 결합되지 않은 후보물질을 확인한다. 결합 친화도를 결정하는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 결합 친화도는, 예를 들어 약 2배 또는 그 초과의 결합 친화도의 차이를 검출하는 비아코어™ 표면 플라즈몬 공명 분석, 키넥사(Kinexa)® 바이오센서, 섬광 근접 검정, ELISA, 오리겐(ORIGEN)® 면역검정, 형광 켄칭, 형광 전달 및/또는 효모 디스플레이를 이용하여 결정할 수 있다. 결합 친화도는 또한 적합한 생물검정을 이용하여 스크리닝할 수 있다. 비아코어™는 출발 항체가 이미 비교적 높은 친화도, 예를 들어 약 10 nM 이하의 K_D로 결합하는 경우에 특히 유용하다.

일부 실시양태에서, CDR 내의 모든 아미노산 위치가 당업계에 인지된 돌연변이유발 방법 (일부는 본원에 기재됨)을 이용하여 모든 20종의 천연 아미노산으로 대체된다 (일부 실시양태에서, 한번에 하나씩). 이것으로 클론의 소형 라이브러리가 생성되는데 (일부 실시양태에서, 분석되는 모든 아미노산 위치마다 하나씩), 각각은 20개 구성원의 복합도를 갖는다 (모든 20종의 아미노산이 모든 위치마다 치환되는 경우).

일부 실시양태에서, 스크리닝될 라이브러리는 2개 이상의 위치에서의 치환을 포함하고, 이는 동일 CDR 내에 또는 2개 이상의 CDR 내에 존재할 수 있다. 따라서, 라이브러리는 1개의 CDR 내의 2개 이상의 위치에서의 치환을 포함할 수 있다. 라이브러리는 2개 이상의 CDR 내의 2개 이상의 위치에서의 치환을 포함할 수 있다. 라이브러리는 2, 3, 4, 5 또는 6개의 CDR에서 발견되는 3, 4, 5개 이상의 위치에서의 치환을 포함할 수 있다. 치환은 낮은 중복도의 코돈을 이용하여 생성될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Balint et al., 1993, Gene 137(1):109-18]의 표 2를 참조한다.

CDR은 중쇄 가변 영역 (VH) CDR3 및/또는 경쇄 가변 영역 (VL) CDR3일 수 있다. CDR은 VH CDR1, VH CDR2, VH CDR3, VL CDR1, VL CDR2 및/또는 VL CDR3 중 하나 이상일 수 있다. CDR은 카바트 CDR, 코티아 CDR, 확장형 CDR, AbM CDR, 접촉 CDR 또는 입체형태적 CDR일 수 있다.

결합이 개선된 후보물질을 서열분석함으로써, 친화도가 개선된 (치환이 "개선된" 것이라 불리기도 함) CDR 치환 돌연변이체를 확인할 수 있다. 결합하는 후보물질 또한 서열분석함으로써 결합이 유지되는 CDR 치환을 확인할 수 있다.

다중 라운드의 스크리닝을 수행할 수 있다. 예를 들어, 개선된 결합을 갖는 후보물질 (각각 1개 이상의 CDR의 1개 이상의 위치에서의 아미노산 치환을 포함함)은 또한 각각의 개선된 CDR 위치 (즉, 치환 돌연변이체가 개선된 결합을 나타내는 CDR 내의 아미노산 위치)에서 적어도 원래의 아미노산 및 치환된 아미노산을 함유하는 제2 라이브러리를 디자인하는데 유용하다. 상기 라이브러리의 제조, 및 스크리닝 또는 선택은 하기에 추가로 논의되어 있다.

라이브러리 스캐닝 돌연변이유발은 또한 결합이 개선되거나 동일하거나 감소되거나 또는 결합되지 않은 클론의 빈도가 또한 항체-항원 복합체의 안정성에 대한 각각의 아미노산 위치의 중요성과 관련이 있는 정보를 제공하는 한은 CDR을 특성화하는 수단을 제공한다. 예를 들어, CDR의 한 위치가 모든 20종의 아미노산으로 변화된 경우에도 결합을 유지한다면, 상기 위치는 항원 결합에 있어서 필요할 것 같지 않은 위치로서 확인된다. 반대로, CDR의 한 위치가 적은 백분율(%)의 치환에서만 결합을 유지한다면, 상기 위치는 CDR 기능에 중요한 위치로서 확인된다. 따라서, 라이브러리 스캐닝 돌연변이유발 방법은, 다수의 상이한 아미노산 (예를 들어, 모든 20종의 아미노산)으로 변화될 수 있는 CDR 내의 위치, 및 변화될 수 없거나 단지 몇개의 아미노산으로만 변화될 수 있는 CDR 내의 위치에 관한 정보를 생성한다.

개선된 친화도를 갖는 후보물질은 그 위치에서 개선된 아미노산, 본래 아미노산을 포함하는 제2 라이브러리 중에서 조합될 수 있고, 목적하는 스크리닝 또는 선택 방법을 이용하여 목적하는, 또는 허용되는 라이브러리의 복합성에 따라 그 위치에서 추가의 치환을 추가로 포함할 수 있다. 추가로, 원하는 경우에, 인접한 아미노산 위치는 적어도 둘 이상의 아미노산에 대해 무작위화될 수 있다. 인접한 아미노산의 무작위화는 돌연변이체 CDR 중 추가 형태 유연성을 허용할 수 있고, 이는 대규모의 돌연변이의 개선의 도입을 차례로 허용하거나 또는 용이하게 할 수 있다. 라이브러리는 제1 라운드의 스크리닝에서 개선된 친화도를 나타내지 않는 위치에서의 치환을 포함할 수 있다.

제2 라이브러리는 비아코어™ 표면 플라즈몬 공명 분석을 이용하는 스크리닝, 및 파지 디스플레이, 효모 디스플레이 및 리보솜 디스플레이를 비롯하여, 선택을 위해 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용하는 선택을 비롯한 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용하여 개선된 및/또는 변경된 결합 친화도를 갖는 라이브러리 구성원에 대해 스크리닝되거나 또는 선택된다.

본 발명의 GHR 항체를 발현시키기 위해, VH 및 VL 영역을 코딩하는 DNA 단편이 먼저 상기 기재된 임의의 방법을 이용하여 수득될 수 있다. 다양한 변형, 예를 들어 돌연변이, 결실 및/또는 첨가가 또한 당업자에게 공지된 표준 방법을 이용하여 DNA 서열 내에 도입될 수 있다. 예를 들어, 돌연변이유발은 표준 방법, 예컨대 PCR 매개 돌연변이유발을 이용하여 수행될 수 있고, 여기서 돌연변이된 뉴클레오티드는 PCR 프라이머 내로 혼입되어 PCR 생성물이 목적 돌연변이 또는 부위-지정 돌연변이를 함유하게 한다.

본 발명은 표 1에 나타낸 가변 영역 및 표 2에 나타낸 CDR에 대한 변형을 포괄한다. 예를 들어, 본 발명은 증진 또는 감소된 활성 및/또는 친화도를 갖는 변이체 뿐만 아니라 항체의 특성에 유의한 영향을 미치지 않는 기능적으로 동등한 가변 영역 및 CDR을 포함하는 항체를 포함한다. 예를 들어, 아미노산 서열을 돌연변이시켜 GHR에 대한 목적 결합 친화도를 갖는 항체를 수득할 수 있다. 폴리펩티드의 변형은 당업계에서 일상적인 실시이며, 본원에 상세히 기재될 필요가 없다. 변형된 폴리펩티드의 예는 아미노산 잔기가 보존적 치환되거나, 기능적 활성에 유의하게 해로운 변화를 야기하지 않는 아미노산이 1개 이상 결실 또는 부가되거나, 또는 리간드에 대한 폴리펩티드의 친화도가 성숙 (증진)되거나, 또는 화학적 유사체가 사용된 폴리펩티드를 포함한다.

아미노산 서열 삽입은 길이 범위가 1개의 잔기 내지 100개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩티드에 이르는 아미노- 및/또는 카르복실-말단 융합, 뿐만 아니라 단일 또는 다수 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입물의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체 또는 에피토프 태그에 융합된 항체를 포함한다. 항체 분자의 다른 삽입 변이체는 혈액 순환 중 항체의 반감기를 증가시키는 효소 또는 폴리펩티드의 항체 N- 또는 C-말단에의 융합을 포함한다.

치환 변이체에서는, 항체 분자 내 적어도 1개의 아미노산 잔기가 제거되고 그 위치에 상이한 잔기가 삽입된다. 치환 돌연변이유발에 가장 흥미로운 부위는 초가변 영역을 포함하지만, 프레임워크 변경도 또한 고려된다. 보존적 치환을 "보존적 치환"의 표제 하에 표 3에 나타내었다. 이러한 치환이 생물학적 활성의 변화를 일으키면, 표 3에서 "예시적인 치환"으로 명명되거나, 또는 아미노산 부류에 대해 하기 추가로 기재된 바와 같은 보다 실질적인 변화를 도입하고 생성물을 스크리닝할 수 있다.

<표 3> 아미노산 치환

항체의 생물학적 특성에 있어서의 실질적인 변형은 (a) 예를 들어 β-시트 또는 나선 입체형태로서, 치환 영역 내의 폴리펩티드 백본의 구조, (b) 표적 부위에서의 분자의 전하 또는 소수성, 또는 (c) 측쇄의 벌크를 유지하는 것에 대한 효과가 유의하게 상이한 치환을 선택함으로써 달성된다. 자연 발생 잔기는 공통적인 측쇄 특성을 기반으로 하기 군으로 분류될 수 있다:

(1) 비-극성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

(2) 전하가 없는 극성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

(3) 산성 (음으로 하전됨): Asp, Glu;

(4) 염기성 (양으로 하전됨): Lys, Arg;

(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro; 및

(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe, His.

비-보존적 치환은 이들 부류 중 하나의 구성원을 또 다른 부류로 교환하여 이루어진다.

예를 들어, 이루어질 수 있는 치환 중 한 유형은 화학적으로 반응성일 수 있는 항체 내 1개 이상의 시스테인을 또 다른 잔기, 예컨대 비제한적으로 알라닌 또는 세린으로 변화시키는 것이다. 예를 들어, 비-전형적 시스테인의 치환이 있을 수 있다. 치환은 항체의 CDR 또는 가변 도메인의 프레임워크 영역 또는 불변 영역에서 만들어질 수 있다. 일부 실시양태에서, 시스테인은 전형적인 시스테인이다. 또한, 항체의 적당한 입체형태 유지에 관여하지 않는 임의의 시스테인 잔기가 일반적으로 세린으로 치환되어 분자의 산화 안정성을 개선하고 이상 가교를 방지할 수 있다. 반대로, 시스테인 결합(들)이 항체에 부가되어 이것의 안정성을 개선할 수 있고, 특히 항체가 Fv 단편과 같은 항체 단편인 경우에 그러하다.

항체는 또한, 예를 들어 중쇄 및/또는 경쇄의 가변 도메인에서, 예를 들어 항체의 결합 특성을 변경시키기 위해 변형될 수 있다. 가변 영역에서의 변화는 결합 친화도 및/또는 특이성을 변경시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 1개 내지 5개 이하의 보존적 아미노산 치환이 CDR 도메인에서 이루어진다. 다른 실시양태에서, 1개 내지 3개 이하의 보존적 아미노산 치환이 CDR 도메인에서 이루어진다. 예를 들어, 돌연변이는 CDR 영역 중 하나 이상에서 GHR에 대한 항체의 K_D가 증가 또는 감소하도록, k_off가 증가 또는 감소하도록, 또는 항체의 결합 특이성이 변경되도록 만들어질 수 있다. 부위-지정 돌연변이유발의 기술은 당업계에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 상기 문헌 [Sambrook et al. 및 Ausubel et al.]을 참조한다.

변형 또는 돌연변이는 또한 GHR 항체의 반감기를 증가시키기 위해 프레임워크 영역 또는 불변 영역에서 만들어 질 수 있다. 예를 들어, PCT 공개 번호 WO 00/09560을 참조한다. 프레임워크 영역 또는 불변 영역에서의 돌연변이는 또한 항체의 면역원성을 변경시키거나, 또 다른 분자에의 공유 결합 또는 비-공유 결합을 위한 부위를 제공하거나, 또는 보체 고정, FcR 결합 및 항체-의존성 세포-매개된 세포독성과 같은 특성을 변경시키기 위해 만들어 질 수 있다. 본 발명에 따라, 단일 항체는 임의의 CDR 또는 가변 도메인의 프레임워크 영역 또는 불변 영역 중 하나 이상에서 돌연변이를 가질 수 있다.

변형은 또한 글리코실화 및 비-글리코실화 폴리펩티드 뿐만 아니라 다른 번역후 변형, 예컨대 다양한 당에 의한 글리코실화, 아세틸화 및 인산화를 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 항체는 불변 영역 내의 보존된 위치에서 글리코실화된다 (문헌 [Jefferis and Lund, 1997, Chem. Immunol. 65:111-128; Wright and Morrison, 1997, TibTECH 15:26-32]). 이뮤노글로불린의 올리고사카라이드 측쇄는 단백질의 기능 (문헌 [Boyd et al., 1996, Mol. Immunol. 32:1311-1318; Wittwe and Howard, 1990, Biochem. 29:4175-4180]), 및 당단백질의 일부 사이의 분자내 상호작용에 영향을 미치고, 이것은 당단백질의 입체형태 및 제시된 3차원 표면에 영향을 미칠 수 있다 (상기 문헌 [Jefferis and Lund]; 문헌 [Wyss and Wagner, 1996, Current Opin. Biotech. 7:409-416]). 올리고사카라이드는 또한 특정 인식 구조에 기반하여 주어진 당단백질을 특정 분자로 표적화하는 기능을 할 수 있다. 항체의 글리코실화는 또한 항체 의존성 세포 세포독성 (ADCC)에 영향을 미치는 것으로 보고되었다. 특히, 양분성 GlcNAc의 형성을 촉매하는 글루코실트랜스퍼라제인 β(1,4)-N-아세틸글루코스아미닐트랜스퍼라제 III (GnTIII)의 테트라실린-조절된 발현을 갖는 CHO 세포가 개선된 ADCC 활성을 갖는다는 것이 보고되었다 (문헌 [Umana et al., 1999, Nature Biotech. 17:176-180]).

항체의 글리코실화는 전형적으로 N-연결 또는 O-연결된다. N-연결은 탄수화물 모이어티가 아스파라긴 잔기의 측쇄에 부착된 것을 나타낸다. 트리펩티드 서열 아스파라긴-X-세린, 아스파라긴-X-트레오닌 및 아스파라긴-X-시스테인 (여기서, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산임)이 아스파라긴 측쇄로의 탄수화물 잔기의 효소적 부착을 위한 인식 서열이다. 따라서, 이러한 트리펩티드 서열 중 어느 하나가 폴리펩티드에 존재함으로써 잠재적인 글리코실화 부위가 생성된다. O-연결된 글리코실화는 히드록시아미노산, 가장 일반적으로는 세린 또는 트레오닌에 대한 당, N-아세틸갈락토사민, 갈락토스 또는 크실로스 중 하나의 부착을 지칭하지만, 5-히드록시프롤린 또는 5-히드록시리신도 사용될 수 있다.

항체에 글리코실화 부위를 부가하는 것은 1개 이상의 상기 기재된 트리펩티드 서열을 함유하도록 아미노산 서열을 변경시킴으로써 편리하게 달성된다 (N-연결된 글리코실화 부위의 경우). 변경은 원래의 항체의 서열에 대한 1개 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기의 부가 또는 치환에 의해 또한 달성될 수 있다 (O-연결된 글리코실화 부위의 경우).

항체의 글리코실화 패턴은 근본적인 뉴클레오티드 서열의 변경 없이 변경될 수 있다. 글리코실화는 항체의 발현에 사용된 숙주 세포에 주로 의존적이다. 잠재적인 치료물질로서 재조합 당단백질, 예를 들어 항체의 발현을 위해 사용된 세포 유형은 거의 천연 세포가 아니기 때문에, 항체의 글리코실화 패턴에서의 변화가 예상될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Hse et al., 1997, J. Biol. Chem. 272:9062-9070] 참조).

숙주 세포의 선택에 더하여, 항체의 재조합 생성 동안 글리코실화에 영향을 미치는 인자는 성장 방식, 배지 제제, 배양물 밀도, 산소 공급, pH, 정제 계획 등을 포함한다. 올리고당 생산과 관련된 특정 효소의 도입 또는 과발현을 비롯하여 특정 숙주 유기체에서 달성된 글리코실화 패턴을 변경하기 위해 다양한 방법이 제안되어 왔다 (미국 특허 번호 5,047,335; 5,510,261 및 5,278,299). 글리코실화, 또는 특정 유형의 글리코실화는, 예를 들어 엔도글리코시다제 H (Endo H), N-글리코시다제 F, 엔도글리코시다제 F1, 엔도글리코시다제 F2, 엔도글리코시다제 F3을 사용하여 당단백질로부터 효소에 의해 제거될 수 있다. 또한, 재조합 숙주 세포는 특정 유형의 폴리사카라이드의 프로세싱에 결함이 있도록 유전자 조작될 수 있다. 이들 기술 및 유사 기술은 당업계에 널리 공지되어 있다.

다른 변형 방법은 효소적 수단, 산화적 치환 및 킬레이트화를 포함하지만 이에 제한되지는 않는, 당업계에 공지된 커플링 기술을 이용하는 것을 포함한다. 변형은, 예를 들어 면역검정을 위한 표지의 부착을 위해 사용될 수 있다. 당업계의 확립된 절차를 사용하여 변형된 폴리펩티드가 제조되고, 당업계에 공지된 표준 검정을 이용하여 스크리닝될 수 있으며, 그의 일부가 이하 및 실시예에 기재되어 있다.

일부 실시양태에서, 항체는, 인간 Fc 감마 수용체에 대해 증가 또는 감소된 결합 친화도를 갖고, 면역학적으로 불활성 또는 부분적으로 불활성 (예를 들어, 보체 매개 용해를 촉발하지 않거나, 항체-의존 세포 매개 세포독성 (ADCC)을 자극하지 않거나, 또는 소교세포를 활성화하지 않음)이거나; 또는 하기: 보체 매개 용해를 촉발하는 것, ADCC를 자극하는 것, 또는 소교세포를 활성화하는 것 중 임의의 하나 이상에서 (비변형된 항체와 비교시) 감소된 활성을 갖는 변형된 불변 영역을 포함한다. 불변 영역의 다양한 변형을 이용하여 최적 수준 및/또는 이펙터 기능의 조합을 달성할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Morgan et al., Immunology 86:319-324, 1995; Lund et al., J. Immunology 157:4963-9 157:4963-4969, 1996; Idusogie et al., J. Immunology 164:4178-4184, 2000; Tao et al., J. Immunology 143: 2595-2601, 1989; 및 Jefferis et al., Immunological Reviews 163:59-76, 1998]을 참조한다. 일부 실시양태에서, 불변 영역은 문헌 [Eur. J. Immunol., 1999, 29:2613-2624]; PCT 출원 번호 PCT/GB99/01441; 및/또는 UK 특허 출원 번호 9809951.8에 기재된 바와 같이 변형된다.

일부 실시양태에서, 항체 불변 영역은 Fc 감마 수용체와 보체 및 면역계의 상호작용을 회피하기 위해 변형될 수 있다. 이러한 항체를 제조하는 기술은 WO 99/58572에 기재되어 있다. 예를 들어, 항체가 인간에서의 임상 실험 및 치료에 사용되는 경우에는 면역 반응을 피하기 위해 불변 영역이 인간 불변 영역과 더 유사하도록 조작할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,997,867 및 5,866,692를 참조한다.

일부 실시양태에서, 불변 영역은 문헌 [Eur. J. Immunol., 1999, 29:2613-2624]; PCT 출원 번호 PCT/GB99/01441; 및/또는 UK 특허 출원 번호 9809951.8에 기재된 바와 같이 변형된다. 이러한 실시양태에서, Fc는 인간 IgG₂ 또는 인간 IgG₄일 수 있다. Fc는 돌연변이 A330P331 → S330S331을 함유하는 인간 IgG2 (IgG_{2 Δa})일 수 있다 (여기서, 아미노산 잔기는 야생형 IgG₂ 서열에 대해 넘버링됨). 문헌 [Eur. J. Immunol., 1999, 29:2613-2624]. 일부 실시양태에서, 항체는 하기 돌연변이를 포함하는 IgG₄의 불변 영역을 포함한다 (문헌 [Armour et al., 2003, Molecular Immunology 40 585-593]): E233F234L235 → P233V234A235 (IgG_4Δc) (여기서, 넘버링은 야생형 IgG₄에 대한 것임). 또 다른 실시양태에서, Fc는 결실 G236을 갖는 인간 IgG₄ E233F234L235 → P233V234A235 (IgG_4Δb)이다. 또 다른 실시양태에서, Fc는 힌지 안정화 돌연변이 S228 → P228을 함유하는 임의의 인간 IgG₄ Fc (IgG₄, IgG_{4Δ b} 또는 IgG_4Δc)이다 (문헌 [Aalberse et al., 2002, Immunology 105, 9-19]).

일부 실시양태에서, 항체는 하기 돌연변이: A330P331 → S330S331 (야생형 IgG₂ 서열에 대한 아미노산 넘버링)를 포함하는 인간 중쇄 IgG₂ 불변 영역을 포함한다. 문헌 [Eur. J. Immunol., 1999, 29:2613-2624]. 또 다른 실시양태에서, 불변 영역은 N-연결 글리코실화에 대해 비-글리코실화된다. 일부 실시양태에서, 불변 영역은 불변 영역 중 N-글리코실화 인식 서열의 일부인 글리코실화된 아미노산 잔기 또는 플랭킹 잔기의 돌연변이에 의해 N-연결된 글리코실화에 대해 비-글리코실화된다. 예를 들어, N-글리코실화 부위 N297은 A, Q, K 또는 H로 돌연변이 될 수 있다. 문헌 [Tao et al., J. Immunology 143: 2595-2601, 1989; 및 Jefferis et al., Immunological Reviews 163:59-76, 1998]을 참조한다. 일부 실시양태에서, 불변 영역은 N-연결 글리코실화에 대해 비-글리코실화된다. 불변 영역은 효소적으로 (예컨대, 효소 PNGase에 의해 탄수화물을 제거함), 또는 글리코실화 결핍 숙주 세포에서의 발현에 의해 N-연결 글리코실화에 대해 비-글리코실화될 수 있다.

다른 항체 변형은 PCT 공개 번호 WO 99/58572에 기재된 바와 같이 변형된 항체를 포함한다. 이들 항체는 표적 분자에서 지시된 결합 도메인에 더하여, 인간 이뮤노글로불린 중쇄의 불변 영역 모두 또는 일부에 실질적으로 상동인 아미노산 서열을 갖는 이펙터 도메인을 포함한다. 이들 항체는 유의한 보체 의존적 용해, 또는 표적의 세포 매개 파괴를 촉발하지 않으면서 표적 분자에 결합할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이펙터 도메인은 FcRn 및/또는 FcγRIIb에 특이적으로 결합할 수 있다. 이들은 전형적으로 2개 이상의 인간 이뮤노글로불린 중쇄 CH2 도메인으로부터 유래된 키메라 도메인에 기반한다. 상기 방식으로 변형된 항체는 통상의 항체 요법에 대한 염증성 반응 및 다른 부작용을 피하기 위해 장기간의 항체 요법에서 사용하기에 특히 적합하다.

일부 실시양태에서, 항체는 비변형된 항체와 비교시 FcRn에 대한 증가된 결합 친화도 및/또는 증가된 혈청 반감기를 갖는 변형된 불변 영역을 포함한다.

"배선화"로 공지된 과정에서, VH 및 VL 서열 내의 특정 아미노산이 배선 VH 및 VL 서열에서 천연에서 발견되는 것들과 매치하도록 돌연변이될 수 있다. 특히, VH 및 VL 서열 내의 프레임워크 영역의 아미노산 서열은 항체 투여시 면역원성의 위험을 감소시키기 위해 배선 서열과 매치되도록 돌연변이될 수 있다. 인간 VH 및 VL 유전자에 대한 배선 DNA 서열은 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, "Vbase" 인간 배선 서열 데이터베이스 참조; 또한 문헌 [Kabat, E. A., et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Tomlinson et al., 1992, J. Mol. Biol. 227:776-798; 및 Cox et al., 1994, Eur. J. Immunol. 24:827-836] 참조).

이루어질 수 있는 또 다른 유형의 아미노산 치환은 항체 내의 잠재적인 단백질분해 부위를 제거하는 것이다. 이러한 부위는 가변 도메인의 CDR 또는 프레임워크 영역 또는 항체의 불변 영역에서 발생할 수 있다. 시스테인 잔기의 치환 및 단백질분해 부위의 제거는 항체 생성물 내 불균질성의 위험을 감소시킬 수 있고, 따라서 그의 균질성을 증가시킬 수 있다. 또 다른 유형의 아미노산 치환은 잔기 중 하나 또는 둘 다를 변경함으로써 잠재적인 탈아미드화 부위를 형성하는 아스파라긴-글리신 쌍을 제거하는 것이다. 또 다른 예에서, 본 발명의 GHR 항체의 중쇄의 C-말단 리신은 절단될 수 있다. 본 발명의 다양한 실시양태에서, GHR 항체의 중쇄 및 경쇄는 임의로 신호 서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 VH 및 VL 절편을 코딩하는 DNA 단편이 일단 수득되면, 이들 DNA 단편을 표준 재조합 DNA 기술에 의해 추가로 조작하여, 예를 들어 가변 영역 유전자를 전장 항체 쇄 유전자, Fab 단편 유전자 또는 scFv 유전자로 전환시킬 수 있다. 이들 조작에서, VL- 또는 VH-코딩 DNA 단편은 또 다른 단백질, 예컨대 항체 불변 영역 또는 가요성 링커를 코딩하는 또 다른 DNA 단편에 작동가능하게 연결된다. 이와 관련하여 사용된 용어 "작동가능하게 연결된"은 2개의 DNA 단편에 의해 코딩된 아미노산 서열이 인-프레임으로 유지되도록 이들 2개의 DNA 단편을 연결하는 것을 의미하는 것으로 의도된다.

VH 영역을 코딩하는 단리된 DNA는 VH-코딩 DNA를 중쇄 불변 영역 (CH1, CH2 및 CH3)을 코딩하는 또 다른 DNA 분자에 작동가능하게 연결시킴으로써 전장 중쇄 유전자로 전환시킬 수 있다. 인간 중쇄 불변 영역 유전자의 서열은 당업계에 공지되어 있고 (예를 들어, 문헌 [Kabat, E. A., et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242] 참조), 이들 영역을 포함하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 수득될 수 있다. 중쇄 불변 영역은 IgG₁, IgG₂, IgG₃, IgG₄, IgA, IgE, IgM 또는 IgD 불변 영역일 수 있지만, 가장 바람직하게는 IgG₁ 또는 IgG₂ 불변 영역이다. IgG 불변 영역 서열은 여러 개체 간에 발생하는 것으로 공지된 임의의 다양한 대립유전자 및 동종이형, 예컨대 Gm(1), Gm(2), Gm(3) 및 Gm(17)일 수 있다. 이러한 동종이형은 IgG1 불변 영역에서의 자연 발생 아미노산 치환을 나타낸다. Fab 단편 중쇄 유전자의 경우에, VH-코딩 DNA는 중쇄 CH1 불변 영역만을 코딩하는 또 다른 DNA 분자에 작동가능하게 연결될 수 있다. CH1 중쇄 불변 영역은 임의의 중쇄 유전자로부터 유래될 수 있다.

VL 영역을 코딩하는 단리된 DNA는 VL-코딩 DNA를 경쇄 불변 영역 CL을 코딩하는 또 다른 DNA 분자에 작동가능하게 연결시킴으로써 전장 경쇄 유전자 (및 또한 Fab 경쇄 유전자)로 전환시킬 수 있다. 인간 중쇄 불변 영역 유전자의 서열은 당업계에 공지되어 있고 (예를 들어, 문헌 [Kabat, E. A., et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242] 참조), 이들 영역을 포함하는 DNA 단편은 표준 PCR 증폭에 의해 수득될 수 있다. 경쇄 불변 영역은 카파 또는 람다 불변 영역일 수 있다. 카파 불변 영역은 여러 개체 간에 발생하는 것으로 공지된 임의의 다양한 대립유전자, 예컨대 Inv(1), Inv(2) 및 Inv(3)일 수 있다. 람다 불변 영역은 임의의 3개의 람다 유전자로부터 유래될 수 있다.

scFv 유전자를 생성하기 위해, VH- 및 VL-코딩 DNA 단편을 가요성 링커를 코딩하는 또 다른 단편에 작동가능하게 연결시켜, VH 및 VL 서열이 가요성 링커에 의해 연결된 VL 및 VH 영역을 갖는 인접 단일-쇄 단백질로 발현될 수 있게 한다 (예를 들어, 문헌 [Bird et al., 1988, Science 242:423-426; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al., 1990, Nature 348:552-554] 참조). 연결 펩티드의 예는 하나의 가변 영역의 카르복시 말단과 다른 가변 영역의 아미노 말단 간에 약 3.5 nm에 걸쳐 있는 (GGGGS)₃ (서열 144)이다. 다른 서열의 링커가 고안되고 사용된다 (상기 문헌 [Bird et al., 1988]). 이후, 링커는 추가의 기능, 예컨대 약물의 부착 또는 고체 지지체에 대한 부착을 위해 변형될 수 있다. 단일 쇄 항체는 단일 VH 및 VL만이 사용되는 경우에는 1가, 2개의 VH 및 VL이 사용되는 경우에는 2가, 또는 2개 초과의 VH 및 VL이 사용되는 경우에는 다가일 수 있다. GHR 및 또 다른 분자에 특이적으로 결합하는 이중특이적 또는 다가 항체가 생성될 수 있다. 단일 쇄 변이체는 재조합 방식으로 또는 합성 방식으로 생성될 수 있다. scFv를 합성 방식으로 생성하는 경우에, 자동화된 합성기가 사용될 수 있다. scFv를 재조합 방식으로 생성하는 경우에, scFv를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 적합한 플라스미드가 효모, 식물, 곤충 또는 포유동물 세포와 같은 진핵생물 또는 이. 콜라이와 같은 원핵생물의 적합한 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 관심 scFv를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드의 라이게이션과 같은 통상의 조작에 의해 제조될 수 있다. 생성된 scFv를 당업계에 공지된 표준 단백질 정제 기술로 단리할 수 있다.

단일 쇄 항체의 다른 형태, 예컨대 디아바디가 또한 포함된다. 디아바디는 VH 및 VL 도메인이 단일 폴리펩티드 쇄에서 발현되지만, 동일 쇄의 2개의 도메인 사이에서 쌍형성을 허용하기에는 지나치게 짧은 링커를 사용함으로써 상기 도메인이 또 다른 쇄의 상보적 도메인과 쌍을 형성하게 하여 2개의 항원 결합 부위를 형성하는 2가의 이중특이적 항체이다 (예를 들어, 문헌 [Holliger, P., et al., 1993, Proc. Natl. Acad Sci. USA 90:6444-6448; Poljak, R. J., et al., 1994, Structure 2:1121-1123] 참조).

2개의 공유적으로 연결된 항체를 포함하는 이종접합 항체 또한 본 발명의 범위 내에 속한다. 이러한 항체는 원치않는 세포에 대해 면역계 세포를 표적화하고 (미국 특허 번호 4,676,980), HIV 감염을 치료하는데 (PCT 공개 번호 WO 91/00360 및 WO 92/200373; EP 03089) 사용되어 왔다. 이종접합체 항체는 임의의 편리한 가교 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 적합한 가교제 및 기술은 당업계에 잘 알려져 있으며, 미국 특허 번호 4,676,980에 기재되어 있다.

가교제를 사용하는 방법을 비롯한 합성 단백질 화학의 공지된 방법을 이용하여 키메라 또는 하이브리드 항체가 또한 시험관내 제조될 수 있다. 예를 들어, 디술피드 교환 반응을 이용하거나 티오에테르 결합을 형성하여 면역독소를 구축할 수 있다. 상기 목적에 적합한 시약의 예는 이미노티올레이트 및 메틸-4-메르캅토부티르이미데이트를 포함한다.

본 발명은 또한 본원에 개시된 항체로부터의 하나 이상의 단편 또는 영역을 포함하는 융합 단백질을 포괄한다. 일부 실시양태에서, 또 다른 폴리펩티드에 연결된 본 발명의 GHR 항체의 전부 또는 일부를 포함하는 융합 항체를 제조할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, GHR 항체의 가변 도메인만이 폴리펩티드에 연결된다. 또 다른 실시양태에서, GHR 항체의 VH 도메인은 제1 폴리펩티드에 연결되지만, GHR 항체의 VL 도메인은 VH 및 VL 도메인이 서로 상호작용하여 항원 결합 부위를 형성할 수 있도록 하는 방식으로 제1 폴리펩티드와 회합되는 제2 폴리펩티드에 연결된다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, VH 및 VL 도메인이 서로 상호작용할 수 있도록 VH 도메인이 링커에 의해 VL 도메인으로부터 분리된다. 이어서, VH-링커-VL 항체가 관심 폴리펩티드에 연결된다. 또한, 2개 (또는 그 초과의) 단일-쇄 항체가 서로 연결된 융합 항체가 생성될 수 있다. 이는 단일 폴리펩티드 쇄 상의 2가 또는 다가 항체를 생성하기를 원하거나 또는 이중특이적 항체를 생성하기를 원하는 경우에 유용하다.

일부 실시양태에서, 서열 7, 9, 11, 13 또는 14에 나타낸 가변 경쇄 영역의 10개 이상의 인접 아미노산 및/또는 서열 8, 10 또는 12에 나타낸 가변 중쇄 영역의 10개 이상의 인접 아미노산을 포함하는 융합 폴리펩티드가 제공된다. 다른 실시양태에서, 가변 경쇄 영역의 적어도 약 10개, 적어도 약 15개, 적어도 약 20개, 적어도 약 25개 또는 적어도 약 30개의 인접 아미노산 및/또는 가변 중쇄 영역의 적어도 약 10개, 적어도 약 15개, 적어도 약 20개, 적어도 약 25개 또는 적어도 약 30개의 인접 아미노산을 포함하는 융합 폴리펩티드가 제공된다. 또 다른 실시양태에서, 융합 폴리펩티드는 서열 7 및 8, 9 및 10, 11 및 12, 13 및 8, 및 14 및 8로부터 선택된 임의의 서열 쌍에서 나타난 바와 같은 경쇄 가변 영역 및/또는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 융합 폴리펩티드는 1개 이상의 CDR(들)을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 융합 폴리펩티드는 VH CDR3 및/또는 VL CDR3을 포함한다. 본 발명의 목적상, 융합 단백질은 하나 이상의 항체, 및 천연 분자에서는 부착되지 않는 또 다른 아미노산 서열, 예를 들어 또 다른 영역으로부터의 이종 서열 또는 상동 서열을 함유한다. 예시적인 이종 서열은 "태그", 예컨대 FLAG 태그 또는 6His 태그를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 태그는 당업계에 공지되어 있다.

융합 폴리펩티드는 당업계에 공지된 방법에 의해, 예를 들어 합성 방식으로 또는 재조합 방식으로 생성될 수 있다. 전형적으로, 본 발명의 융합 단백질은 본원에 기재된 재조합 방법을 이용하여 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 발현시켜 제조될 수 있지만, 예를 들어 화학적 합성을 비롯한 당업계에 공지된 다른 수단에 의해 제조될 수도 있다.

다른 실시양태에서, 다른 변형된 항체는 핵산 분자를 코딩하는 GHR 항체를 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서의 교시에 따라 표준 분자 생물학 기술을 이용하여 "카파 바디" (문헌 [Ill et al., 1997, Protein Eng. 10:949-57]), "미니바디" (문헌 [Martin et al., 1994, EMBO J. 13:5303-9]), "디아바디" (상기 문헌 [Holliger et al.]) 또는 "야누신(Janusin)" (문헌 [Traunecker et al., 1991, EMBO J. 10:3655-3659 및 Traunecker et al., 1992, Int. J. Cancer (Suppl.) 7:51-52])이 제조될 수 있다.

예를 들어, 적어도 2종의 상이한 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 모노클로날 항체인 이중특이적 항체는 본원에 개시된 항체를 이용하여 제조될 수 있다. 이중특이적 항체의 제조 방법은 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Suresh et al., 1986, Methods in Enzymology 121:210] 참조). 예를 들어, 이중특이적 항체 또는 항원-결합 단편은 하이브리도마의 융합 또는 Fab' 단편의 연결에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Songsivilai & Lachmann, 1990, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321, Kostelny et al., 1992, J. Immunol. 148:1547-1553]을 참조한다. 전통적으로, 이중특이적 항체의 재조합 생성은 2종의 이뮤노글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 공발현에 기반하였으며, 이때 2개의 중쇄는 상이한 특이성을 갖는다 (문헌 [Millstein and Cuello, 1983, Nature 305, 537-539]). 또한, "디아바디" 또는 "야누신"으로서 이중특이적 항체가 형성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 이중특이적 항체는 GHR의 2개의 상이한 에피토프에 결합한다. 일부 실시양태에서, 상기 기재된 변형된 항체는 본원에 제공된 인간 GHR 항체의 가변 도메인 또는 CDR 영역 중 하나 이상을 사용하여 제조된다.

이중특이적 항체를 제조하는 한 접근법에 따라, 목적하는 결합 특이성을 갖는 항체 가변 도메인 (항체-항원 조합 부위)은 이뮤노글로불린 불변 영역 서열에 융합된다. 융합은, 바람직하게는 힌지, CH2 및 CH3 영역의 적어도 일부를 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 불변 영역을 갖는다. 경쇄 결합에 필요한 부위를 함유하는 제1 중쇄 불변 영역 (CH1)이 1개 이상의 융합물 내에 존재하도록 하는 것이 바람직하다. 이뮤노글로불린 중쇄 융합물 및 원하는 경우에 이뮤노글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA는 별개의 발현 벡터 내로 삽입되고, 적합한 숙주 유기체 내로 공동 형질감염된다. 이것은 구축에 사용된 3종의 폴리펩티드 쇄의 동일하지 않은 비가 최적의 수율을 제공하는 실시양태에서 상기 3종의 폴리펩티드 단편의 상호 비를 조절하는데 있어서 큰 유연성을 제공한다. 그러나, 동일한 비의 적어도 2종의 폴리펩티드 쇄의 발현으로 높은 수율이 수득되는 경우에, 또는 비가 특정한 유의성을 갖지 않는 경우에, 2종 또는 모든 3종의 폴리펩티드 쇄에 대한 코딩 서열을 1개의 발현 벡터에 삽입할 수 있다.

한 접근법에서, 이중특이적 항체는 한쪽 아암 내의 제1 결합 특이성을 갖는 하이브리드 이뮤노글로불린 중쇄, 및 다른쪽 아암 내의 하이브리드 이뮤노글로불린 중쇄-경쇄 쌍 (제2 결합 특이성 제공)으로 이루어진다. 이중특이적 분자의 한쪽 절반에만 이뮤노글로불린 경쇄가 있는 이러한 비대칭 구조는 원치않는 이뮤노글로불린 쇄 조합물로부터 목적 이중특이적 화합물을 분리하는 것을 용이하게 한다. 상기 접근법은 PCT 공개 번호 WO 94/04690에 기재되어 있다.

본 발명은 또한 고체 지지체 (예컨대, 비오틴 또는 아비딘)에 대한 커플링을 용이하게 하는 작용제에 접합된 (예를 들어, 연결된) 항체를 포함하는 조성물을 제공한다. 간단히, 이들 방법이 본원에 기재된 임의의 GHR 결합 및/또는 길항제 실시양태에 적용되는 점을 이해하면서 일반적으로 항체를 참조할 것이다. 접합은 일반적으로 본원에 기재된 바와 같은 성분들을 연결시키는 것을 지칭한다. 연결 (일반적으로, 적어도 투여를 위해 이러한 성분들을 근접한 관계로 고정시킴)은 임의의 수의 방법으로 달성될 수 있다. 예를 들어, 작용제 및 항체가 각각 서로 반응할 수 있는 치환기를 보유하는 경우에, 이러한 작용제와 항체 사이의 직접 반응이 가능하다. 예를 들어, 한쪽의 친핵성 기, 예컨대 아미노 또는 술프히드릴 기는, 다른쪽의 카르보닐-함유 기, 예컨대 무수물 또는 산 할라이드, 또는 우수한 이탈기 (예를 들어, 할라이드)를 함유하는 알킬 기와 반응할 수 있다.

항체는 다수의 다양한 담체에 결합될 수 있다. 담체는 활성 및/또는 불활성일 수 있다. 널리 공지된 담체의 예는 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 덱스트란, 나일론, 아밀라제, 유리, 천연 및 변형된 셀룰로스, 폴리아크릴아미드, 아가로스 및 자철광을 포함한다. 담체의 성질은 본 발명의 목적을 위해 가용성 또는 불용성일 수 있다. 당업자는 항체를 결합시키기 위한 다른 적합한 담체를 알고 있거나, 또는 일상적인 실험을 통해 이를 확인할 수 있을 것이다.

본 발명의 항체 또는 폴리펩티드는 표지제, 예컨대 형광 분자, 방사성 분자 또는 당업계에 공지된 임의의 다른 표지에 연결될 수 있다. 표지는 당업계에 공지되어 있고, 이는 일반적으로 신호를 (직접 또는 간접적으로) 제공한다.

폴리뉴클레오티드, 벡터 및 숙주 세포

본 발명은 또한 본원에 기재된 항체 단편 및 변형된 항체, 예컨대 예를 들어 손상된 이펙터 기능을 갖는 항체를 비롯한 임의의 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 임의의 폴리뉴클레오티드를 제조하는 방법을 제공한다. 폴리뉴클레오티드는 당업계에 공지된 절차에 따라 제조 및 발현될 수 있다. 따라서, 본 발명은 다음 중의 어느 것을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드 (또는 제약 조성물을 포함하는 조성물)를 제공한다: 항체 SS1, SS3, SS4, TM1 또는 TM9, 또는 GHR에 대해 길항작용을 하는 능력을 갖는 그의 임의의 단편 또는 부분.

임의의 이러한 서열에 상보적인 폴리뉴클레오티드 역시 본 발명에 포함된다. 폴리뉴클레오티드는 단일 가닥 (코딩 또는 안티센스) 또는 이중 가닥일 수 있고, DNA (게놈, cDNA 또는 합성) 또는 RNA 분자일 수 있다. RNA 분자는 인트론을 함유하고 1:1 방식으로 DNA 분자에 상응하는 HnRNA 분자, 및 인트론을 함유하지 않는 mRNA 분자를 포함한다. 추가의 코딩 또는 비-코딩 서열이 본 발명의 폴리뉴클레오티드 내에 존재할 수 있으나 반드시 그럴 필요는 없고, 폴리뉴클레오티드는 다른 분자 및/또는 지지 물질에 연결될 수 있으나 반드시 그럴 필요는 없다.

폴리뉴클레오티드는 천연 서열 (즉, 항체 또는 그의 일부분을 코딩하는 내인성 서열)을 포함할 수 있거나, 또는 이러한 서열의 변이체를 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드 변이체는 코딩되는 폴리펩티드의 면역반응성이 천연 면역반응성 분자에 비해 감소되지 않도록 1개 이상의 치환, 부가, 결실 및/또는 삽입을 함유한다. 코딩되는 폴리펩티드의 면역반응성에 대한 효과는 일반적으로 본원에 기재된 바와 같이 하여 평가될 수 있다. 변이체는 천연 항체 또는 그의 일부분을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 대해 바람직하게는 적어도 약 70% 동일성, 보다 바람직하게는 적어도 약 80% 동일성, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 90% 동일성, 가장 바람직하게는 적어도 약 95% 동일성을 나타낸다.

2개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열은, 2개의 서열 내 뉴클레오티드 또는 아미노산의 서열이 하기 기재된 바와 같이 최대한 상응하게 정렬되었을 때 동일한 경우에 "동일"하다고 일컬어진다. 전형적으로, 2개의 서열 사이의 비교는 비교 윈도우에서 서열들을 비교하여 서열 유사성의 국소 영역을 확인하고 비교함으로써 수행된다. 본원에서 사용된 바와 같이, "비교 윈도우"는 적어도 약 20개의 인접 위치, 통상적으로는 30개 내지 약 75개, 또는 40개 내지 약 50개 인접 위치의 절편을 지칭하고, 여기서 2개의 서열을 최적으로 정렬한 후에 서열을 인접 위치의 수가 동일한 참조 서열과 비교할 수 있다.

비교를 위한 서열들의 최적 정렬은, 디폴트 파라미터를 사용하여 생물정보학 소프트웨어의 레이저진(Lasergene)® 스위트 내의 메그얼라인(MegAlign)® 프로그램 (디엔에이스타®, 인크.(DNASTAR®, Inc.), 위스콘신주 매디슨)을 이용하여 수행될 수 있다. 이러한 프로그램은 하기 참고문헌에 기재된 여러 정렬 기법을 구현한다: 문헌 [Dayhoff, M.O., 1978, A model of evolutionary change in proteins - Matrices for detecting distant relationships. Dayhoff, M.O. (ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC Vol. 5, Suppl. 3, pp. 345-358; Hein J., 1990, Unified Approach to Alignment and Phylogenes pp. 626-645 Methods in Enzymology vol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Higgins, D.G. and Sharp, P.M., 1989, CABIOS 5:151-153; Myers, E.W. and Muller W., 1988, CABIOS 4:11-17; Robinson, E.D., 1971, Comb. Theor. 11:105; Santou, N., Nes, M., 1987, Mol. Biol. Evol. 4:406-425; Sneath, P.H.A. and Sokal, R.R., 1973, Numerical Taxonomy the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA; Wilbur, W.J. and Lipman, D.J., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:726-730].

바람직하게는, "서열 동일성 백분율"은 적어도 20개 위치의 비교 윈도우에서 2개의 최적으로 정렬된 서열들을 비교하여 결정되고, 여기서 비교 윈도우 내의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열의 일부는 2개 서열의 최적의 정렬을 위해 참조 서열 (부가 또는 결실을 포함하지 않음)과 비교시 20% 이하, 일반적으로는 5% 내지 15%, 또는 10% 내지 12%의 부가 또는 결실 (즉, 갭)을 포함할 수 있다. 상기 백분율은 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 2개 서열 모두에 존재하는 위치의 수를 결정하여 매칭되는 위치의 수를 산출하고, 매칭된 위치의 수를 참조 서열 내의 위치의 총 수 (즉, 윈도우 크기)로 나누고, 그 결과에 100을 곱하여 서열 동일성 백분율을 산출함으로써 계산된다.

변이체는 또한 또는 다르게는, 천연 유전자, 또는 그의 일부 또는 상보체에 실질적으로 상동성일 수 있다. 이러한 폴리뉴클레오티드 변이체는 천연 항체를 코딩하는 자연 발생 DNA 서열 (또는 상보적 서열)에 중간 정도의 엄격한 조건 하에 혼성화될 수 있다.

적합한 "중간 정도의 엄격한 조건"은 5x SSC, 0.5% SDS, 1.0 mM EDTA (pH 8.0)의 용액에서 예비세척하고; 50℃-65℃, 5x SSC에서 하룻밤 동안 혼성화시킨 후; 0.1% SDS를 함유하는 각각의 2x, 0.5x 및 0.2x SSC로 65℃에서 20분 동안 2회 세척하는 것을 포함한다.

본원에 사용된 "고도로 엄격한 조건 " 또는 "고 엄격도 조건"은 (1) 세척시 낮은 이온 강도 및 높은 온도, 예를 들어 50℃에서 0.015 M 염화나트륨/0.0015 M 시트르산나트륨/0.1% 나트륨 도데실 술페이트를 사용하거나, (2) 혼성화 동안에 예를 들어 42℃에서 포름아미드, 예를 들어 0.1% 소 혈청 알부민/0.1% 피콜(Ficoll)/0.1% 폴리비닐피롤리돈/750 mM 염화나트륨, 75 mM 시트르산나트륨을 함유하는 50 mM 인산나트륨 완충제 (pH 6.5)를 함유하는 50% (v/v) 포름아미드와 같은 변성제를 사용하거나, 또는 (3) 42℃에서 50% 포름아미드, 5x SSC (0.75 M NaCl, 0.075 M 시트르산나트륨), 50 mM 인산나트륨 (pH 6.8), 0.1% 피로인산나트륨, 5x 덴하르트(Denhardt's) 용액, 초음파처리된 연어 정자 DNA (50 μg/mL), 0.1% SDS 및 10% 덱스트란 술페이트를 사용하고 42℃에서 0.2x SSC (염화나트륨/시트르산나트륨) 및 50% 포름아미드 중에 세척한 후에, 55℃에서 EDTA가 함유된 0.1x SSC로 이루어진 고 엄격도 세척을 수행한다. 당업자는 프로브 길이 등과 같은 인자를 조정하기 위해 필요한 온도, 이온 강도 등의 조정 방법을 알 것이다.

유전자 코드의 축중성으로 인해 본원에 기재된 바와 같은 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 여럿 존재한다는 것을 당업자는 이해할 것이다. 이러한 폴리뉴클레오티드 중 일부는 임의의 천연 유전자의 뉴클레오티드 서열에 대해 최소의 상동성을 갖는다. 그럼에도 불구하고, 코돈 사용에서의 차이로 인해 달라지는 폴리뉴클레오티드가 본 발명에서 구체적으로 고려된다. 추가로, 본원에서 제공되는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자의 대립유전자는 본 발명의 범위 내에 속한다. 대립유전자는 뉴클레오티드의 1개 이상의 돌연변이, 예컨대 결실, 부가 및/또는 치환의 결과로서 변경된 내인성 유전자이다. 생성된 mRNA 및 단백질은 구조 또는 기능이 변경될 수 있지만, 반드시 그러할 필요는 없다. 대립유전자는 표준 기술 (예컨대, 혼성화, 증폭 및/또는 데이터베이스 서열 비교)을 이용하여 확인될 수 있다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 화학적 합성, 재조합 방법 또는 PCR을 이용하여 수득될 수 있다. 화학적 폴리뉴클레오티드 합성 방법은 당업계에 공지되어 있고, 본원에 상세하게 기재될 필요가 없다. 당업자는 본원에서 제공되는 서열 및 시판되는 DNA 합성기를 사용하여 목적 DNA 서열을 생성할 수 있다.

재조합 방법을 이용하여 폴리뉴클레오티드를 제조하는 경우에, 본원에 추가로 논의된 바와 같이, 목적 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 적합한 벡터 내에 삽입할 수 있고, 이어서 상기 벡터를 복제 및 증폭을 위해 적합한 숙주 세포 내로 도입할 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 당업계에 공지된 임의의 수단에 의해 숙주 세포 내로 삽입될 수 있다. 직접 흡수, 세포내 이입, 형질감염, F-접합 또는 전기천공에 의해 외인성 폴리뉴클레오티드를 도입하여 세포를 형질전환시킨다. 외인성 폴리뉴클레오티드는 일단 도입되면 세포 내에서 비-통합 벡터 (예컨대, 플라스미드)로서 유지될 수 있거나, 또는 숙주 세포 게놈 내로 통합될 수 있다. 이와 같이 증폭된 폴리뉴클레오티드는 당업계에 공지된 방법에 의해 숙주 세포로부터 단리될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Sambrook et al., 1989]을 참조한다.

다르게는, PCR은 DNA 서열의 재생산을 허용한다. PCR 기술은 당업계에 널리 공지되어 있고, 미국 특허 번호 4,683,195, 4,800,159, 4,754,065 및 4,683,202, 뿐만 아니라 문헌 [PCR: The Polymerase Chain Reaction, Mullis et al. eds., Birkauswer Press, Boston, 1994]에 기재되어 있다.

RNA는 적합한 벡터 내의 단리된 DNA를 사용하여 이를 적합한 숙주 세포 내로 삽입함으로써 수득할 수 있다. 세포가 복제되고 DNA가 RNA로 전사되면, 예를 들어 상기 문헌 [Sambrook et al., 1989]에 제시된 바와 같이 당업자에게 공지된 방법을 이용하여 RNA를 단리할 수 있다.

적합한 클로닝 벡터는 표준 기술에 따라 구축될 수 있거나, 또는 당업계에서 이용가능한 다수의 클로닝 벡터로부터 선택될 수 있다. 선택된 클로닝 벡터는 사용하고자 하는 숙주 세포에 따라 달라질 수 있지만, 유용한 클로닝 벡터는 일반적으로 자가-복제 능력을 갖고/갖거나 특정 제한 엔도뉴클레아제에 대한 단일 표적을 보유할 수 있고/있거나 벡터를 함유하는 클론을 선택하는데 사용될 수 있는 마커에 대한 유전자를 보유할 수 있다. 적합한 예는 플라스미드 및 박테리아 바이러스, 예를 들어 pUC18, pUC19, 블루스크립트(Bluescript) (예를 들어, pBS SK+) 및 그의 유도체, mp18, mp19, pBR322, pMB9, ColE1, pCR1, RP4, 파지 DNA, 및 셔틀 벡터, 예컨대 pSA3 및 pAT28을 포함한다. 이러한 클로닝 벡터 및 다수의 다른 클로닝 벡터는 바이오라드(BioRad), 스트라테진(Strategene) 및 인비트로젠(Invitrogen)과 같은 판매업체로부터 입수가능하다.

발현 벡터가 추가로 제공된다. 발현 벡터는 일반적으로 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드를 함유하는 복제가능한 폴리뉴클레오티드 구축물이다. 이는 발현 벡터가 숙주 세포 내에서 에피솜으로서 또는 염색체 DNA의 통합 부분으로서 복제가능하여야 한다는 것을 의미한다. 적합한 발현 벡터는 플라스미드, 바이러스 벡터, 예컨대 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스, 레트로바이러스, 코스미드, 및 PCT 공개 번호 WO 87/04462에 개시된 발현 벡터(들)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 벡터 성분은 일반적으로 하기 중 하나 이상을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다: 신호 서열; 복제 기점; 1개 이상의 마커 유전자; 적합한 전사 제어 요소 (예컨대, 프로모터, 인핸서 및 종결인자). 발현 (즉, 번역)에는 통상적으로 1개 이상의 번역 제어 요소, 예컨대 리보솜 결합 부위, 번역 개시 부위 및 정지 코돈도 또한 필요하다.

관심 폴리뉴클레오티드를 함유하는 벡터는 전기천공, 염화칼슘, 염화루비듐, 인산칼슘, DEAE-덱스트란 또는 다른 물질을 사용한 형질감염, 미세발사(microprojectile) 충격, 리포펙션, 및 감염 (예를 들어, 벡터가 백시니아 바이러스와 같은 감염원인 경우)을 포함하는 임의의 다수의 적절한 수단에 의해 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 도입 벡터 또는 폴리뉴클레오티드의 선택은 종종 숙주 세포의 특징에 따라 달라질 것이다.

본 발명은 또한 본원에 기재된 임의의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 이종 DNA를 과다발현할 수 있는 임의의 숙주 세포가 관심 항체, 폴리펩티드 또는 단백질을 코딩하는 유전자를 단리하는 목적에 사용될 수 있다. 포유동물 숙주 세포의 비제한적 예는 COS, HeLa 및 CHO 세포를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. PCT 공개 번호 WO 87/04462를 또한 참조한다. 적합한 비-포유동물 숙주 세포는 원핵생물 (예컨대, 이. 콜라이 또는 비. 서브틸리스(B. subtillis)) 및 효모 (예컨대, 에스. 세레비지아에(S. cerevisae) 및 에스. 폼베(S. pombe) 또는 케이. 락티스(K. lactis))를 포함한다. 바람직하게는, 숙주 세포는 숙주 세포 내에 상응하는 관심 내인성 항체 또는 단백질이 존재한다면, 이들보다 약 5배 더 높은 수준, 보다 바람직하게는 10배 더 높은 수준, 보다 더 바람직하게는 20배 더 높은 수준으로 cDNA를 발현한다. GHR 또는 GHR 도메인에 대한 특이적 결합에 대한 숙주 세포의 스크리닝이 면역검정 또는 FACS에 의해 실행된다. 관심 항체 또는 단백질을 과다발현하는 세포가 확인될 수 있다.

발현 벡터는 GHR 길항제 항체의 직접 발현에 사용될 수 있다. 당업자는 생체내 외인성 단백질의 발현을 달성하기 위한 발현 벡터의 투여에 친숙하다. 예를 들어, 미국 특허 번호 6,436,908; 6,413,942; 및 6,376,471을 참조한다. 발현 벡터의 투여는 국부 또는 전신 투여, 예컨대 주사, 경구 투여, 입자 총 또는 카테터 투여, 및 국소 투여를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 발현 벡터는 교감신경 줄기 또는 신경절에, 또는 관상 동맥, 심방, 심실 또는 심막 내로 직접 투여된다.

발현 벡터 또는 서브게놈 폴리뉴클레오티드를 함유하는 치료 조성물의 표적화된 전달이 또한 이용될 수 있다. 수용체-매개 DNA 전달 기술은, 예를 들어 문헌 [Findeis et al., Trends Biotechnol., 1993, 11:202; Chiou et al., Gene Therapeutics: Methods And Applications Of Direct Gene Transfer, J.A. Wolff, ed., 1994; Wu et al., J. Biol. Chem., 1988, 263:621; Wu et al., J. Biol. Chem., 1994, 269:542; Zenke et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87:3655; Wu et al., J. Biol. Chem., 1991, 266:338]에 기재되어 있다. 폴리뉴클레오티드를 함유하는 치료 조성물은 유전자 요법 프로토콜에서 국소 투여를 위해 약 100 ng 내지 약 200 mg의 DNA의 범위로 투여된다. 약 500 ng 내지 약 50 mg, 약 1 μg 내지 약 2 mg, 약 5 μg 내지 약 500 μg, 및 약 20 μg 내지 약 100 μg의 DNA의 농도 범위가 또한 유전자 요법 프로토콜 동안 사용될 수 있다. 치료용 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드는 유전자 전달 비히클을 사용하여 전달될 수 있다. 유전자 전달 비히클은 또한 바이러스성 또는 비-바이러스성 기원일 수 있다 (일반적으로, 문헌 [Jolly, Cancer Gene Therapy, 1994, 1:51; Kimura, Human Gene Therapy, 1994, 5:845; Connelly, Human Gene Therapy, 1995, 1:185; 및 Kaplitt, Nature Genetics, 1994, 6:148]을 참조). 내인성 포유동물 또는 이종 프로모터를 이용하여 이러한 코딩 서열의 발현을 유도할 수 있다. 코딩 서열의 발현은 구성적일 수 있거나, 또는 조절될 수 있다.

목적 폴리뉴클레오티드의 전달 및 목적 세포에서의 발현을 위한 바이러스-기반 벡터는 당업계에 공지되어 있다. 예시적인 바이러스-기반 비히클은 재조합 레트로바이러스 (예를 들어, PCT 공개 번호 WO 90/07936; WO 94/03622; WO 93/25698; WO 93/25234; WO 93/11230; WO 93/10218; WO 91/02805; 미국 특허 번호 5,219,740 및 4,777,127; GB 특허 번호 2,200,651; 및 EP 특허 번호 0 345 242 참조), 알파바이러스-기반 벡터 (예를 들어, 신드비스(Sindbis) 바이러스 벡터, 셈리키 삼림열(Semliki forest) 바이러스 (ATCC VR-67; ATCC VR-1247), 로스 강(Ross River) 바이러스 (ATCC VR-373; ATCC VR-1246) 및 베네수엘라 말 뇌염 바이러스 (ATCC VR-923; ATCC VR-1250; ATCC VR 1249; ATCC VR-532)), 및 아데노-연관 바이러스 (AAV) 벡터 (예를 들어, PCT 공개 번호 WO 94/12649, WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 및 95/00655 참조)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 문헌 [Curiel, Hum. Gene Ther., 1992, 3:147]에 기재된 바와 같은, 사멸된 아데노바이러스에 연결된 DNA의 투여도 또한 이용될 수 있다.

비-바이러스성 전달 비히클 및 방법, 예컨대 비제한적으로, 단독으로 사멸된 아데노바이러스에 연결되거나 연결되지 않은 다가양이온성 축합 DNA (예를 들어, 문헌 [Curiel, Hum. Gene Ther., 1992, 3:147] 참조); 리간드-연결된 DNA (예를 들어, 문헌 [Wu, J. Biol. Chem., 1989, 264:16985] 참조); 진핵 세포 전달 비히클 세포 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,814,482; PCT 공개 번호 WO 95/07994; WO 96/17072; WO 95/30763; 및 WO 97/42338 참조) 및 핵 전하 중화 또는 세포막과의 융합도 또한 사용될 수 있다. 네이키드 DNA도 또한 사용될 수 있다. 예시적인 네이키드 DNA 도입 방법이 PCT 공개 번호 WO 90/11092 및 미국 특허 번호 5,580,859에 기재되어 있다. 유전자 전달 비히클로서 작용할 수 있는 리포솜이 미국 특허 번호 5,422,120; PCT 공개 번호 WO 95/13796; WO 94/23697; WO 91/14445; 및 EP 0524968에 기재되어 있다. 추가의 접근법이 문헌 [Philip, Mol. Cell Biol., 1994, 14:2411, 및 Woffendin, Proc. Natl. Acad. Sci., 1994, 91:1581]에 기재되어 있다.

조성물

본 발명은 또한 유효량의 본원에 기재된 GHR 항체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 이러한 조성물의 예 뿐만 아니라 제제화 방법이 또한 본원에 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 하나 이상의 GHR 항체를 포함한다. 다른 실시양태에서, GHR 항체는 GHR을 인식한다. 다른 실시양태에서, GHR 항체는 인간 항체이다. 다른 실시양태에서, GHR 항체는 인간화 항체이다. 일부 실시양태에서, GHR 항체는 목적하는 면역 반응, 예컨대 항체-매개된 용해 또는 ADCC를 촉발할 수 있는 불변 영역을 포함한다. 다른 실시양태에서, GHR 항체는 원치 않거나 또는 바람직하지 않은 면역 반응, 예컨대 항체-매개된 용해 또는 ADCC를 촉발하지 않는 불변 영역을 포함한다. 다른 실시양태에서, GHR 항체는 항체의 하나 이상의 CDR(들) (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5개, 또는 일부 실시양태에서는 모든 6개의 CDR)을 포함한다.

조성물은 하나 초과의 GHR 길항제 항체 (예를 들어, GHR의 상이한 에피토프를 인식하는 GHR 길항제 항체 혼합물)를 포함할 수 있는 것으로 이해된다. 다른 예시적인 조성물은 동일한 에피토프(들)를 인식하는 하나 초과의 GHR 길항제 항체, 또는 GHR의 상이한 에피토프에 결합하는 상이한 종의 GHR 길항제 항체를 포함한다.

본 발명에 사용된 조성물은 추가로 제약상 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제 (문헌 [Remington: The Science and practice of Pharmacy 20th Ed. (2000) Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K. E. Hoover])를 동결건조된 제제 또는 수성 용액의 형태로 포함할 수 있다. 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이고, 완충제, 예컨대 포스페이트, 시트레이트, 히스티딘 및 다른 유기산; 항산화제, 예를 들어 아스코르브산 및 메티오닌; 보존제 (예컨대, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들어 혈청 알부민, 젤라틴 또는 이뮤노글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 모노사카라이드, 디사카라이드, 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 비롯한 다른 탄수화물; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대-이온, 예컨대 나트륨; 금속 착물 (예를 들어, Zn-단백질 착물); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예컨대 트윈™, 플루로닉스™ 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함한다. 제약상 허용되는 부형제는 본원에 추가로 기재되어 있다.

GHR 길항제 항체 및 그의 조성물은 또한 작용제의 효과를 향상시키고/거나 보완하는 역할을 하는 다른 작용제와 함께 사용될 수 있다.

본 발명은 또한, 본 발명의 임의의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제약 조성물을 비롯한 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 본원에 기재된 바와 같은 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 포함한다. 다른 실시양태에서, 조성물은 임의의 본원에 기재된 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 조성물은 하기 서열 142 및 서열 143에 나타낸 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나 또는 둘 다를 포함한다. SS1 hIgG_{2Δ a} GHR 길항제 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 핵산 서열을 하기 나타내었다:

SS1 hIgG_{2Δ a} 중쇄:

SS1 hIgG_{2Δ a} 경쇄:

키트

본 발명은 또한 본원에 기재된 임의의 또는 모든 항체를 포함하는 키트를 제공한다. 본 발명의 키트는 본원에 기재된 GHR 길항제 항체를 포함하는 하나 이상의 용기, 및 본원에 기재된 발명의 방법들 중 임의의 것에 따른 사용 지침서를 포함한다. 일반적으로, 이들 지침서는 상기 기재된 치유적 치료를 위한 GHR 길항제의 투여의 설명을 포함한다. 일부 실시양태에서, 키트는 단일-용량 투여 단위를 생성하기 위해 제공된다. 특정 실시양태에서, 키트는 건조된 단백질을 갖는 제1 용기 및 수성 제제를 갖는 제2 용기를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 단일 및 다중-챔버의 예비-충전된 시린지 (예를 들어, 액체 시린지 및 리오시린지(lyosyringe))를 포함하는 키트가 포함된다.

일부 실시양태에서, 항체는 인간 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간화 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 모노클로날 항체이다. GHR 길항제 항체의 사용에 관련된 지침서는 일반적으로 의도된 치료를 위한 용량, 투여 스케쥴, 및 투여 경로에 대한 정보를 포함한다. 용기는 단위 용량, 벌크 패키지 (예를 들어, 다중-용량 패키지) 또는 하위-단위 용량일 수 있다. 본 발명의 키트에 제공되는 지침서는 전형적으로 라벨 또는 포장 삽입물 (예를 들어, 키트에 포함되어 있는 종이 시트) 상의 서면 지침서이지만, 기계-판독식 지침서 (예컨대, 자기 또는 광학 저장 디스크상의 지침서) 또한 허용가능하다.

본 발명의 키트는 적합한 포장물로 존재한다. 적합한 포장물은 바이알, 병, 단지, 가요성 포장물 (예를 들어, 밀봉 마일라(Mylar) 또는 플라스틱 백) 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 특정 장치, 예컨대 흡입기, 비강 투여 장치 (예를 들어, 아토마이저) 또는 주입 장치, 예컨대 미니펌프와 함께 사용하기 위한 포장물도 고려된다. 키트는 멸균 접근 포트를 가질 수 있다 (예를 들어, 용기는 정맥주사액 백 또는 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 마개를 갖는 바이알일 수 있음). 용기도 또한 멸균 접근 포트를 가질 수 있다 (예를 들어, 용기는 정맥주사액 백 또는 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 마개를 갖는 바이알일 수 있음). 조성물 중 적어도 하나의 활성제는 GHR 항체이다. 용기는 제2의 제약 활성제를 추가로 포함할 수 있다.

키트는 추가의 성분, 예컨대 완충제 및 설명 정보를 임의로 제공할 수 있다. 통상적으로, 키트는 용기 및 용기상에 있거나 용기와 결합된 라벨 또는 포장 삽입물(들)을 포함한다.

생물학적 기탁

본 발명의 대표적인 물질은 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection; 미국 20110-2209 버지니아주 마나사스 유니버시티 불러바드 10801)에 2011년 12월 22일에 기탁하였다. ATCC 등록 번호 PTA-12352를 갖는 벡터 SS1-HC는 SS1 중쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드이고, ATCC 등록 번호 PTA-12353을 갖는 벡터 SS1-LC는 SS1 경쇄 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드이다. 이러한 기탁은 특허절차상 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약 및 이러한 조약 (부다페스트 조약) 하의 규정의 조항 하에 이루어졌다. 이는 기탁일로부터 30년 동안 기탁물의 생존 배양의 유지를 보장한다. 기탁물은 부다페스트 조약의 규정하에 ATCC로부터 이용가능할 것이고, 이는 화이자, 인크.(Pfizer, Inc.)와 ATCC 사이의 협정에 따르며, 상기 협정은 관련 미국 특허의 허여시에 또는 임의의 미국 또는 타국 특허 출원의 공개시에 (이 중 빠른 시점에) 기탁 배양물의 자손에 대한 영구적이고 비제한적인 이용가능성을 보장하고, 35 U.S.C. 섹션 122 및 그에 대한 미국 특허청장의 규칙 (886 OG 638에 대한 특정한 언급을 갖는 37 C.F.R. 섹션 1.14 포함)에 따라 특허청장에 의해 자격이 인정된 것에 대한 자손의 이용가능성을 보장한다.

본원의 양수인은 기탁된 물질의 배양물이 적합한 조건 하에 배양시에 사멸하거나 또는 손실 또는 파괴되는 경우에, 그 물질을 통지 하에 또 다른 동일한 것으로 신속하게 대체할 것에 동의하였다. 기탁 물질의 유용성은 그의 특허법에 따른 임의의 정부의 권한 하에 보장된 권리에 반하여 본 발명을 실시하는 것에 대한 허가로 간주되지 않는다.

하기 실시예는 단지 예시적 목적으로만 제공되며, 어떠한 방식으로도 본 발명의 범위를 제한하지 않는다. 실제로, 본원에 제시되고 기재된 것 이외의 본 발명의 다양한 변형은 상기 기재로부터 당업자에게 명백해질 것이고, 첨부된 특허청구범위 내에 속할 것이다.

실시예

실시예 1: GHR 길항제 항체의 생성 및 스크리닝

모노클로날 항체를 생성하기 위해 동물을 면역화하는 일반적 절차:

Balb/c 마우스에 25 μg 항원 hGHR/Fc 알앤디 시스템즈™ 카탈로그 번호 1210-GR-050을 제0일, 제3일, 제6일 및 제9일에 4회 주사하였다. 처음 4회의 주사를 위해, 재조합 단백질을 프로토콜에 따라 게르부(Gerbu) 아주반트와 혼합하고 볼텍싱함으로써 항원을 제조하였다. 면역원을 목덜미, 발바닥 및 복강내로 주사를 통해 제공하였다. 제11일에 최종 부스트를 아주반트 없이 i.v. 투여하였다. 제15일에 마우스를 안락사시키고, 이들의 비장을 제거하였다. 표준 하이브리도마 기술을 이용하여 림프구를 확립된 세포주와의 융합에 의해 불멸화함으로써 하이브리도마 클론을 제조하고, 96 웰 플레이트에 분배하였다. 클론을 성장하도록 한 다음, 하기 기재된 바와 같이 면역화 항원을 사용하여 ELISA 스크리닝에 의해 선택하였다.

항체의 ELISA 스크리닝:

성장하는 하이브리도마 클론으로부터의 상청액 배지를 재조합 인간 GHR/hFc에 결합하는 능력에 대해 개별적으로 스크리닝하였다. 검정은 항원의 1 μg/ml 용액 50 μl로 밤새 코팅된 96-웰 플레이트로 수행하였다. 과량의 시약을 각각의 단계 사이에 0.05% 트윈™-20을 함유하는 PBS로 웰로부터 세척하였다. 상청액을 상기 플레이트에 첨가하고, 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP) 접합된 염소-항-마우스 Fc를 첨가하여 항원에 결합된 마우스 항체에 결합하게 하였다. 이어서, ABTS (2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-술폰산) 디암모늄 염)를 HRP에 대한 기질로서 첨가하여 상청액 중에 존재하는 마우스 항체의 양을 검출하였다. 항체의 상대적 양을 405 nm에서의 흡광도를 판독함으로써 정량화하였다. 인간 GHR/hFc에 결합할 수 있는 항체를 분비하는 하이브리도마 클론을 선택하였다. 다음 검정을 실행하여 hFc에 대한 항체를 검출함으로써, 이들을 회피할 수 있었다. 추가의 분석을 수행하여 선택된 클론을 특성화하였다.

실시예 2: 항체 동역학 및 결합 친화도 결정

본 실시예는 인간 및 시노 GHR에 대한 GHR 항체의 항체 동역학 및 결합 친화도의 결정을 예시한다.

25℃에서의 GHR/Ab13 IgG 상호작용의 동역학 및 친화도의 결정

마우스 항-GHR 항체 Ab13의 인간 및 시노 GHR에 대한 친화도를 비아코어™ 2000 바이오센서 (지이 라이프사이언시스(GE Lifesciences)™, 뉴저지주 피스카타웨이) 상에서 측정하였다. 항-마우스 Ig 센서 표면은 비아코어™ CM5 칩 및 비아코어™ 마우스 항체 포획 키트 (지이 라이프사이언시스™, 카탈로그# BR-1008-38)로부터의 시약을 사용하여 제조업체에 의해 제공된 지침서를 이용하여 제조하였다.

동역학 검정을 문헌 [Karlsson et al., 2006, Anal. Biochem 349, 136-147]에 기재된 바와 같은 동역학적 적정 방법론을 이용하여 실행하였다. 각각 유동 세포 2, 3 및 4 상에서 1분, 2분 및 4분 동안 5 μL/분의 유량으로 마우스 항체 Ab13을 0.5 μg/mL로 하류 유동 세포 상에 포획시켰다. 유동 세포 1을 참조 표면으로 사용하였다. 항체의 포획 후, 인간 또는 시노 GHR (인간 또는 시노 GHR의 세포외 도메인의 아미노산 31-235의 His-태그부착된 단량체)을 저농도 내지 고농도의 연속 주입으로 모든 유동 세포 상에 30 μL/분으로 주입하였다. 최고 농도는 인간 GHR의 경우에는 400 nM이었고, 시노 GHR의 경우에는 2000 nM이었고; 희석 배율은 5배였다. 각각의 GHR 주입은 2분이었고, 400 nM GHR 주입 후의 해리 시간은 10분이었다. 이중-참조 목적 (문헌 [Myszka, 1999, J. Mol. Recognit 12, 279-284]에 기재된 바와 같은 이중-참조)으로 유사한 세트의 주입을 GHR 대신에 러닝 완충제로 수행하였다. 각각의 GHR 연속 희석을 2벌로 실행하였다. 각각의 분석 사이클 후, 모든 유동 세포를 10 mM 글리신 pH 1.7의 3분 주입 1회로 재생시켰다. 이중-참조 센서그램을, 물질 전달을 갖는 단순 1:1 랭뮤어 결합 모델에 전체적으로 적합시켰다 (각각의 유동 세포에 대한 국부 R_max 파라미터로).

실험은 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0.05% (v/v) 트윈-20™, pH 7.4의 러닝 완충제를 사용하여 25℃에서 수행하였다. 연구의 결과를 하기 표 4a에 요약하였다.

25℃에서의 SS1 및 Ab13-hFc 키메라에 대한 GHR/IgG 상호작용의 동역학 및 친화도의 결정

인간화 GHR 항체 SS1 및 인간 Fc 도메인 ("Ab13-hFc")에 융합된 Ab13의 Fab를 포함하는 키메라 분자의 인간 및 시노 GHR에 대한 친화도를 비아코어™ 2000 바이오센서 (지이 라이프사이언시스™, 뉴저지주 피스카타웨이) 상에서 측정하였다.

항-인간 Fc 센서 칩을, 비아코어™ CM4 센서 칩의 모든 유동 세포를 400 mM 에틸-N-(3-디에틸아미노프로필)카르보디이미드 (EDC, 비아코어™) 및 100 mM N-히드록시숙신이미드 (NHS, 비아코어™)의 1:1 (v/v) 혼합물로 7분 동안 10 μL/분의 유량으로 활성화시킴으로써 제조하였다. 항-인간 Fc 시약 (염소 F(ab')₂ 단편 항-인간 IgG Fc, 카펠(Cappel) 카탈로그 # 55053)을 10 mM 아세트산나트륨 pH 5.0 중에 60 μg/mL로 희석하고, 20 μL/분으로 7분 동안 모든 유동 세포 상에 주입하였다. 모든 유동 세포를 10 μL/분으로 7분 동안 150 mM 보레이트 완충제 pH 8.5 중 100 mM 에틸렌디아민으로 차단하였다.

동역학 검정을 문헌 [Katsamba et al., 2006, Anal. Biochem 352, 208-221]에 기재된 바와 같은 해리 시간을 변화시키는 방법론을 이용하여 실행하였다. 1분 동안 10 μL/분의 유량으로 항체를 4 μg/mL로 하류 유동 세포 (유동 세포 2, 3 및 4) 상에 포획시켰다. 다양한 항체를 각각의 유동 세포 상에 포획시켰다. 유동 세포 1을 참조 표면으로 사용하였다. 항체의 포획 후, 분석물 (완충제, 인간 GHR 또는 시노 GHR)을 2분 동안 모든 유동 세포 상에 30 μL/분으로 주입하였다. GHR 분석물의 경우에, 인간 또는 시노 GHR의 세포외 도메인의 아미노산 31-235의 His-태그부착된 단량체를 사용하였다. 분석물 주입 후, 해리를 30분 (400 nM GHR 사이클의 경우) 또는 30초 (모든 다른 사이클) 동안 모니터링하고, 이어서 75 mM 인산의 30초 주입을 2회 수행하여 모든 유동 세포를 재생시켰다. GHR의 5개 구성원 연속 희석물을 상기 방법을 이용하여 분석하였고, 여기서 최고 농도는 400 nM이었고, 희석 배율은 3배였다. 이중-참조 목적으로 30분 및 30초 해리 시간 둘 다를 이용하여 완충제 사이클을 수집하였다. 이중-참조 센서그램을, 물질 전달을 갖는 단순 1:1 랭뮤어 결합 모델에 전체적으로 적합시켰다.

실험은 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0.05% (v/v) 트윈-20™, pH 7.4의 러닝 완충제를 사용하여 25℃에서 수행하였다. 연구의 결과를 하기 표 4a에 요약하였다.

<표 4a>

37℃에서의 (고정화된 Fab와의) GHR/Fab 상호작용의 동역학 및 친화도의 결정

GHR 항체 SS1 Fab의 인간 및 시노 GHR에 대한 친화도를 비아코어™ T200 바이오센서 (지이 라이프사이언시스™, 뉴저지주 피스카타웨이) 상에서 측정하였다.

항-인간 카파 센서 칩을, 비아코어™ CM4 센서 칩의 모든 유동 세포를 400 mM EDC 및 100 mM NHS의 1:1 (v/v) 혼합물로 7분 동안 10 μL/분의 유량으로 활성화시킴으로써 제조하였다. 항-인간 카파 시약 (염소 F(ab')₂ 단편 항-인간 카파, 서던 바이오테크(Southern Biotech) 카탈로그 # 2063-01)을 10 mM 아세트산나트륨 pH 4.5 중에 50 μg/mL로 희석하고, 20 μL/분으로 7분 동안 모든 유동 세포 상에 주입하였다. 모든 유동 세포를 10 μL/분으로 7분 동안 150 mM 보레이트 완충제 pH 8.5 중 100 mM 에틸렌디아민으로 차단하였다.

동역학 검정을 상기 문헌 [Katsamba et al.]에 기재된 바와 같은 해리 시간을 변화시키는 방법론을 이용하여 실행하였다. 2분 동안 10 μL/분의 유량으로 Fab를 2 μg/mL로 하류 유동 세포 (유동 세포 2, 3 및 4) 상에 포획시켰다. 다양한 Fab를 각각의 유동 세포 상에 포획시켰다. 유동 세포 1을 참조 표면으로 사용하였다. Fab의 포획 후, 분석물 (완충제, 인간 GHR 또는 시노 GHR)을 2분 동안 모든 유동 세포 상에 30 μL/분으로 주입하였다. GHR 분석물의 경우에, 인간 또는 시노 GHR의 세포외 도메인의 아미노산 31-235의 His-태그부착된 단량체를 사용하였다. 분석물 주입 후, 해리를 30분 (133 nM 및 400 nM GHR 사이클의 경우) 또는 60초 (모든 다른 사이클) 동안 모니터링하고, 이어서 10 mM 글리신 pH 1.7의 30초 주입을 3회 수행하여 재생시켰다. GHR의 6개 구성원 연속 희석물을 상기 방법을 이용하여 분석하였고, 여기서 최고 농도는 400 nM이었고, 희석 배율은 3배였다. 이중-참조 목적으로 30분 및 60초 해리 시간 둘 다를 이용하여 완충제 사이클을 수집하였다. 이중-참조 센서그램을, 물질 전달을 갖는 단순 1:1 랭뮤어 결합 모델에 전체적으로 적합시켰다.

실험은 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0.05% (v/v) 트윈-20™, pH 7.4의 러닝 완충제를 사용하여 37℃에서 수행하였다. 연구의 결과를 하기 표 4b에 요약하였다.

37℃에서의 GHR/Fab 상호작용 (여기서, hGHR-hFc가 고정화됨)의 동역학 및 친화도의 결정

GHR 항체 SS1 Fab의 인간 및 시노 GHR에 대한 친화도를 비아코어™ T200 바이오센서 (지이 라이프사이언시스™, 뉴저지주 피스카타웨이) 상에서 측정하였다.

항-인간 Fc 센서 칩을, 비아코어™ CM4 센서 칩의 모든 유동 세포를 400 mM EDC 및 100 mM NHS의 1:1 (v/v) 혼합물로 7분 동안 10 μL/분의 유량으로 활성화시킴으로써 제조하였다. 항-인간 Fc 시약 (인간 IgG Fc에 대한 염소 F(ab')₂ 단편, 카펠 카탈로그 # 55053)을 10 mM 아세트산나트륨 pH 5.0 중에 60 μg/mL로 희석하고, 20 μL/분으로 7분 동안 모든 유동 세포 상에 주입하였다. 모든 유동 세포를 10 μL/분으로 7분 동안 150 mM 보레이트 완충제 pH 8.5 중 100 mM 에틸렌디아민으로 차단하였다.

동역학 검정을 상기 문헌 [Katsamba et al.]에 기재된 바와 같은 해리 시간을 변화시키는 방법론을 이용하여 실행하였다. 유동 세포 2, 3 및 4 상에서 30초, 1분 및 2분 동안 10 μL/분의 유량으로 hGHR-hFc 융합 단백질 (알앤디 시스템즈™, 카탈로그# 1210-GR)을 2 μg/mL로 하류 유동 세포 상에 포획시켰다. 유동 세포 1을 참조 표면으로 사용하였다. hGHR-hFc의 포획 후, 분석물 (완충제, SS1 Fab 또는 Ab13 Fab)을 2분 동안 모든 유동 세포 상에 30 μL/분으로 주입하였다. 분석물 주입 후, 해리를 30분 (400 nM Fab 사이클) 또는 60초 (모든 다른 사이클) 동안 모니터링하고, 이어서 75 mM 인산의 30초 주입을 2회 수행하여 재생시켰다. Fab의 5개 구성원 연속 희석물을 상기 방법을 이용하여 분석하였고, 여기서 최고 농도는 400 nM이었고, 희석 배율은 3배였다. 이중-참조 목적으로 30분 및 60초 해리 시간 둘 다를 이용하여 완충제 사이클을 수집하였다. 이중-참조 센서그램을, 물질 전달을 갖는 단순 1:1 랭뮤어 결합 모델에 전체적으로 적합시켰다 (각각의 유동 세포에 대한 국부 Rmax 파라미터로).

실험은 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0.05% (v/v) 트윈-20™, pH 7.4의 러닝 완충제를 사용하여 37℃에서 수행하였다. 연구의 결과를 하기 표 4b에 요약하였다.

<표 4b>

실시예 3: STAT5 인산화 시험관내 검정

본 실시예는 시험관내 STAT5 인산화 검정에서의 GHR 항체의 효과를 예시한다. 본 실시예에서, GHR 하류 신호전달을 차단하는 GHR 항체의 능력을 인간 GHR 과다발현 세포 및 시노 GHR 과다발현 세포를 사용하여 시험하였다.

JAK/STAT 경로를 통한 GH 신호. GHR에 대한 GH의 결합은 이량체화된 수용체의 입체형태 변화를 유발한다. 상기 변화는 JAK2 (야누스-연관 키나제 2)의 세포내 인산화를 일으킨다. 이어서, JAK2의 인산화는 STAT5 (신호 전달자 및 전사 활성화제 5)의 인산화를 유도한다. 인산화 STAT5는 핵으로 전위하며, 여기서 이것은 GH-의존성 유전자의 프로모터 서열에 결합한다.

GHR 길항제 항체 Ab13을, 시험관내 검정에서 STAT5를 차단하는 그의 능력에 대해 시험하였다. HEK293 세포를 전장 인간 GHR (서열 140)을 코딩하는 DNA 또는 전장 시노 GHR (서열 141)을 코딩하는 DNA로 일시적으로 형질감염시켰다. 세포를 시험 전에 대략 60시간 동안 자유형 배지 중에서 배양하였다. 세포를 DPBS (둘베코 포스페이트-완충 염수)로 세척하고, 자유형 배지 중에 재현탁시킨 다음, 혈구계를 사용하여 계수하였다. 웰당 1X10⁶개 세포를 6-웰 플레이트에서 자유형 배지 2 ml 중에 시딩하였다. 세포를 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션한 다음, 배지 중 5, 50 또는 500 nM Ab13 항체로 처리하였다. 세포를 항체와 함께 5분 동안 약하게 혼합하면서 37℃에서 인큐베이션하였다. 이어서, 4.5 nM GH (제노트로핀(Genotropin))를 대조군 웰을 제외한 모든 웰에 첨가하였다. 세포를 10분 동안 약하게 혼합하면서 37℃에서 GH와 함께 인큐베이션하였다.

GH와 인큐베이션한 후, 1X 프로테아제 억제제 칵테일 (로슈(Roche)) 및 1 mM 오르토바나듐산나트륨 (바이오랩스(BioLabs))을 함유하는 빙냉 DPBS 2 ml를 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 얼음 상에 위치시켰다. 세포를 5 ml 튜브로 옮기고, 회전 침강시켜 세포 펠릿을 생성하고, 세척 완충제를 흡인하여 세포 펠릿을 남겼다.

밀리포어(Millipore)™ 밀리플렉스(MILLIPLEX)® MAP 세포 신호전달 완충제 및 검출 키트 (카탈로그 # 48-602)로부터의 시약을 사용하여 세포 펠릿을 용해시키고 처리하였다. 1X 프로테아제 억제제 칵테일 및 1 mM 오르토바나듐산나트륨을 함유하는 밀리포어 용해 완충제를 200 ul/펠릿의 부피로 각각의 펠릿에 첨가하였다. 세포를 볼텍싱하고, 실온에서 15분 동안 간헐적으로 볼텍싱하면서 인큐베이션하였다. 이어서, 1X 프로테아제 억제제 칵테일 및 1 mM 오르토바나듐산나트륨을 함유하는 밀리포어 검정 완충제를 300ul/웰로 용해물에 첨가하였다.

밀리포어™ 밀리플렉스® MAP 포스포 STAT5A/B (Tyr694/699) MAPmate™ 비드 (카탈로그 # 46-641)를 검정 완충제 2 (밀리포어™ 키트 카탈로그 # 48-602로부터의 것) 중에 재현탁시키고, 96-웰 필터 플레이트 (키트에 제공됨) 상에 25 ul/웰로 로딩하였다. 웰에 샘플 용해물 25 ul/웰을 첨가하고, 비드 및 샘플을 암실에서 진탕시키면서 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다.

이어서, 액체를 진공 매니폴드를 사용하여 흡인하고, 남아있는 비드를 밀리포어™ 키트 세척 완충제를 사용하여 세척하였다. 25 ul 밀리포어™ 키트 검출 항체를 첨가하고, 암실에서 진탕시키면서 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 검출 항체를 진공 흡인하고, 25ul 키트 스트렙타비딘-피코에리트린을 첨가하고, 진탕시키면서 15분 동안 암실에서 인큐베이션하였다. 이어서, 25 ul 키트 증폭 완충제를 첨가하고, 암실에서 진탕시키면서 15분 동안 인큐베이션하였다. 액체를 진공 매니폴드를 사용하여 흡인하고, 비드를 150 ul 키트 검정 완충제 2 중에 재현탁시키고, 플레이트를 판독하기 전에 5분 동안 진탕기 상에서 혼합하였다.

플레이트를 루미넥스(Luminex)™ 200 기기를 사용하여 판독하고, 샘플로부터 방출된 형광 신호를 측정하였다. STAT5 검정의 결과를 하기 표 5 및 6에 나타내었다. "평균"은 평균 형광 신호를 나타내고, "SEM"은 평균의 표준 오차를 나타낸다.

<표 5> 인간 GHR-형질감염된 세포를 사용한 STAT5 검정

<표 6> 시노 GHR-형질감염된 세포를 사용한 STAT5 검정

GHR-형질감염된 세포의 4.5 nM GH로의 처리는 인간 GHR (표 5, 제2행) 또는 시노 GHR (표 6, 제2행)을 발현하는 세포에서의 STAT5 신호전달을 자극하였다. Ab13은 용량-의존적 방식으로 STAT5 신호전달을 차단하였다 (표 5, 제3-5행; 표 6, 제3행 및 제4행).

Ab13은 친화도 성숙 및 인간화되어, 항체 SS3 및 SS1의 선택을 유발하였다. 인간화 GHR 길항제 항체 SS1 및 SS3의 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열을 하기에 나타내었다.

SS1 hIgG2Δa 중쇄 아미노산 서열

C-말단 리신을 함유하지 않는 SS1 hIgG2Δa 중쇄 아미노산 서열

SS1 hIgG2Δa 경쇄 아미노산 서열

SS3 hIgG2Δa 중쇄 아미노산 서열

SS3 hIgG2Δa 경쇄 아미노산 서열

SS1 FcM 중쇄 아미노산 서열

SS1 FcM 경쇄 아미노산 서열

항체 SS3 및 SS1 (hIgG2Δa)을 STAT5 인산화 검정을 이용하여 시험하였다. STAT5 검정을 위해, 전장 인간 GHR 과다발현 HEK293 세포 또는 전장 시노 GHR-과다발현 HEK293 세포를 배양하고, 자동화된 세포 계수기에 의해 계수하고, 12-웰 플레이트에 따뜻한 자유형 배지 중에 시딩하였다 (1 ml 배지 중 5X10⁵개 세포/웰). 세포를 37℃에서 3시간 동안 침강되도록 한 다음, 배지 중 2.5, 5, 50 또는 500 nM의 SS1 또는 SS3으로 처리하였다. 세포를 항체와 함께 5분 동안 약하게 혼합하면서 37℃에서 인큐베이션하였다. 이어서, 4.5 nM 인간 성장 호르몬 (화이자)을 대조군 웰을 제외한 모든 웰에 첨가하였다. 세포를 10분 동안 약하게 혼합하면서 37℃에서 GH와 함께 인큐베이션하였다.

GH와 인큐베이션한 후, 1X 프로테아제 억제제 칵테일 (로슈) 및 1mM 오르토바나듐산나트륨 (바이오랩스)을 함유하는 빙냉 DPBS 2 ml를 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 얼음 상에 위치시켰다. 세포를 5 ml 튜브로 옮기고, 회전 침강시켜 세포 펠릿을 생성하고, 세척 완충제를 흡인하여 세포 펠릿을 남겼다.

밀리포어™ 밀리플렉스® MAP 세포 신호전달 완충제 및 검출 키트 (카탈로그 # 48-602)로부터의 시약을 사용하여 세포 펠릿을 용해시키고 처리하였다. 1X 프로테아제 억제제 칵테일 및 오르토바나듐산나트륨을 함유하는 밀리포어™ 용해 완충제를 100 ul/펠릿의 부피로 각각의 펠릿에 첨가하였다. 세포를 볼텍싱하고, 간헐적으로 볼텍싱하면서 실온에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 1X 프로테아제 억제제 칵테일 및 1mM 오르토바나듐산나트륨을 함유하는 밀리포어™ 검정 완충제를 200 ul/웰로 용해물에 첨가하였다.

밀리포어™ 밀리플렉스® MAP 포스포 STAT5A/B (Tyr694/699) MAPmate™ 비드 (카탈로그 # 46-641)를 검정 완충제 2 (밀리포어 키트 카탈로그 # 48-602로부터의 것) 중에 재현탁시키고, 96-웰 필터 플레이트 (키트에 제공됨) 상에 25 ul/웰로 로딩하였다. 웰에 샘플 용해물 25 ul/웰을 첨가하고, 비드 및 샘플을 암실에서 진탕시키면서 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다.

이어서, 액체를 진공 매니폴드를 사용하여 흡인하고, 남아있는 비드를 밀리포어™ 키트 세척 완충제를 사용하여 세척하였다. 25 ul 밀리포어™ 키트 검출 항체를 첨가하고, 암실에서 진탕시키면서 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 검출 항체를 진공 흡인하고, 25 ul 키트 스트렙타비딘-피코에리트린을 첨가하고, 진탕시키면서 15분 동안 암실에서 인큐베이션하였다. 이어서, 25 ul 키트 증폭 완충제를 첨가하고, 암실에서 진탕시키면서 15분 동안 인큐베이션하였다. 액체를 진공 매니폴드를 사용하여 흡인하고, 비드를 150 ul 키트 검정 완충제 2 중에 재현탁시키고, 플레이트를 판독하기 전에 5분 동안 진탕기 상에서 혼합하였다.

플레이트를 루미넥스 200 기기를 사용하여 판독하고, 샘플로부터 방출된 형광 신호를 측정하였다. STAT5 검정의 결과를 하기 표 7 및 8에 나타내었다.

<표 7> 인간 GHR-형질감염된 세포를 사용한 STAT5 검정

<표 8> 시노 GHR-형질감염된 세포를 사용한 STAT5 검정

GHR-형질감염된 세포의 4.5 nM GH로의 처리는 인간 GHR (표 7, 제2행) 또는 시노 GHR (표 8, 제2행)을 발현하는 세포에서의 STAT5 신호전달을 자극하였다. 인간화 GHR 길항제 항체 SS1 및 SS3은 둘 다 용량-의존적 방식으로 STAT5 신호전달을 차단하였다 (표 7, 제3-10행; 표 8, 제3-10행).

실시예 4: GHR 길항제 항체는 시노몰구스 원숭이에서 혈중 IGF -1 수준을 저 하시키는데 효과적이다

본 실시예는 시노몰구스 원숭이에서의 혈중 IGF-1 수준에 대한 GHR 길항제 항체의 효과를 예시한다.

GHR 길항제 모노클로날 항체가 GHR의 기능을 억제함으로써 생체내 IGF-1 수준에 영향을 미칠 수 있을지를 결정하기 위해, 뮤린 항-인간 GHR 항체 Ab13의 효과를 시노몰구스 원숭이에서 시험하였다. IGF-1 수준은 생체내 성장 호르몬 활성에 대한 바이오마커이다. GHR을 차단하는 것은 생체내에서 기준선 수준과 비교시 IGF-1 수준의 감소를 유발하는 것으로 나타난 바 있다.

IGF-1 수준의 변화를 시험하기 위해, 5마리의 미감작 암컷 시노몰구스 원숭이에게 1X PBS 중 Ab13 또는 음성 대조군 마우스 IgG1의 단일 용량을 IV 주사하였다. 제1일에, 2마리의 원숭이에게 30 mg/kg Ab13을 투여하고, 1마리에게 10 mg/kg Ab13을 투여하고, 2마리에게 30 mg/kg 음성 대조군 마우스 IgG1을 투여하였다. 혈청 샘플을 하기 시점: 투여 전, 투여 후 1시간, 4시간, 8시간, 12시간, 24시간, 48시간, 72시간, 96시간, 120시간, 144시간, 168시간, 216시간, 264시간 및 312시간에 모든 동물로부터 채취하였다.

혈청 샘플을 알앤디 시스템즈™ 퀀티카인(Quantikine)™ 인간 IGF-1 면역검정 키트 (카탈로그 #DG100)를 사용하여 기준선과 비교시의 IGF-1 수준의 변화에 대해 분석하였다. 24시간 내지 312시간 범위의 시점에 대한 연구의 결과를 하기 표 9에 나타내었다.

<표 9> 혈청 IGF-1 수준에 대한 Ab13의 효과 (기준선으로부터의 변화 %)

표 9의 데이터는 GHR 길항제 항체 Ab13이 시노몰구스 원숭이에서 혈청 IGF-1 수준을 용량 의존적으로 감소시킨다는 것을 보여준다. 혈청 IGF-1 수준은 30 mg/kg Ab13의 단일 용량의 정맥내 투여 후 96시간까지 기준선 밑으로 약 63% 감소하였고, 혈청 IGF-1 수준은 항체 투여 후 약 144시간까지 기준선 약 63% 밑에 머물렀다. 혈청 IGF-1 수준은 10 mg/kg Ab13의 단일 용량의 정맥내 투여 후 96시간까지 대조군 밑으로 약 48.8% 감소하였다. IGF-1 수준은 312시간까지는 기준선 수준으로 복귀하였다. 대조적으로, 30 mg/kg 대조군 IgG1을 투여한 동물에서의 혈청 IGF-1 수준은 연구 전체에 걸쳐 대략 기준선 수준에 머물렀다 (표 9). 이들 결과는 GHR 길항제 항체로의 처리가 혈중 IGF-1 수준을 저하시키는데 효과적이며, 상기 효과가 용량-의존성임을 입증한다.

실시예 5: GHR 길항제 항체는 시노몰구스 원숭이에서 혈중 IGF -1, IGFBP -3 및 ALS 수준을 저하시키는데 효과적이다

본 실시예는 시노몰구스 원숭이에서의 혈중 IGF-1, IGF 결합 단백질 3 (IGFBP-3) 및 산-불안정성 서브유닛 (ALS) 수준에 대한 GHR 길항제 항체의 효과를 예시한다.

GHR 길항제 모노클로날 항체가 GHR의 기능을 억제함으로써 생체내 IGF-1, IGFBP-3 및 ALS 수준에 영향을 미칠 수 있을지를 결정하기 위해, 인간화 항-인간 GHR 항체 SS1의 효과를 시노몰구스 원숭이에서 시험하였다. SS1의 단일 용량에 따른 IGF-1, IGFBP-3 및 ALS 수준의 변화를 시험하기 위해 용량-반응 연구를 수행하였다. 8마리의 미감작 암컷 시노몰구스 원숭이에게 1X PBS 0.01% 트윈™ 20 중 SS1 또는 음성 대조군 인간 IgG_{2Δ a}의 단일 용량을 정맥내로 주사하였다. 제1일에, 2마리의 원숭이에게 30 mg/kg SS1을 투여하고, 2마리에게 10 mg/kg SS1을 투여하고, 2마리에게 3 mg/kg SS1을 투여하고, 2마리에게 30 mg/kg 음성 대조군 인간 IgG_{2 Δa}를 투여하였다. 혈청 샘플을 하기 시점: 투여 전, 24시간, 48시간, 72시간, 120시간, 144시간, 192시간, 240시간, 336시간, 528시간, 696시간에 모든 동물로부터 채취하였다. 혈청을 또한 투여 후 864시간에 30 mg/kg SS1 및 음성 대조군 처리된 동물로부터 채취하였다.

혈청 샘플을 알앤디 시스템즈™ 퀀티카인™ 인간 IGF-1 면역검정 키트 (카탈로그 #DG100)를 사용하여 기준선과 비교시의 IGF-1 수준의 변화에 대해 분석하였다. 24시간 내지 864시간 범위의 시점에 대한 연구의 결과를 하기 표 10에 나타내었다.

<표 10> 혈청 IGF-1 수준에 대한 SS1의 효과 (기준선으로부터의 변화 %)

표 10의 데이터는 GHR 길항제 항체 SS1이 시노몰구스 원숭이에서 혈청 IGF-1 수준을 용량 의존적으로 감소시킨다는 것을 보여준다. 30 mg/kg IgG1을 투여한 대조군 동물에서, 혈청 IGF-1 수준은 대조군 IgG1을 투여한 후 48시간에 기준선 수준 밑으로 약 47% 감소한 다음, 투여 후 144시간까지 기준선 수준으로 복귀하였고, 연구의 나머지 전체에 걸쳐 대략 기준선 수준에 머무르거나 또는 기준선 수준을 초과하였다 (표 10, 마지막 행). 대조적으로, 혈청 IGF-1 수준은 3, 10 또는 30 mg/kg SS1의 단일 용량의 정맥내 투여 후 120시간까지 기준선 수준 밑으로 약 75% 감소하였다. SS1로 처리한 동물에서의 혈청 IGF-1 수준은 용량 투여 후 240시간 (3 mg/kg 용량), 336시간 (10 mg/kg 용량) 또는 696시간 (30 mg/kg 용량)까지 실질적으로 기준선 밑에 머물렀다. 이들 결과는 GHR 길항제 항체로의 처리가 혈중 IGF-1 수준을 저하시키는데 효과적이며, 상기 효과가 용량-의존성임을 입증한다.

혈청 샘플을 알앤디 시스템즈™ 퀀티카인™ 인간 IGFBP-3 면역검정 키트 (카탈로그 #DGB300)를 사용하여 기준선과 비교시의 IGFBP-3 수준의 변화에 대해 분석하였다. 24시간 내지 336시간 범위의 시점에 대한 연구의 결과를 하기 표 11에 나타내었다.

<표 11> 혈청 IGFBP-3 수준에 대한 SS1의 효과 (기준선으로부터의 변화 %)

표 11의 데이터는 GHR 길항제 항체 SS1이 시노몰구스 원숭이에서 혈청 IGFBP-3 수준을 용량 의존적으로 감소시킨다는 것을 보여준다. 혈청 IGFBP-3 수준은 각각 3, 10 또는 30 mg/kg SS1의 단일 용량의 정맥내 투여 후 72시간까지 기준선 밑으로 약 36%, 38% 또는 23% 감소하였다. 투여 후 144시간까지, 3, 10 또는 30 mg/kg SS1로 처리한 동물에서의 혈청 IGFBP-3 수준은 각각 기준선 밑으로 약 47%, 51% 또는 46% 감소하였다. SS1 항체의 단일 용량으로 처리한 동물에서의 혈청 IGFBP-3 수준은 연구 종료시까지는 기준선 수준으로 복귀하였다. 30 mg/kg 대조군 IgG1을 투여한 동물에서의 혈청 IGFBP-3 수준은 연구 전체에 걸쳐 대략 기준선 수준에 머물렀다 (표 11, 마지막 행). 이들 결과는 GHR 길항제 항체로의 처리가 혈중 IGFBP-3 수준을 저하시키는데 효과적임을 입증한다.

혈청 샘플을 바이오벤더(BioVendor)™ 인간 ALS ELISA 키트 (카탈로그 #RMEE35R)를 사용하여 기준선과 비교시의 ALS 수준의 변화에 대해 분석하였다. 24시간 내지 336시간 범위의 시점에 대한 연구의 결과를 하기 표 12에 나타내었다.

<표 12> 혈청 ALS 수준에 대한 SS1의 효과 (기준선으로부터의 변화 %)

표 12의 데이터는 GHR 길항제 항체 SS1이 시노몰구스 원숭이에서 혈청 ALS 수준을 감소시킨다는 것을 보여준다. 혈청 ALS 수준은 각각 3, 10 또는 30 mg/kg SS1의 단일 용량의 정맥내 투여 후 96시간까지 약 51%, 24% 또는 49% 감소하였다. SS1 항체의 단일 용량으로 처리한 동물에서의 혈청 ALS 수준은 연구 종료시까지는 기준선 수준으로 복귀하였다. 30 mg/kg 대조군 IgG1을 투여한 동물에서의 혈청 ALS 수준은 연구 전체에 걸쳐 대략 기준선 수준에 머물렀다 (표 12, 마지막 행). 이들 결과는 GHR 길항제 항체로의 처리가 혈중 ALS 수준을 저하시키는데 효과적임을 입증한다.

SS1의 피하 투여가 혈중 IGF-1 및 ALS 수준의 저하를 일으키는지의 여부를 결정하기 위해, 동물에게 피하로 투여하였다. 6마리의 미감작 암컷 시노몰구스 원숭이에게 1X PBS 0.01% 트윈™ 20 중 SS1 또는 음성 대조군 인간 IgG_{2Δ a}의 단일 용량을 정맥내로 또는 피하로 주사하였다. 제1일에, 2마리의 원숭이에게 3 mg/kg SS1을 정맥내로 투여하고, 2마리에게 3mg/kg SS1을 피하로 투여하고, 2마리에게 3 mg/kg 음성 대조군 인간 IgG_{2 Δa}를 피하로 투여하였다. 혈청 샘플을 하기 시점: 투여 전, 24시간, 72시간, 120시간, 168시간, 216시간, 264시간, 312시간, 360시간, 408시간, 456시간 및 504시간에 모든 동물로부터 채취하였다.

혈청 샘플을 알앤디 시스템즈™ 퀀티카인™ 인간 IGF-1 면역검정 키트 (카탈로그 #DG100)를 사용하여 기준선과 비교시의 IGF-1 수준의 변화에 대해 분석하였다. 24시간 내지 360시간 범위의 시점에 대한 연구의 결과를 하기 표 13에 나타내었다.

<표 13> 혈청 IGF-1 수준에 대한 SS1의 효과 (기준선으로부터의 변화 %)

표 13의 데이터는 GHR 길항제 항체 SS1이 피하로 (SQ) 또는 정맥내로 (IV) 투여되었을 때 시노몰구스 원숭이에서 혈청 IGF-1 수준을 용량 의존적으로 감소시킨다는 것을 보여준다. 혈청 IGF-1 수준은 3 mg/kg SS1의 단일 용량의 피하 (SC) 또는 정맥내 (IV) 투여 후 72시간까지 대조군 밑으로 약 63% 감소하였다. SS1로 처리한 동물에서의 혈청 IGF-1 수준은 SQ 또는 IV로 투여한 후 약 216시간까지 기준선 수준의 60% 밑에 머물렀다. 3 mg/kg 대조군 IgG1을 피하로 투여한 동물에서의 혈청 IGF-1 수준은 연구 전체에 걸쳐 대략 기준선 수준에 머물렀다 (표 13, 마지막 행). 이들 결과는 정맥내로 또는 피하로 투여되는 GHR 길항제 항체로의 처리가 혈중 IGF-1 수준을 저하시키는데 효과적임을 입증한다.

혈청 샘플을 바이오벤더™ 인간 ALS ELISA 키트 (카탈로그 #RMEE35R)를 사용하여 기준선과 비교시의 ALS 수준의 변화에 대해 분석하였다. 24시간 내지 260시간 범위의 시점에 대한 연구의 결과를 하기 표 14에 나타내었다.

<표 14> 혈청 ALS 수준에 대한 SS1의 효과 (기준선으로부터의 변화 %)

표 14의 데이터는 길항제 항체 SS1이 피하로 (SQ) 또는 정맥내로 (IV) 투여되었을 때 시노몰구스 원숭이에서 혈청 ALS 수준을 용량 의존적으로 감소시킨다는 것을 보여준다. 혈청 ALS 수준은 3 mg/kg SS1의 단일 용량의 피하 (SQ) 투여 후 72시간까지 대조군 밑으로 약 43% 감소하였다. ALS 수준은 3 mg/kg SS1의 단일 용량의 정맥내 (IV) 투여 후 72시간까지 대조군 밑으로 약 31% 감소하였다. 혈청 ALS 수준은 312시간까지는 기준선 수준으로 복귀하였다. 3 mg/kg 대조군 IgG1을 투여한 동물에서의 혈청 ALS 수준은 연구 전체에 걸쳐 기준선 수준에 머무르거나 또는 기준선 수준을 초과하였다 (표 14, 마지막 행). 이들 결과는 정맥내로 또는 피하로 투여되는 GHR 길항제 항체로의 처리가 혈중 ALS 수준을 저하시키는데 효과적임을 입증한다.

실시예 6: 이리노테칸과 조합된 GHR 길항제 항체는 암의 마우스 모델에서 종양을 억제하는데 효과적이다

본 실시예는 암의 동계 마우스 모델에서의 종양 성장에 대한 GHR 길항제 항체의 효과를 예시한다.

GHR 길항제 모노클로날 항체가 종양 성장을 억제할 수 있을지를 결정하기 위해, 마우스 항체 Ab11의 효과를 동계 종양 모델에서 시험하였다. Ab11 항체는 마우스 GHR을 차단하는 마우스 IgG1 항체이다. CT26 세포주를 결장직장암의 동계 마우스 모델로서 사용하였다. 마우스에 종양 세포를 주사하고, Ab11 항체를 단독으로 또는 이리노테칸과 조합하여 투여하였다. 음성 대조군 군 및 이리노테칸 단독 군도 또한 연구에 포함시켰다.

BALB/c 마우스 (BALB/cAnNCrl)를 찰스 리버(Charles River; 미국 캘리포니아주 홀리스터)로부터 입수하고, 리나트(Rinat)에 있는 동물 시설에서 유지하였다. 동물은 연구에 사용될 때 7주령이었고, 22-23 g의 초기 체중을 가졌다. 마우스를 실험 전체에 걸쳐 12시간 명 / 12시간 암 스케줄 및 오토클레이빙된 표준 고형사료 및 물 공급과 함께 무-병원체 조건 하에 마이크로격리기 (필터 상부 케이지)에 입주시켰다.

마우스 미분화 결장 암종 세포주 CT26 (CRL-2638)을 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC; 미국 버지니아주 마나사스)으로부터 입수하였다. CT26 세포를 10% 태아 소 혈청 (43640) (제이알 사이언티픽™, 인크.(JR Scientific™, Inc.), 미국 버지니아주 마나사스) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신 용액 (30-002-CI) (셀그로™ 미디어테크™, 인크.(Cellgro™ Mediatech™, Inc.), 미국 버지니아주 마나사스)을 함유하는 L-글루타민 함유 RPMI 1640, 1X (10-040-CV) (셀그로™ 미디어테크™, 인크., 미국 버지니아주 마나사스) 중에서 성장시켰다. 세포를 아큐타제(Accutase) (A6964-100ML) (시그마™ 알드리치, 인크.(Sigma™ Aldrich, Inc.), 미국 미주리주 세인트 루이스)와 함께 간결하게 인큐베이션함으로써 수확하고, 계수를 위해 새로운 배지 중에서 세척하였다. 세포 카운트 및 생존율 (95.8%)을 자동화된 계수기 및 생존율 기계인 바이셀(ViCell)™을 사용하여 평가하였다. 새로운 배지 중 최종 세포 현탁액을 주사를 위해 BD 매트리겔(Matrigel)™ 매트릭스 기저막 (356234) (BD 바이오사이언시스(BD Biosciences)™, 미국 매사추세츠주 베드포드)으로 1:2로 희석하였다.

BALB/c 마우스의 좌측면 내로 10⁵개 세포를 피하 (SC) 주사함으로써 종양 이종이식을 개시하였다. 7일 후, 종양은 대략 75-150 mm³의 부피로 성장하였다. 동물을 대략 동일한 평균 종양 부피 및 평균의 표준 오차를 갖는 4개의 군으로 분할하고, 처리를 받도록 무작위로 배정하였다. 대조군 내의 동물을 10% 디메틸 술폭시드 (DMSO) (D2650 - 시그마™ 알드리치, 인크., 미국 미주리주 세인트 루이스)를 함유하는 1X PBS + 10 mg/kg 마우스 IgG1 이소형 대조군 항체로 처리하였다. 이리노테칸 군 내의 동물을 100 mg/kg 이리노테칸 히드로클로라이드 (I1406 - 시그마™ 알드리치) + 10 mg/kg 마우스 IgG1 이소형 대조군 항체로 처리하였다. Ab11 군 내의 동물을 10 mg/kg Ab11 + 10% DMSO를 함유하는 1X PBS로 처리하였다. 조합 군 내의 동물을 100 mg/kg 이리노테칸 + 10 mg/kg Ab11로 처리하였다.

마우스에 매 2 내지 3일마다 복강내로 (IP) 투여하였다. 종양 부피 및 체중을 1주에 적어도 2회 측정하였다. 연구는 맹검이었다. 제28일에, 혈청 IGF-1의 측정을 위해 혈액을 수집하였다.

종양을 디지털 캘리퍼 (mm)로 매 2-4일마다 측정하였다. 기준선 종양 부피를 하기 공식을 이용하여 계산하였다: V = d2² x (d1/2) (여기서, d1은 종양의 가장 긴 직경이고, d2는 d1에 수직임). 연구 종료시에, 연구를 여전히 맹검으로 유지하면서, 모든 4개의 군으로부터 이상치를 결정하고 제외시켰다. 제14일 이후의 모든 날 (제18, 22, 25 및 28일)에 3X 평균의 표준 오차 < 평균 및 3X 평균의 표준 오차 > 평균인 종양을 이상치인 것으로 결정하였다. 연구 종료시의 종양 중량도 또한 측정하였다.

혈청 IGF-1을 마우스 / 래트 IGF-1 ELISA 키트 (MG100) (알앤디 시스템즈™, 인크., 미국 미네소타주 미네아폴리스)를 사용하여 ELISA에 의해 측정하였다.

마우스 암 모델 연구로부터의 데이터를 하기 표 16 및 17에 나타내었다. 표 16은 대조군 동물, GHR 길항제 항체 Ab11로 처리한 동물, 이리노테칸으로 처리한 동물, 및 Ab11 및 이리노테칸 둘 다로 처리한 동물에서의 평균 종양 부피 (mm³ 단위)를 보여준다. 표 17은 대조군 동물, GHR 길항제 항체 Ab11로 처리한 동물, 이리노테칸으로 처리한 동물, 및 Ab11 및 이리노테칸 둘 다로 처리한 동물에서의 제28일의 평균 종양 중량 (그램 단위)을 보여준다. 표 15 및 16에서, 값은 대조군 IgG1 항체, GHR 길항제 항체, 이리노테칸, 또는 GHR 길항제 항체와 이리노테칸의 조합물로 처리한 동물의 각 군에 대한 평균으로서 주어져 있다. 표 15 및 16의 데이터에 대해, *는 대조군에 대해 p < 0.05임을 나타내고, **는 대조군에 대해 p < 0.01임을 나타내고, ***는 대조군에 대해 p < 0.001임을 나타낸다.

<표 15> CT26 종양을 보유하는 BALB/c 마우스에서의 종양 부피 (mm³).

<표 16> CT26 종양을 보유하는 BALB/c 마우스에서의 제28일의 종양 중량 (그램 단위) 및 혈청 IGF-1 수준 (ng/mL).

표 15는 이리노테칸과 조합된 GHR 길항제 항체로 처리한 동물에서의 평균 종양 부피 (1092.1 mm³)가 대조군 동물에서의 평균 종양 부피 (1939.7 mm³)보다 유의하게 더 낮았다는 것을 보여준다.

표 16은 GHR 길항제 항체로 처리한 동물에서의 제28일 평균 혈청 IGF-1 수준 (단독으로 (298.6 ng/mL) 또는 이리노테칸과 조합하여 (278 ng/mL))이 대조군 동물에서의 혈청 IGF-1 수준 (410.1 ng/mL)과 비교시 유의하게 더 낮았다는 것을 보여준다. 이들 결과는 GHR 길항제 항체로의 처리가 암의 마우스 모델에서 혈중 IGF-1 수준을 저하시키는데 효과적임을 입증한다. 표 16은 또한 이리노테칸과 조합된 GHR 길항제 항체로 처리한 동물에서의 제28일 평균 종양 중량 (0.8 g)이 대조군 동물에서의 평균 종양 중량 (1.9 g)보다 유의하게 더 낮았다는 것을 보여준다. 이리노테칸 단독으로의 처리는 1.2 g의 평균 종양 중량을 유발한다. 이들 결과는 이리노테칸과 조합된 GHR 길항제 항체로의 처리가 암의 마우스 모델에서 종양 성장을 억제하는데 효과적임을 입증한다.

실시예 7: GHR 길항제 항체는 콜라겐-유발 관절염의 마우스 모델에서 질환 중증도를 감소시키는데 효과적이다

본 실시예는 콜라겐-유발 관절염의 마우스 모델에서의 질환 중증도에 대한 GHR 길항제 항체의 효과를 예시한다.

GHR 길항제 모노클로날 항체가 관절염에서 질환 중증도를 감소시킬 수 있을지를 결정하기 위해, 마우스 항체 Ab11의 효과를 콜라겐-유발 관절염의 마우스 모델에서 시험하였다.

44마리의 수컷 마우스 (계통 B10.RIII-H2r H2-T18bl(71NS)SnJ. 스톡 # 000457)를 잭슨 랩스(Jackson Labs; 메인주 바 하버)로부터 구입하고, 도착 후 수일 동안 적응하도록 하였다. 동물은 연구 시작 시점에 대략 8주령이었다. 마우스를 류마티스 관절염 유도를 받도록 10마리의 4개 군에 무작위로 할당하였다. 4마리의 건강한 비처리된 마우스는 대조군으로서 분석하였다. 제0일 및 제15일에, 질환군 동물을 이소플루란으로 마취하고, 4 mg/ml 보충적 미코박테리움 투베르쿨로시스 (디프코 래보러토리즈(Difco Laboratories), 미시간주 디트로이트)를 함유하는 100 μl 프로인트 완전 아주반트 (시그마-알드리치, 미주리주 세인트 루이스) 중 200 μg 소 제II형 콜라겐 (엘라스틴 프로덕츠(Elastin Products), 미주리주 오웬스빌)을 피내로 주사하였다. 동물을 제-1일에 예방적으로 Ab11 시험 물품 또는 비히클 대조군의 복강내 (IP) 주사로 처리하였다. 이어서, 3 mg/kg, 10 mg/kg 또는 30mg/kg의 Ab11 항체 또는 비히클 대조군 주사 (PBS 0.01% 폴리소르베이트 20. 제이티 베이커(JT Baker), 카탈로그 # 4116-04, 뉴저지주 필립스버그)를 1개월의 기간 동안 매주 2회 IP 투여하였다. 제-4일, 제15일 및 제29일에 혈청을 위해 마우스를 이소플루란으로 마취하고, 안와동을 통해 출혈시켰다. 혈청 샘플을 분석 시점까지 -20℃ 이하에서 결빙시켰다.

임상 점수를 매일 모든 4개의 발에 대해 관찰 및 기록하였다. 실험자는 항상 투여군의 정체에 대해 맹검상태였다. 점수를 하기 기준에 따라 결정하였다: 0 = 건강함; 1 = 1개의 뒷발 또는 앞발 관절이 영향받거나 또는 최소 광범위 홍반 및 종창; 2 = 2개의 뒷발 또는 앞발 관절이 영향받거나 또는 경도 광범위 홍반 및 종창; 3 = 3개의 뒷발 또는 앞발 관절이 영향받거나 또는 중등도 광범위 홍반 및 종창; 4 = 현저한 광범위 홍반 및 종창, 또는 4개의 발가락 관절이 영향받음; 5 = 중증 광범위 홍반 및 발 전체의 중증 종창, 발가락을 굽히지 못함.

제29일에, 마우스 중 절반 (질환 세트의 경우에는 군당 5마리, 및 건강한 대조군 세트로부터 2마리의 마우스)을 안락사시키고, 이들의 앞발, 뒷발 및 무릎을 제거하고, 중성 완충 포르말린에 넣었다. 앞발, 뒷발 및 무릎을 1-2일 동안 고정한 다음, 4-5일 동안 탈회제로 옮겼다. 이들 관절을 포매시키고, 절단하고, 톨루이딘 블루로 염색하였다. 조직병리학적 점수화를 발 및 무릎 상에서 염증, 판누스의 존재, 연골 손상 및 골 손상에 대해 수행하였다. 조직을 점수화하기 위해 하기 기준을 이용하였다. 염증: 0 = 정상; 1 = 환부 관절의 활막 및 관절주위 조직에서의 염증 세포의 최소 침윤; 2 = 경도 침윤; 발의 경우에는, 환부 관절에 국한됨; 3 = 중등도 침윤, 및 중등도 부종; 발의 경우에는, 환부 관절에 국한됨; 4 = 대부분의 영역에 영향을 미치는 현저한 침윤, 및 현저한 부종; 5 = 중증 광범위 침윤, 및 중증 부종. 판누스: 0 = 정상; 1 = 연골 및 연골하골에서의 판누스의 최소 침윤; 2 = 환부 관절에서의 경도 침윤, 및 경조직의 변연부 파괴; 3 = 환부 관절에서의 중등도 침윤, 및 중등도 경조직 파괴; 4 = 현저한 침윤, 및 관절 구조의 현저한 파괴, 대부분의 관절; 5 = 관절 구조의 완전한 또는 거의 완전한 파괴와 연관된 중증 침윤, 모든 관절에 영향을 미침. 연골 손상: 0 = 정상; 1 = 최소: 환부 관절에서의 톨루이딘 블루 염색의 최소 내지 가벼운 손실, 명백한 연골세포 소실 또는 콜라겐 파괴는 전혀 없음; 2 = 경도: 환부 관절에서의 톨루이딘 블루 염색의 가벼운 소실, 및 국소 경도 (표재성) 연골세포 소실 및/또는 콜라겐 파괴; 3 = 중등도: 환부 관절에서의 톨루이딘 블루 염색의 중간 정도의 소실, 및 다발성 중등도 (중층 부위 깊이) 연골세포 소실 및/또는 콜라겐 파괴; 4 = 현저함: 대부분의 관절에서의 톨루이딘 블루 염색의 현저한 손실, 및 다발성 현저한 (심층 부위 깊이) 연골세포 소실 및/또는 콜라겐 파괴; 5 = 중증: 모든 관절에서의 톨루이딘 블루 염색의 심한 광범위 소실, 및 다발성 중증 (최고 도달점 깊이) 연골세포 소실 및/또는 콜라겐 파괴. 골 흡수: 0 = 정상; 1 = 최소: 환부 관절에서의 최소 영역의 흡수, 저배율에서 용이하게 분명하지 않음, 드문 파골세포; 2 = 경도: 환부 관절에서의 보다 다수 영역의 흡수, 저배율에서 용이하게 분명하지 않음, 보다 다수의 파골세포; 3 = 중등도: 환부 관절에서 피질에서의 전층 결손 없이 수질 소주골 및 피질골의 명백한 흡수, 일부 수질 소주의 소실, 저배율에서 병변이 분명함, 보다 다수의 파골세포; 4 = 현저함: 피질골에서의 전층 결손, 종종 남아있는 피질 표면의 측면상의 뒤틀림이 있음, 수질골의 현저한 소실, 다수의 파골세포, 대부분의 관절에 영향을 미침; 5 = 중증: 모든 관절의 피질골에서의 전층 결손 및 관절 구조의 파괴.

체중을 매일 측정 및 기록하였다. 제14일 (질환 소견)에서 제29일까지의 체중의 퍼센트 변화를 각 군에 대해 계산하였다. 제29일에, 마우스 중 절반 (질환 세트의 경우에는 군당 5마리, 및 건강한 대조군 세트로부터 2마리의 마우스)을 안락사시키고, 이들의 뒷발을 제거하고, 칭량하였다.

제29일 혈액 수집으로부터의 혈청을 Ab11 치료 항체의 수준에 대해 분석하였다. 눈크(Nunc) 96-웰 맥시소르프(maxisorp) ELISA 플레이트 (카탈로그 # 446612, 덴마크)를 1X PBS (셀그로 - 미디어테크, 버지니아주 헌던) 중 5 μg/ml 재조합 마우스 GHR/Fc 키메라 (알앤디 시스템즈. 카탈로그 # 1360-GR, 미네소타주 미네아폴리스) 100 μl/웰로 코팅하였다. 표준 곡선을 위해 Ab11의 2배 연속 희석물을 사용하였고, 여기서 최고 희석은 0.03μg/ml 이었다. 표준물 및 샘플을 1X PBS 중 0.5% BSA (카탈로그 # A7906, 시그마, 미주리주 세인트 루이스)로 구성된 검정 완충제 중에 희석하고, 100 μl/웰로 로딩하였다. 검정 완충제 중 HRP-접합된 토끼 항-마우스 IgG1 (자이메드(Zymed), 카탈로그 # 61-0120, 캘리포니아주 사우스 샌프란시스코)의 1:2000 희석물을 검출 항체로 사용하였다. ELISA 플레이트를 TMB 기질 (카탈로그 # 50-76-02/50-65-02, KPL, 메릴랜드주 게이더스버그)을 사용하여 발색시키고, 1 M 인산으로 정지시켰다. 플레이트를 몰레큘라 디바이시스(Molecular Devices) 마이크로플레이트 판독기 상에서 450 nm에서 판독하였다.

자가항체를 연구 제15일 및 제29일에 수집된 혈청으로부터 측정하였다. 눈크 ELISA 플레이트를 5 μg/ml 소 제II형 콜라겐 (로크랜드(Rockland), 카탈로그 # 001-001-104)으로 코팅하였다. 검정 완충제 중 퍼옥시다제-접합된 염소 항-마우스 IgG (H+L) (잭슨 이뮤노리서치 랩스(Jackson ImmunoResearch labs). 카탈로그 # 115-035-146, 펜실베니아주 웨스트 그로브)의 1:5000 희석물을 검출 항체로 사용하였다. ELISA 플레이트를 TMB 기질 (카탈로그 # 50-76-02/50-65-02, KPL, 메릴랜드주 게이더스버그)을 사용하여 발색시키고, 1 M 인산으로 정지시켰다. 플레이트를 몰레큘라 디바이시스 마이크로플레이트 판독기 상에서 450 nm에서 판독하였다. 광학 밀도 점수를 각각의 희석에 대해 플롯팅하였다.

기준선, 제15일 및 제29일 혈액 수집으로부터의 혈청을 IGF-1의 수준에 대해 분석하였다. ELISA를 퀀티카인 마우스 IGF-1 면역검정 키트 (알앤디 시스템즈. 카탈로그 # MG100, 미네소타주 미네아폴리스)를 사용하여 실행하였다. 플레이트를 몰레큘라 디바이시스 마이크로플레이트 판독기 상에서 450 nm에서 판독하였다. 기준선 IGF-1로부터의 퍼센트 변화를 각각의 시점에 대해 계산하였다. Ab11로 처리한 동물은 대조군과 비교시 IGF-1 수준의 용량-의존적 감소를 나타내었다 (데이터는 제시하지 않음).

제31일에, 마우스 중 절반 (질환 세트의 경우에는 군당 5마리, 및 건강한 대조군 세트로부터 2마리의 마우스)을 안락사시키고, 이들의 서혜 림프절을 수집하고, FACS 분석을 이용하여 특정 세포 유형에 대해 분석하였다. 배액 림프절로부터의 단세포 현탁액을, 림프성 조직을 3 ml 시린지의 고무 플런저 끝으로 와이어 메쉬를 통해 약하게 밀어냄으로써 생성하였다. 수집한 후, 세포를 염색 완충제 (Mg^{2 +} 또는 Ca^{2 +} 무함유 DPBS + 1% 열-불활성화 FCS, pH 7.4 - 7.6) 중에서 세척하고, 항-CD16-CD32 (2.4G2, BD 바이오사이언시스, 캘리포니아주 산호세)로 차단하였다. 세포를 다시 세척한 다음, 세포 표면 마커 CD4 (CD4-PerCP, BD 바이오사이언시스, 카탈로그# 553052), CD8 (CD8-APC, BD 바이오사이언시스, 카탈로그# 553035), IgD (IgD-FITC, BD 바이오사이언시스, 카탈로그# 553439) 및 CD25 (CD25-PE, BD 바이오사이언시스, 카탈로그# 558642)에 대해 특이적인 형광-표지된 항체로 4℃에서 암실에서 30분 동안 염색하였다. 데이터는 FACSAria (BD 바이오사이언시스) 상에서 획득하고, FACS 디바(Diva) 소프트웨어로 분석하였다.

제31일에, 마우스 중 절반 (질환 세트의 경우에는 군당 5마리, 및 건강한 대조군 세트로부터 2마리의 마우스)을 안락사시키고, 이들의 비장을 수집하고, FACS 분석을 이용하여 특정 세포 유형에 대해 분석하였다. 비장세포의 단세포 현탁액을, 조직을 3ml 시린지의 고무 플런저 끝으로 와이어 메쉬를 통해 약하게 밀어냄으로써 생성하였다. 수집한 후, 세포를 염색 완충제 (Mg^{2 +} 또는 Ca^{2 +} 무함유 DPBS + 1% 열-불활성화 FCS, pH 7.4 - 7.6) 중에서 세척하고, 항-CD16-CD32 (2.4G2, BD 바이오사이언시스, 캘리포니아주 산호세)로 차단하였다. 세포를 다시 세척한 다음, 세포 표면 마커 CD4 (CD4-PerCP, BD 바이오사이언시스, 카탈로그# 553052), CD8 (CD8-APC, BD 바이오사이언시스, 카탈로그# 553035), IgD (IgD-FITC, BD 바이오사이언시스, 카탈로그# 553439) 및 CD25 (CD25-PE, BD 바이오사이언시스, 카탈로그# 558642)에 대해 특이적인 형광-표지된 항체로 4℃에서 암실에서 30분 동안 염색하였다. 데이터는 FACSAria (BD 바이오사이언시스) 상에서 획득하고, FACS 디바 소프트웨어로 분석하였다.

제31일에, 마우스 중 절반 (질환 세트의 경우에는 군당 5마리, 및 건강한 대조군 세트로부터 2마리의 마우스)을 안락사시키고, 비히클 처리한 마우스, 3 및 10 mg/kg Ab11 처리한 마우스, 및 건강한 대조군 마우스로부터 전혈을 수집하였다. 30 mg/kg 처리한 마우스로부터는 혈액을 수집하지 않았다. 혈액을 아드비아(ADVIA) 120 혈액학 시스템 (지멘스 메디칼 솔루션즈 디아그노스틱스(Siemens Medical Solutions Diagnostics), 뉴욕주 태리타운)을 사용하여 유동 세포측정법에 의해 분석하였다. 백혈구를 계수하고, 입방 mm당 1000개 세포의 단위로 기록하였다. 적혈구를 계수하고, 입방 mm당 100만개 세포의 단위로 기록하였다. 림프구 및 단핵구를 계수하고, 백혈구의 퍼센트로 기록하였다. 호중구 및 호산구를 계수하고, 백혈구의 퍼센트로 기록하였다.

GHR 길항제 항체 Ab11로의 처리는 대조군과 비교시 임상 관절염 점수의 감소를 일으켰다. 예를 들어, 제21일에, GHR 길항제 항체-처리한 동물은 약 0.5 (30 mg/kg 용량), 약 0.7 (3 mg/kg 용량) 또는 약 1.1 (10 mg/kg 용량)의 임상 점수 (발)를 가졌다. 대조적으로, 제21일에, 대조군 동물은 약 1.8의 임상 점수를 가졌다. 제29일에, GHR 길항제 항체-처리한 동물은 약 2 내지 2.5의 임상 점수 (발)를 가졌다. 대조적으로, 제29일에, 대조군 동물은 약 3.5의 임상 점수를 가졌다.

이들 결과는 GHR 길항제 항체로의 처리가 콜라겐-유발 관절염의 마우스 모델에서 중증도를 감소시키는데 효능이 있음을 입증한다.

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ATCC PTA-12352 20111222 ATCC PTA-12353 20111222

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1 5 <210> 34 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized and/or affinity matured antibody sequence <400> 34 His Gln Tyr His Arg His Thr Pro Thr 1 5 <210> 35 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized and/or affinity matured antibody sequence <400> 35 His Gln Tyr His Arg Gln Thr Pro Thr 1 5 <210> 36 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized and/or affinity matured antibody sequence <400> 36 His Gln Tyr His Arg Gly Thr Pro Thr 1 5 <210> 37 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized and/or affinity matured antibody sequence <400> 37 His Gln Tyr His Arg Ser Tyr Pro Thr 1 5 <210> 38 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized and/or affinity matured antibody sequence <400> 38 His Gln Tyr His Arg Ser Phe Pro Thr 1 5 <210> 39 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized and/or affinity matured antibody sequence <400> 39 His Gln Tyr His Arg Ser Ile Pro Thr 1 5 <210> 40 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized and/or affinity matured antibody sequence <400> 40 His Gln Tyr His Arg Ser Trp Pro Thr 1 5 <210> 41 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized and/or affinity matured antibody sequence <400> 41 Arg Ala Thr Ser Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu His 1 5 10 <210> 42 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized and/or affinity matured antibody sequence <400> 42 Glu Ala Thr Ser Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu His 1 5 10 <210> 43 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized and/or affinity matured antibody sequence <400> 43 Thr Pro Thr Ser Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu His 1 5 10 <210> 44 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized and/or affinity matured antibody sequence <400> 44 Thr Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu His 1 5 10 <210> 45 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized and/or affinity matured antibody sequence <400> 45 Thr Ala Thr Thr Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu His 1 5 10 <210> 46 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized and/or affinity matured antibody sequence <400> 46 Thr Ala Thr Arg Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu His 1 5 10 <210> 47 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized and/or affinity matured antibody sequence <400> 47 Thr Ala Thr Trp Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu His 1 5 10 <210> 48 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized and/or affinity matured antibody sequence <400> 48 Thr Ala Thr Phe Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu His 1 5 10 <210> 49 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized and/or affinity matured antibody sequence <400> 49 Thr Ala Thr Ser Trp Val Ser Ser Ser Tyr Leu His 1 5 10 <210> 50 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized and/or affinity matured antibody sequence <400> 50 Thr Ala Thr Ser Val Val Ser Ser Ser Tyr Leu His 1 5 10 <210> 51 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized and/or affinity matured antibody sequence <400> 51 Thr Ala Thr Ser Asp Val Ser Ser Ser Tyr Leu His 1 5 10 <210> 52 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized and/or affinity matured antibody sequence <400> 52 Thr Ala Thr Ser Ser Val Gly Ser Ser Tyr Leu His 1 5 10 <210> 53 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized and/or affinity matured antibody sequence <400> 53 Thr Ala Thr Ser Ser Val Trp Ser Ser Tyr Leu His 1 5 10 <210> 54 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized and/or affinity matured antibody sequence <400> 54 Thr Ala Thr Ser Ser Val Ser Pro Ser Tyr Leu His 1 5 10 <210> 55 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized and/or affinity matured antibody sequence <400> 55 Thr Ala Thr Ser Ser Val Ser Gln Ser Tyr Leu His 1 5 10 <210> 56 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized and/or affinity matured antibody sequence <400> 56 Thr Ala Thr Ser Ser Val Ser Ala Ser Tyr Leu His 1 5 10 <210> 57 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized and/or affinity matured antibody sequence <400> 57 Thr Ala Thr Ser Ser Val Ser Ser Gly Tyr Leu His 1 5 10 <210> 58 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized and/or affinity matured antibody sequence <400> 58 Thr Ala Thr Ser Ser Val Ser Ser Ile Tyr Leu His 1 5 10 <210> 59 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized and/or affinity matured antibody sequence <400> 59 Thr Ala Thr Ser Ser Val Ser Ser Glu Tyr Leu His 1 5 10 <210> 60 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized and/or affinity matured antibody sequence <400> 60 Thr Ala Thr Ser Ser Val Ser Ser Ser Trp Leu His 1 5 10 <210> 61 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized and/or affinity matured antibody sequence <400> 61 Thr Ala Thr Ser Ser Val Ser Ser Ser Tyr Val His 1 5 10 <210> 62 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized and/or affinity matured antibody sequence <400> 62 Thr Ala Thr Ser Ser Val Ser Ser Ser Tyr Phe His 1 5 10 <210> 63 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized and/or affinity matured antibody sequence <400> 63 Thr Ala Thr Ser Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Pro 1 5 10 <210> 64 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized and/or affinity matured antibody sequence <400> 64 Arg Ala Lys Ala Asn Asn His Ala 1 5 <210> 65 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized and/or affinity matured antibody sequence <400> 65 Glu Ile Arg Ala Lys Ala Asn Asn His Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 66 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized and/or affinity matured antibody sequence <400> 66 His Gln Tyr His Arg Ser Ala Pro Thr 1 5 <210> 67 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized and/or affinity matured antibody sequence <400> 67 Arg Thr Lys Ala Asn Asn His Ala 1 5 <210> 68 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized and/or affinity matured antibody sequence <400> 68 Glu Ile Arg Thr Lys Ala Asn Asn His Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 69 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized and/or affinity matured antibody sequence <400> 69 Arg Ser Arg Ala Asn Asn His Ala 1 5 <210> 70 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized and/or affinity matured antibody sequence <400> 70 Glu Ile Arg Ser Arg Ala Asn Asn His Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 71 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized and/or affinity matured antibody sequence <400> 71 Arg Ser Glu Ala Asn Asn His Ala 1 5 <210> 72 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized and/or affinity matured antibody sequence <400> 72 Glu Ile Arg Ser Glu Ala Asn Asn His Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 73 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized and/or affinity matured antibody sequence <400> 73 Arg Ser Lys Asp Asn Asn His Ala 1 5 <210> 74 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized and/or affinity matured antibody sequence <400> 74 Glu Ile Arg Ser Lys Asp Asn Asn His Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 75 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized and/or affinity matured antibody sequence <400> 75 Arg Ser Lys Ser Asn Asn His Ala 1 5 <210> 76 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized and/or affinity matured antibody sequence <400> 76 Glu Ile Arg Ser Lys Ser Asn Asn His Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 77 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized and/or affinity matured antibody sequence <400> 77 Arg Ser Lys Val Asn Asn His Ala 1 5 <210> 78 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized and/or affinity matured antibody sequence <400> 78 Glu Ile Arg Ser Lys Val Asn Asn His Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 79 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized and/or affinity matured antibody sequence <400> 79 Arg Ser Lys Tyr Asn Asn His Ala 1 5 <210> 80 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized and/or affinity matured antibody sequence <400> 80 Glu Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn His Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 81 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized and/or affinity matured antibody sequence <400> 81 Arg Ser Lys Glu Asn Asn His Ala 1 5 <210> 82 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized and/or affinity matured antibody sequence <400> 82 Glu Ile Arg Ser Lys Glu Asn Asn His Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 83 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized and/or affinity matured antibody sequence <400> 83 Arg Ser Lys Ala Asn Trp His Ala 1 5 <210> 84 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized and/or affinity matured antibody sequence <400> 84 Glu Ile Arg Ser Lys Ala Asn Trp His Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 85 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized and/or affinity matured antibody sequence <400> 85 Arg Ser Lys Ala Asn Ile His Ala 1 5 <210> 86 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized and/or affinity matured antibody sequence <400> 86 Glu Ile Arg Ser Lys Ala Asn Ile His Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 87 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized and/or affinity matured antibody sequence <400> 87 Arg Ser Lys Ala Asn Asp His Ala 1 5 <210> 88 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized and/or affinity matured antibody sequence <400> 88 Glu Ile Arg Ser Lys Ala Asn Asp His Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 89 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized and/or affinity matured antibody sequence <400> 89 Arg Ser Lys Ala Asn Lys His Ala 1 5 <210> 90 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized and/or affinity matured antibody sequence <400> 90 Glu Ile Arg Ser Lys Ala Asn Lys His Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 91 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized and/or affinity matured antibody sequence <400> 91 Arg Ser Lys Ala Asn Arg His Ala 1 5 <210> 92 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized and/or affinity matured antibody sequence <400> 92 Glu Ile Arg Ser Lys Ala Asn Arg His Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 93 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized and/or affinity matured antibody sequence <400> 93 Arg Ser Lys Ala Asn Asn Trp Ala 1 5 <210> 94 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized and/or affinity matured antibody sequence <400> 94 Glu Ile Arg Ser Lys Ala Asn Asn Trp Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 95 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized and/or affinity matured antibody sequence <400> 95 Arg Ser Lys Ala Asn Asn Ile Ala 1 5 <210> 96 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized and/or affinity matured antibody sequence <400> 96 Glu Ile Arg Ser Lys Ala Asn Asn Ile Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 97 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized and/or affinity matured antibody sequence <400> 97 Arg Ser Lys Ala Asn Asn Tyr Ala 1 5 <210> 98 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized and/or affinity matured antibody sequence <400> 98 Glu Ile Arg Ser Lys Ala Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 99 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized and/or affinity matured antibody sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Xaa can be H, D, P, or N <400> 99 Thr Ala Thr Ser Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Xaa 1 5 10 <210> 100 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized and/or affinity matured antibody sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa can be S, T, R, W, or F <400> 100 Thr Ala Thr Xaa Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu His 1 5 10 <210> 101 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized and/or affinity matured antibody sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa can be S, W, V, or D <400> 101 Thr Ala Thr Ser Xaa Val Ser Ser Ser Tyr Leu His 1 5 10 <210> 102 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized and/or affinity matured antibody sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa can be S, G, or W <400> 102 Thr Ala Thr Ser Ser Val Xaa Ser Ser Tyr Leu His 1 5 10 <210> 103 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized and/or affinity matured antibody sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa can be S, P, or Q <400> 103 Thr Ala Thr Ser Ser Val Ser Xaa Ser Tyr Leu His 1 5 10 <210> 104 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized and/or affinity matured antibody sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa can be S, G, I, E, W, or F <400> 104 Thr Ala Thr Ser Ser Val Ser Ser Xaa Tyr Leu His 1 5 10 <210> 105 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized and/or affinity matured antibody sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Xaa can be L, V, or F <400> 105 Thr Ala Thr Ser Ser Val Ser Ser Ser Tyr Xaa His 1 5 10 <210> 106 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized and/or affinity matured antibody sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa can be S, F, R, Y, H, Q, or G <400> 106 His Gln Tyr His Arg Xaa Thr Pro Thr 1 5 <210> 107 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized and/or affinity matured antibody sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa can be T, Y, F, I, A, or W <400> 107 His Gln Tyr His Arg Ser Xaa Pro Thr 1 5 <210> 108 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized and/or affinity matured antibody sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa can be S, A, or T <400> 108 Arg Xaa Lys Ala Asn Asn His Ala 1 5 <210> 109 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized and/or affinity matured antibody sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa can be S, A, or T <400> 109 Glu Ile Arg Xaa Lys Ala Asn Asn His Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 110 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized and/or affinity matured antibody sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> Xaa can be K, R, or E <400> 110 Arg Ser Xaa Ala Asn Asn His Ala 1 5 <210> 111 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized and/or affinity matured antibody sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> Xaa can be K, R, or E <400> 111 Glu Ile Arg Ser Xaa Ala Asn Asn His Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 112 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized and/or affinity matured antibody sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> Xaa can be A, D, S, V, Y, or E <400> 112 Arg Ser Lys Xaa Asn Asn His Ala 1 5 <210> 113 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized and/or affinity matured antibody sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa can be A, D, S, V, Y, or E <400> 113 Glu Ile Arg Ser Lys Xaa Asn Asn His Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 114 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized and/or affinity matured antibody sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa can be N, F, W, I, D, Y, K, or R <400> 114 Arg Ser Lys Ala Asn Xaa His Ala 1 5 <210> 115 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized and/or affinity matured antibody sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa can be N, F, W, I, D, Y, K, or R <400> 115 Glu Ile Arg Ser Lys Ala Asn Xaa His Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 116 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized and/or affinity matured antibody sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa can be H, W, I, Y, or F <400> 116 Arg Ser Lys Ala Asn Asn Xaa Ala 1 5 <210> 117 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized and/or affinity matured antibody sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa can be H, W, I, Y or F <400> 117 Glu Ile Arg Ser Lys Ala Asn Asn Xaa Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 118 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized and/or affinity matured antibody sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa can be Y, F, or I <400> 118 Xaa Arg Asp Tyr Trp 1 5 <210> 119 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized and/or affinity matured antibody sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa can be L or I <400> 119 Xaa Tyr Arg Asp Tyr Trp 1 5 <210> 120 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized and/or affinity matured antibody sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa can be S, W, or F <400> 120 Thr Ala Thr Ser Ser Val Ser Ser Xaa Tyr Leu His 1 5 10 <210> 121 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized and/or affinity matured antibody sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Xaa can be H, D, or N <400> 121 Thr Ala Thr Ser Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Xaa 1 5 10 <210> 122 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized and/or affinity matured antibody sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa can be T, Y, F, I, or W <400> 122 His Gln Tyr His Arg Ser Xaa Pro Thr 1 5 <210> 123 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized and/or affinity matured antibody sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa can be N, F, or Y <400> 123 Arg Ser Lys Ala Asn Xaa His Ala 1 5 <210> 124 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized and/or affinity matured antibody sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa can be N, F, or Y <400> 124 Glu Ile Arg Ser Lys Ala Asn Xaa His Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 125 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized and/or affinity matured antibody sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> Xaa can be H or F <400> 125 Arg Ser Lys Ala Asn Asn Xaa Ala 1 5 <210> 126 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized and/or affinity matured antibody sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> Xaa can be H or F <400> 126 Glu Ile Arg Ser Lys Ala Asn Asn Xaa Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 127 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized and/or affinity matured antibody sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa can be N or Y <400> 127 Arg Ser Lys Ala Asn Xaa His Ala 1 5 <210> 128 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized and/or affinity matured antibody sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> Xaa can be N or Y <400> 128 Glu Ile Arg Ser Lys Ala Asn Xaa His Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 129 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized and/or affinity matured antibody sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa can be Y or I <400> 129 Xaa Arg Asp Tyr Trp 1 5 <210> 130 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized and/or affinity matured antibody sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa can be S, F, R, Y, H or G <400> 130 His Gln Tyr His Arg Xaa Thr Pro Thr 1 5 <210> 131 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized and/or affinity matured antibody sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> Xaa can be H or D <400> 131 Thr Ala Thr Ser Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Xaa 1 5 10 <210> 132 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized and/or affinity matured antibody sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> Xaa can be S or F <400> 132 His Gln Tyr His Arg Xaa Thr Pro Thr 1 5 <210> 133 <211> 440 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized and/or affinity matured antibody sequence <400> 133 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala 20 25 30 Trp Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Glu Ile Arg Ser Lys Ala Asn Tyr His Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Thr Leu Ile Arg Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 115 120 125 Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val 130 135 140 Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala 145 150 155 160 Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly 165 170 175 Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly 180 185 190 Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys 195 200 205 Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys 210 215 220 Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 225 230 235 240 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 245 250 255 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr 260 265 270 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 275 280 285 Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His 290 295 300 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 305 310 315 320 Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln 325 330 335 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met 340 345 350 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 355 360 365 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 370 375 380 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 385 390 395 400 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 405 410 415 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 420 425 430 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 <210> 134 <211> 441 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized and/or affinity matured antibody sequence <400> 134 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala 20 25 30 Trp Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Glu Ile Arg Ser Lys Ala Asn Tyr His Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Thr Leu Ile Arg Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 115 120 125 Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val 130 135 140 Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala 145 150 155 160 Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly 165 170 175 Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly 180 185 190 Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys 195 200 205 Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys 210 215 220 Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 225 230 235 240 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 245 250 255 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr 260 265 270 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 275 280 285 Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His 290 295 300 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 305 310 315 320 Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln 325 330 335 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met 340 345 350 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 355 360 365 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 370 375 380 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 385 390 395 400 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 405 410 415 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 420 425 430 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 <210> 135 <211> 215 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized and/or affinity matured antibody sequence <400> 135 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Thr Ala Thr Ser Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln Tyr His Arg Ser Thr 85 90 95 Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala 100 105 110 Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser 115 120 125 Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu 130 135 140 Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser 145 150 155 160 Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu 165 170 175 Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val 180 185 190 Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys 195 200 205 Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 136 <211> 441 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized and/or affinity matured antibody sequence <400> 136 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala 20 25 30 Trp Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Glu Ile Arg Ser Lys Ala Asn Asn His Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Thr Leu Phe Arg Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 115 120 125 Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val 130 135 140 Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala 145 150 155 160 Leu Thr Ser Gly Val His 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Ala Thr Ala Ala Ile Leu Ser Arg Ala 20 25 30 Pro Trp Ser Leu Gln Ser Val Asn Pro Gly Leu Lys Thr Asn Ser Ser 35 40 45 Lys Glu Pro Lys Phe Thr Lys Cys Arg Ser Pro Glu Arg Glu Thr Phe 50 55 60 Ser Cys His Trp Thr Asp Glu Val His His Gly Thr Lys Asn Leu Gly 65 70 75 80 Pro Ile Gln Leu Phe Tyr Thr Arg Arg Asn Thr Gln Glu Trp Thr Gln 85 90 95 Glu Trp Lys Glu Cys Pro Asp Tyr Val Ser Ala Gly Glu Asn Ser Cys 100 105 110 Tyr Phe Asn Ser Ser Phe Thr Ser Ile Trp Ile Pro Tyr Cys Ile Lys 115 120 125 Leu Thr Ser Asn Gly Gly Thr Val Asp Glu Lys Cys Phe Ser Val Asp 130 135 140 Glu Ile Val Gln Pro Asp Pro Pro Ile Ala Leu Asn Trp Thr Leu Leu 145 150 155 160 Asn Val Ser Leu Thr Gly Ile His Ala Asp Ile Gln Val Arg Trp Glu 165 170 175 Ala Pro Arg Asn Ala Asp Ile Gln Lys Gly Trp Met Val Leu Glu Tyr 180 185 190 Glu Leu Gln Tyr Lys Glu Val Asn Glu Thr Lys Trp Lys Met Met Asp 195 200 205 Pro Ile Leu Thr Thr Ser Val Pro Val Tyr Ser Leu Lys Val Asp Lys 210 215 220 Glu Tyr Glu Val Arg Val Arg Ser Lys Gln Arg Asn Ser Gly Asn Tyr 225 230 235 240 Gly Glu Phe Ser Glu Val Leu Tyr Val Thr Leu Pro Gln Met Ser Gln 245 250 255 Phe Thr Cys Glu Glu Asp Phe Tyr Phe Pro Trp Leu Leu Ile Ile Ile 260 265 270 Phe Gly Ile Phe Gly Leu Thr Val Met Leu Phe Val Phe Leu Phe Ser 275 280 285 Lys Gln Gln Arg Ile Lys Met Leu Ile Leu Pro Pro Val Pro Val Pro 290 295 300 Lys Ile Lys Gly Ile Asp Pro Asp Leu Leu Lys Glu Gly Lys Leu Glu 305 310 315 320 Glu Val Asn Thr Ile Leu Ala Ile His Asp Ser Tyr Lys Pro Glu Phe 325 330 335 His Ser Asp Asp Ser Trp Val Glu Phe Ile Glu Leu Asp Ile Asp Glu 340 345 350 Pro Asp Glu Lys Thr Glu Glu Ser Asp Thr Asp Arg Leu Leu Ser Ser 355 360 365 Asp His Glu Lys Ser His Ser Asn Leu Gly Val Lys Asp Gly Asp Ser 370 375 380 Gly Arg Thr Ser Cys Cys Glu Pro Asp Ile Leu Glu Thr Asp Phe Asn 385 390 395 400 Ala Asn Asp Ile His Glu Gly Thr Ser Glu Val Ala Gln Pro Gln Arg 405 410 415 Leu Lys Gly Glu Ala Asp Leu Leu Cys Leu Asp Gln Lys Asn Gln Asn 420 425 430 Asn Ser Pro Tyr His Asp Ala Cys Pro Ala Thr Gln Gln Pro Ser Val 435 440 445 Ile Gln Ala Glu Lys Asn Lys Pro Gln Pro Leu Pro Thr Glu Gly Ala 450 455 460 Glu Ser Thr His Gln Ala Ala His Ile Gln Leu Ser Asn Pro Ser Ser 465 470 475 480 Leu Ser Asn Ile Asp Phe Tyr Ala Gln Val Ser Asp Ile Thr Pro Ala 485 490 495 Gly Ser Val Val Leu Ser Pro Gly Gln Lys Asn Lys Ala Gly Met Ser 500 505 510 Gln Cys Asp Met His Pro Glu Met Val Ser Leu Cys Gln Glu Asn Phe 515 520 525 Leu Met Asp Asn Ala Tyr Phe Cys Glu Ala Asp Ala Lys Lys Cys Leu 530 535 540 Pro Val Ala Pro His Ile Lys Val Glu Ser His Ile Gln Pro Ser Leu 545 550 555 560 Asn Gln Glu Asp Ile Tyr Ile Thr Thr Glu Ser Leu Thr Thr Ala Ala 565 570 575 Gly Arg Pro Gly Thr Gly Glu His Val Pro Gly Ser Glu Met Pro Val 580 585 590 Pro Asp Tyr Thr Ser Ile His Ile Val Gln Ser Pro Gln Gly Leu Ile 595 600 605 Leu Asn Ala Thr Ala Leu Pro Leu Pro Asp Lys Glu Phe Leu Ser Ser 610 615 620 Cys Gly Tyr Val Ser Thr Asp Gln Leu Asn Lys Ile Met Pro 625 630 635 <210> 141 <211> 637 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <400> 141 Met Asp Leu Trp Gln Leu Leu Leu Thr Phe Ala Leu Ala Gly Ser Ser 1 5 10 15 Asp Ala Phe Ser Gly Ser Glu Pro Thr Ala Ala Ile Leu Ser Arg Ala 20 25 30 Ser Trp Ser Leu Gln Ser Val Asn Pro Asp Leu Lys Thr Asn Ser Ser 35 40 45 Lys Glu Pro Lys Phe Thr Lys Cys Arg Ser Pro Glu Arg Glu Thr Phe 50 55 60 Ser Cys His Trp Thr Asp Ala Val His His Gly Leu Lys Ser Leu Gly 65 70 75 80 Pro Ile Gln Leu Phe Tyr Thr Arg Arg Asn Ile Gln Glu Gln Thr Gln 85 90 95 Glu Trp Lys Glu Cys Pro Asp Tyr Val Ser Ala Gly Glu Asn Ser Cys 100 105 110 Tyr Phe Asn Ser Ser Phe Thr Ser Val Trp Ile Pro Tyr Cys Ile Lys 115 120 125 Leu Thr Ser Asn Gly Asp Thr Val Asp Gly Lys Cys Phe Ser Val Asp 130 135 140 Glu Ile Val Gln Pro Asp Pro Pro Ile Ala Leu Asn Trp Thr Leu Leu 145 150 155 160 Asn Val Ser Leu Thr Gly Ile His Ala Asp Ile Gln Val Arg Trp Glu 165 170 175 Ala Pro Pro Asn Ala Asp Ile Gln Lys Gly Trp Met Val Leu Glu Tyr 180 185 190 Glu Leu Gln Tyr Lys Glu Val Asn Glu Thr Lys Trp Lys Met Met Asp 195 200 205 Pro Ile Leu Ser Thr Ser Val Pro Val Tyr Ser Leu Lys Val Asp Lys 210 215 220 Glu Tyr Glu Val Arg Val Arg Ser Lys Arg Arg Asn Ser Arg Asn Tyr 225 230 235 240 Gly Glu Phe Ser Glu Val Leu Tyr Val Thr Leu Pro Gln Met Asn Gln 245 250 255 Phe Thr Cys Glu Glu Asp Phe Tyr Phe Pro Trp Leu Leu Ile Ile Ile 260 265 270 Phe Gly Ile Phe Gly Leu Thr Val Met Leu Phe Val Phe Leu Phe Ser 275 280 285 Lys Gln Gln Arg Ile Lys Met Leu Ile Leu Pro Pro Val Pro Val Pro 290 295 300 Lys Ile Lys Gly Ile Asp Pro Asp Leu Leu Lys Glu Gly Lys Leu Glu 305 310 315 320 Glu Val Asn Thr Ile Leu Ala Ile His Asp Ser Tyr Lys Pro Glu Phe 325 330 335 His Ser Asp Asp Ser Trp Val Glu Phe Ile Glu Leu Asp Ile Asp Glu 340 345 350 Pro Asp Glu Lys Asn Glu Gly Ser Asp Thr Asp Arg Leu Leu Ser Ser 355 360 365 Asp His Gln Lys Ser His Ser Asn Leu Gly Val Lys Asp Gly Asp Ser 370 375 380 Gly Arg Thr Ser Cys Tyr Glu Pro Asp Ile Leu Glu Thr Asp Phe Asn 385 390 395 400 Ala Asn Asn Ile His Glu Gly Thr Ser Glu Val Ala Gln Pro Gln Arg 405 410 415 Leu Lys Gly Glu Ala Asp Leu Leu Cys Leu Asp Gln Lys Asn Gln Asn 420 425 430 Lys Pro Pro Tyr His Asp Ala Cys Pro Ala Thr Gln Gln Pro Ser Val 435 440 445 Ile Gln Ala Glu Lys Asn Lys Pro Gln Pro Leu Pro Thr Asp Gly Ala 450 455 460 Glu Ser Thr His Gln Ala Ala His Ile Gln Leu Ser Asn Pro Ser Ser 465 470 475 480 Leu Ala Asn Ile Asp Phe Tyr Ala Gln Val Ser Asp Ile Thr Pro Ala 485 490 495 Gly Ser Val Val Leu Ser Pro Gly Gln Lys Asn Lys Ala Gly Met Ser 500 505 510 Gln Cys Asp Met His Leu Glu Met Val Ser Leu Cys Gln Glu Asp Phe 515 520 525 Ile Met Asp Asn Ala Tyr Phe Cys Glu Ala Asp Ala Lys Lys Cys Ile 530 535 540 Pro Val Ala Pro His Ile Lys Val Glu Ser His Ile Glu Pro Ser Phe 545 550 555 560 Asn Gln Glu Asp Ile Tyr Ile Thr Thr Glu Ser Leu Thr Thr Thr Ala 565 570 575 Gly Arg Pro Gly Thr Thr Glu His Ile Pro Gly Ser Glu Met Pro Val 580 585 590 Pro Asp Tyr Thr Ser Ile His Ile Val Gln Ser Pro Gln Gly Leu Ile 595 600 605 Leu Asn Ala Thr Ala Leu Pro Leu Pro Gly Lys Glu Phe Leu Ser Ser 610 615 620 Cys Gly Tyr Val Ser Thr Asp Gln Leu Asn Lys Ile Met 625 630 635 <210> 142 <211> 1323 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized and/or affinity matured antibody sequence <400> 142 gaggtgcagc tggtggaatc tggcggcgga ctggtgaaac ctggcggcag cctgagactg 60 agctgcgccg ccagcggctt caccttcagc gacgcctgga tggactgggt gcgccaggcc 120 cctggcaagg gactggaatg ggtggccgag atcagaagca aggccaacta tcacgccacc 180 tactacgccg agagcgtgaa gggccggttc accatcagcc gggacgacag caagaacacc 240 ctgtacctgc agatgaacag cctgaaaacc gaggacaccg ccgtgtacta ctgcaccctg 300 attagagact actggggcca gggcaccctg gtcaccgtct cctcagcctc caccaagggc 360 ccatcggtct tccccctggc gccctgctcc aggagcacct ccgagagcac agcggccctg 420 ggctgcctgg tcaaggacta cttccccgaa ccggtgacgg tgtcgtggaa ctcaggcgct 480 ctgaccagcg gcgtgcacac cttcccggct gtcctacagt cctcaggact ctactccctc 540 agcagcgtag tgaccgtgcc ctccagcaac ttcggcaccc agacctacac ctgcaacgta 600 gatcacaagc ccagcaacac caaggtggac aagacagttg agcgcaaatg ttgtgtcgag 660 tgcccaccgt gcccagcacc acctgtggca ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa 720 cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc cctgaggtca cgtgcgtggt ggtggacgtg 780 agccacgaag accccgaggt ccagttcaac tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat 840 gccaagacaa agccacggga ggagcagttc aacagcacgt tccgtgtggt cagcgtcctc 900 accgtcgtgc accaggactg gctgaacggc aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa 960 ggcctcccat cctccatcga gaaaaccatc tccaaaacca aagggcagcc ccgagaacca 1020 caggtgtaca ccctgccccc atcccgggag gagatgacca agaaccaggt cagcctgacc 1080 tgcctggtca aaggcttcta ccccagcgac atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag 1140 ccggagaaca actacaagac cacacctccc atgctggact ccgacggctc cttcttcctc 1200 tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc 1260 gtgatgcatg aggctctgca caaccactac acacagaaga gcctctccct gtctccgggt 1320 aaa 1323 <210> 143 <211> 645 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized and/or affinity matured antibody sequence <400> 143 gagatcgtgc tgacccagag ccccggcacc ctgtctctga gccctggcga gagagccacc 60 ctgagctgta ccgccaccag cagcgtgtcc agcagctacc tgaattggta tcagcagaag 120 cccggccagg cccccagact gctgatctac agcaccagca acctggccag cggcatcccc 180 gacagattca gcggcagcgg ctccggcacc gacttcaccc tgaccatcag ccggctggaa 240 cccgaggact tcgccgtgta ctactgccac cagtaccaca gaagcacccc caccttcggc 300 ggaggcacca aggtggagat caaacgaact gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 360 ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 420 tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 480 caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 540 acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 600 ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgt 645 <210> 144 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide linker <400> 144 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 145 <211> 205 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <400> 145 Glu Pro Lys Phe Thr Lys Cys Arg Ser Pro Glu Arg Glu Thr Phe Ser 1 5 10 15 Cys His Trp Thr Asp Ala Val His His Gly Leu Lys Ser Leu Gly Pro 20 25 30 Ile Gln Leu Phe Tyr Thr Arg Arg Asn Ile Gln Glu Gln Thr Gln Glu 35 40 45 Trp Lys Glu Cys Pro Asp Tyr Val Ser Ala Gly Glu Asn Ser Cys Tyr 50 55 60 Phe Asn Ser Ser Phe Thr Ser Val Trp Ile Pro Tyr Cys Ile Lys Leu 65 70 75 80 Thr Ser Asn Gly Asp Thr Val Asp Gly Lys Cys Phe Ser Val Asp Glu 85 90 95 Ile Val Gln Pro Asp Pro Pro Ile Ala Leu Asn Trp Thr Leu Leu Asn 100 105 110 Val Ser Leu Thr Gly Ile His Ala Asp Ile Gln Val Arg Trp Glu Ala 115 120 125 Pro Pro Asn Ala Asp Ile Gln Lys Gly Trp Met Val Leu Glu Tyr Glu 130 135 140 Leu Gln Tyr Lys Glu Val Asn Glu Thr Lys Trp Lys Met Met Asp Pro 145 150 155 160 Ile Leu Ser Thr Ser Val Pro Val Tyr Ser Leu Lys Val Asp Lys Glu 165 170 175 Tyr Glu Val Arg Val Arg Ser Lys Arg Arg Asn Ser Arg Asn Tyr Gly 180 185 190 Glu Phe Ser Glu Val Leu Tyr Val Thr Leu Pro Gln Met 195 200 205 <210> 146 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized and/or affinity matured antibody sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> Xaa can be T, R, or E <400> 146 Xaa Ala Thr Ser Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu His 1 5 10

Claims (27)

1. 인간 및 시노몰구스 원숭이 성장 호르몬 수용체 (GHR)에 특이적으로 결합하며, 대상체에게 투여될 때 상기 대상체의 혈중 인슐린-유사 성장 인자-1 (IGF-1)의 수준을 저하시키는 단리된 GHR 길항제 항체.
2. 제1항에 있어서, 인간 GHR에의 결합에 대해 모노클로날 항체 SS1과 경쟁하는 항원 결합 영역을 포함하는 단리된 GHR 길항제 항체.
3. 제1항에 있어서, 모노클로날 항체 SS1에 의해 인식되는 인간 GHR 상의 에피토프와 동일하거나 또는 중첩되는 에피토프를 인식하는 단리된 GHR 길항제 항체.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 약 10 nM 미만의 평형 해리 상수로 인간 GHR에 결합하는 단리된 GHR 길항제 항체.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 GHR 길항제 항체.
6. 성장 호르몬 수용체 (GHR)에 특이적으로 결합하며, 서열 1, 15 또는 16의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH) 상보성 결정 영역 1 (CDR1), 서열 114 또는 115의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR2, 서열 118의 아미노산 서열을 포함하는 VH CDR3, 서열 99의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL) CDR1, 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR2, 및 서열 106의 아미노산 서열을 포함하는 VL CDR3을 포함하는 단리된 GHR 길항제 항체.
7. 성장 호르몬 수용체 (GHR)에 특이적으로 결합하며, 서열 8의 VH 서열의 VH 상보성 결정 영역 1 (CDR1), VH CDR2 및 VH CDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역 (VH); 및 VL CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역 (VL)을 포함하는 단리된 GHR 길항제 항체.
8. 제7항에 있어서, VL이 서열 7의 VL 서열의 CDR1, VL CDR2 및 VL CDR3을 포함하는 것인 단리된 GHR 길항제 항체.
9. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, VH CDR1이 서열 1, 15 또는 16의 아미노산 서열을 포함하고, VH CDR2가 서열 2 또는 17의 아미노산 서열을 포함하고, VH CDR3이 서열 3의 아미노산 서열을 포함하고, VL CDR1이 서열 4의 아미노산 서열을 포함하고, VL CDR2가 서열 5의 아미노산 서열을 포함하며, VL CDR3이 서열 6의 아미노산 서열을 포함하는 것인 단리된 GHR 길항제 항체.
10. 제9항에 있어서, VH가 서열 8의 아미노산 서열, 또는 CDR 내에 있지 않은 잔기에 1개 또는 여러 개의 보존적 아미노산 치환을 갖는 그의 변이체를 포함하고, VL이 서열 7의 아미노산 서열, 또는 CDR 내에 있지 않은 아미노산에 1개 또는 여러 개의 아미노산 치환을 갖는 그의 변이체를 포함하는 것인 단리된 GHR 길항제 항체.
11. 제6항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 면역학적으로 불활성인 불변 영역을 추가로 포함하는 단리된 GHR 길항제 항체.
12. 제11항에 있어서, IgG₂, IgG_{2Δ a}, IgG₄, IgG_{4Δ b}, IgG_{4Δ c}, IgG₄ S228P, IgG_{4Δ b} S228P 및 IgG_{4Δ c} S228P로 이루어진 군으로부터 선택되는 이소형을 갖는 단리된 GHR 길항제 항체.
13. 제11항에 있어서, 불변 영역이 비-글리코실화 Fc인 단리된 GHR 길항제 항체.
14. 제10항에 있어서, 서열 134 또는 133의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄, 및 서열 135의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 단리된 GHR 길항제 항체.
15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 항체를 포함하는 제약 조성물.
16. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 항체를 재조합적으로 생산하는 세포주.
17. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 항체의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산.
18. 혈중 인슐린-유사 성장 인자-1 (IGF-1) 수준의 감소를 필요로 하는 개체에게 치료 유효량의 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 항체를 투여하는 것을 포함하는, 상기 개체의 혈중 인슐린-유사 성장 인자-1 (IGF-1)의 수준을 감소시키는 방법.
19. 제18항에 있어서, IGF-1의 수준이 적어도 약 40% 감소되는 것인 방법.
20. 제18항에 있어서, IGF-1의 수준이 적어도 약 60% 감소되는 것인 방법.
21. 제18항에 있어서, 개체가 말단비대증, 거인증, 암, 당뇨병성 신병증, 관절염 및 폐 염증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환을 앓는 것인 방법.
22. 말단비대증의 치료를 필요로 하는 개체에게 치료 유효량의 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 항체를 투여하는 것을 포함하는, 상기 개체에서 말단비대증을 치료하는 방법.
23. 거인증의 치료를 필요로 하는 개체에게 치료 유효량의 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 항체를 투여하는 것을 포함하는, 상기 개체에서 거인증을 치료하는 방법.
24. 암의 치료를 필요로 하는 개체에게 치료 유효량의 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 항체를 투여하는 것을 포함하는, 상기 개체에서 암을 치료하는 방법.
25. 당뇨병성 신병증의 치료를 필요로 하는 개체에게 치료 유효량의 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 항체를 투여하는 것을 포함하는, 상기 개체에서 당뇨병성 신병증을 치료하는 방법.
26. 폐 염증의 치료를 필요로 하는 개체에게 치료 유효량의 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 항체를 투여하는 것을 포함하는, 상기 개체에서 폐 염증을 치료하는 방법.
27. 관절염의 치료를 필요로 하는 개체에게 치료 유효량의 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 항체를 투여하는 것을 포함하는, 상기 개체에서 관절염을 치료하는 방법.