JP4438479B2 - エンド−1,4−βグルカナーゼ - Google Patents
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Description
本発明者は、自然界からエンド−1,4−βグルカナーゼ生産菌のスクリーニングを行ったところ、上記目的に適う酵素を生産する微生物を見出し、更に当該微生物からエンド−1,4−βグルカナーゼをコードする遺伝子をクローン化することにより本発明を完成するに至った。
(a)配列番号1に示すアミノ酸配列からなるタンパク質、
(b)(a)のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つエンド−1,4−βグルカナーゼ活性を有するタンパク質、当該タンパク質をコードする遺伝子、当該遺伝子を含有する組換えベクター、該組換えベクターを有する形質転換体を提供するものである。
なお、当該等価のアミノ酸配列をコードする塩基配列は、自然界から取得すること以外にも部位特異的突然変異誘発法等の公知の手法を利用して調製することができる。例えば、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット[Mutan-super Express Km キット(タカラ)]等を用いて変異を導入し調製することができる。
尚、ここで述べるアミノ酸配列の同一性は、Lipman-Pearson法 (Science, 227, 1435, (1985))によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Win(Ver.5.1.1;ソフトウェア開発)のホモロジー解析(Search homology)プログラムを用いて、Unit size to compare(ktup)を1として解析を行うことにより算出される。
培養は微生物の資化可能な炭素源、窒素源その他の必須栄養素を含む培地に接種し、常法に従って行えばよい。
A:形態学的性質
(a)細胞の形及び大きさ:桿菌(0.3〜0.6×1.5〜4.3μm)
(b)多形性:無し
(c)運動性:有り
(d)胞子の形、大きさ、位置、膨潤の有無:楕円形、0.4〜0.6×0.8〜1.4μm、中央準端、膨潤無し
(e)グラム染色:陽性
(a)硝酸塩の還元:陽性
(c)VPテスト:陰性
(d)インドールの生成:陰性
(e)硫化水素の生成:陰性
(f)デンプンの加水分解:陽性
(g)カゼインの加水分解:陰性
(h)ゼラチンの液化:陽性
(i)クエン酸の利用:陽性
(j)プロピオン酸の利用:陰性
(k)チロシン分解:陰性
(l)フェニルアラニン分解:陰性
(m)レシチナーゼ反応:陰性
(n)カタラーゼ:陽性
(o)オキシダーゼ:陽性
(p)生育の温度範囲:15〜50℃
(q)生育における酸素の影響:嫌気条件下で生育する。
(r)pH5.7における生育:生育せず
(s)pH6.8における生育:生育する
(t)pH9.0における生育:生育する
(u)グルコースからのガス産生:陰性
(v)塩化ナトリウム耐性:2%塩化ナトリウム存在下で生育する。
(w)糖の資化:グルコース、アラビノース、キシロース、マンニトールを利用し、酸を生成する。
少量の日本各地の土壌サンプルを10mLの滅菌水に懸濁し、80℃、15分間熱処理した。室温で冷却した後、0.1mLの上清を以下の組成を有する寒天平板培地に塗布した[3.0%(w/v)トリプティケースソイブロス(BBL)、2.0% リン酸膨潤セルロース(セルロースパウダーKCフロック W−100Gより調製,日本製紙)(別滅菌)、1.5% 寒天、0.005% トリパンブルー(メルク社:別滅菌)、0.01%炭酸ナトリウム(別滅菌)]。30℃で7〜10日間培養し、コロニーの周りにハローを形成したものをアルカリセルラーゼ生産菌株として選択した。
バチルス エスピー KSM−N546株の培養は、2.0%(w/v)ポリペプトンS(大日本製薬)、0.1%カルボキシセルロース(A10MC)、0.1%酵母エキス(ディフコ)、1.0% 魚肉エキス(和光純薬)、0.15%リン酸1カリウム、0.035%硫酸マグネシウム7水塩、0.3%炭酸ナトリウム(別滅菌)から成る培地を用い、30℃、40時間振盪(125rpm)して行った。得られた培養液約300mLから遠心分離(12000xg、15分、5℃)により菌体を回収した。この菌体から斉藤・三浦の方法(Biochim. Biophys. Acta, 72, 619-629, 1963)によりゲノムDNAを調製した。
N546株のゲノムDNA(2μg)を制限酵素HindIIIで37℃、一夜完全分解させた後、エタノール沈殿を行い、得られた沈殿を2.5μLの脱イオン水に溶解した。また、予めHindIIIで処理し、脱リン酸化したpUC18(タカラバイオ)50ngをエタノール沈殿し、沈殿を2.5μLの脱イオン水に溶解した。各溶液を混合し(5μL)、Ligation キット Ver.2(タカラバイオ)の溶液I 5μLを加え16℃、30分間恒温してDNA連結反応を行った。反応液を用いて E. coli HB101株を形質転換し、100μg/mLアンピシリン、0.5%(w/v)カルボキシルメチルセルロース(関東化学)、0.005%トリパンブルー(メルク)を含むLB寒天培地に塗沫した。セルラーゼ生産に伴いハローを形成した形質転換体よりHight Pure Plasmid Purification キット(ベーリンガーマンハイム)を用いてプラスミドDNAを抽出した。得られたプラスミドDNAを鋳型に、pUC18のマルチクローニングサイト近傍に相補的なM13 Primer M2及びRV(タカラバイオ)を用い塩基配列を377DNAシークエンサー(P-E アプライド・バイオシステムズ)にて決定した。塩基配列を解析した結果、シグナル配列の途中から上流が欠損していることが判明した為、ゲノムDNAを制限酵素BamH Iで処理し、インバースPCRを行った。即ち、N546株のゲノムDNA(500ng)を制限酵素BamH Iにて完全分解した後、エタノールを添加し、得られた沈殿を脱イオン水10μLに溶解した。この溶液にLigation キット Ver.1(タカラバイオ)の溶液Aを40μL、溶液Bを10μL加えて自己閉環を行った後、エタノールを添加し、得られた沈殿を5μLの脱イオン水に溶解したものを鋳型としてPCRを行った。プライマーは、すでに決定した塩基配列を用いて構築した上流プライマー1(配列番号3)と下流プライマー2(配列番号4)を用いた。PCRは自己閉環溶液0.5μL、各プライマーを2pmol用いLA Taqポリメラーゼ(タカラバイオ)の説明書に従いを行った。反応条件は、94℃ 2分間の熱変性後、94℃ 20秒、60℃ 30秒、72℃ 4分を1サイクルとし16サイクル行った。次いで伸張反応時間を徐々に延長する目的で、94℃ 20秒、60℃ 30秒、72℃ 4分のサイクルにおいて伸張反応(72℃ 4分)を1サイクル毎に20秒間ずつ増加するようにプログラムし、12サイクル反応させた後、72℃10分間放置した。得られたPCR産物を用い1.5%(w/v)アガロースゲル電気泳動を行ったところ、約1.6kbの位置にバンドを確認した。PCR産物をHigh Pure PCR Product Purification キット(ベーリンガー・マンハイム)を用いて精製し、一部を用いてダイレクトシークエンスを行った。
取得したEgl−546Hの成熟領域をコードする遺伝子をBacillus sp. KSM-S237株由来アルカリセルラーゼ(Egl−S237)遺伝子(特願平11−013049)の上流発現領域と下流発現領域の間に導入した。即ち、予めSma Iで処理したpHY300PLK(タカラバイオ)にEgl−S237遺伝子の上流発現領域からターミネーターを含む領域を連結したプラスミドpHYS237から以下のようにEgl-S237の構造遺伝子を除き、そこへEgl-546Hの構造遺伝子を挿入することでプラスミドを作製した。
実施例5により得られた培養液150mLを脱イオン水で4倍に希釈した後、予め50mMトリス塩酸緩衝液(pH7.5)により平衡化しておいたSuperQトヨパールカラム(2.5×8.5cm)に添着させた。同緩衝液にて洗浄した後、0.2M 塩化カリウム濃度まで直線濃度勾配法により吸着タンパク質を溶出させた。更に0.5M塩化カリウムにて吸着タンパク質を溶出させた。Egl活性はこの画分に溶出され、限外濾過膜により濃縮、脱塩を行った。得られた酵素液を予め10mMリン酸緩衝液(pH6)にて平衡化しておいたDEAE−トヨパール650M(2.5×4.5cm)へ添着させた。洗浄溶出後、0.3M 塩化カリウム濃度まで直線濃度勾配法により吸着タンパク質を溶出させた。Egl活性は0.2M塩化カリウム濃度付近に溶出されこの画分を集めて限外濾過膜にて濃縮し、諸性質を調べるために用いた。
0.1mLの0.5M酢酸緩衝液(pH5.0)、0.4mLの2.5%(w/v)カルボキシメチルセルロース(A01MC;日本製紙)、0.4mLの脱イオン水から成る反応液に0.1mLの適当に希釈した酵素液を加え40℃で20分間反応させた後、1mLのジニトロサリチル酸試薬(0.5%ジニトロサリチル酸、30%ロッシェル塩、1.6%水酸化ナトリウム水溶液)を添加し、沸水中で5分間恒温した。氷水中で急冷し、4mLの脱イオン水を加え535nmにおける吸光度を測定し還元糖の生成量を求めた。尚、ブランクは酵素液を加えずに処理した反応液にジニトロサリチル酸試薬を加えた後、酵素液を添加し、同様に発色させたものを用意した。酵素1単位(1U)は、上記反応条件下において1分間に1μmolのグルコース相当の還元糖を生成する量とした。
クエン緩衝液(pH4〜7)、リン緩衝液(pH6〜8)、トリス−塩酸緩衝液(pH7〜9)、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液(pH8〜11)、リン酸−水酸化ナトリウム緩衝液(pH12〜12.5)の各緩衝液(50mM)を用いて最適反応pHを調べた結果、N546HセルラーゼはpH5.3のクエン緩衝液中で最も高い反応速度を示した。また、酢酸緩衝液(pH5.0)中、CMC分解に対する最適反応温度は40℃付近に認められた。
Egl−546Hの酢酸緩衝液(pH5.0)中におけるCMCに対する分解速度を100%とした場合、リケナン、グルコマンナン並びにペクチンに対し、それぞれ251%、177%、38%の相対速度を示した。一方、ラミナリン、カードランには全く作用しなかった。
Claims (6)
- 以下の(a)又は(b)のタンパク質:
(a)配列番号1に示すアミノ酸配列からなるタンパク質、
(b)(a)のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つエンド−1,4−βグルカナーゼ活性を有するタンパク質。 - 請求項1記載のタンパク質をコードする遺伝子。
- 以下の(a)又は(b)のDNAからなるエンド−1,4−βグルカナーゼ遺伝子:
(a)配列番号2に示す塩基配列で示されるDNA、
(b)(a)の塩基配列からなるDNAとストリンジエントな条件下でハイブリダイズし、且つエンド−1,4−βグルカナーゼ活性を有するタンパク質をコードするDNA。 - 請求項2又は3記載のいずれかの遺伝子を含有する組換えベクター。
- 請求項4記載の組換えベクターを含む形質転換体。
- 宿主が微生物である請求項5記載の形質転換体。
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