JPH11514219A

JPH11514219A - 好アルカリ性で好熱姓の微生物およびそれから得られる酵素

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Publication number: JPH11514219A
Application number: JP9511624A
Authority: JP
Inventors: エドワードジョーンズ，ブライアン; アドリアナヘルウェイエル，マルハレタ; ジョンダンソン，マイケル; ウィリアムハフ，デイヴィッド; レイモンドトンプソン，カール
Original assignee: ジェネンコアインターナショナルインコーポレーテッド
Priority date: 1995-09-13
Filing date: 1996-09-03
Publication date: 1999-12-07
Also published as: CA2231843A1; WO1997010342A1; DE69635419D1; EP0850307A1; DE69635419T2; AU7126696A; AU714478B2; CN1199424A; ATE309373T1; US6218164B1; DK0850307T3; US6432689B1; NZ319118A; US20040033580A1; EP0850307B1

Abstract

(57)【要約】本発明は、好熱姓で好アルカリ性のバクテリア、およびそれから得られる熱安定性アルカリポリペプチドを提供する。本発明は、さらに、該ポリペプチドを製造する方法、該ポリペプチドをコードする核酸、および該ポリペプチドを含む組成物を提供する。また、本発明は、該新規微生物から得られる酵素を洗剤産業、紙およびパルプ産業、および繊維産業に利用することに関する。

Description

【発明の詳細な説明】好アルカリ性で好熱姓の微生物およびそれから得られる酵素発明の属する技術分野本発明は、新規な好アルカリ性で好熱姓の微生物、およびそれから得られる新規な酵素に関する。発明の背景好アルカリ性微生物は、多数の分類学上の群にわたって存在し、アルカリ性のｐＨ環境（一般的にはｐＨ８以上）において最適な生育を示す異種群の微生物である(Jones，B．E．他、(1994)好アルカリ性微生物：多様性と同定(Alkaliphile s : diversity and identification)「微生物の多様性と同定(Microbial Divers ity and Identification) 」(F．G．Priest 他編)から、Plenum Press社発行、Ne w YorkおよびLondon，195-230 頁)。偏性の好アルカリ性微生物は、一般にｐＨ９からｐＨ10の間に最適生育ｐＨを有し、中性ｐＨにおいては生育することができない。アルカリ耐性（すなわち、通性的に好アルカリ性）微生物は、それほど厳しくなく、そしてアルカリｐＨ値においても生育することはできるが、その最適値は中性から酸性域に存する。好熱姓微生物もまた、極めて異なる集団にわたって存在する微生物であり、50 ℃以上において最適生育温度を有するものを指す。中位の好熱姓微生物における最高生育温度は通常70℃より低い。最低生育温度が40℃以上、最適温度が65℃以上で、最高生育温度が70℃以上の微生物は、高度好熱姓微生物と定義される(Cow an，D．A．(1992)。高度好熱姓の原始バクテリアにおける生化学と分子生物学(B iochemistry and molecular biology of extremely thermophilic archeaobacte ria)、「高度好熱姓微生物の分子生物学とバイオテクノロジー(Molecular Biolo gy and Biotechnology of Extremophiles) 」から(R．A．Herbert およびR．J． Sharp編集)、Blachie & sons社発行、Glasgow およびLondon，1-43頁)。好アルカリ性と好熱姓を組み合わせた表現型が見られるのはきわめて稀のようである。そのような微生物の２種類のみ（いずれも下水道処理設備から単離された）が詳細に検討され、いずれもグラム陽性バクテリアのクロストリジム(Clost ridium )属として帰属された。その微生物の一方、すなわち、クロストリジウム・パラドクサム(Clostridium paradoxum)は、ｐＨ7.3 からｐＨ11.0において生育し最適値がｐＨ10近傍にある偏性好アルカリ微生物である。しかしながら、この微生物は、最適生育温度が55℃で最高温度が63℃である点において中位の好熱姓微生物に分類され得るものにすぎない(Youhong Li 他(1992)Int．J．Syst．Ba cteriol． 43，450-460)。第２の微生物、すなわち、クロストリジウム・テルモアルカリフィラム(Clostridium thermoalcaliphilum)は、ｐＨ７からｐＨ11の間で生育し、最適値がｐＨ9.5 からｐＨ10にある通性好アルカリ性ないしはアルカリ耐性生物である。最適生育温度50℃であり最高温度が57℃であるので、このバクテリアは、非常に中位の好熱姓微生物または耐アルカリ性微生物として分類され得るものにすぎない(Youhong Li 他(1994)Int．J．Syst．Bacteriol． 44，11 1-118)。既知の好熱姓バクテリアのうち、数種がテルモトガレス(Thermotogales)目に属する。主として高度好熱姓バクテリアから成るこの群は、リボソームＲＮＡ遺伝子の配列決定により他のすべてのバクテリアから系統発生学的に遠いものであることが示され、また、バクテリア界の中で最も深い分派にあり且つ最も進化の遅いものの１種であることが示されている。テルモトゲラスに属するバクテリアの特徴は、グラム陰性、棒状（杆状）、嫌気性、発酵性バクテリアであることにあり、さや状の外膜（「トガ(toga)」）を有し、そして、その生育は分子状水素によって阻害される(Huber，R．およびStetter，K．O．（1992）テルモトガレス目(The order Thermotogales)「原核生物(The Prokarvotes)」から、(A．Balows 他編集)、Springer-Verlag 社発行、New York，3809-3815 頁）。現在、テルモトガレスは５つの属によって表されている。テルモトガ(Thermot oga) 属、テルモシフォ(Thermosipho)属およびフェルビドバクテリウム(Fervidob acterium) 属は既知の高度好熱性種を構成し、一方、(16S rＲＮＡ分析によれば) 互いの類縁性の高いゲオトガ(Geotoga)属およびペトロトガ(Petrotoga)属はさらに中熱性の種を構成している。既知の種はいずれも、顕著な好アルカリ性を示さない。高度好熱姓テルモトガレスに属する現存種の多くは、浅海または深海熱水システムのような活動中の地熱水環境、または低塩の硫黄噴気泉から単離されたものである。最近、好熱姓の低い菌株、特にゲオトガ属およびペトロトガ属の菌株が地表下の深油田から単離されている。（Huber，R．およびStetter，K． O．(1992)同上、Davey，M．E．他、(1993)Syst．Appl．Microbiol．16，191-200 ；Ravot，G．他、(1995)Int．J．Syst．Bacteriol．45，308-314）。テルモトガレスのいろいろな微生物は、生育を可能にする温度、ｐＨおよびＮａＣｌ範囲のような表現型の特性によっても区別し得る(表１、Ravot，G他（199 5）Int．J．Syst．Bacteriol， 45，308-314)が、それらの分類は、主として、1 6S ｒＲＮＡ遺伝子によるヌクレオチド配列間の類似性比較およびＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション実験に基づく。Stackebrandt およびGoebelは、16S ｒＲＮＡ配列の同一性が97％以上の微生物菌株は、その他の基準も満たしていれば、同一の種のものであると考えることができると提示している(Int．J．Syst ．Bacteriol．44，846-849，1994)。フェルヒドバクテリウム・アイランディカム(Fervidobacterium islandicum)とフェルビドバクテリウム・ノドスム(Fervid obacterium nodosum) の16S ｒＲＮＡ配列は95.3％の類似性を有することが示されており、この値は同一属内の異なる種に典型的なものである(Huber，R 他、(1 990)Arch．Microbiol．154, 105-111)が、テルモトガおよびテルモシフォに属する菌株とは10〜15％相違する。テルモトガレス(Thermotogales)目内で、一般的に配列の相違が約８％以下であると同一の属にあるものと判定されている。16S ｒＲＮＡ配列の相違が約10％であり且つ表現型に相違があると、多くの場合、別の属にある異なるテルモトガレス単離物であると主張される(Huber，R．他、(19 89)Syst．Appl．Microbiol．12，32-37；Davey，M．E.他(1993)Syst．Appl．Mic robiol．16，191-200；Ravot，G．他、(1995)Int．J．Syst．Bacteriol．45，30 8-314)。発明の概要本発明は、新しい属であるテルモパリウム(Thermopallium)属、詳述すれば、新しい種テルモパリウム・ナトロノフィラム(Thermopallium natronophilum)に属する新規な好熱姓で好アルカリ性のバクテリア、およびこれらのバクテリアから得られるペプチドを提供する。別の態様として、本発明は、これらの新規なバクテリア由来の新規なアルカリプルラナーゼおよびアミラーゼ製剤を提供する。第３の態様として、本発明は、本発明に従う新規なポリペプチドを含む組成物を提供する。第４の態様として、本発明は、本発明に従うポリペプチドをコードする単離されたＤＮＡフラグメント、そのようなＤＮＡフラグメントを含む組換えＤＮＡ、そのような組換えＤＮＡで形質転換された宿主細胞、およびそのような宿主細胞の培養物を提供する。さらに、別の態様として、本発明は、本発明に従うポリペプチド、好ましくは酵素を製造するための方法を提供する。図面の簡単な説明図１は、テルモトガレス目について、新規なバクテリアであるテルモパリウム・ナトロノフィラム(Thermopallium natronophilum)と他のバクテリアの関係を示すための16S ｒＤＮＡ配列に基づく系統分類図である。図２は、テルモパリウム・ナトロノフィラムＴｇ９Ａから得られた未精製アミラーゼの温度と酵素活性（％相対値）との関係（ｐＨ8.5 で20分後に測定）を示す。図３は、テルモパリウム・ナトロノフィラムＴｇ９Ａから得られた未精製アミラーゼのｐＨと酵素活性（％相対値）との関係（80℃のおいて20分後に測定）を示す。図４は、アミラーゼＡ−１の温度と酵素活性（％相対値）との関係（ｐＨ8.5 で20分後に測定）を示す。図５は、アミラーゼＡ−１のｐＨと酵素活性（％相対値）との関係（80℃において20分後に測定）を示す。図６は、アミラーゼＡ−IIの温度と酵素活性（％相対値）との関係（ｐＨ8.5 において20分後に測定）を示す。図７は、アミラーゼＡ−IIのｐＨと酵素活性（％相対値）との関係（80℃において20分後に測定）を示す。発明の詳細な説明微生物本発明の新規微生物は、炭酸塩（および関連アニオン）が溶けているためにアルカリｐＨを有するが（導電率測定（表２）によると）溶解塩の濃度は低い温泉およびその流水から分離された。該温泉は、アフリカ大陸東部のリフトバレー(R ift Valley)の地域にある。その代表的な炭酸塩アニオン濃度は１ｇ／ｌを超えており、したがって、通常の硫黄噴気孔ではない。単離された微生物の純水培養物は、テルモパリウム・ナトロノフィラムＴｇ９Ａと命名され、1994年９月21日に、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約に従い、寄託番号ＤＳＭ９４６０として、DSM-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen un d Zellkulturen GmbH(Mascheroder Weg 1b，D-38124 Braunschweig，ドイツ)に寄託している。本発明の微生物は、内生胞子を形成しない厳密に嫌気性の棒状（杆状）バクテリアである。このバクテリアの細胞は、特徴的な外部構造、すなわち「トガ(tog a)」で覆われ、細胞の両極がふくらんでいる。この細胞は、通常、単一の細胞として、または３個の細胞から成る短い鎖状で存在する。増殖期に、該細胞は曲がったり不規則な形状をとることがあり、また、凝集体を形成することがある。定常増殖期に、この細胞は球状となり、１ヶまたはそれ以上の細胞が大きな球状体内部に含まれる。この微生物は、アルカリ栄養寒天もしくはGelrite(炭酸塩を含有)上で丸く、光沢があり、白色で半透明のコロニーを形成する。したがって、これらの特性に基づき、該微生物テルモパリウム・ナトロノフィラムは、「テルモトガレス(Thermotogales)」目のバクテリアであると帰属することができる（H uber，R．およびStetter，K．O．(1992)“テルモトガレス(Thermotogales)”目：「原核生物(The Prokaryotes)」から、(A．Barlows 他、編集)、Springer-Ver lag 社発行、New York，3809-3815 頁）。自然から単離した本発明の微生物は、さらに以下の特性によって記述することができる。生育温度：52℃〜78℃の間で生育する。50℃または79℃においては生育しない。最大生育速度は約70℃で観察されたが、最大の細胞産生量は約63℃から約64℃ で得られた。生育ｐＨ：ｐＨ範囲： 7.2から＞10.5で生育できる。最適ｐＨ：約8.8 から約 9.5。ＮａＣｌの影響：生育に最適なＮａＣｌ濃度は１％(w/v)であり、４〜５(w/v) を超えると生育しない。グラム反応性：陰性。ＫＯＨ反応性：陰性。アミノペプチダーゼ反応性：陰性。ＳＯＤの影響：ドデシル硫酸ナトリウム１％(w/v)が存在すると、細胞およびさや状構造体のいずれも顕微鏡観察下に数秒以内で消失する。リソチームの影響：顕微鏡観察下に細胞の懸濁液にリソチーム(10mg/ml)を添加したが影響は殆ど認められなかった。20mg/ml のリソチームでは、杆状細胞が球状になるものもあった。生育性：グルコース：陽性ガラクトース：陽性マルトース：陽性キシロース：弱いリボース：陰性ホルメート：陰性アセテート：陽性ラクテート：陰性プロピオネート：陰性ピルベート：弱いグルタメート：陰性グリシン：陽性グリセロール：陽性エタノール：陰性セルロース：陽性カゼイン：陽性ゼラチン：陽性キシラン：陽性でん粉：陽性オリーブ油：陽性トリプトン：陽性。生育に対するイオウおよび水素の影響：分子状水素(Ｈ₂)によって生育が阻害される。この阻害は、培地にイオウを添加することにより解除することができる。Ｇ＋Ｃ含有量：36.3±0.9 モル％（ｎ−２）（ＨＰＬＣ法）。微生物の分類と同定本発明の菌株の分類は、ＰＣＲにより増幅された16S ｒＲＮＡ遺伝子の直接的な配列決定による系統発生学的関係に基づいて行われた。Genbank データベースおよびＥＭＢＬデータベースからアクセスした既知の配列との配列比較を行った。それらの配列を互いに整合させ、コンピュータプログラム(ＰＨＬＩＰパケッジのバージョン3.4 および3.5c(Felstein，J．(1989)Cladistics 5, 164-166)) を用いて系統発生学的分析を行った。類似値を計算し（表３）、系統発生図を作製した（図１）。その結果、該菌株は98.7％の16S ｒＲＮＡ配列類似値を有し、したがって、同一の種の単離物と考えられる。さらに、この新規微生物の菌株は、他の属のバクテリアよりもフェルビドバクテリウム属との相関性が高いことも示されている。しかしながら、この新規微生物菌株は、しばしば「トガ(toga)」と称され、杆状細胞の両極をふくらませているさや状の外部構造を有する。この「トガ」は、テルモトガ属、テルモシフォ属、ゲオトガ属およびペトロトガ属の微生物に共通の特徴である(Balows 他編集、Springer-Verlag 社発行、New York，3809-3815 頁；Ravot，G．他、(1995)International Journal of Systematic Bacteriology 4 5 ，308-314)。これに対して、フェルビドバクテリウムに属する種は、端部が「偏球（スフェロイド）」である(Huber，R.およびStetter，K．O．ibid；Huber， R．他(1990)Archives of Microbiology 154, 105-111；Patel，B．K．C．他、(1 985)Archives of Microbiology 141, 63-69)。この事実からだけでも、本発明の新規微生物菌株が新しい種であることが示されている。しかしながら、フェルビドバクテリウムに対する配列ホモロジーの相違が殆ど10％であることはきわめて重要である。その理由は、バクテリア界の最も深い分派の１つを表すこれらの系統(Winkler，S．およびWoese，C．R．(1991)Systematic & Applied Microbiolo gy 13，161-16S)は、他のバクテリア群に比べてゆっくり進化しているからである(Huber，R．他、Systematic & Applied Microbilogy 12, 32-37)。このことは、このたびの新しい微生物が、別異で、これまで知られていない族のものであることを示す。このことを基礎にして、該微生物は新しい属であるテルモパリウム(Thermopallium )に帰属させられ、該微生物菌株はテルモパリウム・ナトロノフィラム(Thermopallium natronophilum)種に帰属させたれた。テルモパリウム属およびテルモパリウム・ナトロノフィラム種は、16S ｒＲＮＡ遺伝子のヌクレオチド配列(添付した配列リストのSEQ ID No.1)および本明細書に記述した表現型特性によって同定される。Ｇ＋Ｃの値を既知の種と比較して相違を調べることによっても（表４）、本発明の新規微生物菌株が新しい種に帰属させ得ることが裏付けられる。本発明の微生物の表現型特徴は、テルモトガレスの既知の種から別異のものであることを明示している（表１）。この新規微生物は、明らかに高度好熱姓微生物であり、大陸内温泉（すなわち、非海洋源）から単離されたテルモトガレス種に典型的な温度プロフィルを有している。しかしながら、既知のテルモトガレス種はすべて、中性近傍に最適生育ｐＨを有する。これに対して、本発明の新規微生物は、明らかに、偏性的に好アルカリ性であり、中性ｐＨにおいて（表１）または炭酸塩アニオンを含有する培地なしでは生育することができない。微生物の培養本発明の微生物は、厳密な無酸素条件下においてのみ培養することができ、例えば、Freter型の嫌気室またはBalch 等により記載された(Microbiol．Rev.(197 9)，43，260-296)厳密な嫌気技術を用いる密閉容器が使用される。好適な栄養培地が必要であり、代表的には、同化性の炭素および窒素源とともに、その他の必須栄養分を含む培地が使用される。好ましくは、培地の全溶解塩濃度が、約15mS /cm の導電率を超えないようにし、そして、上記のような厳密な嫌気性条件下に調製する。好ましくは、還元剤を添加して、当初のレドックス値が充分に低くなるようにする。好適な培地は、当該分野で既知の手法によって調製することができる。自然から単離された本発明の新規テルモパリウム・ナトロノフィラム種から成る新規微生物は、好アルカリ性であり、ｐＨ7.2 以下では生育できないので、培養はアルカリｐＨ値で実施することが好ましく、これは、生育用培地を無菌処理した後、炭酸ナトリウム（より好ましくは、炭酸ナトリウムと重炭酸ナトリウムの混合物）のような適当な緩衝剤を添加することによって達成され、そして、頭部のスペースに無酸素(Ｏ₂)のＮ₂用のガス相を設けてこの操作を行うのが好ましい。そのような培地の１例は、ＴＭＺ培地であり、これはCastenholtz 塩を用いるサーマス(Thermus)培地を改良したものであり(Willlams，R．A．D．およびD aCosta，M．S．(1992),サーマス属および関連微生物(The genus Thermus and re lated microorganisms)：「原核生物(The Prokarvotes)」から、(A．Barlows 他編集)、Springer-Verlag 社発行、New York，3745頁)、当該微生物を純粋な培養物として単離した温泉水の当初の条件に適応しているものである。他の緩衝液、例えば、トリス／ＨＣｌまたはBorax/ＮａＣｌ中でも生育は可能であるが、炭酸塩によるｐＨ調製が必要である。ＮａＯＨを用いてアルカリ性ｐＨに調整した培地上では殆どまたは全く生育は起こらない。大規模の培養を行うには、一般に、Ｏ₂を含有しない窒素ガスを用いて連続的に培地を散布することが必要である。生育の最低温度は約40℃であった。好ましい態様においては、この新規テルモパリウム・ナトロノフィラム種の単離物は65℃で生育した。培養後、当該分野で知られた手法を用いて培養ブロスから細胞を分離し、該ブロスを濃縮することにより液状の酵素濃縮物を得ることができる。別の方法として、細胞を適当な液体中に懸濁させて、破断、分解、もしくは溶解、またはその他の処理を行い、適当な方法を用いて可溶性画分として酵素を分離することもできる。この可溶化された酵素は、塩もしくは水と混和性の溶媒を用いてまたは水を除去することにより固体状に濃縮および／または沈殿させた後、随時、精製することができる。このようにして精製された酵素は最終的に結晶状態で得ることができる。微生物由来の酵素本発明の酵素は、アルカリｐＨ（例えばｐＨ7.5 から12.0、より好ましくはｐＨ8.5 から９）に維持され、炭酸塩、または炭酸塩と重炭酸塩の混合物が添加され、炭素および窒素源ならびに無機塩類を含有する適当な栄養培地中で、本発明の微生物、（好ましくはテルモパリウム・ナトロノフィラムＴｇ９Ａ、ＤＳＭ９４６０）、またはその変異体を培養することによって得られる。テルモパリウム・ナトロノフィラムの変異体は、自然発生、化学的操作、遺伝子操作またはその他の方法によって得ることができ、核酸転移、環境圧の選択、ＵＶ照射および当業者に既知の突然変異付与性化学物質の使用によって得られた変異体が含まれる。この酵素は、好適な宿主生物中で適当な遺伝子をクローニングする組換えＤＮＡ技術によって得ることもできる。これは任意の好適な手段で行うことができ、例えば、１種またはそれ以上の制限酵素を用いて染色体ＤＮＡを分解してゲノムライブラリーまたは或る１つの大きさのランダムＤＮＡフラグメントを調製する。ランダムフラグメントから成るライブラリー由来のＤＮＡフラグメントは組換え核酸内に挿入されることができる。そのような組換え核酸の典型がベクターであり、これは、例えば、プラスミド、バクテリオファージまたはその他の構造体であって、核酸の転移または核酸の転移と発現に適するようになっているものである。当業者であれば、広く入手できる適当なベクターから、当該分野で知られた遺伝子工学的手法、例えば、Sambrook他による「分子クローニング：実験室マニアル(Molecular cloning：a Laboratory Manual；1989」に記載の手法を用いて好適なベクターを調製できるであろう。本発明のベクターは、一般に、１つまたはそれ以上の複製起点を有することによって、バクテリア細胞または酵母細胞のような宿主細胞内で複製され得るようになっている（これによって、分子生物学の標準的な手法により、例えば、大腸菌内で構造体が複製され処理され得る）。さらに、ベクターは、一般に（通常、５´から３´方向に沿って）次の構成要素を含む：本発明の酵素をコードする核酸配列の発現を支配するプロモータ；プロモータのレギュレータ（随時）、転写開始部位、翻訳開始コドン；および本発明の酵素をコードする核酸配列。ベクターは、さらに、１種またはそれ以上の選択マーカー遺伝子、例えば抗生物質耐性遺伝子を含むことができる。そのようなマーカー遺伝子によって形質転換体の同定が可能となる。必要に応じて、ベクターはプロモータのエンハンサーを含むこともある。ベクターは、また、ポリアデニル化シグナルを含むこともあり、これは、一般に、本発明の酵素をコードする核酸に対して３´位にある。さらに、ベクターは、本発明の酵素をコードする配列に対する３´位に転写終了部位（ターミネータ）を含むことがある。ベクターは、さらに、例えば、対象となるポリペプチドをコードする配列に対して３´位に１種またはそれ以上のイントロンまたは非コード配列を含むことがある。典型的なベクターにおいては、本発明の酵素をコードする核酸配列は、該配列を発現させることのできるプロモータと作動的に結合されている。「作動的に結合(operably linked)」とは、プロモータと本発明の酵素をコードする核酸配列とが、該プロモータの制御下に該コード配列が発現され得るような関係になるように並置されていることを意味する。したがって、プロモータとコード配列との間に５´非コード配列のような要素が存在することもある。コード配列に対するプロモータによる正確な制御を促進するが、損なうことがなければそのような配列を含ませることもできる。治療用ポリペプチドまたはタンパク質をコードする核酸配列を支配することができれば、ベクター内に任意のプロモータを含ませることができる。例えば、バクテリア由来、真核生物由来、またはウイルス由来のプロモータがある。これらのプロモータは構成性または誘発性のいずれでもよい。かくして、本発明は、本発明の組換え核酸配列の１種またはそれ以上を含む宿主細胞を提供する。これらの細胞は、一般に、組換え核酸により形質転換またはトランスフェクションされる。宿主細胞内に組換え核酸を導入するには任意の好適な手段が用いられる。例えば、本発明の酵素をコードする配列を感染性ウイルス粒子にパッケージして細胞をトランスフェクションする。本発明の酵素をコードする核酸配列は、エレクトロポーレーション、リポフェクション、バイオリスティック形質転換、または溶液中に核酸を細胞に単に接触させることによっても導入され得る。そのようなベクターは、宿主細胞のゲノムに組み込まれた後、または、プラスミドの場合のように染色体外に保持されて、複製を行う。任意の好適な宿主細胞を用いることができ、これには、例えば、原核微生物および真核微生物、ならびに植物細胞が挙げられる。組換えクローンは、一般的に利用できる手法、例えばマーカーの存在によるスクリーニングなどを用いて選択される。好適なスクリーニング法としては核酸ハイブリダイゼーション、抗体アッセイ、タンパク質活性を検出するためのプレートアッセイなどが含まれる。目的の酵素が分泌される場合には、従来法により生育培地から回収することができる。別のやり方として、宿主細胞を破砕し、次いで当該分野で既知の回収法により回収することもできる。本発明に従う新規微生物であるテルモパリウム・ナトロフィラムは、有価値の新しい酵素、特に、アミラーゼ、セルラーゼ、リパーゼ、プロテアーゼ、プルラナーゼおよびキシラナーゼを産生することが見出されている。１例として、本発明のアミラーゼの特性について記述する。微生物によって産生されたアミラーゼの特性生育培地からゲルろ過クロマトグラフィによって分離された可溶性アミラーゼ画分の分子量は、タンパク質マーカーと比較すると、90ｋＤａである。このアミラーゼ画分は、アミラーゼ活性の最適温度が95℃であり、最適ｐＨは8.8 である（図２および図３）。イオン交換クロマトグラフィにより２種類のアミラーゼを分離することができ、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法で測定すると以下の分子量を与える。アミラーゼＡ−Ｉサブユニット分子量＝87ｋＤａアミラーゼＡ−IIサブユニット分子量＝83ｋＤａアミラーゼはＡ−Ｉは、最適温度95℃であり、最適ｐＨが10.2である（図４および図５）。その活性の半減期は96℃で測定すると11分間である。アミラーゼＡ−IIは、最適温度が80℃であり、最適ｐＨが9.6 である（図６および図７）。80℃で120 分間のインキュベーション中に酵素活性は失活しない。これらのアミラーゼは、さらに、次のような特性を有する。アミラーゼＡ−Ｉ：・可溶性でん粉に対して加水分解活性を有し、主としてマルトースおよびその他のデキストリンを産生。・プルラナンに対する加水分解活性。・ＮａＣｌ(0.0067M)により活性が増大される。アミラーゼＡ−II：・可溶性でん粉に対して加水分解活性を有し、デキストリン（Ｇ１〜Ｇ９）を産生。・ＥＤＴＡおよびＥＧＴＡにより活性が減少。・活性にＣａ²⁺が必要アミラーゼＡ−Ｉは以下のＮ末端配列を有する：Xaa-Xaa-Glu-Ile-Tyr-Val/ Asp-Gly-Phe（Xaaは任意のアミノ酸を示す）。そして、（内部に）以下の部分的アミノ酸配列を有する：Tyr-Ile-Gly-Asp-Gl y-Ala-(Trp)-Glu-Ala-Val-Leu-Glu-Gly-(Asp)-(Asp)-Glu-(Gly/Glu)-Phe-Tyr-Ar g（カッコ内はアミノ酸の同定が不確定であることを示す）。アミラーゼＡ−IIは（内部に）以下の部分的アミノ酸配列を有する：Ile-Gly- Leu-Pro-Ser-Val-Met-Thr-Glu-Pro-Trp-Asn-Pro-Ile-Gly-Gly-Ser-Asn-(Trp)-Il e-Phe-Asp-Met-Met-Leu-Ile-(Arg)。アミラーゼＡ−ＩおよびＡ−IIは、本発明の好ましいアミラーゼではあるが、本発明はこれらのアミラーゼに限定されるものではない。むしろ、本発明は、アミノ酸配列が若干異なるそれらのアミノ酸の変異体、およびそれらの変異体をコードする核酸配列も提供するものである。本発明の変異体アミラーゼは、アミラーゼＡ−ＩまたはアミラーゼＡ−IIに対して配列相同性（ホモロジー）の程度が高く、例えば、70％、80％、90％、95％、あるいは99％に達するような配列相同性を有する。変異体は、該変異体がアミラーゼＡ−ＩまたはアミラーゼＡ−IIのアミラーゼ活性を有するか、または実質的に該活性を有している限りは、アミラーゼＡ−ＩまたはアミラーゼＡ−IIとの配列の相違が、１個またはそれ以上の欠失、置換または挿入によるものであってもよい。例えば、変異体は、一般に、アミラーゼＡ −Ｉおよび／またはＡ−IIが加水分解活性を発揮する物質の幾つかまたは全てに対して加水分解活性を有する。本発明の有用性本発明の新規微生物から得られる酵素は、洗剤産業においてクリーニング洗剤や自動皿洗い洗剤として使用されることができる。熱的に安定であり、アルカリ性であるため、該酵素は、高温、高ｐＨ下で使用されるのに極めて適している。換言すれば、これらの酵素は、洗浄、特に皿洗いに理想的な条件下で使用されるのに極めて適している。しみや汚れを分解するために粉末状および液状洗剤の両方で使用され得る酵素の例は、炭水化物を分解するアミラーゼ、タンパク質を分解するプロテアーゼ、および脂質を分解するリパーゼである。酵素を組成物として、例えば洗剤組成物として使用する場合には、当該分野で知られている他の多くの洗剤成分、例えば、ビルダー、漂白剤、漂白剤活性剤、柔軟剤、香料、他の酵素等と組み合わせて使用しなければならない。洗剤産業は、熱的に安定なアルカリ性酵素に興味を持っている唯一の産業ではない。これらの酵素に対する多くの有用な用途は、紙パルプ産業および繊維産業においても見出される。例えば、熱的安定でアルカリ性の洗剤は、クリーニング用洗剤や自動皿洗い用洗剤として有用であるが、紙の製造（特にデサイジング）、および織物のデサイジング（特にアルカリ性精練工程と組み合わせる場合）においても有用である。これらの酵素に対する要求が増大しているのは、熱的安定なアルカリ性酵素のこの汎用性にある。実施例実施例１：微生物の培養培地次の組成（リッター当たり）の倍地中でテルモパリウム・ナトロノフィラムの培養を行った。 100 ml 溶液Ａ 10 ml 溶液Ｂ 10 ml 溶液Ｃ 5m l ビタミン溶液(Raven他(1992)、Appl．Microbiol．Biotech． 38，263-267またはＤＳＭ141) 1 ml レザツリン(Resazurin)溶液(１g/L)(シグマ製) 2 g トリプトン(Difco Bacto製) 1 g 酵母エキス(Difco Bacto製) 2.5 g でん粉、可溶性(BDH/Merck製) 2 g 塩化ナトリウム 5 g 重炭酸ナトリウム 0.5 g 硫化ナトリウムＸＨ₂Ｏ１ＭのＨＣｌまたは20％(v/v)のＨ₂ＳＯ₄を用いてｐＨ8.5 に調整した。培地の調製は厳密な嫌気性条件下に行った。大規模生育条件容積20リッターのガラス製貯蔵ビン内でｐＨ制御を行わず、65℃において、ｐ 160 ガラス製分散管（最大孔径160 μｍ）から酸素を含有しない窒素で連続的に散布を行ないながら、培養を行った。無菌培地に１％の予備生育培養物を接種した。18〜21時間、細胞を生育させたところ、光学密度(Ａ₆₀₀)は0.7 から0.8 となった。Sorvall RC3-B 遠心分離機を用いる連続的な遠心分離(5000rpm、20分間、４℃）により細胞をハーベストした。代表的なバイオマス収量は3.2 〜3.2 g/ L（湿重量）であった。細胞ペーストは−20℃で貯蔵した。実施例２：酵素の抽出（実施例１で得られた）細胞ペーストを緩衝液（0.05Ｍのトリス、0.005ＭのＥＤＴＡ）に溶かして0.2 g/mlに稀釈した。得られた混合液を、０℃においてUl trasonics 社製 model SP-958 中で３mmプローブを用いて50Ｗを３×10秒間印加して超音波処理した。分解した細胞サスペンションを５℃において20分間、20,0 00rpm で遠心分離(Sorvall，ローターＳＭ−24)した。得られた細胞ペレットを緩衝液に再懸濁し、混合し、再び遠心分離した。２つの上清画分を一緒にした。別の方法として、細胞の濃縮サスペンションを解凍し、６ＮのＮａＯＨを添加してｐＨを12に上げた。得られた混合物を室温で一晩インキュベートした。酸を用いてｐＨを再調整しｐＨ８〜10とし、得られた混合液を20,000rpm で20分間遠心分離し、上清を集めた。実施例３：アミラーゼ酵素の精製（実施例２で得られた）上清を、分子量10ｋＤａのカットオフを有する膜を用いCentriprep-30 装置(Amicon 製)で限外ろ過することにより1.5 〜２mlに濃縮した。得られた濃縮タンパク質をＨＲ16/60 Superdex-200カラムにかけてゲルろ過を行い、１ml／分の流量で0.02Ｍのトリス緩衝液(ｐＨ8.5)を用いて溶出を行った。アミラーゼ活性を含有する画分を集めて、ＨＲ5/5 MonoＱカラムを用いるイオン交換クロマトグラフィにかけた。0.02Ｍのトリス緩衝液(ｐＨ8.5)に溶かした０〜２ＭのＮａＣｌの塩勾配を用い0.75 ml/分の流量でタンパク質を溶出させた。アミラーゼ活性を有する２つの別々の画分が得られたので、これを一緒にして0.02Ｍのトリス緩衝液(ｐＨ8.5)を用いて透析した。それぞれのアミラーゼタンパク質をさらにイオン交換クロマトグラフィにかけることによって更なる精製を行った。アミラーゼ活性を有する２つの画分、アミラーゼＡ−ＩおよびアミラーゼＡ−IIが得られた。これらの２つのアミラーゼ成分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで調べたところ、Ａ−ＩおよびＡ−IIについてのサブユニット分子量は、それぞれ、87ｋＤａおよび83ｋＤａであることが示された。実施例４：アミラーゼ活性の分析方法１改良ベルンフェルド(Bernfeld)分析を用いた(Bernfeld，P．(1955)：「酵素学における方法(Methods in Enzymology，vol．1 )」(S．P．Colowick およびN．O．Kaplan編集)Academic Press 社発行、New York，149-158 頁)。425μ ｌの緩衝液（0.05Ｍのトリス、0.005ＭのＥＤＴＡ、0.0067ＭのＮａＣｌ〔20℃ においてｐＨ8.5 、80℃においてｐＨ８〕）、150μｌの基質(0.05Ｍとトリス、 0.005ＭのＥＤＴＡ、0.0067ＭのＮａＣｌ、１％(w/w)の可溶性トマトでん粉（Si gma 製）、20℃においてｐＨ8.5)、および0.002ＭのＣａＣｌ₂75μｌを用いて80 ℃において酵素サンプル100μｌを20分間インキュベートした。展開液（0.4 ＭのＮａＯＨに溶かした１％(w/v)の３，５−ジニトロサリチル酸）を用いて反応を停止させ、５分間沸とうさせた。この分析混合液を氷上で冷却し、550nm における吸光度を測定し、酵素の代わりにマルトースを用いて作製した検量線に基づいて値を読みとった。方法２ 900μｌの基質溶液（0.005 ＭのＭＥＳ／ＨＥＰＥＳ／グリシン緩衝液に溶かした１％(w/v)の可溶性でん粉）を用いて100μｌの酵素をサンプルを70℃ において60分間インキュベートした。６ＮのＨＣｌを10μｌ添加して反応を停止させ、１ｍｌのヨウ素溶液(Sigma製、P700-2；3倍稀釈)を添加して展開し、100 μｌの反応混合液を得た。620 ｎｍにおいて水に対する吸光度を測定し、82650T AU/gのα−アミラーゼ活性を有する標準α−アミラーゼ(Maxamyl S3)を用いて作製した標準量線と比較した。方法３（アミラーゼＡ−Ｉ測定用）条件は方法１と同じにした。但し、酵素サンプルのインキュベーションは、650μｌの基質(0.05 Ｍのトリス、１％(w/v) の可溶性ポテトでん粉、0.0067ＭのＮａＣｌ、20℃におけるｐＨ8.5)を用いて行った。方法４（アミラーゼＡ−II測定用）条件は方法１と同じにした。但し、酵素サンプルのインキュベーションは、650 μｌの基質溶液(0.05 Ｍのトリス、１％(w /v)の可溶性ポテトでん粉、0.002ＭのＣａＣｌ₂、20℃におけるｐＨ8.5 )を用いて行った。実施例５：酵素活性に対する温度の影響最初の試験として、実施例２に従った生育細胞から得られ、ゲルろ過クロマトグラフィ（実施例３）によって分離された未精製酵素について、60℃から105 ℃ の範囲においてアミラーゼ活性を分析した。酵素活性の測定は、実施例４の方法１に従い0.05Ｍのトリス緩衝液中で行った。この結果、活性の最適温度は95℃であることが示された（図２参照）。第２の試験として、実施例３に従って得られた精製アミラーゼＡ−Ｉについて 65℃〜100 ℃における分析を行った。酵素活性の測定は実施例４の方法３に従って行った。その結果、活性の最適温度は95℃であり、88℃〜99℃の範囲において最大活性の50％が示された（図４参照）。第３の試験として、実施例３により得られた精製アミラーゼＡ−IIについて65℃ 〜100 ℃における分析を行った。酵素活性の測定は実施例４の方法に従って行われた。この結果、活性の最適値は80℃であるが、＜65℃から96℃の範囲にわたって最大活性の50％が示されるという広いプロフィルが認められた（図６参照）。実施例６：酵素活性に対するｐＨの影響最初の試験として、実施例２に従う生育細胞から得られゲルろ過クロマトグラフィ（実施例３）により分離された未精製酵素について、ｐＨ6.0 から10.8のｐＨ範囲においてアミラーゼ活性を測定した。酵素活性の測定は、実施例４の方法１に従い、そして、ｐＨ範囲に応じてトリス緩衝液の代わりに適当な緩衝液（ＭＥＳ，ＨＥＰＥＳまたはグリシン）を用いて80℃において行った。この結果、ｐＨ7.5 からｐＨ9.5 の間の広い範囲にわたって最適値があり、最大活性はｐＨ8. 8 であった（図３参照）。第２の試験として、実施例３に従って得られた精製アミラーゼＡ−Ｉについて、適当な緩衝液（酢酸塩、ＭＯＰＳ，ＭＥＳ，トリス，ＨＥＰＥＳ，ジエタノールアミンまたはグリシン）を用いて4.1 から11.4のｐＨ範囲において分析を行った。酵素活性の測定は、実施例４の方法３に従い80℃において実施した。その結果、アミラーゼＡ−Ｉの活性の最適ｐＨは10.2であることが示されている（図５参照）。第３の試験として、実施例３に従って得られた精製アミラーゼＡ−IIについて、適当な緩衝液（酢酸塩、ＭＯＰＳ，ＭＥＳ，トリス，ＨＥＰＥＳ，ジエタノールアミンまたはグリシン）を用い4.1 から11.4のｐＨ範囲において分析を行った。この結果が示すところによれば、アミラーゼＡ−IIの活性の最適ｐＨは9.6 であり、ｐＨ8.1 から＞ｐＨ11.5の範囲において最大活性の50％が認められる（図７参照）。実施例７：アミラーゼのアミノ酸配列実施例３により得られ、87ｋＤａの分子量を有するアミラーゼＡ−ＩのＮ末端アミノ酸配列を、EUROSEQUENCE(Groningen，オランダ)により測定した。帰属されたＮ末端アミノ酸配列(添付の配列リストのSEQ ID No.2)は以下のとおりである： Xaa-Xaa-Glu-Ile-Tyr-Val/Asp-Gly-Phe(Xaa は任意のアミノ酸を示す)。アミラーゼＡ−Ｉタンパク質の別のフラグメントは以下のようなアミノ酸配列( 添付の配列リストのSEQ ID No.3)を示した： Tyr-Ile-Gly-Asp-Gly-Ala-(Trp)-Glu-Ala-Val-Leu-Glu-Gly-(Asp)-(Asp)-Gl u-(Glu/Gly)-Phe-Tyr-Arg（カッコは、アミノ酸の同定が不確実であることを示す）。同様にして、実施例３により得られ、83ｋＤａのタンパク質であるアミラーゼＡ −IIは以下の部分的アミノ酸配列(添付の配列リストのSEQ ID No.4)を示した： Ile-Gly-Leu-Pro-Ser-Val-Met-Thr-Glu-Pro-Trp-Asn-Pro-Ile-Gly-Gly-Ser- Asn-(Trp)-Ile-Phe-Asp-Met-Met-Leu-Ile-(Arg)。実施例８：アミラーゼ遺伝子の単離プラスミドｐＴＺ18Ｒ(Mead，D．A.他(1998)Protein 1, 67)に、Ｔｇ９ａ株のゲノムライブラリーを作製した。ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩを用いてテルモパリウム・ナトロノフィラム(Thermopallium natronophilum)Ｔｇ９Ａの染色体ＤＮＡを分解した。アガロースゲル電気泳動法により制限断片（フラグメント）のサイズ分画を行い、１ｋｂおよびそれより大きいフラグメントをゲルから単離した。この画分を、ベクターｐＴＺ18Ｒ由来のＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩ分解ＤＮＡに連結（ライゲート）した。該連結体をエレクトロポレーションにより大腸菌ＸＬ１ＢｌｕｅＭＲＦに形質転換した。組換えクローンをアミロース清澄寒天上でスクリーニングした。ＬＢ培地で37℃において24時間増殖させた後、該組換え菌株のアミラーゼ活性を測定した(Miller，J．H．(1972)、「分子遺伝学実験法(Experiments in Molecular Genetics)」Cold Spring Harbor Labora tory 発行、433 頁)。組換え菌株のプラスミドＤＮＡを単離し、制限分析法により挿入体（インサート）の特性を調べることができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｓ 3/08 Ｃ１２Ｓ 3/08 // Ｄ０６Ｌ 1/00 Ｄ０６Ｌ 1/00 Ｄ２１Ｃ 9/10 Ｄ２１Ｃ 9/10 Ｚ (Ｃ１２Ｎ 9/28 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:01） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ダンソン，マイケルジョンイギリス国ビーエス18 ３エイキューソルトフォードグレンジロード 49 (72)発明者ハフ，デイヴィッドウィリアムイギリス国ビー12 ２エイエックスバスブルームフィールドロード 220 (72)発明者トンプソン，カールレイモンドイギリス国ビー12 ２エイワイバスバイオケミストリーデパートメントユニヴァーシティオブバス

Claims

【特許請求の範囲】１．テルモパリウム(Thermopallium)属のバクテリアから成る好熱姓で好アルカリ性バクテリアの純粋培養物。２．バクテリアがテルモパリウム・ナトロノフィラム(Thermppallium natronoph ilum) 種に属する請求の範囲１の好熱姓で好アルカリ性バクテリアの純粋培養物。３．バクテリアが、ＤＳＭ９４６０として寄託されたテルモパリウム・ナトロノフィラム(Thermopallium Natronophilum)株Ｔｇ９ａである請求の範囲１の好熱姓バクテリアの純水培養物。４．１６Ｓ rＲＮＡの核酸配列が、SEQ ID No.1 の１６Ｓ rＲＮＡ遺伝子配列に対して92〜100 ％の同一性を示すバクテリアの純粋培養物。５．１６Ｓ rＲＮＡの核酸配列が、SEQ ID No.1 、１６Ｓ rＲＮＡ遺伝子配列に対して95〜100 ％の同一性を示すバクテリアの純粋培養物。６．バクテリアが好熱姓または好熱姓である請求の範囲５のバクテリアの純粋培養物。７．請求の範囲１〜６のいずれかのバクテリアから得られるポリペプチドであって、該ポリペプチドを産生する能力のあるバクテリアを該ポリペプチド産生を導くような条件下で培養し、該ポリペプチドを回収することによって得られるポリペプチド。８．ポリペプチドが酵素である請求項７のポリペプチド。９．酵素がアミラーゼまたはプルラナーゼである請求の範囲８のポリペプチド。１０．(a) SEQ ID No.2 に示されるＮ末端アミノ酸配列、またはSEQ ID No.3 に示される内部アミノ酸配列、または(b) １つまたはそれ以上のアミノ酸の欠失、置換または挿入によって相違し、プルラナーゼ活性を有するその変異体から成る単離されたアルカリプルラナーゼ。１１．(a) SEQ ID No.4 によって示される内部アミノ酸配列、または(b) １つまたはそれ以上のアミノ酸の欠失、置換または挿入によって相違し、アミラーゼ活性を有するその変異体から成る単離されたアルカリアミラーゼ。１２．請求の範囲７〜９に記載されたポリペプチド、請求の範囲10に記載されたアミラーゼを含む組成物。１３．組成物が洗剤組成物である請求の範囲12の組成物。１４．請求の範囲７〜９に記載のポリペプチド、請求の範囲10に記載のプルラナーゼ、または請求の範囲11に記載のアミラーゼを得るための方法であって、(a) 請求の範囲１〜６に従うバクテリアを培養し、(b) 請求の範囲７〜９に記載のポリペプチド、請求の範囲10に記載のアミラーゼを含む画分を回収することを含む方法。１５．請求の範囲11または12に従う組成物を製造する方法であって、(a) 請求の範囲１〜６に従うバクテリアを培養し、(b) 請求の範囲７〜９に記載のポリペプチド、請求の範囲10に記載のプルラナーゼ、または請求の範囲11に記載のアミラーゼを含む画分を回収することを含む方法。１６．請求の範囲７〜９に従うポリペプチド、またはSEQ ID No.2,3 もしくは４に示されるアミノ酸配列を有する酵素をコードする単離された核酸。１７．請求の範囲16に従う核酸を含む組換え核酸。１８．請求の範囲17に従う組換え核酸を含む宿主細胞。１９．請求の範囲７〜９に従うポリペプチド、請求の範囲10に記載のプルラナーゼ、または請求の範囲11に記載のアミラーゼを製造する方法であって、(a) 請求の範囲18に従う宿主細胞を培養することによって、該ポリペプチド、プルラナーゼまたはアミラーゼを発現させ、(b) 得られたポリペプヂド、プルラナーゼまたはアミラーゼを回収することを含む方法。２０．請求の範囲７〜９に従うポリペプチド、請求の範囲９に記載のプルラナーゼ、または請求の範囲10に記載のアミラーゼの、紙もしくはパルプ製造、織物の製造または洗剤組成物の調製における使用。