JP2009207368A - アスペルギルス由来のセルロース分解助長因子とその利用 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】下記のアミノ酸配列のいずれかを含み、セルラーゼによるセルロースの分解を助長するセルロース分解助長活性を有するタンパク質をセルロース分解助長因子として用いる。(a)特定アミノ酸配列、(b)該アミノ酸配列で表されるアミノ酸配列において1又は複数個のアミノ酸変異を有する配列(c)別の特定アミノ酸配列と少なくとも70%以上の相同性を有する配列。
【選択図】なし
Description
(a)配列番号2で表されるアミノ酸配列
(b)配列番号2で表されるアミノ酸配列において1又は複数個のアミノ酸変異を有する配列
(c)配列番号2で表されるアミノ酸配列と少なくとも70%以上の相同性を有する配列
本発明のタンパク質は、セルロース分解助長活性を有している。セルロース分解助長活性は、セルロースの構造緩和活性とセルラーゼ活性とを含む。セルロース構造緩和活性は、セルロースの糖化(部分的な分解又はグルコースへの分解)に大きく依存することなく、セルロースの構造を緩和し、結果としてセルロースを膨潤又は軟化を生じさせる活性を意味している。好ましくはセルロース構造緩和活性は、セルラーゼ活性に実質的に依存しないでセルロースの構造緩和できる活性である。また、セルロース構造緩和活性は、結晶性セルロースの構造を緩和するものであることが好ましい。
0.15M NaCl、15mM クエン酸ナトリウム、pH7.0)、5×Denhardt溶液、1%SDS、10%デキストラン硫酸、10μg/ml変性サケ***DNA、50mM リン酸バッファー(pH7.5))を用いて、42℃〜50℃程度でインキュベーションし、その後、0.1×SSC、0.1%SDSを用いて65℃〜70℃で洗浄する条件を挙げることができる。なおストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAとしては、プローブとして使用するDNAの塩基配列と一定以上の相同性を有するDNAが挙げられ、例えば70%以上、好ましくは80%以上、より好ましくは90%以上、さらに好ましくは93%以上、特に好ましくは95%以上、最も好ましくは98%以上の相同性を有するDNAが挙げられる。
本発明のDNA構築物は、本セルロース分解助長因子をコードするコード化DNAを含んでいる。本DNA構築物は、セルロース分解促進因子生産用として有用である。従来、形質転換して生産するのに適したセルロース分解助長因子は見つかっていなかった。特に、本DNA構築物は、取得源であるAspergillus fumigatusを包含する糸状菌でのセルロース分解助長因子として有用である。糸状菌としては、、Aspergillus属、Phanerochaete属、Trichoderma属、Rhizopus属、Rhizomucor属及びNeurospora属から選択される菌であることが好ましい。これらは、いずれも分泌タンパク質の生産能力が高い菌であり、Aspergillus属、Rhizopus属及びRhizomucor属は、いわゆる麹菌として各種酵素の分泌生産能力が高く、Phanerochaete属及びTrichoderma属は、セルロースを分解する各種酵素等のタンパク質を分泌生産能力が高い菌である。本発明のDNA構築物は、取得源とは異種の菌であるAspergillus oryzaeで高効率で生産されたことから、他の分泌タンパク質生産性の菌においても高生産されると考えられる。本DNA構築物によれば、Aspergillus oryzaeをはじめとして工業的な利用に適した効率的に本セルロース分解助長因子を製造することができる。
本発明の形質転換体は、本DNA構築物によって形質転換された形質転換体である。本発明の形質転換体は、本セルロース分解助長因子をコードするコード化DNAを外来因子として有し、本セルロース分解助長因子を外来タンパク質として生産可能である。本形質転換体は、好ましくは、本セルロース分解助長因子を分泌タンパク質として生産可能である。本形質転換体の好ましい宿主細胞は、本発明のタンパク質の取得源である、Aspergillus fumigatusを包含する糸状菌とすることが好ましく、なかでも、タンパク質の分泌生産能力の高いAspergillus属、Phanerochaete属、Trichoderma属、Rhizopus属、Rhizomucor属及びNeurospora属から選択される菌を宿主とすることが好ましい。また、工業的な培養・発酵技術が確立されているAspergillus属菌であることが好ましく、より好ましくはAspergillus oryzaeである。
本発明のセルロース分解助長因子の生産方法は、本形質転換体を準備する工程と、本形質転換体を、本セルロース分解助長因子を発現可能な条件下で培養する培養工程と、前記培養工程で得られた培養産物から本セルロース分解助長因子を回収する回収工程と、を備えることができる。本セルロース分解助長因子は、上記したように、各種の化学合成及び遺伝子工学的手法を単独であるいは組み合わせることで生産することができるが、好ましくは、本形質転換体を培養する。こうすることで大量の本セルロース分解助長因子を効率的に得ることができる。
本発明のセルロース含有材料の処理方法は、本セルロース分解助長因子とセルロース含有材料とを接触させる処理工程、を備えることができる。本セルロース分解助長因子は、セルロース含有材料と接触されることでセルロース、特にその結晶領域を膨潤又は軟化することができ、セルラーゼがアクセスしやすい状態を形成できる。さらに、本セルロース分解助長因子がセルラーゼ活性を有するときには、セルラーゼとしてセルロースに作用して、セルロースを少なくとも部分的に分解して、セルロースの膨潤又は軟化を促進できる。
本発明のセルロースの分解産物の生産方法は、本セルロース分解助長因子とセルロース含有材料とを接触させて得られる産物とセルラーゼとを接触させる分解工程を備えることができる。セルロース含有材料のセルロースは本セルロース分解助長因子と接触されることでセルラーゼが作用しやすい状態が形成されており、このような状態のセルロースとセルラーゼとを接触させることで、効率的にセルラーゼによってセルロースが分解される。
本発明のセルロース処理用組成物は、本セルロース分解助長因子又は本形質転換体を含有することができる。この処理用組成物によれば、セルロース含有材料のセルロースの構造を効果的に緩和することができる。また、本発明のセルロース分解用組成物は、セルラーゼ又はセルラーゼを分泌生産可能な微生物と、本セルロース分解助長因子又は本形質転換体と、を含有することができる。本分解用組成物によれば、効率的にセルロースを分解・糖化することができる。これらの組成物において、セルラーゼ及びセルラーゼを分泌生産可能な微生物については、本発明のセルロースの分解産物の生産方法において既に説明した態様を適用することができる。
本発明のセルロースから有用物質を生産する方法は、本セルロース分解助長因子とセルロースとを接触させて得られる産物とセルラーゼとを接触させる分解工程と、前記分解工程で得られるセルロース分解産物の存在下、セルロース分解産物を利用する微生物を培養する培養工程と、を備えることができる。本発明の有用物質生産方法によれば、本セルロース分解助長因子を用いて効率的に分解したセルロース分解産物を利用するため、効率的にセルロースを利用して有用物質を生産することができる。
麹菌をはじめとする糸状菌のデータベース(Fungal Genetics Stock Center(http://www。fgsc.net/)を利用して、公知情報である各種エクスパンシン、Trichoderma reesei由来のスウォレニン(GenBankアクセッション番号:AJ245918)との相同性検索を行った。各種相同性検索のうちから、Aspergillus fumigatusにおいてある遺伝子を見出した(以後、当該遺伝子をafswol遺伝子というものとする。)。本塩基配列の両末端の配列に、下記に記載するオリゴヌクレオチドプライマー(aB1F-AfSWO及びaB2R-AfSWO)を設計し、Aspergillus fumigatus TIMM0063のゲノムDNAを鋳型にPCR増幅を行った。PCRの反応条件は、98℃30秒の処理後、98℃10秒、60℃5秒、72℃80秒の3段階の反応を1サイクルとし、これを30サイクル繰返し、4℃とした。またPCR反応には、PrimeSTAR HS DNA polymerase(タカラバイオ製)を使用した。
5’- GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCGACGGAATGACTCTTCTATTTGG -3’
aB2R-AfSWO(配列番号4):
5’- GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTAGGTGAACTGCACTCCCAG -3’
本実施例では、実施例1で取得したafswol遺伝子を麹菌であるAspergillus oryzaeで高発現させるためのベクターを構築した。本遺伝子の上流に、麹菌で高発現される特徴を有するAspergillus oryzae由来のtef1プロモーター遺伝子、下流にamyBターミネーター遺伝子を連結し、染色体導入型ベクターpgTAFSNを構築した。本ベクターは、麹菌のniaD遺伝子部位を認識し、麹菌ゲノム中に1コピー導入される特徴を有している。また、比較例として、既存のTrichoderma reesei由来遺伝子のswolを発現する染色体導入型ベクターpgTTRSNを同様にして構築した。両ベクターのマップを図2に示す。なお、ベクター構築に関する遺伝子連結法、形質転換法は、常法に従い行った。
試料液1:セルラーゼ単独(エンドグルカナーゼ、CelA上清2μl)
試料液2:スウォレニン単独(エンドグルカナーゼ、CelA上清2μl)
Claims (27)
- 配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
- 以下のアミノ酸配列のいずれかを含み、セルラーゼによるセルロースの分解を助長するセルロース分解助長活性を有するタンパク質。
(a)配列番号2で表されるアミノ酸配列
(b)配列番号2で表されるアミノ酸配列において1又は複数個のアミノ酸変異を有する配列
(c)配列番号2で表されるアミノ酸配列と70%以上の相同性を有する配列 - アスペルギルス・フミガータス(Aspergillus fumigatus)由来である、請求項2に記載のタンパク質。
- 請求項1〜3いずれかに記載のタンパク質をコードするDNAを含む、セルロース分解助長因子生産用のDNA構築物。
- 発現ベクターである、請求項4に記載のDNA構築物。
- 糸状菌での形質転換用である、請求項4又は5に記載のDNA構築物。
- 請求項4〜6のいずれかに記載のDNA構築物によって形質転換された形質転換体。
- 宿主細胞が糸状菌である、請求項7に記載の形質転換体。
- 前記糸状菌は、アスペルギルス(Aspergillus)属、ファネロケーテ(Phanerochaete)属、トリコデルマ(Trichoderma)属、リゾプス(Rhizopus)属、リゾムコール(Rhizomucor)属及びニューロスポラ(Neurospora)属から選択される菌である、請求項8に記載の形質転換体。
- 前記糸状菌はアスペルギルス・オリゼ(Aspergillus oryzae)を含む、請求項8に記載の形質転換体。
- セルロース分解助長因子の生産方法であって、
請求項7に記載の形質転換体を準備する工程と、
前記形質転換体を、本セルロース分解助長因子を発現可能な条件下で培養する培養工程と、
前記培養工程で得られた培養産物から本セルロース分解助長因子を回収する回収工程と、を備える、生産方法。 - 前記形質転換体は、Aspergillus属菌である、請求項11に記載の生産方法。
- 前記Aspergillus属菌は、Aspergillus oryzaeである、請求項12に記載の生産方法。
- セルロース含有材料の処理方法であって、
請求項1〜3のいずれかに記載のタンパク質とセルロースとを接触させる処理工程、
を備える、処理方法。 - 前記処理工程は、セルロース含有材料の存在下、請求項7〜10のいずれかに記載の形質転換体を前記タンパク質を分泌生産可能な条件下で培養する工程である、請求項14に記載の緩和方法。
- セルロースの分解産物の生産方法であって、
請求項1〜3のいずれかに記載のタンパク質とセルロース含有材料とを接触させて得られる産物と、セルラーゼと接触させる分解工程、
を備える、生産方法。 - 前記分解工程は、前記タンパク質及びセルロース含有材料の存在下、セルラーゼを発現可能な微生物を当該セルラーゼを分泌生産可能な条件下で培養する工程である、請求項16に記載の糖化方法。
- 前記分解工程は、セルロース含有材料及びセルラーゼの存在下、請求項7〜10のいずれかに記載の形質転換体を前記タンパク質を分泌生産可能な条件下で培養する工程である、請求項16に記載の糖化方法。
- セルロース処理用組成物であって、
請求項1〜3のいずれかに記載のタンパク質又は請求項7〜10のいずれかに記載の形質転換体、
を含有する、組成物。 - セルロースを含有する、請求項19に記載の組成物。
- セルロース分解用組成物であって、
請求項1〜3のいずれかに記載のタンパク質又は請求項7〜10のいずれかに記載の形質転換体と、
セルラーゼ又はセルラーゼを分泌生産可能な微生物と、
を含有する、組成物。 - セルロースの分解産物を含有する、請求項21に記載の組成物。
- セルロースから有用物質を生産する方法であって、
請求項1〜3のいずれかに記載のタンパク質とセルロースとを接触させて得られる産物とセルラーゼとを接触させる分解工程と、
前記分解工程で得られるセルロース分解産物の存在下、当該セルロース分解産物を利用する微生物を培養する培養工程と、
を備える、生産方法 - 前記培養工程は、前記微生物として酵母を利用する工程である、請求項23に記載の生産方法。
- 前記酵母は、サッカロマイセス(Saccharomyces)属酵母である、請求項24に記載の生産方法。
- 前記分解工程は、前記タンパク質及びセルロース含有材料の存在下、セルラーゼを発現可能な微生物を当該セルラーゼを分泌生産可能な条件下で培養する工程である、請求項23〜25のいずれかに記載の生産方法。
- 前記分解工程は、セルロース含有材料及びセルラーゼの存在下、請求項7〜10のいずれかに記載の形質転換体を前記タンパク質を分泌生産可能な条件下で培養する工程である、請求項23〜25のいずれかに記載の生産方法。
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