JP5807866B2 - プラスミドベクター - Google Patents
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Description
[1]プラスミド(1)
まず、本発明のプラスミドの一実施態様である、コクリア(Kocuria)属細菌内で自律的に複製可能な環状のプラスミドについて説明する。なお、本明細書における「自律的な複製」とは、プラスミドが宿主細菌の細胞質内に存在して、宿主の染色体DNAとは独立して複製および/または増殖することをいう。
本発明の別の態様として、以下(A)〜(C)のいずれかの、細菌内、好ましくはコクリア属細菌その他ミクロコッカセア科細菌内で自律的に複製する機能を担うと推測される複製領域を有する環状プラスミドが挙げられる:
(A)DNA結合タンパク質様タンパク質遺伝子の塩基配列と;レプリカーゼ様タンパク質遺伝子の塩基配列と;配列番号45に記載の塩基配列または該塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列とを含む複製領域。
(B)DNA結合タンパク質様タンパク質遺伝子の塩基配列と;レプリカーゼ様タンパク質遺伝子の塩基配列と;DNA結合タンパク質結合配列および繰り返しモチーフ配列からなる群から選ばれる少なくとも1種の配列とを含む複製領域。
(C)DNA結合タンパク質様タンパク質遺伝子の塩基配列と;レプリカーゼ様タンパク質遺伝子の塩基配列と;DNA結合タンパク質結合配列および繰り返しモチーフ配列からなる群から選ばれる少なくとも1種の配列、酸化剤感受性配列ならびに逆方向反復配列を含む塩基配列とを含む複製領域。
本発明の別の側面によれば、配列番号3に記載の塩基配列または該塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むDNA断片が提供される。本発明のDNA断片と外来遺伝子を連結させたものを、コクリア属細菌などの宿主細胞の染色体に、または環状化したプラスミドとして宿主細胞の細胞質内に導入することにより、外来遺伝子を発現する形質転換体が得られる。
相模湾内の深度約2000mの底泥から、アクチノマイセス亜目細菌の約250株を分離した。そのうち、コクリア属細菌であるコクリア エスピー MBE131(Kocuria sp. MBE131)株がプラスミドDNAを含有することを次のように確認した。MBE131株をYTNM培地(1.6% バクトトリプトン、0.5% イーストイクストラクト、1% 塩化ナトリウム、0.1% 硫酸マグネシウム)中で25℃2日間振盪培養した。この培養物から遠心操作により菌体を得た。リゾチーム(2mg/mL)を含有する20mM トリス塩酸緩衝液において37℃で1時間保温し、菌体の細胞壁を溶解したのち、High pure plasmid purification kit(ロシュ社製)を用いてプラスミドDNAを調製した。
例1で調製したプラスミドを制限酵素BamHIまたはSalIで消化して得られたフラグメントをプラスミドベクターpUC18にそれぞれクローン化し、各全塩基配列を決定した。その結果、それぞれのクローンは全く同一の塩基配列からなる挿入断片を有している、環状プラスミドであることが分かった。本プラスミドをpKR100と命名し、その塩基配列を配列番号4および図1に示した。また、本プラスミドの制限酵素マップに、ORFを記載したものを図1に示した。プラスミドpKR100の塩基配列をGENETYX MACプログラム第12.1.1版(GENETYX社製)を使用して解析した。プラスミドpKR100は、3187塩基長であり、そのG+C含量は63%であった。
例1で得たMBE131株の総DNAより、配列番号7および8に記載の塩基配列からなるプライマーセットを用いて16S rRNA遺伝子を増幅した。増幅断片をWizard PCR purification kit (promega社製)を用いて精製し、その塩基配列を決定した。MBE131株の16S rRNA遺伝子配列は、データベースに登録されているコクリア ロゼア(Kocuria rosea)標準株の16S rRNA遺伝子配列(アクセッション番号 X87756)に対して、99%の塩基配列の同一性を示した。これによりMBE131株は、系統分類学的にコクリア ロゼアに最も近縁の種であると想定される。
MBE131株を、YTMN培地で25℃、2日間培養し、得られた菌体から例1と同様の手順で、プラスミド精製キットを用いたプラスミド抽出操作を行った。一方、菌株保存機関に保存されているコクリア属細菌であるコクリア ロゼア 標準株(NBRC15588)を同条件で培養し、培養物から得られた菌体を同様の操作に供した。続いて、前述の2株より抽出した各DNA溶液をアガロース電気泳動に供した(図5を参照)。その結果、MBE131株の場合には、プラスミドDNAのバンドが検出されたが、コクリア ロゼア標準株では検出されなかった。
プラスミドpKR100の配列番号4の7−3170番に示す塩基配列を含むDNA断片とスタフィロコッカス オーレウス(Staphyrococcus aureus)由来のクロラムフェニコール耐性遺伝子を、pHY300PLKのマルチクローニングサイトに連結し、大腸菌とのシャトルベクターpR6632を構築した。コクリア属細菌MBE131株の形質転換は、pR6632を有する大腸菌HB101の形質転換体から調製したプラスミドを用いて、以下の諸条件からなるエレクトロポレーションによって実施した。プラスミドDNA 0.1〜10μg;電場強度6〜25kV/cm;抵抗50〜900Ω。細胞のパルス処理後のインキュベーション時間は30℃で3時間とした。
プラスミドpKR100の一部を含む種々のDNA断片をPCRで増幅した。pHY300PLKのマルチクローニングサイトに上述のクロラムフェニコール耐性遺伝子を連結し、さらに図4に示した各断片を連結した。構築した各プラスミドで大腸菌HB101を形質転換し、大腸菌HB101形質転換体からプラスミドを調製した。調製したプラスミドを用いて、上述の方法でMBE131株を形質転換した。その結果、配列番号4の1031−3170番の塩基配列を含む断片を有するプラスミドを用いた場合にMBE131株を形質転換することができた(図4を参照)。従って、配列番号4に示す1031−3170番の塩基配列で示す領域はMBE131株中でプラスミドの複製・保持を担う領域であるといえる。なお、配列番号4の1031−3170番の塩基配列を含む断片は、次のようにして得た。プラスミドpKR100を鋳型として、表4に示すGからQのフォワードプライマーとリバースプライマーからなるプライマーセットから選ばれる一組のプライマーセットを用いて、PCR反応を行なった。
プラスミドpR6632を用いて、種の異なるコクリア属細菌Kocuria rhizophila DC2201(NBRC103217)を形質転換した。形質転換体を2μg/mLのクロラムフェニコールまたは4μg/mLのテトラサイクリン含有のYTNM寒天培地上で、30℃で5〜7日間培養した。増殖したコロニーを、0.1mg/mL プロテアーゼKを含む0.1% TritonX溶液にけん濁し、65℃にて20分間保温した後、100℃にて10分間加熱し、細胞溶解液を調整した。得られた細胞溶解液を鋳型DNA溶液として、pR6632の有するクロラムフェニコール耐性遺伝子塩基配列に相補的なプライマーセット(配列番号21および22の塩基配列からなるフォワードプライマーおよびリバースプライマー)、テトラサイクリン耐性遺伝子塩基配列に相補的なプライマーセット(配列番号43および44の塩基配列からなるフォワードプライマーおよびリバースプライマー)、を用いたPCRを行った。
pKR100の有するタンパクをコードしないDNA塩基配列の機能を確かめるために、以下の実験を行った。pKR100の一部が欠如したDNA断片を含むプラスミドpKR111、pKR121、pKR141を作成した。これらのプラスミドはpR6632と同様に、クロラムフェニコール耐性遺伝子を選択マーカーとして有している。pKR111はpKR100の312−3170番に由来するDNA断片を有し、pKR121はpKR100の559−3170番に由来するDNA断片を有し、pKR141はpKR100の1031−3170番に由来するDNA断片を有している。pKR111およびpKR121はpR6632と同様に、近似的な繰り返しモチーフ配列からなるダイレクトリピートとインバーテッドリピートからなる特徴的な配列を2セット有しているが、pKR141では1セットのみである。各プラスミドを有する形質転換体MBE131(pR6632)MBE131(pKR111)、MBE131(pKR121)、MBE131(pKR141)を25℃にて、抗生物質を含有しないYTNM培地中20世代培養した。培養後の培養液を、抗生物質を含有しないYTNM寒天培地に塗布し、25℃にて3日間、単一コロニーを形成させた。固体寒天培地上に増殖した各コロニーを、抗生物質を含有していないYTNM寒天培地とクロラムフェニコールを含有する個体寒天培地に同時にピックアップした。抗生物質を含有しない固体寒天培地に増殖したコロニー数に対する、クロラムフェニコール含有固体寒天培地に増殖したコロニー数を算出し、プラスミド保持率(%)とした(図12を参照)。この結果、近似的な繰り返しモチーフ配列からなるダイレクトリピートとインバーテッドリピートからなる特徴的な配列を1セットしか有していないpKR141は他の被験プラスミドに比べて、プラスミド安定性が低いことが分かった。すなわち、pKR100の559−1031番塩基配列は、プラスミドの安定保持に関与する機能を持つことが分かった。また、さらにpKR141に存在するダイレクトリピートをした削除プラスミドはMBE131株中で複製不可能である(すでに記載の実施例、例6より)ことからダイレクトリピートとインバーテッドリピートからなる特徴的な配列は、pKR100の複製や安定保持に重要な役割を担っていると判断される。また、pKR100の559−3170番塩基は、プラスミドの複製、安定性に重要な役割を持つと判断される。
[配列番号1]pKR100におけるorf1領域
ATGGGCGACCCTCAGCTTGTAATGGGCTTTTTCCAGGTCTTCCTTCGTGCCTTTCTCGTACAGAGCGTCTGCTTCGAGAAGGGCCCATTCCGCTTCGACAAACTGCCGGGCAAGAAGTTTTTTGCTGGATGGCTTAGTCATGGCAAGGAACGTAGCTGCCGAAGTAGTGAAGGCTGTACAGATCCGACGCGGTTCGCGCGGGTCCGTCAGTAG
[配列番号2]pKR100におけるorf2領域
GTGACCAGTGTAGGCACGCACCTTCCCTCGTCCACCAGCCCCGCCGCAACACGGCAGGCGGCTGTTCGGCAGGCATTTGTTAACCATTTAGGCGTGCGCCACGTGCGTGTGGCGGCCACCAAGAACGGTGCGCCGCGCACCGTTCCCATTGAGGCGTTAGGCGAGTTCGCCTTTTGGACGCCACCGGCCTGGCCCAACCTCGGATTGCTGACTATTGACGTCGACCGGGATGCGGCCGTGCTCGAGCTCTTCGCCGCCCCTGCCCTGCCGCATGTGGTCGTGGAGACCCCCCGCGGGGCCCAAGCGGTGTGGCTGATCGACCGAGTACACACCGGCCCGAACGCCCGCCCGCACCCGATCGCCTATGCCGAAACCGTAGGAAGCGCTTTGCGTGCCTCCCTGGATGGAGACTCGGCCGTGGATCCATTGCGCCCGGTACGTACCCGTAACCCCTGCTACAGACCTGCACAGCGCGATGTGTTCACCACTGCCCGCCCGCTAACGGCGCCCTACCGTCTCGGAGAGCTCCAGAAATCCCTGGATGCTGCTGGAGCATGGCCAACACGTCCTGAGCGCTCTCAGGCCCGTGGAAGGGCGCAGAAGGCCGTTGACGGAGTGTTCGTGGGCCGTAACGACGCCGTCAACCGCTCCACCTGGCTGACCGTGCGCTACGGACTCGAAAATGGTTCCGTGACTCACTGGACCGATGCCGACGTGCTGGAGCTGGCCCATGGCATTAACGAGGCCGTCGCTGCTGAGCAAGGCGTGCCGCCCTTACCCGAGGATCAAGTGCGCGACTTGGCTGTCTCGATCTGCCGGCATCAACACCGACCTGGCCGCCGAGCCATCTCCGGACAAGGCTCGGCCACCGCCCGCGCCCTCGGCGCTAAAGGCGGCGCAGCCCGTTCCGAGGCCAAAACCATTAGCGGGCGGCGCAACGTGGGCAAGGCGACCGCTGTGCGTTCCGCATCCGCGGCCTTGCGTTCTGAGAGCATCCGAATCCTGGCCGAGCAAGGGCACACCTACGAGGCCATTGCCGCCGCTGTCGGATGCTCCACTAAGACCGTTCAGCGTGCTCTTCGCGACCTCTGA
[配列番号3]pKR100における複製領域
CGGTCAGGCTGGACGGTGCGTGGTCATAAACCGTGGGTCGGTTCGGAGAGCCGGGGGGTGGCTTCCTATCGTCGTGAGATGAGCAGAGAACGCTATGAGCCGATGAGTGAGGCCCGGTTGGAAGTCGCTTGGATGGTCGTGTTGCTGGGGTGTGCGCTGGTTCTTATGGGTGGGGTGGCCCTGGATGTGTTGATCGATCATCTCGCTGTCAGCTTCGCCTTGGCGGGGGTGCCGAGTGTGTTGGTGGTGGCGGTGTTGTGGCGGCGGCACGTGCGCTAAGCCGTGTACGGGCACAGAAAAAGCCGGGTGGTAGAGCCCGGCTTTTTCCGTGGGGGAGAGTCTCGTACCCCGCGTCTCAGTGTCCTGCACACCGGTCGTGATGCCTACTGCCGCTACACGGAGCAAAGCTATGCGTTATGTGCCATAAACGCGGATCGCCCTTCGTCCAGCTCGTGGAGCTGGCTGAGTGCCTATGTGCCATAGGCGGGCGGGGGCACCCGAGCGGGCTCGTGTGAGCGCTGCGCTGGGCATAGGGAAGGCCGGGCGCTAGCCCAGCCCTCCATGGGGGCAGAGGGCCCCGTGGTGTTGAGAGTGGCGAGCCCTACTGAGGGTCCTCGAAGGCGTCGGGGGCGCTTCGTGTCCTCTTCAGTTTTTGATCCCTGGCGTCCTGAACTTCGTTCGCGACTGCCTCCGGGGTGCCGGTGGCAAGGAGAGCATGCACATGGGCGACCCTCAGCTTGTAATGGGCTTTTTCCAGGTCTTCCTTCGTGCCTTTCTCGTACAGAGCGTCTGCTTCGAGAAGGGCCCATTCCGCTTCGACAAACTGCCGGGCAAGAAGTTTTTTGCTGGATGGCTTAGTCATGGCAAGGAACGTAGCTGCCGAAGTAGTGAAGGCTGTACAGATCCGACGCGGTTCGCGCGGGTCCGTCAGTAGGCCAGTGATGGGCCATAGGGTGACCAGGAAAGAGTTGAGCCCCGGAGATTCCACCCTCCGGGGCTCGACTTCCCCGATTGATAGCGGCAATCAGGAGAAGCCTTGTGACCAGTGTAGGCACGCACCTTCCCTCGTCCACCAGCCCCGCCGCAACACGGCAGGCGGCTGTTCGGCAGGCATTTGTTAACCATTTAGGCGTGCGCCACGTGCGTGTGGCGGCCACCAAGAACGGTGCGCCGCGCACCGTTCCCATTGAGGCGTTAGGCGAGTTCGCCTTTTGGACGCCACCGGCCTGGCCCAACCTCGGATTGCTGACTATTGACGTCGACCGGGATGCGGCCGTGCTCGAGCTCTTCGCCGCCCCTGCCCTGCCGCATGTGGTCGTGGAGACCCCCCGCGGGGCCCAAGCGGTGTGGCTGATCGACCGAGTACACACCGGCCCGAACGCCCGCCCGCACCCGATCGCCTATGCCGAAACCGTAGGAAGCGCTTTGCGTGCCTCCCTGGATGGAGACTCGGCCGTGGATCCATTGCGCCCGGTACGTACCCGTAACCCCTGCTACAGACCTGCACAGCGCGATGTGTTCACCACTGCCCGCCCGCTAACGGCGCCCTACCGTCTCGGAGAGCTCCAGAAATCCCTGGATGCTGCTGGAGCATGGCCAACACGTCCTGAGCGCTCTCAGGCCCGTGGAAGGGCGCAGAAGGCCGTTGACGGAGTGTTCGTGGGCCGTAACGACGCCGTCAACCGCTCCACCTGGCTGACCGTGCGCTACGGACTCGAAAATGGTTCCGTGACTCACTGGACCGATGCCGACGTGCTGGAGCTGGCCCATGGCATTAACGAGGCCGTCGCTGCTGAGCAAGGCGTGCCGCCCTTACCCGAGGATCAAGTGCGCGACTTGGCTGTCTCGATCTGCCGGCATCAACACCGACCTGGCCGCCGAGCCATCTCCGGACAAGGCTCGGCCACCGCCCGCGCCCTCGGCGCTAAAGGCGGCGCAGCCCGTTCCGAGGCCAAAACCATTAGCGGGCGGCGCAACGTGGGCAAGGCGACCGCTGTGCGTTCCGCATCCGCGGCCTTGCGTTCTGAGAGCATCCGAATCCTGGCCGAGCAAGGGCACACCTACGAGGCCATTGCCGCCGCTGTCGGATGCTCCACTAAGACCGTTCAGCGTGCTCTTCGCGACCTCTGAAACAGTCTCC
[配列番号4]pKR100
ATAAGCCCAAGGTGAGGGGACGCTCCCCGGGCCTCTCAGCCCCCCCTCTGAGGGCTCCTGCGGGCACCTCCTACGATCCTCCGAACAGCCCTGATCGTCACACCTCATGCATCATTCGATGAGCCAGGTCTAGGTGACCAAACGCAGGCGGCCACAGACTCAGCTGCACTCTCATCGTGAGGTGCCCAGAGCGTCGCAACAAGGCACCGACCCAGCCTCAATTTTCATCCGCCGGCCTTAACGGCGACCGTCACTGTTGATGACTTTTGCTGTCCTCGAATCACCCTTCGCGGGTGAGGGGTAACCCGCTTCGGGTGAGGCAACCAGAACGGGTCCCTGTGCTCGGCTATGTGGTCGAGCAGGTGCCTGGTGGGGTGGCGTGGTCGTTGTCGGCGGGCCGGTTTCGGGCGCGCTGGGGTGACCTAGCTGTGCGCACCGAGGACCGGTGCGAAGGACAAGATGAGCGTCTTTCCCGAGGGCCGGCCAAAGAATGCAAGAGGTGTGACGACTTGGATCAGAGTTCGGAGCTCCGACGCATTGGGAGGTGATTGGGTGCAGCGTGAGACCAGTCCGTAGCGTTTGACGAATGCAAATGCGACGCGGGGACCAGGAGGCTAGACATCGTCGAGATATGGCTTGGATTCTGGTGCTGCTGGCTGGAGTGCAGGTGGGTTTGCTGGCGACGGTGATCGGTGTCTTGGTCGAGGACCTCGTGGTGGGCACTGTCGTTGCTTTGGTTCCTGGGGCTGTGGTGGTGGGGCTGTGGTGGCGGCGGTTTTTGGACTAGCCGGCGTTGCTGGGCATGGAAAAAGCCGGGCTGCTGCCCGGCTTTTTCTTCTGGGAGGCGGGGCCTGGTCAACCGGGCCTCCCGGGAAGCGGTGGTGTGAGCACGTCAGTTCCCGCCTCCAGTGTTGGCCGTTCTTCGGTTTGTTCCCAAAAGTGACGGCGATGGGTGGGTGGAAGGTCCCGTCCAGGTCTGATTTGCCGGCACAGGTTGCTGGGCCGGGGTTGTCCCCGTAGGGGTCTGTCCCGGTCAGGCTGGACGGTGCGTGGTCATAAACCGTGGGTCGGTTCGGAGAGCCGGGGGGTGGCTTCCTATCGTCGTGAGATGAGCAGAGAACGCTATGAGCCGATGAGTGAGGCCCGGTTGGAAGTCGCTTGGATGGTCGTGTTGCTGGGGTGTGCGCTGGTTCTTATGGGTGGGGTGGCCCTGGATGTGTTGATCGATCATCTCGCTGTCAGCTTCGCCTTGGCGGGGGTGCCGAGTGTGTTGGTGGTGGCGGTGTTGTGGCGGCGGCACGTGCGCTAAGCCGTGTACGGGCACAGAAAAAGCCGGGTGGTAGAGCCCGGCTTTTTCCGTGGGGGAGAGTCTCGTACCCCGCGTCTCAGTGTCCTGCACACCGGTCGTGATGCCTACTGCCGCTACACGGAGCAAAGCTATGCGTTATGTGCCATAAACGCGGATCGCCCTTCGTCCAGCTCGTGGAGCTGGCTGAGTGCCTATGTGCCATAGGCGGGCGGGGGCACCCGAGCGGGCTCGTGTGAGCGCTGCGCTGGGCATAGGGAAGGCCGGGCGCTAGCCCAGCCCTCCATGGGGGCAGAGGGCCCCGTGGTGTTGAGAGTGGCGAGCCCTACTGAGGGTCCTCGAAGGCGTCGGGGGCGCTTCGTGTCCTCTTCAGTTTTTGATCCCTGGCGTCCTGAACTTCGTTCGCGACTGCCTCCGGGGTGCCGGTGGCAAGGAGAGCATGCACATGGGCGACCCTCAGCTTGTAATGGGCTTTTTCCAGGTCTTCCTTCGTGCCTTTCTCGTACAGAGCGTCTGCTTCGAGAAGGGCCCATTCCGCTTCGACAAACTGCCGGGCAAGAAGTTTTTTGCTGGATGGCTTAGTCATGGCAAGGAACGTAGCTGCCGAAGTAGTGAAGGCTGTACAGATCCGACGCGGTTCGCGCGGGTCCGTCAGTAGGCCAGTGATGGGCCATAGGGTGACCAGGAAAGAGTTGAGCCCCGGAGATTCCACCCTCCGGGGCTCGACTTCCCCGATTGATAGCGGCAATCAGGAGAAGCCTTGTGACCAGTGTAGGCACGCACCTTCCCTCGTCCACCAGCCCCGCCGCAACACGGCAGGCGGCTGTTCGGCAGGCATTTGTTAACCATTTAGGCGTGCGCCACGTGCGTGTGGCGGCCACCAAGAACGGTGCGCCGCGCACCGTTCCCATTGAGGCGTTAGGCGAGTTCGCCTTTTGGACGCCACCGGCCTGGCCCAACCTCGGATTGCTGACTATTGACGTCGACCGGGATGCGGCCGTGCTCGAGCTCTTCGCCGCCCCTGCCCTGCCGCATGTGGTCGTGGAGACCCCCCGCGGGGCCCAAGCGGTGTGGCTGATCGACCGAGTACACACCGGCCCGAACGCCCGCCCGCACCCGATCGCCTATGCCGAAACCGTAGGAAGCGCTTTGCGTGCCTCCCTGGATGGAGACTCGGCCGTGGATCCATTGCGCCCGGTACGTACCCGTAACCCCTGCTACAGACCTGCACAGCGCGATGTGTTCACCACTGCCCGCCCGCTAACGGCGCCCTACCGTCTCGGAGAGCTCCAGAAATCCCTGGATGCTGCTGGAGCATGGCCAACACGTCCTGAGCGCTCTCAGGCCCGTGGAAGGGCGCAGAAGGCCGTTGACGGAGTGTTCGTGGGCCGTAACGACGCCGTCAACCGCTCCACCTGGCTGACCGTGCGCTACGGACTCGAAAATGGTTCCGTGACTCACTGGACCGATGCCGACGTGCTGGAGCTGGCCCATGGCATTAACGAGGCCGTCGCTGCTGAGCAAGGCGTGCCGCCCTTACCCGAGGATCAAGTGCGCGACTTGGCTGTCTCGATCTGCCGGCATCAACACCGACCTGGCCGCCGAGCCATCTCCGGACAAGGCTCGGCCACCGCCCGCGCCCTCGGCGCTAAAGGCGGCGCAGCCCGTTCCGAGGCCAAAACCATTAGCGGGCGGCGCAACGTGGGCAAGGCGACCGCTGTGCGTTCCGCATCCGCGGCCTTGCGTTCTGAGAGCATCCGAATCCTGGCCGAGCAAGGGCACACCTACGAGGCCATTGCCGCCGCTGTCGGATGCTCCACTAAGACCGTTCAGCGTGCTCTTCGCGACCTCTGAAACAGTCTCCGTCGAGGTGGACATTTC
[配列番号5]pKR100におけるorf1によってコードされるORF1
MTSVGTHLPSSTSPAATRQAAVRQAFVNHLGVRHVRVAATKNGAPRTVPIEALGEFAFWTPPAWPNLGLLTIDVDRDAAVLELFAAPALPHVVVETPRGAQAVWLIDRVHTGPNARPHPIAYAETVGSALRASLDGDSAVDPLRPVRTRNPCYRPAQRDVFTTARPLTAPYRLGELQKSLDAAGAWPTRPERSQARGRAQKAVDGVFVGRNDAVNRSTWLTVRYGLENGSVTHWTDADVLELAHGINEAVAAEQGVPPLPEDQVRDLAVSICRHQHRPGRRAISGQGSATARALGAKGGAARSEAKTISGRRNVGKATAVRSASAALRSESIRILAEQGHTYEAIAAAVGCSTKTVQRALRDL
[配列番号6]pKR100におけるorf2によってコードされるORF2
MGDPQLVMGFFQVFLRAFLVQSVCFEKGPFRFDKLPGKKFFAGWLSHGKERSCRSSEGCTDPTRFARVRQ
[配列番号7]MBE131株の系統分類解析用のフォワードプライマー
AGAGTTTGATCCTGGCTCAG
[配列番号8]MBE131株の系統分類解析用のリバースプライマー
AAAGGAGGTGATCCAGCC
[配列番号9]表1のセットAのフォワードプライマー
TGGTGGCGGTGTTGTG
[配列番号10]表1のセットAのリバースプライマー
TCGCGAACGAAGTTCAGG
[配列番号11]表1のセットBのフォワードプライマー
GCCGGTGGCAAGGAGAGCATGCACATGGGCGACCCTC
[配列番号12]表1のセットBのリバースプライマー
CACTGGCCTACTGACGGACC
[配列番号13]表1のセットCのフォワードプライマー
GGTCCGTCAGTAGGCCAGTG
[配列番号14]表1のセットCのリバースプライマー
GGAGACTGTTTCAGAG
[配列番号15]表1のセットDのフォワードプライマー
TGGTGGCGGTGTTGTG
[配列番号16]表1のセットDのリバースプライマー
CACTGGCCTACTGACGGACC
[配列番号17]表1のセットEのフォワードプライマー
GCCGGTGGCAAGGAGAGCATGCACATGGGCGACCCTC
[配列番号18]表1のセットEのリバースプライマー
GGAGACTGTTTCAGAG
[配列番号19]表1のセットFのフォワードプライマー
TGGTGGCGGTGTTGTG
[配列番号20]表1のセットFのリバースプライマー
GGAGACTGTTTCAGAG
[配列番号21]pR6632の有するクロラムフェニコール耐性遺伝子塩基配列に相補的なフォワードプライマー
GTTACAATAGCGACGGAGAG
[配列番号22]pR6632の有するクロラムフェニコール耐性遺伝子塩基配列に相補的なリバースプライマー
AGGTTAGTGACATTAGAAAACC
[配列番号23]表4のセットGのフォワードプライマー
ATTAAAGCTTCCAAGGTGAGGGGACGC
[配列番号24]表4のセットGのリバースプライマー
GTCCACAAGCTTGGAGACTGTTTCAGAG
[配列番号25]表4のセットHのフォワードプライマー
ATTAAAGCTTCCAAGGTGAGGGGACGC
[配列番号26]表4のセットHのリバースプライマー
AAAAAAGCTTCGGCGGCCAGGTCGGTGTTGATGC
[配列番号27]表4のセットIのフォワードプライマー
TTTTAAGCTTCGGGTGAGGCAACCAGAAC
[配列番号28]表4のセットIのリバースプライマー
GTCCACAAGCTTGGAGACTGTTTCAGAG
[配列番号29]表4のセットJのフォワードプライマー
ATTGGAAGCTTCGTGAGACCAGTCC
[配列番号30]表4のセットJのリバースプライマー
GTCCACAAGCTTGGAGACTGTTTCAGAG
[配列番号31]表4のセットKのフォワードプライマー
TTTTAAGCTTGGACTAGCCGGCGTTGC
[配列番号32]表4のセットKのリバースプライマー
GTCCACAAGCTTGGAGACTGTTTCAGAG
[配列番号33]表4のセットLのフォワードプライマー
AAGGGTAAGCTTCGGTCAGGCTGGACGGTGCGTGG
[配列番号34]表4のセットLのリバースプライマー
GTCCACAAGCTTGGAGACTGTTTCAGAG
[配列番号35]表4のセットMのフォワードプライマー
AAGGAAGCTTGTGCGCTAAGCCGTGTACG
[配列番号36]表4のセットMのリバースプライマー
GTCCACAAGCTTGGAGACTGTTTCAGAG
[配列番号37]表4のセットOのフォワードプライマー
TTTTAAGCTTCTCGTACCCCGCGTCTCAG
[配列番号38]表4のセットOのリバースプライマー
GTCCACAAGCTTGGAGACTGTTTCAGAG
[配列番号39]表4のセットPのフォワードプライマー
CACCCGAAGCTTCTCGTGTGAGCGCTGCG
[配列番号40]表4のセットPのリバースプライマー
GTCCACAAGCTTGGAGACTGTTTCAGAG
[配列番号41]表4のセットQのフォワードプライマー
AGGTTAAGCTTGGTCCGTCAGTAGGCCAGTG
[配列番号42]表4のセットQのリバースプライマー
GTCCACAAGCTTGGAGACTGTTTCAGAG
[配列番号43]pR6632の有するテトラサイクリン耐性遺伝子塩基配列に相補的なフォワードプライマー
GTAACCAGCCAACTAATGAC
[配列番号44]pR6632の有するテトラサイクリン耐性遺伝子塩基配列に相補的なリバースプライマー
CTCGTAATGGTTGTAGTTGC
[配列番号45]pKR100における複製領域からorf1領域およびorf2領域を除いた領域
CGGTCAGGCTGGACGGTGCGTGGTCATAAACCGTGGGTCGGTTCGGAGAGCCGGGGGGTGGCTTCCTATCGTCGTGAGATGAGCAGAGAACGCTATGAGCCGATGAGTGAGGCCCGGTTGGAAGTCGCTTGGATGGTCGTGTTGCTGGGGTGTGCGCTGGTTCTTATGGGTGGGGTGGCCCTGGATGTGTTGATCGATCATCTCGCTGTCAGCTTCGCCTTGGCGGGGGTGCCGAGTGTGTTGGTGGTGGCGGTGTTGTGGCGGCGGCACGTGCGCTAAGCCGTGTACGGGCACAGAAAAAGCCGGGTGGTAGAGCCCGGCTTTTTCCGTGGGGGAGAGTCTCGTACCCCGCGTCTCAGTGTCCTGCACACCGGTCGTGATGCCTACTGCCGCTACACGGAGCAAAGCTATGCGTTATGTGCCATAAACGCGGATCGCCCTTCGTCCAGCTCGTGGAGCTGGCTGAGTGCCTATGTGCCATAGGCGGGCGGGGGCACCCGAGCGGGCTCGTGTGAGCGCTGCGCTGGGCATAGGGAAGGCCGGGCGCTAGCCCAGCCCTCCATGGGGGCAGAGGGCCCCGTGGTGTTGAGAGTGGCGAGCCCTACTGAGGGTCCTCGAAGGCGTCGGGGGCGCTTCGTGTCCTCTTCAGTTTTTGATCCCTGGCGTCCTGAACTTCGTTCGCGACTGCCTCCGGGGTGCCGGTGGCAAGGAGAGCATGCAC
[配列番号46]DNA結合タンパク質結合配列1
TCGGAGCTCCGA
[配列番号47]DNA結合タンパク質結合配列2
TGATCGATCA
[配列番号48]繰り返しモチーフ配列の反復単位1
TGGCGTGGTCGTTG
[配列番号49]繰り返しモチーフ配列の反復単位2
GCGCTGGGGTG
[配列番号50]繰り返しモチーフ配列の反復単位3
TGGGGCTGTGGTGG
[配列番号51]繰り返しモチーフ配列の反復単位4
GCGGTGGTGTG
[配列番号52]繰り返しモチーフ配列の反復単位5
GGGCCGGGGTTG
[配列番号53]繰り返しモチーフ配列の反復単位6
GCCGGGGTTGT
[配列番号54]繰り返しモチーフ配列の反復単位7
TGGTCGTGTTG
[配列番号55]繰り返しモチーフ配列の反復単位8
TGTTGCTGGGGTG
[配列番号56]繰り返しモチーフ配列の反復単位9
TGGCGGTGTTGTGG
[配列番号57]繰り返しモチーフ配列の反復単位10
GGGGTGCCGGTGG
[配列番号58]酸化剤感受性配列1
TGTGGGGTGGCCCCTCAGCGAAATA
[配列番号59]酸化剤感受性配列2
GGCCTCTCAGC
[配列番号60]酸化剤感受性配列3
CTGCGGGCACCTCCTAC
[配列番号61]酸化剤感受性配列4
GGTGAGGGGTAACCC
[配列番号62]酸化剤感受性配列5
GTGGGGTGGC
[配列番号63]酸化剤感受性配列6
GGGGGGTGGCTTCCTATCG
[配列番号64]酸化剤感受性配列7
GTGGGGTGGCCC
[配列番号65]酸化剤感受性配列8
TGTGGCGGCGGCACGTGCGCTAA
[配列番号66]酸化剤感受性配列9
GCGGGGGCACCCGA
[配列番号67]酸化剤感受性配列10
CTGAGGGTCCTC
[配列番号68]逆方向反復配列1
GAAAAAGCCGGGCTGCTGCCCGGCTTTTTC
[配列番号69]逆方向反復配列2
CACAGAAAAAGCCGGGTGGTAGAGCCCGGCTTTTTCCGTG
Claims (9)
- (1)配列番号3に記載の塩基配列;
(2)配列番号4の第559位〜第3,170位に記載の塩基配列;
(3)配列番号4の第312位〜第3,170位に記載の塩基配列;
(4)配列番号4の第7位〜第3,170位に記載の塩基配列;
(5)配列番号4に記載の塩基配列;および
(6)前記塩基配列(1)〜(5)のいずれか1つの塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
からなる群から選ばれる複製領域を有する、細菌内で自律的に複製可能な環状のプラスミド。 - コクリア エスピー MBE131(Kocuria sp. MBE131)株(FERM P−21885)に由来する、請求項1に記載のプラスミド。
- 前記プラスミドが、さらに外来遺伝子を含む、請求項1または2に記載のプラスミド。
- 前記外来遺伝子が、薬剤耐性遺伝子である、請求項3に記載のプラスミド。
- (1)配列番号3に記載の塩基配列;
(2)配列番号4の第559位〜第3,170位に記載の塩基配列;
(3)配列番号4の第312位〜第3,170位に記載の塩基配列;
(4)配列番号4の第7位〜第3,170位に記載の塩基配列;
(5)配列番号4に記載の塩基配列;および
(6)前記塩基配列(1)〜(5)のいずれか1つの塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列
からなる群から選ばれる複製領域を含む、DNA断片。 - 前記DNA断片が、さらに外来遺伝子を含む、請求項5に記載のDNA断片。
- 前記外来遺伝子が、薬剤耐性遺伝子である、請求項6に記載のDNA断片。
- 請求項5〜7のいずれか1項に記載のDNA断片の塩基配列を含む、ベクター。
- 請求項1〜4のいずれか1項に記載のプラスミド、請求項5〜7のいずれか1項に記載のDNA断片、または請求項8に記載のベクターを含有してなる、形質転換体。
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