JP4258650B2 - 糖類修飾金属あるいは半導体微粒子 - Google Patents
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Description
蛍光色素等の色素で標識することなく、誰にでも簡単に操作ができ、瞬時に目的タンパク質を検出できる手段の開発が極めて重要である。
(2) 金属が、金、白金、銀及び銅から選ばれたものであり、半導体が硫化カドミウム、酸化チタン、酸化亜鉛、酸化モリブデンである、上記(1)に記載の糖類固定微粒子。
(3) 糖類誘導体化合物が以下の一般式IA’で表される化合物であることを特徴とする、上記(1)又は(2)に記載の糖類固定微粒子。
(4) 糖類誘導体化合物が以下の一般式IBで表される化合物であることを特徴とする、上記(4)に記載の糖類固定微粒子。
(5) 糖類誘導体化合物が以下の一般式(1)で表される化合物であることを特徴とする、上記(3)に記載の糖類固定微粒子。
(6) 上記(1)〜(5)のいずれか記載の糖類固定微粒子を試料溶液と接触させ、糖類固定微粒子と糖類結合成分を結合させることにより、該成分を捕捉することを特徴とする糖類結合成分の捕捉方法。
(7) 糖類結合成分が、糖類結合タンパク質である上記(6)に記載の方法。
(8) 糖類結合成分が、酵素、血液凝集活性タンパク質、菌体、細胞、細胞膜、ウイルス、がん細胞の各種細胞組織であることを特徴とする上記(7)に記載の方法。
(9) 上記(1)〜(5)のいずれかに記載の糖類固定微粒子の分散液中に試料溶液を注入し、該微粒子表面に固定された糖類に特異的な結合をする糖類結合成分が試料溶液中に存在する場合において変化する糖類固定微粒子の光学的性質を指標にして、糖類結合成分の有無の検出、および/またはその濃度を測定することを特徴とする、糖類結合物質の分析方法。
(10) 上記(1)〜(5)のいずれかに記載の糖類固定微粒子の分散液中に試料溶液を注入し、該微粒子表面に固定された糖類に特異的な結合をする糖類結合成分が試料溶液中に存在する場合において沈殿する、糖類固定微粒子の溶液分散状態を指標にして、糖類結合成分の有無,および/またはその濃度を測定することを特徴とする、糖類結合成分の分析方法。
(11) 以下の一般式(1)で表される化合物。
(12) 以下の一般式(2)で表される化合物。
(13) 以下の一般式(3)で表される化合物。
したがって、本法を適用すれば、例えば、上述した各種ウィルスの検出が容易に行えるので、迅速な判断が必要である臨床検査にも極めて有用である。インフルエンザ、アデノウィルスなど、季節により大流行が危惧されるようなウィルスの検出も診察のその場で検出(リアルタイムでの検出)が可能となり、迅速診断、治療方針の決定に非常に有効である。また、ガン細胞のような特定糖鎖をもつ細胞の検出も行えるので、ガンのみならず成人病等の病気の早期発見、病後の薬剤の投与計画、病状管理にも極めて有用である。
また、ガラス等の基板上に金などの金属微粒子をナノドット状に配した基板やシリコン表面状に金-シリコンの積層した突起状の金属半導体複合ナノドット表面なども好都合に利用できる。またインジウムチンオキサイド(ITO)などの透明導電性電極状に構築した微粒子表面にも適用できる。
例えば、金属微粒子を得るには、K. C. Grabarら(Langmuir, 12, 2353-2361 (1996))または、J. Turkevichら(Discuss. FaradaySoc., 11, 55-75 (1951))の方法で調整し、溶液中に分散させた溶液を作製する。具体的には直径2.6 nmの金微粒子の場合、1%の塩化金酸1mlを100mlの水に溶解させ、激しく撹拌の後、1%のクエン酸ナトリウムを加え、混合物に1mlの0.075%の水素化ホウ素ナトリウム/1%クエン酸ナトリウムを加えて5分撹拌し4℃に保存することで調整する。市販のものを使用してもよい。白金、銀、銅等の他の金属微粒子も、基本的には金微粒子の場合と同様にコロイド法で調製したものを使用するか、レーザーアブレーション法で水溶液中に分散、調製したものを使用する。これらも市販品を利用してもよい。半導体微粒子についても金微粒子同様、コロイド法、レーザーアブレーション法等で調製したものを使用するほか、市販品を利用してもよい。
また、これら含硫黄官能基は、飽和または不飽和炭化水素鎖を介して糖鎖と結合していることが好ましく、糖類誘導体化合物が含硫黄官能基を2以上有していても良い。
〔 但し、式中〔G〕は、単糖類若しくは2等以上の糖類を表し、Oは糖類の炭素原子に結合する酸素原子、Aは飽和若しくは不飽和の脂肪族炭化水素鎖、Rは−SH基、−S−R1基、−S2−R2基(R1は・・・、R2は・・・を表す。)を表し、mは1以上の整数を表す。また、mが2以上の整数を表すとき、少なくとも2つの−O−A−R基は、一緒になって、−O−A−S−A−O−、あるいは−O−A−S2−A−O−基を形成していてもよい。〕
さらに、本明細書において、糖類の「水酸基」とは、糖類がヘミアセタール構造を形成することに伴い生成するOH基を含む。
HO−A−X ・・・(4)
(式中、Xはハロゲン原子、アルキルスルホニルオキシ基またはアリールスルホニルオキシ基、Aは飽和若しくは不飽和の脂肪族炭化水素基を表す。)
本発明における一般式1で表される糖類誘導体化合物の製法について、飽和炭化水素鎖を有する化合物を例にとりさらに具体的に説明する。
第1工程として、単糖類若しくは2糖以上の糖類の水酸基の保護を行い、下記一般式IIの化合物を調製する。
(式中、[G]、O、mは一般式Iと同様であり、R3は保護基を表す。)
R3の具体例としてはアセチル基、ベンゾイル基等のアシル基、アルキル基、あるいはベンジル基等が挙げられる。このうちアセチル基保護は最も容易に導入でき、また脱保護も容易である。アセチル基保護は通常のアセチル化法、すなわち、ピリジンのような塩基存在下、糖類に無水酢酸を作用させることにより容易に導入できる。また、単糖類及び二糖類のアセチル化体は市販品を用いることもできる。
次に、式IIの化合物から以下の一般式IIIの化合物を調製する。
(式中の[G]、O、およびmは上記一般式Iと同様であり、nは1以上の整数を表し、Xはハロゲン原子またはアルキルスルホニルオキシ基、アリールスルホニルオキシ基を表す。)
すなわち 一般式IIIの化合物は、上記一般式IIで表される糖供与体と一般式V:
HO-(CH2)n-X ・・・IV
(式中のX、nは前記式IIIの定義と同様。)で表されるω−ハロゲン化またはω−スルホニルオキシ化1-アルカノールとの縮合反応(グリコシル化)により得られる。
また、ω−スルホニルオキシ化1-アルカノールは1,ω−アルカンジオールのモノスルホニル化により容易に調製される。スルホニル化剤としては塩化p−トルエンスルホニル、塩化メタンスルホニル等が用いられる。
アルコール類のグリコシル化に関しては多様な方法が提案され、実施されている(Chem. Rev., 1993, vol.93, p.1503-1531、第4版実験化学講座26・有機合成VIII, p.267-354, 日本化学会編, 丸善1992)。
(式中、R4は、少なくとも糖類のアノマー位を置換する置換基であって、アシルオキシ
基、ハロゲン原子、アルキルチオ基、アリールチオ基、N−置換カルバモイル基を表す。)
上記一般式Vの化合物を例示すると、糖類のアノマー位(C1位)が、−OCOCH3基等により置換されたO-アシル体(−OCOCH3基等)、ハロゲン化体 Br, Cl等のハロゲン原子により置換されたハロゲン化体、−SMe基, −SEt基, −SPh基等により置換されたアルキルまたはアリールチオ体、あるいは−OC(=NH)CCl3基等により置換されたイミデート体(−OC(=NH)CCl3等)などが用いられる。これらのうち、アセチル化体は無保護の糖類を全アセチル化することにより1工程で調製できるので最も簡便である。ハロゲン化体、チオ体、イミデート体は一般にアセチル化体から文献記載の方法によりそれぞれ調製する。
糖類のアノマー位(C1位)は一般にグリコシル化により不斉炭素になり、2つの立体異性体(α-及びβ−アノマー)が生成し得る。隣接するC2位の水酸基をアセチル基のようなアシル基で保護するとC1位と2位がtrans配置の異性体が主に生成する。すなわち、例えば、グルコース及びガラクトースにおいてはβ-アノマーが、マンノースにおいてはα−アノマーが優先する。
IV)のアセチル化体が相当量副成した。溶媒としては塩化メチレン、ジクロロエタンなどのハロゲン化炭化水素が好適である。反応は-30〜+50℃が好ましいが、室温以上で反応させるとアノマー位が異性化し、末端がグルコース及びガラクトースの場合はα-グリコシドの割合が増加する傾向が見られた。単糖類のグルコース場合はα-アノマーとβ-アノマーを分離できるが、二糖以上の場合、分離は困難なので、β-アノマーを選択的に得るためには反応を5℃以下で行うことが望ましい。四塩化スズを用いると糖のC1位塩化物(一般式化合物VにおいてR4 = Cl)が相当量生成し、低温では蓄積する傾向がみられた。このような場合は反応液中に銀塩を加えれば塩化物とアルコール類との反応が進行する。銀塩としてはトリフルオロメタンスルホン酸銀、過塩素酸銀、炭酸銀が好適で、0.2〜1.0当量程度で十分である。
次に、式IIIの化合物から以下の一般式VI:
(式中の[G]、O、n、mは一般式IIIの定義と同様であり、R5はアルキル基を表す。)で表されるチオアセチル体へ変換する。反応は溶媒中、化合物IIIに対し1〜10当量のチオ酢酸等のカルボチオ酸アルカリ金属塩を作用させて行う。化合物III中のXが塩素原子で反応の進行が遅い場合は触媒量のヨウ化または臭化4級アンモニウム塩を加えてもよい。Xが臭素原子の場合、例えば、チオ酢酸カリウムまたはナトリウムの使用量は1.5〜3当量が好適である。溶媒は試薬を溶かすことのできる非プロトン性極性溶媒が好ましく、特に好ましいのはジメチルホルムアミドである。反応温度は-20〜+100℃、好ましくは室温〜50℃で、数分間から数時間で行うことができる。
最後の工程として、化合物VI中の全ての保護基を除去する。保護基がアセチル基のようなアシル基の場合、反応は通常の脱アシル化法、すなわち、低級アルコール中、アルカリ金属アルコキシドを作用させることにより行う。化合物IVのアルキル鎖が長く低級アルコールに溶けにくい場合は、塩化メチレン、テトラヒドロフラン等の金属アルコキシドと反応しない有機溶剤を加える。アルカリ金属アルコキシドの使用量は化合物IVに対し0.1〜5.0当量、特に1〜2当量が好適である。反応は-20〜+50℃、好ましくは0℃〜室温で、数十分間から十数時間で行うことができる。反応後は酢酸等の酸を加えて中和し、反応液を濃縮後、シリカゲルクロマトグラフィーによる精製を行うことにより、純粋な一般式IAの化合物を得ることができる。
〔式中〔G〕、O、n、mは、一般式IIIの定義と同様。)
上記一般式IAの化合物は、空気中で徐々に酸化され、−O−(CH2)nSH基は、一緒になって、分子内で−O−(CH2)n−S2−(CH2)−O−結合を形成し、あるいは、さらに、他の糖類誘導体化合物分子の間でジスルフィド結合を生じ、例えば、以下の一般式1A’の化合物の場合、
〔式中〕〔G〕、O、n、は一般式1Aと同様。)
下記一般式IBで表されるジスルフィドを生じる。
・・・IB
(式中の〔G〕、O、nは前記式IA’の定義と同様。)
これらのジスルフィド類もチオール類と同様に金属表面と強固な化学結合を形成し得るので、一般式化合物Iの糖類誘導体化合物と同様に利用することができる。
なお、本発明の糖類誘導体化合物のうち、上記一般式(1)、(2)および(3)の化合物はいずれも文献未記載の新規化合物である。
微粒子表面に結合させ、糖類固定金属あるいは半導体微粒子とする。
本発明の糖類固定微粒子は、糖鎖結合タンパク質等の糖類結合成分の捕捉、回収に使用できる。この場合においては捕捉対象の糖類結合成分のターゲットとなる糖類を微粒子に固定する。これにより試料溶液中の特定の糖類結合成分を捕捉できる。 例えば、特定の糖鎖結合タンパク質を捕捉するためには、該タンパク質が認識する糖鎖を合成する等して該微粒子に結合させればよい。これは、以下に説明する、本発明の糖類結合成分の検出法、濃度測定法においても同様である。また、本発明において捕捉、検出及び濃度測定対象となる糖対結合成分としては、例えば、酵素、血液凝集性タンパク質、菌体、ウイルス、リンパ球あるいは赤血球等の各種細胞膜、あるいはガン細胞等の各種細胞組織等であるが、特にこれらに限定されるものではない。
糖類結合成分を捕捉した糖類固定微粒子から糖類結合成分を回収するには、例えば、1)塩強度の高い溶液を用いて、結合成分をはずすかあるいは2)電気化学的に還元して、微粒子結合成分を遊離させることにより行う。
例えば、糖類固定金属微粒子を溶液に分散させ、ここに試料溶液を添加する。金属微粒子には予め目的とする糖類結合成分を認識する糖類を固定してあるので、糖類を認識する糖鎖結合タンパク質あるいはこれを有する細胞等が特異的に凝集する。凝集反応が起きた場合、分散金属微粒子は沈殿し、溶液の色が次第に無色化し、目的タンパク質を検出できる。また、この沈殿反応に伴い、変化する吸光度は、試料溶液中の糖類結合成分の濃度と一定の関係にあり、予め目的とする糖類結合成分の濃度と吸光度の関係を表す検量線を作成しておけば、試料溶液中の糖類固定微粒子の濃度を簡単に測定することができる。特に本発明の糖類固定微粒子を用いる吸光度の測定においては、糖類結合成分の濃度が低い場合には、ほぼ該濃度に比例して吸光度が減少するので、その濃度測定は極めて簡便、正確に行い得る。さらに、この糖類固定微粒子と糖類結合成分との反応は、例えば微粒子を金または銀等の金属基板上に分散させておき、表面プラズモン共鳴センサー(SPRセンサー)にて表面の屈折率の変化を追跡する方法でも検出可能であり、この方法によっても、試料溶液中の目的とする糖類固定成分の有無を検出可能である。 上記基板としては、金属の他にガラス基板、あるいは光ファイバー等の断面も使用しうる。
次に、実施例により本発明をさらに詳細に説明する。
(12-メルカプトドデシル β-D-マルトシド(化合物Ia)の合成)
合成スキーム(3工程)
アルゴン雰囲気下、β-D-マルトース・オクタアセテート(IIa)410 mg (0.60 mmol)を塩化メチレン5 mlに溶解させ、四塩化スズの1.0 M ヘプタン溶液0.6 ml(0.60 mmol)を5分間かけて滴下した。15分後に反応容器を-10℃に冷却し、12-ブロモ-1-ドデカノール 175 mg(0.66 mmol)(化合物Va)の塩化メチレン溶液1 mlを5分間かけて加え、-10℃から+5℃で1時間攪拌後、室温下1時間攪拌した。反応液を再び約5℃に冷却後、トリフルオロメタンスルホン酸銀 80 mg(0.30 mmol)を加え1時間攪拌した。反応液を酢酸エチル20 mlで希釈し、炭酸水素ナトリウム水溶液10 mlを加えてしばらく攪拌した後、層を分離した。有機層を飽和食塩水で洗浄した後、水層をまとめて酢酸エチルで2回抽出した。有機層をまとめて無水硫酸ナトリウムを加えて乾燥し、濾過・濃縮乾固を行うと淡黄色オイルが約700 mg残った。これをシリカゲルクロマトグラフィー(ヘキサン/酢酸エチル=2:1→1.5:1)で精製することにより化合物IIIaを無色固体として175 mg (収率33%)得た。
1H-NMR(270 MHz, CDCl3):δ (ppm) 1.26 (14H, s), 1.41 (2H, m), 1.55 (2H, m), 1.85 (2H, quint, J = 7.0Hz), 2.00 (6H, s), 2.01 (3H, s), 2.03 (3H, s), 2.05 (3H, s), 2.10 (3H, s), 2.14 (3H, s), 3.41 (2H, t, J = 6.8 Hz), 3.47 (1H, dt, J = 9.5, 6.6 Hz), 3.67 (1H, m), 3.84 (1H, dt, J = 9.8, 6.3 Hz), 3.98 (1H, m), 4.00 (1H, t, J = 9.2 Hz), 4.03 (1H, dd, J = 2.0, 12.2 Hz), 4.23 (1H, dd, J = 5.6, 12.2 Hz), 4.26 (1H, dd, J = 5.4, 12.2 Hz), 4.47 (1H, dd, J = 2.7, 12.2 Hz), 4.51 (1H, d, J = 8.1 Hz), 4.81 (1H, dd, J = 7.8, 9.5 Hz), 4.86 (1H, dd, J = 4.1, 10.5 Hz), 5.05 (1H, t, J = 9.9 Hz), 5.25 (1H, t, J = 9.2 Hz), 5.36 (1H, dd, J = 9.8, 10.5 Hz), 5.42 (1H, d, J = 3.9 Hz).
13C-NMR (CDCl3) 20.51, 20.54, 20.56, 20.61, 20.8, 20.9, 25.7, 28.1, 28.7, 29.2, 29.30, 29.34, 29.42, 29.45, 29.48, 32.8, 34.0, 61.5, 62.8, 68.0, 68.4, 69.9, 70.1, 72.0, 72.2, 72.7, 75.4, 95.4, 100.2, 169.3, 169.5, 169.9, 170.2, 170.4, 170.5.
窒素雰囲気下、化合物IIIa180 mg (0.2 mmol)とチオ酢酸カリウム70 mg(0.6 mmol)をジメチルホルムアミド1.5 mlに溶かし、室温下2時間攪拌した。反応液を酢酸エチル10 mlで希釈し、水10 mlを加えてしばらく攪拌した後、層を分離した。有機層を飽和食塩水で洗浄した後、水層をまとめて酢酸エチルで2回抽出した。有機層をまとめて無水硫酸ナトリウムを加えて乾燥し、濾過・濃縮乾固を行うと黄色オイルが残った。これをシリカゲルクロマトグラフィー(ヘキサン/酢酸エチル=3:2)で精製することにより化合物VIaを無色固体として170 mg (収率95%)得た。
1H-NMR(270 MHz, CDCl3):δ (ppm) 1.25 (16H, s), 1.55 (4H, m), 2.01 (6H, s), 2.02 (3H, s), 2.03 (3H, s), 2.05 (3H, s), 2.11 (3H, s), 2.15 (3H, s), 2.32 (3H, s), 2.86 (2H, t, J = 7.2 Hz), 3.47 (1H, dt, J = 9.5, 6.7 Hz), 3.68 (1H, m), 3.85 (1H, dt, J = 9.5, 6.2 Hz), 3.98 (1H, m), 4.00 (1H, t, J = 9.2 Hz), 4.03 (1H, m), 4.23 (2H, m), 4.47 (1H, dd, J = 2.7, 12.2 Hz), 4.51 (1H, d, J = 8.1 Hz), 4.81 (1H, dd, J = 8.1, 9.3 Hz), 4.86 (1H, dd, J = 3.9, 10.5 Hz), 5.05 (1H, t, J = 9.8 Hz), 5.25 (1H, t, J = 9.2 Hz), 5.36 (1H, t, J = 10.0 Hz), 5.42 (1H, d, J = 3.9 Hz).
13C-NMR (CDCl3) 20.52, 20.55, 20.57, 20.63, 20.8, 20.9, 25.7, 28.7, 29.0, 29.1, 29.2, 29.3, 29.38, 29.43, 29.48, 30.6, 61.4, 62.8, 68.0, 68.4, 69.3, 69.9, 70.2, 72.0, 72.2, 72.7, 75.4, 95.4, 100.2, 169.4, 169.5, 169.9, 170.2, 170.4, 170.5, 196.0.
元素分析値(C40H62O19Sとして)
実測値(%):C 54.73; H 7.00; S 3.56
計算値(%):C 54.66; H 7.11; S 3.65
化合物VIa 142 mg(0.16 mmol)をメタノール2ml及び塩化メチレン2mlに溶かして冷却し、ナトリウムメトキシドの3%メタノール溶液0.5 ml(0.25 mmol)を加え、5〜10℃で3時間攪拌した。この溶液に酢酸50 mgを加えて中和後、濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー(塩化メチレン/メタノール=5:1→4:1)で精製することにより化合物Iaを無色固体として73 mg (収率84%)得た。
1H-NMR(270 MHz, CDCl3-CD3OD):δ (ppm) 1.27 (14H, s), 1.37 (2H, m), 1.58 (4H, m), 2.52 (2H, t, J = 7.2 Hz), 3.34 (4H, m), 3.50 (2H, m), 3.65 (4H, m), 3.85 (4H, m), 4.28 (1H, d, J = 7.8 Hz), 5.14 (1H, d, J = 3.2 Hz).
13C-NMR (CDCl3-CD3OD) 24.6, 26.0, 28.5, 29.2, 29.6, 29.7, 34.1, 61.0, 61.7, 70.1, 70.5, 72.6, 73.2, 73.3, 73.8, 75.1, 76.2, 80.1, 101.5, 102.7.
m/z (CI): C24H46O11S M+としての計算値:542.2761, 実測値:542.2774
[a]D +44.2°(c 1.3, CHCl3-CH3OH)
8-メルカプトオクチル β-D-マルトシド(化合物Ib)の合成
合成スキーム
アルコールとして8-ブロモ-1-オクタノール(化合物Vb)を用いて実施例1の(1)とほぼ同様に合成したが、反応温度は0〜5℃において行った。無色油状物。収率28%。
1H-NMR(270 MHz, CDCl3):δ(ppm) 1.30 (6H, s-like), 1.42 (2H, m), 1.55 (2H, m), 1.84 (2H, quint, J = 7.0Hz), 2.00 (6H, s), 2.02 (3H, s), 2.03 (3H, s), 2.04 (3H, s), 2.10 (3H, s), 2.14 (3H, s), 3.40 (2H, t, J = 6.7 Hz), 3.47 (1H, dt, J = 9.5, 6.6 Hz), 3.67 (1H, m), 3.84 (1H, dt, J = 9.8, 6.3 Hz), 3.98 (1H, m), 4.00 (1H, t, J = 9.2 Hz), 4.04 (1H, dd, J = 2.0, 12.5 Hz), 4.23 (1H, dd, J = 4.9, 11.7 Hz), 4.26 (1H, dd, J = 4.7, 12.2 Hz), 4.47 (1H, dd, J = 2.2, 12.2 Hz), 4.51 (1H, d, J = 8.1 Hz), 4.81 (1H, dd, J = 8.1, 9.3 Hz), 4.86 (1H, dd, J = 3.9, 10.5 Hz), 5.05 (1H, t, J = 9.9 Hz), 5.25 (1H, t, J = 9.0 Hz), 5.36 (1H, t, J = 10.3 Hz), 5.41 (1H, d, J = 3.9 Hz).
13C-NMR (CDCl3) 20.51, 20.55, 20.58, 20.62, 20.8, 20.9, 25.6, 28.0, 28.6, 29.0, 29.3, 32.7, 33.9, 61.5, 62.8, 68.0, 68.4, 69.3, 69.9, 70.1, 72.0, 72.2, 72.7, 75.4, 95.5, 100.2, 169.4, 169.5, 169.9, 170.2, 170.4, 170.5
化合物IIIbから実施例1の(2)と同様に合成した。
無色油状物。収率96%
[a]D +51.4°(c 2.0, CHCl3)
13C-NMR (CDCl3) 20.52, 20.55, 20.58, 20.63, 20.8, 20.9, 25.7, 28.6, 28.96, 29.04, 29.3, 29.4, 30.6, 61.4, 62.8, 68.0, 68.4, 69.3, 69.9, 70.1, 72.0, 72.2, 72.7, 75.4, 95.5, 100.2, 169.4, 169.5, 169.9, 170.2, 170.4, 170.5, 196.0.
化合物VIbから実施例1の(3)と同様に合成した。
無色固体。収率82%
[a]D +60.8°(c 0.72, CHCl3-CH3OH)
13C-NMR (CDCl3-CD3OD) 24.3, 24.4, 25.7, 28.1, 28.9, 29.2, 29.4, 33.8, 60.8, 61.0, 69.4, 70.2, 72.2, 72.9, 73.0, 73.4, 74.7, 76.0, 79.3, 101.3, 102.6.
(糖鎖固定金微粒子によるレクチンの検出1)
1%の塩化金酸0.5 mlを100mlの水に溶解させ、激しく撹拌の後、1%のクエン酸ナトリウム0.275 mlを加え、混合物に0.75 mlの0.075%の水素化ホウ素ナトリウム/1%クエン酸ナトリウムを加えて5分撹拌し4度に保存し、直径約4nmの金微粒子分散溶液を調整した。金微粒子分散溶液(約0.25 nM)に、実施例1で得られた12-メルカプトドデシル-β-マルトシド溶液(終濃度約10μM)を加え微粒子表面に糖鎖部位を固定した。図1に糖鎖で修飾した金微粒子の透過電子顕微鏡(TEM)像を示す。また、図2(a)は表面未修飾金微粒子、(b)は糖鎖修飾金微粒子の吸光スペクトルである。表面を修飾することにより光学的性質が変化し、吸収ピークが20nm程度高波長側にシフトした。
(糖鎖固定金微粒子によるレクチンの検出2)
実施例1で示したものと同様の糖鎖修飾金微粒子に対し、Con Aを(終濃度0.6 μM)注入したところ、直ちに凝集が起こった。沈殿が完全に生成した後(2時間後)、吸光度を測定した。図3は糖鎖修飾金微粒子(●)および糖鎖修飾金微粒子溶液にCon Aを添加したもの(◇)それぞれの吸光スペクトルである。糖鎖修飾金微粒子溶液にCon Aを添加した場合、Con A添加と同時に凝集が起こり、次第に沈殿し、最終的(本例では2時間後)には完全に530 nm付近の吸光度が消失していることが確認できる。これらは当然ながら目視でも確認できる。
未修飾金微粒子溶液に対してCon A溶液を添加した場合や、Con A以外のレクチン(マルトシドに対して親和性の無いレクチン)を添加した場合はこのような無色化現象は全く観察されなかった。
(糖鎖固定金微粒子によるレクチン検出3)
図4は、実施例1と同様の内容で調整した糖鎖修飾金微粒子溶液に対し、最終濃度1.3μM となるようにCon A溶液を添加し、添加と同時に波長536nmでの吸光度を測定した結果である。Con A溶液の添加と同時に微粒子は凝集し、懸濁が起こった。536nmでの吸光度はCon A溶液添加後、約20分後に減少しはじめた。
〔実施例6〕
図5は、実施例1と同様の内容で調整した糖鎖修飾金微粒子溶液に対し、各種濃度のCon A溶液を添加し、添加直後に懸濁状態で波長536 nmでの吸光度を測定し、Con A濃度(添加後最終濃度)に対してプロットした図である。挿入図は低濃度領域の結果である。低濃度領域(1.5μM)ではCon Aの濃度と吸光度の間に直線関係が成り立っている。この手法によるCon Aの定量限界は7.8 nM、検出飽和濃度は5 μMである。
〔実施例7〕
清浄化した金基板(金微粒子で修飾したガラス基板)表面に、12-メルカプトドデシル-β-マルトシド溶液20 μl(添加後の最終濃度40 μM、10 mMリン酸緩衝液(pH 7.65)80μl)を加えてSPR角の変化を追跡したところ、図6破線に示すようにSPR角が変化し、金表面に糖鎖誘導体が吸着していることが確認できた。この表面をリン酸緩衝液で十分に洗浄したが、SPR角の変化がみられず、糖鎖誘導体が金表面に安定に吸着されていることが確認できた。さらにこの表面に Con A 溶液を注入したところ(最終濃度20μM)、図6点線に示すように非常に大きな角度変化が確認できた。本結果は、SPRセンサーにより特定レクチンの検出が可能であることを示している。
Claims (13)
- 単糖類若しくは2糖以上の糖類部分を含み、かつ含硫黄官能基を有する糖類誘導体化合物を金属または半導体微粒子表面に結合させた糖類固定微粒子であって、金属又は半導体微粒子の直径が5〜20nmであり、糖類誘導体が糖類誘導体化合物が以下の一般式Iで表される化合物であることを特徴とする、糖類固定微粒子。
- 金属が、金、白金、銀及び銅から選ばれたものであり、半導体が硫化カドミウム、酸化チタン、酸化亜鉛、酸化モリブデンである、請求項1に記載の糖類固定微粒子。
- 糖類誘導体化合物が以下の一般式IA’で表される化合物であることを特徴とする、請求項1又は2に記載の糖類固定微粒子。
- 糖類誘導体化合物が以下の一般式IBで表される化合物であることを特徴とする、請求項4に記載の糖類固定微粒子。
- 糖類誘導体化合物が以下の一般式(1)で表される化合物であることを特徴とする、請求項3に記載の糖類固定微粒子。
- 請求項1〜5のいずれか記載の糖類固定微粒子を試料溶液と接触させ、糖類固定微粒子と糖類結合成分を結合させることにより、該成分を捕捉することを特徴とする糖類結合成分の捕捉方法。
- 糖類結合成分が、糖類結合タンパク質である請求項6に記載の方法。
- 糖類結合成分が、酵素、血液凝集活性タンパク質、菌体、細胞、細胞膜、ウイルス、がん細胞の各種細胞組織であることを特徴とする請求項7に記載の方法。
- 請求項1〜5のいずれかに記載の糖類固定微粒子の分散液中に試料溶液を注入し、該微粒子表面に固定された糖類に特異的な結合をする糖類結合成分が試料溶液中に存在する場合において変化する糖類固定微粒子の光学的性質を指標にして、糖類結合成分の有無の検出、および/またはその濃度を測定することを特徴とする、糖類結合物質の分析方法。
- 請求項1〜5のいずれかに記載の糖類固定微粒子の分散液中に試料溶液を注入し、該微粒子表面に固定された糖類に特異的な結合をする糖類結合成分が試料溶液中に存在する場合において沈殿する、糖類固定微粒子の溶液分散状態を指標にして、糖類結合成分の有無,および/またはその濃度を測定することを特徴とする、糖類結合成分の分析方法。
- 以下の一般式(1)で表される化合物。
- 以下の一般式(2)で表される化合物。
- 以下の一般式(3)で表される化合物。
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