JP3994461B2 - ヒドロキシアルキルピリジン誘導体 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ（以下ＮＡＧと略記する。）、Ｎ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトサミニダーゼ、Ｎ−アセチル−β−Ｄ−ヘキソサミニダーゼ等の活性測定用基質として有用な新規なヒドロキシアルキルピリジン誘導体及びそれを用いたＮＡＧ活性測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＮＡＧは、種々の細胞のリソソーム内に存在する糖質分解酵素の１つであり、特に腎の近位尿細管上皮細胞に多く含まれ、腎尿細管の障害により尿中へ放出される事から、尿中のその活性は腎疾患の重要な指標となっている。尿中ＮＡＧ活性は、急性腎不全、慢性腎不全、ネフローゼ症候群、糸球体腎炎、更に糖尿病性腎症や薬剤による腎障害により上昇する事が知られており、これら腎疾患の早期診断指標となる。また、腎移植後の拒絶反応の早期診断の指標としても、尿中ＮＡＧ活性は重要な役割を果たしている。即ち、ＮＡＧ活性を測定することには、臨床的見地から極めて重要な意義がある。
【０００３】
従来、ＮＡＧ活性測定法として様々な方法が開発されているが、基本的にはＮＡＧの作用により遊離する化合物を蛍光検出計、或いは紫外−可視吸光度計を用いて検出し、これに基づいてＮＡＧ活性を求める方法が一般に採用されている。現在の臨床検査分野に於ける測定法は、合成基質を用いた初速度測定法が主流となっている。
【０００４】
以下に、従来のＮＡＧ活性測定方法の代表的な例を挙げる。
▲１▼４−メチルウンベリフェリル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニドを基質として、ＮＡＧによる酵素反応によって遊離した４−メチルウンベリフェロンの蛍光強度を測定する方法〔特開平１−２６５８９７号公報〕。
▲２▼ｐ−ニトロフェニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニドを基質として、ＮＡＧによる酵素反応によって遊離したｐ−ニトロフェノールをアルカリ性にすることで発色させ、それを比色定量する方法〔Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，２７，１１８０（１９８１）〕。
▲３▼ソジオ−ｍ−クレゾールスルホフタレイニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニドを基質として、ＮＡＧによる酵素反応によって遊離したｍ−クレゾールスルホフタレインをアルカリ性にすることで発色させ、それを比色定量する方法〔Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，２９，１７１３（１９８３）、特公昭６３−７１９６号公報〕。
▲４▼ソジオ−３，３’−ジクロロフェノールスルホフタレイニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニドを基質として、ＮＡＧによる酵素反応によって遊離したクロロフェノールレッドを直接比色定量する方法〔特開昭６３−３０９１９９号公報〕。
▲５▼２−クロロ−４−ニトロフェニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニドを基質として、ＮＡＧによる酵素反応によって遊離した２−クロロ−４−ニトロフェノールを直接比色定量する方法〔特開昭６２−４８３９９号公報等〕。
▲６▼２−フルオロ−４−ニトロフェニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニドを基質として、ＮＡＧによる酵素反応によって遊離した２−フルオロ−４−ニトロフェノールを直接比色定量する方法〔特公平５−７３３９８号公報、特公平５−５５５１７号公報等〕。
▲７▼ｐ−ニトロフェニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニドを基質として、ＮＡＧによる酵素反応によって遊離したＮ−アセチルグルコサミンに、酸化酵素（Ｎ−アセチルグルコサミンオキシダーゼ：ＮＡＧＯＤ）を作用させ、発生する過酸化水素をパーオキシダーゼ（ＰＯＤ）存在下で発色剤と反応させ比色定量する方法〔機器・試薬，１３，８８７（１９９０）〕。
▲８▼６−メチル−２−ピリジル−Ｎ−アセチル−１−チオ−β−Ｄ−グルコサミニド（６−ＭＰＴ−ＮＡＧＳ）を基質として、ＮＡＧによる酵素反応によって遊離する６−メチル−２−ピリジンチオールを特定波長に於けるその吸光度を求めることにより定量する方法〔特開平５−５９０８３号公報〕
【０００５】
しかしながら、これらの方法は各々に基質の水溶性、測定感度、溶液の安定性等の面で多くの問題を抱えている。
即ち、例えば上述した測定方法のうち、▲１▼の測定法では蛍光強度計の様な特殊な測定装置を必要とするという問題点を有している。
▲２▼及び▲３▼の測定法は、酵素反応により遊離する色原体のｐＫａが高く、ＮＡＧの至適ｐＨでは比色定量を行うに足る測定感度が得られないため、反応停止後アルカリ性として比色定量を行わなければならず、現在主流を占めているレートアッセイには使用できない。即ち、迅速な多数検体処理には不向きな測定法である。
【０００６】
そこでレートアッセイに適用可能な測定法として、色原体部分のｐＫａを低下させた基質を用いた▲４▼、▲５▼及び▲６▼の測定法も開発されているが、これらは、ＮＡＧの至適ｐＨである４.５〜５.０において、酵素反応により生成した色原体の解離（即ち、発色）が不十分であるため、溶液中の僅かなｐＨ変動によっても吸光度が変動し、測定誤差を生じやすく、しかも基質溶解後の液状での長期安定性が悪いという問題点を有している。
【０００７】
また、▲２▼、▲５▼及び▲６▼の測定法では、遊離する色原体の極大吸収波長が４００ｎｍ前後であるため、ビリルビン等生体成分の影響を受けやすいという問題点も有している。 ▲７▼に示される測定法はレートアッセイに適用可能であるが、酸化酵素を使用して過酸化水素を発生させる測定系であるため、生体成分に含まれるビリルビン等の還元性物質やその他の共存物質の影響を受けやすく、また、上記▲４▼、▲５▼及び▲６▼の基質と同様、基質の溶解後の安定性が悪いという問題点を有している。
【０００８】
一方、これらの問題点を解決すべく▲８▼の測定法が開発されたが、この方法で用いられる基質の安定性は、短期的には向上しているもの、基質溶解後の長期安定性を考慮した場合、酸性からアルカリ性の領域で分解する傾向がみられるため、必ずしも満足できるものではなかった。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記した如き状況に鑑みなされたもので、感度及び安定性に優れたＮＡＧ活性測定用基質として有用なヒドロキシアルキルピリジン誘導体とこれを基質として用いたＮＡＧ活性測定方法及びそのための試薬を提供することを目的とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明は、一般式［１］
【００１１】
【化２】
【００１２】
（式中、Ｇは還元性末端でβ結合している、アミノ基にアシル基が結合しているヘキソサミン残基を表し、Ｒはヒドロキシアルキル基を表す。）で示されるヒドロキシアルキルピリジン誘導体、及びこの誘導体を基質として用いることを特徴とするＮＡＧ活性測定方法、の発明である。
即ち本発明者等は、ＮＡＧ活性測定に於いて有効に使用し得る合成基質について鋭意研究を重ねた結果、一般式［１］で示されるヒドロキシアルキルピリジン誘導体を基質として用いれば、上記した如き問題点を解決できることを見出し、本発明を完成するに到った。
【００１３】
一般式［１］に於いて、Ｇで示される、アミノ基にアシル基が結合しているヘキソサミン残基に於けるアシル基としては、脂肪族カルボン酸由来、脂肪族ヒドロキシカルボン酸由来、脂肪族アミノカルボン酸由来、芳香族カルボン酸由来等のアシル基が挙げられる。ここで脂肪族カルボン酸としては、例えば炭素数が２〜８、好ましくは炭素数２〜４のものが挙げられ、具体的には例えば酢酸，プロピオン酸，酪酸，イソ酪酸等が挙げられる。脂肪族ヒドロキシカルボン酸としては、水酸基を有しているカルボン酸であれば何れのものでも良いが、好ましくは例えば炭素数１〜７、より好ましくは炭素数１〜４のヒドロキシアルキル基を有するカルボン酸が挙げられ、具体的には例えばヒドロキシメチル基，ヒドロキシエチル基，ヒドロキシプロピル基，ヒドロキシブチル基等を有するカルボン酸が挙げられる。また、脂肪族アミノカルボン酸としては、アミノ基を有しているカルボン酸であれば如何なるものでも良いが、好ましくは所謂アミノ酸が挙げられ、より好ましくは例えばメチオニン，ロイシン，グリシン，アラニン等の必須アミノ酸が挙げられる。更に、芳香族カルボン酸としては、例えば安息香酸等が挙げられる。
【００１４】
Ｇで示される、アミノ基にアシル基が結合しているヘキソサミン残基に於けるヘキソサミン残基としては、例えばグルコサミン残基，ガラクトサミン残基等が挙げられる。アミノ基にアシル基が結合しているヘキソサミン残基の好ましい具体例としては、例えばＮ−アセチルグルコサミン，Ｎ−アセチルガラクトサミン，Ｎ−プロピオニルグルコサミン，Ｎ−プロピオニルガラクトサミン，Ｎ−ベンゾイルグルコサミン，Ｎ−ベンゾイルガラクトサミン等のＮ−アシルヘキソサミンの１位の水酸基が脱離したしたもの（残基）が挙げられる。
【００１５】
Ｒで示されるヒドロキシアルキル基としては、直鎖状でも分枝状でも何れにても良く、好ましくは炭素数１〜７、より好ましくは１〜３のヒドロキシアルキル基が挙げられ、具体的には例えばヒドロキシメチル基，１−ヒドロキシエチル基，２−ヒドロキシエチル基，１−ヒドロキシプロピル基，２−ヒドロキシプロピル基，３−ヒドロキシプロピル基，１−メチル−１−ヒドロキシエチル基，１−メチル−２−ヒドロキシエチル基等が挙げられる。
【００１６】
一般式［１］に於けるピリジン環は更に置換基を有していても良く、好ましい置換基としては、例えばハロゲン原子、アルキル基、アルコキシ基等が挙げられる。ここでハロゲン原子としては、例えば塩素，臭素，ヨウ素等が挙げられる。アルキル基としては直鎖状でも分枝状でも良く例えば炭素数１〜３のものが好ましく挙げられ、具体的には例えばメチル基，エチル基，ｎ−プロピル基，イソプロピル基等が挙げられる。アルコキシ基としては直鎖状でも分枝状でも良く例えば炭素数１〜３のものが挙げられ、具体的には、メトキシ基，エトキシ基，ｎ−プロポキシ基，イソプロポキシ基等が挙げられる。
【００１７】
本発明のヒドロキシアルキルピリジン誘導体の好ましい具体例としては、例えば以下の化合物等が挙げられる。
３−ヒドロキシメチル−２−ピリジル−Ｎ−アセチル−１−チオ−β−Ｄ−グルコサミニド，４−ヒドロキシメチル−２−ピリジル−Ｎ−アセチル−１−チオ−β−Ｄ−グルコサミニド，５−ヒドロキシメチル−２−ピリジル−Ｎ−アセチル−１−チオ−β−Ｄ−グルコサミニド，６−ヒドロキシメチル−２−ピリジル−Ｎ−アセチル−１−チオ−β−Ｄ−グルコサミニド，５−（１−ヒドロキシエチル）−２−ピリジル−Ｎ−アセチル−１−チオ−β−Ｄ−グルコサミニド，５−ヒドロキシメチル−４−メチル−２−ピリジル−Ｎ−アセチル−１−チオ−β−Ｄ−グルコサミニド，５−ヒドロキシメチル−３−メチル−２−ピリジル−Ｎ−アセチル−１−チオ−β−Ｄ−グルコサミニド及び、上記化合物のグルコサミニドをガラクトサミニドに置き換えた化合物又は／及びアミノ基に結合しているアセチル基を例えばプロピオニル基，ブチリル基，ベンゾイル基，メチオニン残基，ロイシン残基，アラニン残基，グリシン残基等に置き換えた化合物等が挙げられる。
【００１８】
本発明のヒドロキシアルキルピリジン誘導体は、水に２００ｍＭ以上溶解する為、ＮＡＧ活性測定用基質として十分な水溶性を有している。
また、水溶液とした場合、広いｐＨ範囲、例えばｐＨ４.５〜ｐＨ１０の範囲で長期間安定であり、特にｐＨ７〜ｐＨ１０の範囲では長期間極めて安定に存在し得る。
更にこの誘導体は、３２０ｎｍ以上に吸収波長が無いため、この誘導体から遊離するヒドロキシアルキルピリジンチオール誘導体（極大吸収波長：３２０〜３６０ｎｍ）に由来する吸光度変化測定に影響を与えないという特性を有している。
尚、上記一般式［１］で示される化合物のうち、ＮＡＧ活性測定のための基質として好適なものは、ＮＡＧに対してのＫｍ値が、好ましくは０.５〜５.０ｍＭ、より好ましくは１.０〜３.５ｍＭ、更に好ましくは１.５〜１.７ｍＭ程度のものが良い。
【００１９】
本発明のヒドロキシアルキルピリジン誘導体は、一般式［２］
【００２０】
【化３】
【００２１】
（式中、Ｒはヒドロキシアルキル基を表す。）で示されるヒドロキシアルキルピリジンチオール誘導体より容易に合成することができる。即ち、一般式［２］で示される化合物と、１位にＳＨ基と反応し得る基（例えば−Ｃｌ，−Ｂｒ，−Ｉ等のハロゲンなど）を有し、アミノ基が目的物に対応するアシル基で修飾されたものであって且つ水酸基が必要に応じて保護されていても良いヘキソサミン残基、例えば２−アセタミド−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−α−Ｄ−グルコピラノシル クロリド（例えば、Ｏｒｇ．Ｓｙｎｔｈ．４６，１(１９６６)に記載の方法により合成したもの等）等とを、例えば臭化テトラ−ｎ−ブチルアンモニウム等の相間移動触媒の存在下、アルカリ水溶液と適当な有機溶剤（例えばクロロホルム，ジクロロメタン等）との混合溶媒中でグリコシル化反応させ、得られたＳ−グリコシル化体を例えばナトリウムメトキシド等の金属アルコキシドで水酸基の脱アシル化をすることにより、本発明化合物を得ることができる。又、上記のグリコシル化反応の代わりに、直接的或いは間接的な通常のグリコシド結合形成反応により本発明化合物を合成しても良い。
【００２２】
本発明のヒドロキシアルキルピリジン誘導体の合成原料である一般式［２］で示されるヒドロキシアルキルピリジンチオール誘導体は、例えば以下の方法により合成できる。
即ち、先ず、一般式［３］
【００２３】
【化４】
【００２４】
（式中、Ｒ1はカルボニル基を有する置換基を表し、ＸはＣｌ，Ｂｒ，Ｉなどのハロゲン原子を表す。）で示される化合物を、例えばＬｉＡｌＨ4又はＮａＢＨ4等の還元剤を用いる常法により還元し、２−ハロゲノ−ヒドロキシアルキルピリジン誘導体とする。
【００２５】
次に、得られた２−ハロゲノ−ヒドロキシアルキルピリジン誘導体を例えばＮａＳＨ等の一般的なチオール化剤を用いる常法により、チオール化することで一般式［２］で表されるヒドロキシアルキルピリジンチオール誘導体が得られる。一般式［１］で示される化合物を基質として、活性を測定できる酵素としては、例えばＮＡＧ，Ｎ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトサミニダーゼ，Ｎ−アセチル−β−Ｄ−ヘキソサミニダーゼ等が挙げられるが、好ましくはＮＡＧ，Ｎ−アセチル−β−Ｄ−ヘキソサミニダーゼ、更に好ましくはＮＡＧである。
【００２６】
ＮＡＧと一般式［１］で示されるヒドロキシアルキルピリジン誘導体とを反応させることで、下記一般式［２］で示されるヒドロキシアルキルピリジンチオール誘導体が遊離する。
一般式［２］
【００２７】
【化５】
【００２８】
（式中、Ｒは前記に同じ。）
ＮＡＧなどの酵素反応によって本発明のヒドロキシアルキルピリジン誘導体から遊離するヒドロキシアルキルピリジンチオール誘導体は、３２０ｎｍ〜３６０ｎｍに極大吸収を示すため、生体成分中の例えばビリルビンやヘモグロビン等の影響を受けない紫外領域（３２０ｎｍ〜３８０ｎｍ）での測定が可能である。特にピリジン環の３位或いは４位にヒドロキシアルキル基が置換した例えば３−ヒドロキシメチル−２−ピリジンチオール（極大吸収波長３４１ｎｍ）や４−ヒドロキメチル−２−ピリジンチオール（極大吸収波長３３９ｎｍ）等は、極大吸収波長が現在臨床検査分野で主流となっている自動分析機の設定波長（３４０ｎｍ）とほぼ同じであるため測定波長を極大吸収波長のピークに設定できる。即ち本発明のヒドロキシアルキル誘導体をＮＡＧ等の活性測定用基質として用いれば、ＮＡＧ等の活性の測定に於ける分析機種間や測定条件により生じる測定値の誤差やばらつきを極力押さえることができる。
【００２９】
本発明の化合物であるヒドロキシアルキルピリジン誘導体は、全ｐＨ領域に於いて試薬ブランク上昇が低く、特にｐＨ７以上の溶液中で保存すれば少なくとも３カ月以上の長期に渡って試薬ブランクの上昇が抑えられることから、ＮＡＧ活性測定用基質として非常に有用である。又、二液法によるＮＡＧ活性測定用試薬に本発明のヒドロキシアルキルピリジン誘導体を基質として用いれば、特にその溶液状態での保存性が増すので望ましい。
【００３０】
一般式［１］で示されるヒドロキシアルキルピリジン誘導体を用いた本発明のＮＡＧ活性測定法は、基質として一般式［１］で示されるヒドロキシアルキルピリジン誘導体を用いる以外、自体公知の初速度法に準じて測定を行えば足りる。
具体的には、例えば以下の方法が挙げられる。
【００３１】
(ｉ)方法１
例えば、血清、血液、尿等の生体由来試料と、予め２０〜５０℃、好ましくは３０〜４０℃でインキュベートした、一般式［１］で示されるヒドロキシアルキルピリジン誘導体と適当な緩衝剤とを含有した試薬溶液（ｐＨは通常３.０〜７.０、好ましくは４.０〜６.５）とを２０〜５０℃、好ましくは３０〜４０℃で反応させる。ＮＡＧの作用により生成するヒドロキシアルキルピリジンチオール誘導体の増加量を、例えば分光光度計等の適当な測定装置を用いて３２０〜３８０ｎｍに於ける単位時間当たりの吸光度変化量として測定する。得られた吸光度変化量をヒドロキシアルキルピリジンチオール誘導体の分子吸光係数を用いて単位換算することで、試料中のＮＡＧ活性を求めることができる。
尚、ここで用いられる試料溶液は一般式［１］で示されるヒドロキシアルキルピリジン誘導体と適当な緩衝剤とを含有するｐＨ７〜１１好ましくはｐＨ７〜９の試薬溶液と適当な緩衝剤を含有した試薬溶液（ｐＨは通常３.０〜７.０、好ましくは４.０〜６.５程度）とを混合して調製されたものでも良い。
【００３２】
(ｉｉ)方法２
生体由来試料と、適当な緩衝剤を含有する第一試薬溶液（ｐＨは通常３.０〜７.０、好ましくは４.０〜６.５程度）とを混合し、２０〜５０℃、好ましくは３０〜４０℃で適当な時間インキュベートした後、これと予め２０〜５０℃好ましくは３０〜４０℃でインキュベートした、一般式［１］で示されるヒドロキシアルキルピリジン誘導体と適当な緩衝剤を含有する第２試薬溶液とを混合し、２０〜５０℃、好ましくは３０〜４０℃で反応させる。ＮＡＧの作用により生成するヒドロキシアルキルピリジンチオール誘導体の増加量を、例えば分光光度計等の適当な測定装置を用いて３２０〜３８０ｎｍにおける単位時間当たりの吸光度変化量として測定する。得られた吸光度変化量をヒドロキシアルキルピリジンチオール誘導体の分子吸光係数を用いて単位換算することで試料中のＮＡＧ活性を求めることができる。
【００３３】
尚、上記の方法に於いて、第２試薬溶液のｐＨ及び緩衝剤の濃度は、第１試薬溶液と混合した場合のｐＨが３.０〜７.０好ましくは４.０〜６.５となるように設定されていれば良く、特に限定されないが、本発明のヒドロキシアルキルピリジン誘導体の水溶液中の安定性を考慮すれば、そのｐＨは７〜１１、好ましくは７〜９の範囲で設定しておくことが望ましい。
【００３４】
又、上記(ｉ)及び(ｉｉ)の方法に於いて、基質として用いられる本発明のヒドロキシアルキルピリジン誘導体の使用濃度としては、ＮＡＧの活性測定を実施し得る濃度であれば良く、特に限定されないが、ＮＡＧとの反応時の濃度として０.１〜５００ｍＭ、好ましくは１〜５０ｍＭの範囲から適宜選択すれば良い。
【００３５】
上記(ｉ)及び(ｉｉ)の方法における試薬溶液に用いられる緩衝剤としては、通常この分野で用いられるものであれば特に限定されないが、例えばグッド（Ｇｏｏｄ’ｓ）緩衝剤、クエン酸塩、ほう酸塩、リン酸塩が好ましく挙げられる。また、これら緩衝剤の使用濃度としては、ＮＡＧの活性測定を実施し得る濃度であれば良く特に限定されないが、ＮＡＧ活性測定時の濃度として１〜１０００ｍＭ、好ましくは１０〜５００ｍＭの範囲から適宜選択すれば良い。また、上記(ｉ)及び(ｉｉ)で用いた試薬溶液中には、必要に応じて、通常この分野で用いられる溶解補助剤、防腐剤、安定化剤、界面活性剤等を適宜選択して含有させても良く、これらの使用量は通常この分野で用いられる範囲から適宜選択すれば良い。
【００３６】
本発明のＮＡＧ活性測定用試薬は、本発明のヒドロキシアルキルピリジン誘導体を基質として含んで成るものである。より具体的には、▲１▼ヒドロキシアルキルピリジン誘導体と緩衝剤とを含んで成る一液法用試薬、▲２▼緩衝剤を含んで成る第一試薬と、ヒドロキシアルキルピリジン誘導体と緩衝剤とを含んで成る第二試薬とを含んで成る、二液法用試薬等が挙げられる。また、これら本発明試薬の構成要素の好ましい態様と具体例は上で述べた通りである。
以下に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
【００３７】
【実施例】
実施例１
３−ヒドロキシメチル−２−ピリジル−Ｎ−アセチル−１−チオ−β−Ｄ−グルコサミニド〔ＩＵＰＡＣ名：３−ヒドロキシメチル−２−ピリジニル ２−（アセチルアミノ）−２−デオキシ−１−チオ−β−Ｄ−グルコピラノシド 以下化合物［１］と略記する。〕の合成
【００３８】
(1)２−クロロニコチン酸（和光純薬工業(株)品）１５.７６ｇ（１００ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン１５.３２ｍｌ（１１０ｍｍｏｌ）を溶解したトルエン溶液（１Ｌ）にクロロ炭酸エチル１０.５２ｍｌを加え、室温で１時間攪拌反応させた。析出した結晶を濾去し、トルエンを減圧留去して得られた褐色オイルをテトラヒドロフランに溶解し、これを予めテトラヒドロフランに水素化リチウムアルミニウム４.１７ｇ（１１０ｍｍｏｌ）を加え窒素置換し−７８℃に冷却しておいた溶液に滴下した。滴下後同温度で２時間攪拌反応させ、水（３０ｍｌ）で反応を停止させた後室温とし、１Ｎ−ＮａＯＨ（２００ｍｌ）を加え、ジエチルエーテルで抽出処理を行った。抽出液から溶媒を減圧留去し得られた褐色オイルをヘキサンから結晶化することにより、２−クロロ−３−ヒドロキシメチルピリジン１１.９１ｇ（収率７５％）を得た。
融点：５８〜５９℃。
元素分析値 Ｃ6Ｈ6ＣｌＮＯ
実測値（％）； Ｃ：５０.２４，Ｈ：４.１１，Ｎ：９.７４。
計算値（％）； Ｃ：５０.１９，Ｈ：４.２１，Ｎ：９.７６。
【００３９】
(2)(1)で得られた２−クロロ−３−ヒドロキシメチルピリジン８.６１ｇ（６０ｍｍｏｌ）と硫化水素ナトリウム３.３６ｇ（６０ｍｍｏｌ）とを１−メチル−２−ピロリドン中に加え１４０℃で２時間攪拌反応させた。攪拌後溶媒を減圧留去し、水（２００ｍｌ）を加え、酢酸でｐＨ４.０とした後、クロロホルムにより抽出処理を行った。抽出液から溶媒を減圧留去後、残渣をエタノールで再結晶し、黄色針状晶の３−ヒドロキシメチル−２−ピリジンチオール６.４ｇ（収率６７％）を得た。
融点：１７４〜１７５℃。
元素分析値 Ｃ6Ｈ7ＮＯＳ
実測値（％）； Ｃ：５１.１４，Ｈ：４.９７，Ｎ：９.９８。
計算値（％）； Ｃ：５１.０４，Ｈ：５.００，Ｎ：９.９２。
【００４０】
(3)(2)で得られた３−ヒドロキシメチル−２−ピリジンチオール４.２４ｇ（３０ｍｍｏｌ）、１−クロロ−１−デオキシ−２，３，４，６−テトラアセチル−α−Ｄ−グルコサミン１０.９７ｇ（３０ｍｍｏｌ）及びテトラ−ｎ−ブチルアンモニウムブロミド９.６７ｇ（３０ｍｍｏｌ）を１Ｎ−ＮａＯＨ５０ｍｌとジクロロメタン５０ｍｌとの混合溶媒中、室温で１時間攪拌反応させた。反応終了後反応液に水１００ｍｌとジクロロメタン１００ｍｌを加えて攪拌分液し、有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥後溶媒を減圧留去した。得られた淡黄色の結晶をエタノールで再結晶することにより白色綿状結晶の３−ヒドロキシメチル−２−ピリジル−２，３，４，６−テトラアセチル−１−チオ−β−Ｄ−グルコサミニド５.１４ｇ（収率３６.４％）を得た。
融点：１７２〜１７３℃。
元素分析値 Ｃ20Ｈ26Ｎ2Ｏ9Ｓ
実測値（％）； Ｃ：５１.１４，Ｈ：５.４４，Ｎ：５.９８。
計算値（％）； Ｃ：５１.０１，Ｈ：５.５６，Ｎ：５.９５。
【００４１】
(4)(3)で得られた３−ヒドロキシメチル−２−ピリジル−２，３，４，６−テトラアセチル−１−チオ−β−Ｄ−グルコサミニド５.１４ｇ（１１ｍｍｏｌ）にメタノール１００ｍｌを加え、同溶液にナトリウムメトキシドの２８％メタノール溶液を１０滴添加した後、室温で１時間撹拌反応させた。反応終了後、反応液を酢酸で中和し、溶媒を減圧留去した。得られた残渣を、エタノールで再結晶することにより、白色針状結晶の３−ヒドロキシメチル−２−ピリジル−Ｎ−アセチル−１−チオ−β−Ｄ−グルコサミニド３.５０ｇ（収率９３％）を得た（通算収率１７％）。
融点：１９０〜１９３℃。
元素分析値 Ｃ14Ｈ20Ｎ2Ｏ6Ｓ
実測値（％）； Ｃ：４８.８１，Ｈ：５.９７，Ｎ：８.２０。
計算値（％）； Ｃ：４８.８３，Ｈ：５.８５，Ｎ：８.１３。
ＩＲ：１６４３ｃｍ-1（Ｃ＝Ｏ）
【００４２】
実施例２
４−ヒドロキシメチル−２−ピリジル−Ｎ−アセチル−１−チオ−β−Ｄ−グルコサミニド〔ＩＵＰＡＣ名：４−ヒドロキシメチル−２−ピリジニル ２−（アセチルアミノ）−２−デオキシ−１−チオ−β−Ｄ−グルコピラノシド 以下化合物［２］と略記する。〕の合成
【００４３】
２−クロロニコチン酸１５０ｍｍｏｌの代わりに２−クロロイソニコチン酸（東京化成(株)品）２３.６３ｇ（１５０ｍｍｏｌ）を用いた以外は、実施例１と同じ試薬を用い、実施例１と同様にして反応及び後処理を行って、４−ヒドロキシメチル−２−ピリジル−Ｎ−アセチル−１−チオ−β−Ｄ−グルコサミニド１.６５ｇを得た（通算収率８％）。
融点：１９８〜１９９℃。
元素分析値 Ｃ14Ｈ20Ｎ2Ｏ6Ｓ
実測値（％）； Ｃ：４８.７７，Ｈ：５.６７，Ｎ：８.２４。
計算値（％）； Ｃ：４８.８３，Ｈ：５.８５，Ｎ：８.１３。
ＩＲ：１６４１ｃｍ-1。
【００４４】
実施例３
５−ヒドロキシメチル−２−ピリジル−Ｎ−アセチル−１−チオ−β−Ｄ−グルコサミニド〔ＩＵＰＡＣ名：５−ヒドロキシメチル−２−ピリジニル ２−（アセチルアミノ）−２−デオキシ−１−チオ−β−Ｄ−グルコピラノシド以下化合物［３］と略記する。〕の合成
【００４５】
２−クロロニコチン酸１５０ｍｍｏｌの代わりに６−クロロニコチン酸（和光純薬工業(株)品）２３.６３ｇ（１５０ｍｍｏｌ）を用いた以外は、実施例１と同じ試薬を用い、実施例１と同様にして反応及び後処理行って、５−ヒドロキシメチル−２−ピリジル−Ｎ−アセチル−１−チオ−β−Ｄ−グルコサミニド５.１５ｇを得た（通算収率２５％）。
融点：２１３〜２１４℃。
元素分析値 Ｃ14Ｈ20Ｎ2Ｏ6Ｓ
実測値（％）； Ｃ：４８.８０，Ｈ：５.７８，Ｎ：８.１７。
計算値（％）； Ｃ：４８.８３，Ｈ：５.８５，Ｎ：８.１３。
ＩＲ：１６４３ｃｍ-1。
【００４６】
実施例４
６−ヒドロキシメチル−２−ピリジル−Ｎ−アセチル−１−チオ−β−Ｄ−グルコサミニド〔ＩＵＰＡＣ名：６−ヒドロキシメチル−２−ピリジニル ２−（アセチルアミノ）−２−デオキシ−１−チオ−β−Ｄ−グルコピラノシド 以下化合物［４］と略記する。〕の合成
【００４７】
２−クロロニコチン酸１５０ｍｍｏｌの代わりに６−クロロピコリン酸（和光純薬工業(株)品）２３.６３ｇ（１５０ｍｍｏｌ）を用いた以外は、実施例１と同じ試薬を用い、実施例１と同様にして反応及び後処理を行って、６−ヒドロキシメチル−２−ピリジル−Ｎ−アセチル−１−チオ−β−Ｄ−グルコサミニド２.６８ｇを得た（通算収率１３％）。
融点：１６４〜１６５℃。
元素分析値 Ｃ14Ｈ20Ｎ2Ｏ6Ｓ
実測値（％）； Ｃ：４８.６５，Ｈ：５.８３，Ｎ：８.２４。
計算値（％）； Ｃ：４８.８３，Ｈ：５.８５，Ｎ：８.１３。
ＩＲ：１６４４ｃｍ-1（Ｃ＝Ｏ）
【００４８】
実施例５
５−（１−ヒドロキシエチル）−２−ピリジル−Ｎ−アセチル−１−チオ−β−Ｄ−グルコサミニド〔ＩＵＰＡＣ名：５−（１−ヒドロキシエチル）−２−ピリジニル ２−（アセチルアミノ）−２−デオキシ−１−チオ−β−Ｄ−グルコピラノシド 以下化合物［５］と略記する。〕の合成
【００４９】
６−クロロニコチン酸（和光純薬工業(株)品）３９.３９ｇ（２５０ｍｍｏｌ）をトルエン（０.５Ｌ）に懸濁し塩化チオニル（３６ｍｌ）とＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１ｍｌ）とを加え、室温で１８時間撹拌反応させた。次に反応溶媒を減圧留去し、残渣をクロロホルム（１.５Ｌ）に溶解後、ジエチルアミン（２５.８ｍｌ）のクロロホルム溶液（１００ｍｌ）とトリエチルアミン（７０ｍｌ）のクロロホルム溶液（１５０ｍｌ）を添加した。添加終了後室温で２時間撹拌し、反応終了後精製水（１Ｌ）を加え有機層を分液洗浄した。有機層を、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を減圧留去した。得られた粗Ｎ，Ｎ−ジエチル−６−クロロニコチンアミド（４９.１６ｇ）をテトラヒドロフラン（２Ｌ）に溶解し、窒素置換後、−７８℃でメチルリチウム（１６５ｍｌ：１.４Ｍジエチルエーテル溶液）を滴下した。滴下終了後同温度で１時間撹拌反応させ、飽和塩化アンモニウム溶液で反応を停止後室温とし、溶媒を留去した。得られた残渣に精製水（０.５Ｌ）とクロロホルム（０.５Ｌ）を加えて分液し、有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥後溶媒を留去した。得られた残渣をエタノールで再結晶することにより精製し、３−アセチル−６−クロロピリジン２４.５７ｇを得た（収率６３％）。
融点：９８〜９９℃。
元素分析値 Ｃ7Ｈ6ＣｌＮＯ
実測値（％）； Ｃ：５５.１５，Ｈ：３.８３，Ｎ：８.２４。
計算値（％）； Ｃ：５４.９１，Ｈ：３.８１，Ｎ：８.８３。
【００５０】
得られた３−アセチル−６−クロロピリジン２３.７９ｇ（１５０ｍｍｏｌ）を、テトラヒドロフランに溶解し、これを予めテトラヒドロフランに水素化リチウムアルミニウム６.２５ｇ（１６５ｍｍｏｌ）を加え窒素置換し−７８℃に冷却しておいた溶液に滴下した。滴下後同温度で２時間攪拌反応させ、水（３０ｍｌ）で反応を停止した後室温とし、１Ｎ−ＮａＯＨ（２００ｍｌ）を加え、ジエチルエーテルで抽出処理を行った。抽出液から溶媒を減圧留去し得られた褐色オイルをヘキサンから結晶化することにより、３−（１−ヒドロキシエチル）−６−クロロピリジン２０.４８ｇ（収率８５％）を得た。
次に２−クロロ−３−ヒドロキシメチルピリジン８.６１ｇ（６０ｍｍｏｌ）の代わりに、上で得られた３−（１−ヒドロキシエチル）−６−クロロピリジン２０.４８ｇ（１２７.５ｍｍｏｌ）を用いた以外は実施例１の(2)〜(3)と同じ試薬を用い、実施例１の(2)〜(3)と同様にして反応及び後処理を行って、５−（１−ヒドロキシエチル）−２−ピリジル−Ｎ−アセチル−１−チオ−β−Ｄ−グルコサミニド５.９３ｇを得た（全収率１３％）。
融点：２０１〜２０２℃。
元素分析値 Ｃ15Ｈ22Ｎ2Ｏ6Ｓ
実測値（％）； Ｃ：５０.５５，Ｈ：６.０８，Ｎ：７.６９。
計算値（％）； Ｃ：５０.２７，Ｈ：６.１９，Ｎ：７.８２。
ＩＲ：１６５１ｃｍ-1（Ｃ＝Ｏ）
【００５１】
実験例１ 本発明のヒドロキシアルキルピリジン誘導体のｐＨ安定性の検討
従来品中、水溶液状態で最も長期間安定な６−メチル−２−ピリジル−Ｎ−アセチル−１−チオ−β−Ｄ−グルコサミニド〔Ｎ−アッセイＮＡＧニットーボー（ニットーボーメディカル（株）商品名）で用いられている基質〕（以下６−ＭＰＴ−ＮＡＧＳと略記する。）と、本発明のヒドロキシアルキルピリジン誘導体のうち従来品と同じ位置に置換基を持つ６−ヒドロキシメチル−２−ピリジル−Ｎ−アセチル−１−チオ−β−Ｄ−グルコサミニド（化合物［４］）との水溶液状態での安定性をｐＨ４.５〜１０の範囲で比較した。
【００５２】
（操作法）
６−ＭＰＴ−ＮＡＧＳと化合物［４］を夫々精製水に溶解し、２０ｍＭの基質原液を調製した。同原液と、５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ４.５，５.０，５.５，６.０）、５０ｍＭ Ｎ,Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸緩衝液（ｐＨ７.０）又は５０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８.０，９.０，１０.０）とを各々１：１で混合して、各ｐＨの基質溶液を調製し、１０℃で１６日間保存した。同基質溶液について、調製直後と１６日目の３４０ｎｍのＯＤ値（吸光度）を測定した。
（結果）
各基質溶液の調製直後のＯＤ値、１６日目のＯＤ値、及び１６日目のＯＤ値から調製直後のＯＤ値を差し引いたＯＤ値変化量（ΔＯＤ値）を表１に併せて示す。
【００５３】
【表１】
【００５４】
表１の結果に基づいて作成したｐＨとΔＯＤ値の関係を表すグラフを図１に示す。尚、図中、−●−は、従来品の６−ＭＰＴ−ＮＡＧＳについて得られたグラフを、また、−◆−は化合物［４］について得られたグラフをそれぞれ示す。
表１及び図１の結果から、本発明のヒドロキシアルキルピリジン誘導体は、従来のＮＡＧの基質である６−ＭＰＴ−ＮＡＧＳに比べて、水溶液中で良好な安定性を有していることが判る。特に、ＮＡＧの至適ｐＨ付近での安定性は、従来品に比べて著しく向上しているので、本発明のヒドロキシアルキルピリジン誘導体がＮＡＧの基質として好ましいものであることが判る。
実験例２ 本発明化合物の水溶液状態での長期保存安定性の検討
従来品中、水溶液状態で最も長期間安定な６−ＭＰＴ−ＮＡＧＳと、本発明の化合物［１］〜［４］とのｐＨ８.０の溶液中で安定性を比較した。
実験例１と同様にして調製した、従来品と化合物［１］〜［４］の基質溶液（２５ｍＭ ホウ酸緩衝液、ｐＨ８.０）を１０℃で保存し、各々の調製直後、保存後８日目、保存後１６日目、保存後６０日目、保存後９０日目の３４０ｎｍのＯＤ値を測定した。
【００５５】
（結果）
結果を表２に示す。
【００５６】
【表２】
【００５７】
また、表２の結果に基づいて作成した、保存日数とＯＤ値の関係を表すグラフを図２に示す。尚、図２に於いて、−○−は従来品について得られた結果を、−◆−は化合物［１］について得られた結果を、−●−は化合物［２］について得られた結果を、−△−は化合物［３］について得られた結果を、−×−は化合物［４］について得られた結果をそれぞれ示す。
表２及び図２の結果から明らかな如く、本発明のヒドロキシアルキルピリジン誘導体は、従来品の６−ＭＰＴ−ＮＡＧＳに比較して水溶液中での長期保存安定性が著しく向上していることが判る。言い換えれば、本発明のヒドロキシアルキルピリジン誘導体は、所謂液状試薬用のＮＡＧ活性測定用基質として好適なものであることが判る。
【００５８】
実施例６ ３−ヒドロキシメチル−２−ピリジル−Ｎ−アセチル−１−チオ−β−Ｄ−グルコサミニド（化合物［１］）を基質として用いたＮ−アセチルグルコサミニダーゼ活性の測定
（検体）
ヒト胎盤由来ＮＡＧ（シグマ社品）を生理食塩水で適宜希釈して調製したもの３４検体を用いた。
（試薬）
第１試薬溶液
１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ４.４０、ａｔ２５℃）。
第２試薬溶液
化合物［１］を４１.７ｍＭ含有するホウ酸緩衝液（ｐＨ８.０）。
【００５９】
（操作法）
第１試薬溶液１.８ｍｌと検体０.１ｍｌとを混合し、３７℃で５分間インキュベートした後、これに第２試薬溶液０.６ｍｌを加えると同時に３４０ｎｍにおける吸光度の測定を開始し、吸光度を１分毎に５分間測定した。得られた測定値から１分間当たりの吸光度変化量（ΔＡ）を求めた。又、試薬ブランク（ΔＢ）は、検体の代わりに生理食塩水を用いた以外、同じ試薬を用い、同様の操作を行って測定した。得られたΔＡ及びΔＢを下記の式に代入し、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ活性値を算出した。
検体のＮ−アセチルグルコサミニダーゼ活性（ｕ／Ｌ）＝
（ΔＡ−ΔＢ）×反応時の総液量×１０6／分子吸光係数×検体液量
ΔＡ ：検体の３４０ｎｍの１分間当たりの吸光度変化量
ΔＢ ：試薬ブランクの３４０ｎｍの１分間当たりの吸光度変化量
反応時の総液量 ：２.５（ｍｌ）
分子吸光係数 ：８３５４
検体液量 ：０.１（ｍｌ）
【００６０】
実施例７ ４−ヒドロキシメチル−２−ピリジル−Ｎ−アセチル−１−チオ−β−Ｄ−グルコサミニド（化合物［２］）を基質として用いたＮ−アセチルグルコサミニダーゼ活性の測定
（検体）実施例６と同じ
（試薬）
第１試薬溶液
実施例６と同じ
第２試薬溶液
化合物［２］を４１.７ｍＭ含有するホウ酸緩衝液（ｐＨ８.０）
【００６１】
（操作法）
上記の試薬を用いた以外は実施例６の測定方法と同じ操作方法により測定を行い、得られたΔＡとΔＢとを下記の式に代入し、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ活性値を算出した。
検体のＮ−アセチルグルコサミニダーゼ活性（ｕ／Ｌ）＝
（ΔＡ−ΔＢ）×反応時の総液量×１０6／分子吸光係数×検体液量
ΔＡ ：検体の３４０ｎｍの１分間当たりの吸光度変化量
ΔＢ ：試薬ブランクの３４０ｎｍの１分間当たりの吸光度変化量
反応時の総液量 ：２.５（ｍｌ）
分子吸光係数 ：８３９７
検体液量 ：０.１（ｍｌ）
【００６２】
実施例８ ５−ヒドロキシメチル−２−ピリジル−Ｎ−アセチル−１−チオ−β−Ｄ−グルコサミニド（化合物［３］）を用いたＮ−アセチルグルコサミニダーゼ活性の測定
（検体）実施例６と同じ
（試薬）
第１試薬溶液
実施例６と同じ
第２試薬溶液
化合物［３］を４１.７ｍＭ含有するホウ酸緩衝液（ｐＨ８.０）
【００６３】
（操作法）
上記の試薬を用いた以外は実施例６の測定方法と同じ操作方法により測定を行い、得られたΔＡとΔＢとを下記の式に代入し、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ活性値を算出した。
検体のＮ−アセチルグルコサミニダーゼ活性（ｕ／Ｌ）＝
（ΔＡ−ΔＢ）×反応時の総液量×１０6／分子吸光係数×検体液量
ΔＡ ：検体の３４０ｎｍの１分間当たりの吸光度変化量
ΔＢ ：試薬ブランクの３４０ｎｍの１分間当たりの吸光度変化量
反応時の総液量 ：２.５（ｍｌ）
分子吸光係数 ：８０４９
検体液量 ：０.１（ｍｌ）
【００６４】
参考例１ 市販品によるＮ−アセチルグルコサミニダーぜ活性の測定
市販のＮ−アセチルグルコサミニダーゼ活性測定試薬（Ｎ−アッセイＮＡＧニットーボー：ニットーボーメディカル(株)商品名）を用いて実施例６、７、８でＮ−アセチルグルコサミニダーゼ活性測定を行った３４検体についてＮ−アセチルグルコサミニダーゼ活性の測定を行った。尚、測定操作は、商品に添付の現品説明書に記載の標準操作法に従って行った。
【００６５】
又、実施例６、７及び８で得られた各検体の活性測定値と参考例１で得られた活性測定値との相関図を図３〜５に夫々示す。また、これら測定値を統計的処理して得られた回帰直線及び相関係数（ｒ）は以下の如くであった。
１．Ｘ：参考例１で得られたＮＡＧ活性値、Ｙ：実施例６で得られたＮＡＧ活性値。
回帰直線式：Ｙ＝０.９３Ｘ−０.２４
相関係数（ｒ）：０.９９３
２．Ｘ：参考例１で得られたＮＡＧ活性値、Ｙ：実施例７で得られたＮＡＧ活性値。
回帰直線式：Ｙ＝０.９０Ｘ＋０.４７
相関係数（ｒ）：０.９９３
３．Ｘ：参考例１で得られたＮＡＧ活性値、Ｙ：実施例８で得られたＮＡＧ活性値。
回帰直線式：Ｙ＝０.８４Ｘ＋０.８１
相関係数（ｒ）：０.９９３
以上の結果並びに図３〜５の結果から、本発明のヒドロキシアルキルピリジン誘導体を基質として用いるＮＡＧ活性測定法により、市販品と良好な相関関係を有するＮＡＧ活性値が得られることが判る。
【００６６】
実施例９、直線性の検討
ヒト胎盤由来ＮＡＧ（シグマ社品）を生理食塩水で１０段階に希釈したもの（希釈率1/10〜１）を検体とし、実施例６〜８の試薬を夫々用い、同様の操作を行って、本発明のＮＡＧ活性測定方法の検量線の直線性の検討を行った。
実施例６の試薬を用いて得られた結果を図６に、実施例７の試薬を用いて得られた結果を図７に、また、実施例８の試薬を用いて得られた結果を図８に夫々示す。
図６〜図８の結果から明らかな如く、本発明のＮＡＧ活性測定方法の検量線は原点を通る良好な直線性を示していることが判る。
【００６７】
【発明の効果】
以上述べた如く、本発明は、新規ヒドロキシアルキルピリジン誘導体、この誘導体を基質として用いるＮＡＧ活性測定方法及びＮＡＧ活性測定試薬を提供するものである。本発明のヒドロキシアルキルピリジン誘導体は、水溶性に優れていると共に、非酵素的分解が少ないため、酸性からアルカリ性の広い領域に渡って、水溶液中に於ける安定性が極めて高く、特に本発明のヒドロキシアルキルピリジン誘導体を含む溶液のｐＨを７以上に設定すれば（好ましくはｐＨ７〜１０）、水溶液状態で少なくとも３ヶ月以上の長期に渡って安定であるというＮＡＧ活性測定用基質として極めて優れた性質を有している。
また、本発明のヒドロキシアルキルピリジン誘導体は、ＮＡＧ等の作用によりヒドロキシアルキルピリジンチオール誘導体を遊離するが、この誘導体はビリルビン等の生体成分による影響を回避できる紫外領域波長での測定が可能であると共に、極大吸収波長が自動分析機の設定波長と殆ど同じであるため、これを基質として用いるＮＡＧ活性測定法及び試薬は、用手法のみならず汎用の自動分析機へも容易に応用できるという効果を奏する。従って、本発明は斯業に貢献するところ極めて大なる発明である。
【００６８】
【図面の簡単な説明】
【図１】実験例１で得られた、ｐＨとＯＤ値変化量（ΔＯＤ値）との関係を表すグラフである。
【図２】実験例２で得られた保存日数とＯＤ値との関係を表すグラフである。
【図３】実施例６で得られたＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ（以下、ＮＡＧと略記する。）活性測定値と、参考例１で得られたＮＡＧ活性測定値との相関図である。
【図４】実施例７で得られたＮＡＧ活性測定値と、参考例１で得られたＮＡＧ活性測定値との相関図である。
【図５】実施例８で得られたＮＡＧ活性測定値と、参考例１で得られたＮＡＧ活性測定値との相関図である。
【図６】実施例９で得られた、本発明のＮＡＧ活性測定法の検量線の直線性を示す図である。
【図７】実施例９で得られた、本発明のＮＡＧ活性測定法の検量線の直線性を示す図である。
【図８】実施例９で得られた、本発明のＮＡＧ活性測定法の検量線の直線性を示す図である。
【００６９】
【符号の簡単な説明】
図１に於いて、−●−は従来品の６−メチル−２−ピリジル−Ｎ−アセチル−１−チオ−β−Ｄ−グルコサミニド（以下６−ＭＰＴ−ＮＡＧＳと略記する。）を用いて得られた結果を、−◆−は化合物［４］を用いて得られた結果を夫々示す。
図２に於いて、−○−は従来品の６−ＭＰＴ−ＮＡＧＳを用いて得られた結果を、−◆−は化合物［１］を用いて得られた結果を、−●−は化合物［２］を用いて得られた結果を、−△−は化合物［３］を用いて得られた結果を、−×−は化合物［４］を用いて得られた結果を夫々示す。
【発明の属する技術分野】
本発明は、Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ（以下ＮＡＧと略記する。）、Ｎ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトサミニダーゼ、Ｎ−アセチル−β−Ｄ−ヘキソサミニダーゼ等の活性測定用基質として有用な新規なヒドロキシアルキルピリジン誘導体及びそれを用いたＮＡＧ活性測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＮＡＧは、種々の細胞のリソソーム内に存在する糖質分解酵素の１つであり、特に腎の近位尿細管上皮細胞に多く含まれ、腎尿細管の障害により尿中へ放出される事から、尿中のその活性は腎疾患の重要な指標となっている。尿中ＮＡＧ活性は、急性腎不全、慢性腎不全、ネフローゼ症候群、糸球体腎炎、更に糖尿病性腎症や薬剤による腎障害により上昇する事が知られており、これら腎疾患の早期診断指標となる。また、腎移植後の拒絶反応の早期診断の指標としても、尿中ＮＡＧ活性は重要な役割を果たしている。即ち、ＮＡＧ活性を測定することには、臨床的見地から極めて重要な意義がある。
【０００３】
従来、ＮＡＧ活性測定法として様々な方法が開発されているが、基本的にはＮＡＧの作用により遊離する化合物を蛍光検出計、或いは紫外−可視吸光度計を用いて検出し、これに基づいてＮＡＧ活性を求める方法が一般に採用されている。現在の臨床検査分野に於ける測定法は、合成基質を用いた初速度測定法が主流となっている。
【０００４】
以下に、従来のＮＡＧ活性測定方法の代表的な例を挙げる。
▲１▼４−メチルウンベリフェリル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニドを基質として、ＮＡＧによる酵素反応によって遊離した４−メチルウンベリフェロンの蛍光強度を測定する方法〔特開平１−２６５８９７号公報〕。
▲２▼ｐ−ニトロフェニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニドを基質として、ＮＡＧによる酵素反応によって遊離したｐ−ニトロフェノールをアルカリ性にすることで発色させ、それを比色定量する方法〔Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，２７，１１８０（１９８１）〕。
▲３▼ソジオ−ｍ−クレゾールスルホフタレイニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニドを基質として、ＮＡＧによる酵素反応によって遊離したｍ−クレゾールスルホフタレインをアルカリ性にすることで発色させ、それを比色定量する方法〔Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，２９，１７１３（１９８３）、特公昭６３−７１９６号公報〕。
▲４▼ソジオ−３，３’−ジクロロフェノールスルホフタレイニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニドを基質として、ＮＡＧによる酵素反応によって遊離したクロロフェノールレッドを直接比色定量する方法〔特開昭６３−３０９１９９号公報〕。
▲５▼２−クロロ−４−ニトロフェニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニドを基質として、ＮＡＧによる酵素反応によって遊離した２−クロロ−４−ニトロフェノールを直接比色定量する方法〔特開昭６２−４８３９９号公報等〕。
▲６▼２−フルオロ−４−ニトロフェニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニドを基質として、ＮＡＧによる酵素反応によって遊離した２−フルオロ−４−ニトロフェノールを直接比色定量する方法〔特公平５−７３３９８号公報、特公平５−５５５１７号公報等〕。
▲７▼ｐ−ニトロフェニル−Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニドを基質として、ＮＡＧによる酵素反応によって遊離したＮ−アセチルグルコサミンに、酸化酵素（Ｎ−アセチルグルコサミンオキシダーゼ：ＮＡＧＯＤ）を作用させ、発生する過酸化水素をパーオキシダーゼ（ＰＯＤ）存在下で発色剤と反応させ比色定量する方法〔機器・試薬，１３，８８７（１９９０）〕。
▲８▼６−メチル−２−ピリジル−Ｎ−アセチル−１−チオ−β−Ｄ−グルコサミニド（６−ＭＰＴ−ＮＡＧＳ）を基質として、ＮＡＧによる酵素反応によって遊離する６−メチル−２−ピリジンチオールを特定波長に於けるその吸光度を求めることにより定量する方法〔特開平５−５９０８３号公報〕
【０００５】
しかしながら、これらの方法は各々に基質の水溶性、測定感度、溶液の安定性等の面で多くの問題を抱えている。
即ち、例えば上述した測定方法のうち、▲１▼の測定法では蛍光強度計の様な特殊な測定装置を必要とするという問題点を有している。
▲２▼及び▲３▼の測定法は、酵素反応により遊離する色原体のｐＫａが高く、ＮＡＧの至適ｐＨでは比色定量を行うに足る測定感度が得られないため、反応停止後アルカリ性として比色定量を行わなければならず、現在主流を占めているレートアッセイには使用できない。即ち、迅速な多数検体処理には不向きな測定法である。
【０００６】
そこでレートアッセイに適用可能な測定法として、色原体部分のｐＫａを低下させた基質を用いた▲４▼、▲５▼及び▲６▼の測定法も開発されているが、これらは、ＮＡＧの至適ｐＨである４.５〜５.０において、酵素反応により生成した色原体の解離（即ち、発色）が不十分であるため、溶液中の僅かなｐＨ変動によっても吸光度が変動し、測定誤差を生じやすく、しかも基質溶解後の液状での長期安定性が悪いという問題点を有している。
【０００７】
また、▲２▼、▲５▼及び▲６▼の測定法では、遊離する色原体の極大吸収波長が４００ｎｍ前後であるため、ビリルビン等生体成分の影響を受けやすいという問題点も有している。 ▲７▼に示される測定法はレートアッセイに適用可能であるが、酸化酵素を使用して過酸化水素を発生させる測定系であるため、生体成分に含まれるビリルビン等の還元性物質やその他の共存物質の影響を受けやすく、また、上記▲４▼、▲５▼及び▲６▼の基質と同様、基質の溶解後の安定性が悪いという問題点を有している。
【０００８】
一方、これらの問題点を解決すべく▲８▼の測定法が開発されたが、この方法で用いられる基質の安定性は、短期的には向上しているもの、基質溶解後の長期安定性を考慮した場合、酸性からアルカリ性の領域で分解する傾向がみられるため、必ずしも満足できるものではなかった。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記した如き状況に鑑みなされたもので、感度及び安定性に優れたＮＡＧ活性測定用基質として有用なヒドロキシアルキルピリジン誘導体とこれを基質として用いたＮＡＧ活性測定方法及びそのための試薬を提供することを目的とする。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明は、一般式［１］
【００１１】
【化２】
（式中、Ｇは還元性末端でβ結合している、アミノ基にアシル基が結合しているヘキソサミン残基を表し、Ｒはヒドロキシアルキル基を表す。）で示されるヒドロキシアルキルピリジン誘導体、及びこの誘導体を基質として用いることを特徴とするＮＡＧ活性測定方法、の発明である。
即ち本発明者等は、ＮＡＧ活性測定に於いて有効に使用し得る合成基質について鋭意研究を重ねた結果、一般式［１］で示されるヒドロキシアルキルピリジン誘導体を基質として用いれば、上記した如き問題点を解決できることを見出し、本発明を完成するに到った。
【００１３】
一般式［１］に於いて、Ｇで示される、アミノ基にアシル基が結合しているヘキソサミン残基に於けるアシル基としては、脂肪族カルボン酸由来、脂肪族ヒドロキシカルボン酸由来、脂肪族アミノカルボン酸由来、芳香族カルボン酸由来等のアシル基が挙げられる。ここで脂肪族カルボン酸としては、例えば炭素数が２〜８、好ましくは炭素数２〜４のものが挙げられ、具体的には例えば酢酸，プロピオン酸，酪酸，イソ酪酸等が挙げられる。脂肪族ヒドロキシカルボン酸としては、水酸基を有しているカルボン酸であれば何れのものでも良いが、好ましくは例えば炭素数１〜７、より好ましくは炭素数１〜４のヒドロキシアルキル基を有するカルボン酸が挙げられ、具体的には例えばヒドロキシメチル基，ヒドロキシエチル基，ヒドロキシプロピル基，ヒドロキシブチル基等を有するカルボン酸が挙げられる。また、脂肪族アミノカルボン酸としては、アミノ基を有しているカルボン酸であれば如何なるものでも良いが、好ましくは所謂アミノ酸が挙げられ、より好ましくは例えばメチオニン，ロイシン，グリシン，アラニン等の必須アミノ酸が挙げられる。更に、芳香族カルボン酸としては、例えば安息香酸等が挙げられる。
【００１４】
Ｇで示される、アミノ基にアシル基が結合しているヘキソサミン残基に於けるヘキソサミン残基としては、例えばグルコサミン残基，ガラクトサミン残基等が挙げられる。アミノ基にアシル基が結合しているヘキソサミン残基の好ましい具体例としては、例えばＮ−アセチルグルコサミン，Ｎ−アセチルガラクトサミン，Ｎ−プロピオニルグルコサミン，Ｎ−プロピオニルガラクトサミン，Ｎ−ベンゾイルグルコサミン，Ｎ−ベンゾイルガラクトサミン等のＮ−アシルヘキソサミンの１位の水酸基が脱離したしたもの（残基）が挙げられる。
【００１５】
Ｒで示されるヒドロキシアルキル基としては、直鎖状でも分枝状でも何れにても良く、好ましくは炭素数１〜７、より好ましくは１〜３のヒドロキシアルキル基が挙げられ、具体的には例えばヒドロキシメチル基，１−ヒドロキシエチル基，２−ヒドロキシエチル基，１−ヒドロキシプロピル基，２−ヒドロキシプロピル基，３−ヒドロキシプロピル基，１−メチル−１−ヒドロキシエチル基，１−メチル−２−ヒドロキシエチル基等が挙げられる。
【００１６】
一般式［１］に於けるピリジン環は更に置換基を有していても良く、好ましい置換基としては、例えばハロゲン原子、アルキル基、アルコキシ基等が挙げられる。ここでハロゲン原子としては、例えば塩素，臭素，ヨウ素等が挙げられる。アルキル基としては直鎖状でも分枝状でも良く例えば炭素数１〜３のものが好ましく挙げられ、具体的には例えばメチル基，エチル基，ｎ−プロピル基，イソプロピル基等が挙げられる。アルコキシ基としては直鎖状でも分枝状でも良く例えば炭素数１〜３のものが挙げられ、具体的には、メトキシ基，エトキシ基，ｎ−プロポキシ基，イソプロポキシ基等が挙げられる。
【００１７】
本発明のヒドロキシアルキルピリジン誘導体の好ましい具体例としては、例えば以下の化合物等が挙げられる。
３−ヒドロキシメチル−２−ピリジル−Ｎ−アセチル−１−チオ−β−Ｄ−グルコサミニド，４−ヒドロキシメチル−２−ピリジル−Ｎ−アセチル−１−チオ−β−Ｄ−グルコサミニド，５−ヒドロキシメチル−２−ピリジル−Ｎ−アセチル−１−チオ−β−Ｄ−グルコサミニド，６−ヒドロキシメチル−２−ピリジル−Ｎ−アセチル−１−チオ−β−Ｄ−グルコサミニド，５−（１−ヒドロキシエチル）−２−ピリジル−Ｎ−アセチル−１−チオ−β−Ｄ−グルコサミニド，５−ヒドロキシメチル−４−メチル−２−ピリジル−Ｎ−アセチル−１−チオ−β−Ｄ−グルコサミニド，５−ヒドロキシメチル−３−メチル−２−ピリジル−Ｎ−アセチル−１−チオ−β−Ｄ−グルコサミニド及び、上記化合物のグルコサミニドをガラクトサミニドに置き換えた化合物又は／及びアミノ基に結合しているアセチル基を例えばプロピオニル基，ブチリル基，ベンゾイル基，メチオニン残基，ロイシン残基，アラニン残基，グリシン残基等に置き換えた化合物等が挙げられる。
【００１８】
本発明のヒドロキシアルキルピリジン誘導体は、水に２００ｍＭ以上溶解する為、ＮＡＧ活性測定用基質として十分な水溶性を有している。
また、水溶液とした場合、広いｐＨ範囲、例えばｐＨ４.５〜ｐＨ１０の範囲で長期間安定であり、特にｐＨ７〜ｐＨ１０の範囲では長期間極めて安定に存在し得る。
更にこの誘導体は、３２０ｎｍ以上に吸収波長が無いため、この誘導体から遊離するヒドロキシアルキルピリジンチオール誘導体（極大吸収波長：３２０〜３６０ｎｍ）に由来する吸光度変化測定に影響を与えないという特性を有している。
尚、上記一般式［１］で示される化合物のうち、ＮＡＧ活性測定のための基質として好適なものは、ＮＡＧに対してのＫｍ値が、好ましくは０.５〜５.０ｍＭ、より好ましくは１.０〜３.５ｍＭ、更に好ましくは１.５〜１.７ｍＭ程度のものが良い。
【００１９】
本発明のヒドロキシアルキルピリジン誘導体は、一般式［２］
【００２０】
【化３】
（式中、Ｒはヒドロキシアルキル基を表す。）で示されるヒドロキシアルキルピリジンチオール誘導体より容易に合成することができる。即ち、一般式［２］で示される化合物と、１位にＳＨ基と反応し得る基（例えば−Ｃｌ，−Ｂｒ，−Ｉ等のハロゲンなど）を有し、アミノ基が目的物に対応するアシル基で修飾されたものであって且つ水酸基が必要に応じて保護されていても良いヘキソサミン残基、例えば２−アセタミド−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−α−Ｄ−グルコピラノシル クロリド（例えば、Ｏｒｇ．Ｓｙｎｔｈ．４６，１(１９６６)に記載の方法により合成したもの等）等とを、例えば臭化テトラ−ｎ−ブチルアンモニウム等の相間移動触媒の存在下、アルカリ水溶液と適当な有機溶剤（例えばクロロホルム，ジクロロメタン等）との混合溶媒中でグリコシル化反応させ、得られたＳ−グリコシル化体を例えばナトリウムメトキシド等の金属アルコキシドで水酸基の脱アシル化をすることにより、本発明化合物を得ることができる。又、上記のグリコシル化反応の代わりに、直接的或いは間接的な通常のグリコシド結合形成反応により本発明化合物を合成しても良い。
【００２２】
本発明のヒドロキシアルキルピリジン誘導体の合成原料である一般式［２］で示されるヒドロキシアルキルピリジンチオール誘導体は、例えば以下の方法により合成できる。
即ち、先ず、一般式［３］
【００２３】
【化４】
（式中、Ｒ1はカルボニル基を有する置換基を表し、ＸはＣｌ，Ｂｒ，Ｉなどのハロゲン原子を表す。）で示される化合物を、例えばＬｉＡｌＨ4又はＮａＢＨ4等の還元剤を用いる常法により還元し、２−ハロゲノ−ヒドロキシアルキルピリジン誘導体とする。
【００２５】
次に、得られた２−ハロゲノ−ヒドロキシアルキルピリジン誘導体を例えばＮａＳＨ等の一般的なチオール化剤を用いる常法により、チオール化することで一般式［２］で表されるヒドロキシアルキルピリジンチオール誘導体が得られる。一般式［１］で示される化合物を基質として、活性を測定できる酵素としては、例えばＮＡＧ，Ｎ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトサミニダーゼ，Ｎ−アセチル−β−Ｄ−ヘキソサミニダーゼ等が挙げられるが、好ましくはＮＡＧ，Ｎ−アセチル−β−Ｄ−ヘキソサミニダーゼ、更に好ましくはＮＡＧである。
【００２６】
ＮＡＧと一般式［１］で示されるヒドロキシアルキルピリジン誘導体とを反応させることで、下記一般式［２］で示されるヒドロキシアルキルピリジンチオール誘導体が遊離する。
一般式［２］
【００２７】
【化５】
（式中、Ｒは前記に同じ。）
ＮＡＧなどの酵素反応によって本発明のヒドロキシアルキルピリジン誘導体から遊離するヒドロキシアルキルピリジンチオール誘導体は、３２０ｎｍ〜３６０ｎｍに極大吸収を示すため、生体成分中の例えばビリルビンやヘモグロビン等の影響を受けない紫外領域（３２０ｎｍ〜３８０ｎｍ）での測定が可能である。特にピリジン環の３位或いは４位にヒドロキシアルキル基が置換した例えば３−ヒドロキシメチル−２−ピリジンチオール（極大吸収波長３４１ｎｍ）や４−ヒドロキメチル−２−ピリジンチオール（極大吸収波長３３９ｎｍ）等は、極大吸収波長が現在臨床検査分野で主流となっている自動分析機の設定波長（３４０ｎｍ）とほぼ同じであるため測定波長を極大吸収波長のピークに設定できる。即ち本発明のヒドロキシアルキル誘導体をＮＡＧ等の活性測定用基質として用いれば、ＮＡＧ等の活性の測定に於ける分析機種間や測定条件により生じる測定値の誤差やばらつきを極力押さえることができる。
【００２９】
本発明の化合物であるヒドロキシアルキルピリジン誘導体は、全ｐＨ領域に於いて試薬ブランク上昇が低く、特にｐＨ７以上の溶液中で保存すれば少なくとも３カ月以上の長期に渡って試薬ブランクの上昇が抑えられることから、ＮＡＧ活性測定用基質として非常に有用である。又、二液法によるＮＡＧ活性測定用試薬に本発明のヒドロキシアルキルピリジン誘導体を基質として用いれば、特にその溶液状態での保存性が増すので望ましい。
【００３０】
一般式［１］で示されるヒドロキシアルキルピリジン誘導体を用いた本発明のＮＡＧ活性測定法は、基質として一般式［１］で示されるヒドロキシアルキルピリジン誘導体を用いる以外、自体公知の初速度法に準じて測定を行えば足りる。
具体的には、例えば以下の方法が挙げられる。
【００３１】
(ｉ)方法１
例えば、血清、血液、尿等の生体由来試料と、予め２０〜５０℃、好ましくは３０〜４０℃でインキュベートした、一般式［１］で示されるヒドロキシアルキルピリジン誘導体と適当な緩衝剤とを含有した試薬溶液（ｐＨは通常３.０〜７.０、好ましくは４.０〜６.５）とを２０〜５０℃、好ましくは３０〜４０℃で反応させる。ＮＡＧの作用により生成するヒドロキシアルキルピリジンチオール誘導体の増加量を、例えば分光光度計等の適当な測定装置を用いて３２０〜３８０ｎｍに於ける単位時間当たりの吸光度変化量として測定する。得られた吸光度変化量をヒドロキシアルキルピリジンチオール誘導体の分子吸光係数を用いて単位換算することで、試料中のＮＡＧ活性を求めることができる。
尚、ここで用いられる試料溶液は一般式［１］で示されるヒドロキシアルキルピリジン誘導体と適当な緩衝剤とを含有するｐＨ７〜１１好ましくはｐＨ７〜９の試薬溶液と適当な緩衝剤を含有した試薬溶液（ｐＨは通常３.０〜７.０、好ましくは４.０〜６.５程度）とを混合して調製されたものでも良い。
【００３２】
(ｉｉ)方法２
生体由来試料と、適当な緩衝剤を含有する第一試薬溶液（ｐＨは通常３.０〜７.０、好ましくは４.０〜６.５程度）とを混合し、２０〜５０℃、好ましくは３０〜４０℃で適当な時間インキュベートした後、これと予め２０〜５０℃好ましくは３０〜４０℃でインキュベートした、一般式［１］で示されるヒドロキシアルキルピリジン誘導体と適当な緩衝剤を含有する第２試薬溶液とを混合し、２０〜５０℃、好ましくは３０〜４０℃で反応させる。ＮＡＧの作用により生成するヒドロキシアルキルピリジンチオール誘導体の増加量を、例えば分光光度計等の適当な測定装置を用いて３２０〜３８０ｎｍにおける単位時間当たりの吸光度変化量として測定する。得られた吸光度変化量をヒドロキシアルキルピリジンチオール誘導体の分子吸光係数を用いて単位換算することで試料中のＮＡＧ活性を求めることができる。
【００３３】
尚、上記の方法に於いて、第２試薬溶液のｐＨ及び緩衝剤の濃度は、第１試薬溶液と混合した場合のｐＨが３.０〜７.０好ましくは４.０〜６.５となるように設定されていれば良く、特に限定されないが、本発明のヒドロキシアルキルピリジン誘導体の水溶液中の安定性を考慮すれば、そのｐＨは７〜１１、好ましくは７〜９の範囲で設定しておくことが望ましい。
【００３４】
又、上記(ｉ)及び(ｉｉ)の方法に於いて、基質として用いられる本発明のヒドロキシアルキルピリジン誘導体の使用濃度としては、ＮＡＧの活性測定を実施し得る濃度であれば良く、特に限定されないが、ＮＡＧとの反応時の濃度として０.１〜５００ｍＭ、好ましくは１〜５０ｍＭの範囲から適宜選択すれば良い。
【００３５】
上記(ｉ)及び(ｉｉ)の方法における試薬溶液に用いられる緩衝剤としては、通常この分野で用いられるものであれば特に限定されないが、例えばグッド（Ｇｏｏｄ’ｓ）緩衝剤、クエン酸塩、ほう酸塩、リン酸塩が好ましく挙げられる。また、これら緩衝剤の使用濃度としては、ＮＡＧの活性測定を実施し得る濃度であれば良く特に限定されないが、ＮＡＧ活性測定時の濃度として１〜１０００ｍＭ、好ましくは１０〜５００ｍＭの範囲から適宜選択すれば良い。また、上記(ｉ)及び(ｉｉ)で用いた試薬溶液中には、必要に応じて、通常この分野で用いられる溶解補助剤、防腐剤、安定化剤、界面活性剤等を適宜選択して含有させても良く、これらの使用量は通常この分野で用いられる範囲から適宜選択すれば良い。
【００３６】
本発明のＮＡＧ活性測定用試薬は、本発明のヒドロキシアルキルピリジン誘導体を基質として含んで成るものである。より具体的には、▲１▼ヒドロキシアルキルピリジン誘導体と緩衝剤とを含んで成る一液法用試薬、▲２▼緩衝剤を含んで成る第一試薬と、ヒドロキシアルキルピリジン誘導体と緩衝剤とを含んで成る第二試薬とを含んで成る、二液法用試薬等が挙げられる。また、これら本発明試薬の構成要素の好ましい態様と具体例は上で述べた通りである。
以下に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
【００３７】
【実施例】
実施例１
３−ヒドロキシメチル−２−ピリジル−Ｎ−アセチル−１−チオ−β−Ｄ−グルコサミニド〔ＩＵＰＡＣ名：３−ヒドロキシメチル−２−ピリジニル ２−（アセチルアミノ）−２−デオキシ−１−チオ−β−Ｄ−グルコピラノシド 以下化合物［１］と略記する。〕の合成
【００３８】
(1)２−クロロニコチン酸（和光純薬工業(株)品）１５.７６ｇ（１００ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン１５.３２ｍｌ（１１０ｍｍｏｌ）を溶解したトルエン溶液（１Ｌ）にクロロ炭酸エチル１０.５２ｍｌを加え、室温で１時間攪拌反応させた。析出した結晶を濾去し、トルエンを減圧留去して得られた褐色オイルをテトラヒドロフランに溶解し、これを予めテトラヒドロフランに水素化リチウムアルミニウム４.１７ｇ（１１０ｍｍｏｌ）を加え窒素置換し−７８℃に冷却しておいた溶液に滴下した。滴下後同温度で２時間攪拌反応させ、水（３０ｍｌ）で反応を停止させた後室温とし、１Ｎ−ＮａＯＨ（２００ｍｌ）を加え、ジエチルエーテルで抽出処理を行った。抽出液から溶媒を減圧留去し得られた褐色オイルをヘキサンから結晶化することにより、２−クロロ−３−ヒドロキシメチルピリジン１１.９１ｇ（収率７５％）を得た。
融点：５８〜５９℃。
元素分析値 Ｃ6Ｈ6ＣｌＮＯ
実測値（％）； Ｃ：５０.２４，Ｈ：４.１１，Ｎ：９.７４。
計算値（％）； Ｃ：５０.１９，Ｈ：４.２１，Ｎ：９.７６。
【００３９】
(2)(1)で得られた２−クロロ−３−ヒドロキシメチルピリジン８.６１ｇ（６０ｍｍｏｌ）と硫化水素ナトリウム３.３６ｇ（６０ｍｍｏｌ）とを１−メチル−２−ピロリドン中に加え１４０℃で２時間攪拌反応させた。攪拌後溶媒を減圧留去し、水（２００ｍｌ）を加え、酢酸でｐＨ４.０とした後、クロロホルムにより抽出処理を行った。抽出液から溶媒を減圧留去後、残渣をエタノールで再結晶し、黄色針状晶の３−ヒドロキシメチル−２−ピリジンチオール６.４ｇ（収率６７％）を得た。
融点：１７４〜１７５℃。
元素分析値 Ｃ6Ｈ7ＮＯＳ
実測値（％）； Ｃ：５１.１４，Ｈ：４.９７，Ｎ：９.９８。
計算値（％）； Ｃ：５１.０４，Ｈ：５.００，Ｎ：９.９２。
【００４０】
(3)(2)で得られた３−ヒドロキシメチル−２−ピリジンチオール４.２４ｇ（３０ｍｍｏｌ）、１−クロロ−１−デオキシ−２，３，４，６−テトラアセチル−α−Ｄ−グルコサミン１０.９７ｇ（３０ｍｍｏｌ）及びテトラ−ｎ−ブチルアンモニウムブロミド９.６７ｇ（３０ｍｍｏｌ）を１Ｎ−ＮａＯＨ５０ｍｌとジクロロメタン５０ｍｌとの混合溶媒中、室温で１時間攪拌反応させた。反応終了後反応液に水１００ｍｌとジクロロメタン１００ｍｌを加えて攪拌分液し、有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥後溶媒を減圧留去した。得られた淡黄色の結晶をエタノールで再結晶することにより白色綿状結晶の３−ヒドロキシメチル−２−ピリジル−２，３，４，６−テトラアセチル−１−チオ−β−Ｄ−グルコサミニド５.１４ｇ（収率３６.４％）を得た。
融点：１７２〜１７３℃。
元素分析値 Ｃ20Ｈ26Ｎ2Ｏ9Ｓ
実測値（％）； Ｃ：５１.１４，Ｈ：５.４４，Ｎ：５.９８。
計算値（％）； Ｃ：５１.０１，Ｈ：５.５６，Ｎ：５.９５。
【００４１】
(4)(3)で得られた３−ヒドロキシメチル−２−ピリジル−２，３，４，６−テトラアセチル−１−チオ−β−Ｄ−グルコサミニド５.１４ｇ（１１ｍｍｏｌ）にメタノール１００ｍｌを加え、同溶液にナトリウムメトキシドの２８％メタノール溶液を１０滴添加した後、室温で１時間撹拌反応させた。反応終了後、反応液を酢酸で中和し、溶媒を減圧留去した。得られた残渣を、エタノールで再結晶することにより、白色針状結晶の３−ヒドロキシメチル−２−ピリジル−Ｎ−アセチル−１−チオ−β−Ｄ−グルコサミニド３.５０ｇ（収率９３％）を得た（通算収率１７％）。
融点：１９０〜１９３℃。
元素分析値 Ｃ14Ｈ20Ｎ2Ｏ6Ｓ
実測値（％）； Ｃ：４８.８１，Ｈ：５.９７，Ｎ：８.２０。
計算値（％）； Ｃ：４８.８３，Ｈ：５.８５，Ｎ：８.１３。
ＩＲ：１６４３ｃｍ-1（Ｃ＝Ｏ）
【００４２】
実施例２
４−ヒドロキシメチル−２−ピリジル−Ｎ−アセチル−１−チオ−β−Ｄ−グルコサミニド〔ＩＵＰＡＣ名：４−ヒドロキシメチル−２−ピリジニル ２−（アセチルアミノ）−２−デオキシ−１−チオ−β−Ｄ−グルコピラノシド 以下化合物［２］と略記する。〕の合成
【００４３】
２−クロロニコチン酸１５０ｍｍｏｌの代わりに２−クロロイソニコチン酸（東京化成(株)品）２３.６３ｇ（１５０ｍｍｏｌ）を用いた以外は、実施例１と同じ試薬を用い、実施例１と同様にして反応及び後処理を行って、４−ヒドロキシメチル−２−ピリジル−Ｎ−アセチル−１−チオ−β−Ｄ−グルコサミニド１.６５ｇを得た（通算収率８％）。
融点：１９８〜１９９℃。
元素分析値 Ｃ14Ｈ20Ｎ2Ｏ6Ｓ
実測値（％）； Ｃ：４８.７７，Ｈ：５.６７，Ｎ：８.２４。
計算値（％）； Ｃ：４８.８３，Ｈ：５.８５，Ｎ：８.１３。
ＩＲ：１６４１ｃｍ-1。
【００４４】
実施例３
５−ヒドロキシメチル−２−ピリジル−Ｎ−アセチル−１−チオ−β−Ｄ−グルコサミニド〔ＩＵＰＡＣ名：５−ヒドロキシメチル−２−ピリジニル ２−（アセチルアミノ）−２−デオキシ−１−チオ−β−Ｄ−グルコピラノシド以下化合物［３］と略記する。〕の合成
【００４５】
２−クロロニコチン酸１５０ｍｍｏｌの代わりに６−クロロニコチン酸（和光純薬工業(株)品）２３.６３ｇ（１５０ｍｍｏｌ）を用いた以外は、実施例１と同じ試薬を用い、実施例１と同様にして反応及び後処理行って、５−ヒドロキシメチル−２−ピリジル−Ｎ−アセチル−１−チオ−β−Ｄ−グルコサミニド５.１５ｇを得た（通算収率２５％）。
融点：２１３〜２１４℃。
元素分析値 Ｃ14Ｈ20Ｎ2Ｏ6Ｓ
実測値（％）； Ｃ：４８.８０，Ｈ：５.７８，Ｎ：８.１７。
計算値（％）； Ｃ：４８.８３，Ｈ：５.８５，Ｎ：８.１３。
ＩＲ：１６４３ｃｍ-1。
【００４６】
実施例４
６−ヒドロキシメチル−２−ピリジル−Ｎ−アセチル−１−チオ−β−Ｄ−グルコサミニド〔ＩＵＰＡＣ名：６−ヒドロキシメチル−２−ピリジニル ２−（アセチルアミノ）−２−デオキシ−１−チオ−β−Ｄ−グルコピラノシド 以下化合物［４］と略記する。〕の合成
【００４７】
２−クロロニコチン酸１５０ｍｍｏｌの代わりに６−クロロピコリン酸（和光純薬工業(株)品）２３.６３ｇ（１５０ｍｍｏｌ）を用いた以外は、実施例１と同じ試薬を用い、実施例１と同様にして反応及び後処理を行って、６−ヒドロキシメチル−２−ピリジル−Ｎ−アセチル−１−チオ−β−Ｄ−グルコサミニド２.６８ｇを得た（通算収率１３％）。
融点：１６４〜１６５℃。
元素分析値 Ｃ14Ｈ20Ｎ2Ｏ6Ｓ
実測値（％）； Ｃ：４８.６５，Ｈ：５.８３，Ｎ：８.２４。
計算値（％）； Ｃ：４８.８３，Ｈ：５.８５，Ｎ：８.１３。
ＩＲ：１６４４ｃｍ-1（Ｃ＝Ｏ）
【００４８】
実施例５
５−（１−ヒドロキシエチル）−２−ピリジル−Ｎ−アセチル−１−チオ−β−Ｄ−グルコサミニド〔ＩＵＰＡＣ名：５−（１−ヒドロキシエチル）−２−ピリジニル ２−（アセチルアミノ）−２−デオキシ−１−チオ−β−Ｄ−グルコピラノシド 以下化合物［５］と略記する。〕の合成
【００４９】
６−クロロニコチン酸（和光純薬工業(株)品）３９.３９ｇ（２５０ｍｍｏｌ）をトルエン（０.５Ｌ）に懸濁し塩化チオニル（３６ｍｌ）とＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１ｍｌ）とを加え、室温で１８時間撹拌反応させた。次に反応溶媒を減圧留去し、残渣をクロロホルム（１.５Ｌ）に溶解後、ジエチルアミン（２５.８ｍｌ）のクロロホルム溶液（１００ｍｌ）とトリエチルアミン（７０ｍｌ）のクロロホルム溶液（１５０ｍｌ）を添加した。添加終了後室温で２時間撹拌し、反応終了後精製水（１Ｌ）を加え有機層を分液洗浄した。有機層を、無水硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を減圧留去した。得られた粗Ｎ，Ｎ−ジエチル−６−クロロニコチンアミド（４９.１６ｇ）をテトラヒドロフラン（２Ｌ）に溶解し、窒素置換後、−７８℃でメチルリチウム（１６５ｍｌ：１.４Ｍジエチルエーテル溶液）を滴下した。滴下終了後同温度で１時間撹拌反応させ、飽和塩化アンモニウム溶液で反応を停止後室温とし、溶媒を留去した。得られた残渣に精製水（０.５Ｌ）とクロロホルム（０.５Ｌ）を加えて分液し、有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥後溶媒を留去した。得られた残渣をエタノールで再結晶することにより精製し、３−アセチル−６−クロロピリジン２４.５７ｇを得た（収率６３％）。
融点：９８〜９９℃。
元素分析値 Ｃ7Ｈ6ＣｌＮＯ
実測値（％）； Ｃ：５５.１５，Ｈ：３.８３，Ｎ：８.２４。
計算値（％）； Ｃ：５４.９１，Ｈ：３.８１，Ｎ：８.８３。
【００５０】
得られた３−アセチル−６−クロロピリジン２３.７９ｇ（１５０ｍｍｏｌ）を、テトラヒドロフランに溶解し、これを予めテトラヒドロフランに水素化リチウムアルミニウム６.２５ｇ（１６５ｍｍｏｌ）を加え窒素置換し−７８℃に冷却しておいた溶液に滴下した。滴下後同温度で２時間攪拌反応させ、水（３０ｍｌ）で反応を停止した後室温とし、１Ｎ−ＮａＯＨ（２００ｍｌ）を加え、ジエチルエーテルで抽出処理を行った。抽出液から溶媒を減圧留去し得られた褐色オイルをヘキサンから結晶化することにより、３−（１−ヒドロキシエチル）−６−クロロピリジン２０.４８ｇ（収率８５％）を得た。
次に２−クロロ−３−ヒドロキシメチルピリジン８.６１ｇ（６０ｍｍｏｌ）の代わりに、上で得られた３−（１−ヒドロキシエチル）−６−クロロピリジン２０.４８ｇ（１２７.５ｍｍｏｌ）を用いた以外は実施例１の(2)〜(3)と同じ試薬を用い、実施例１の(2)〜(3)と同様にして反応及び後処理を行って、５−（１−ヒドロキシエチル）−２−ピリジル−Ｎ−アセチル−１−チオ−β−Ｄ−グルコサミニド５.９３ｇを得た（全収率１３％）。
融点：２０１〜２０２℃。
元素分析値 Ｃ15Ｈ22Ｎ2Ｏ6Ｓ
実測値（％）； Ｃ：５０.５５，Ｈ：６.０８，Ｎ：７.６９。
計算値（％）； Ｃ：５０.２７，Ｈ：６.１９，Ｎ：７.８２。
ＩＲ：１６５１ｃｍ-1（Ｃ＝Ｏ）
【００５１】
実験例１ 本発明のヒドロキシアルキルピリジン誘導体のｐＨ安定性の検討
従来品中、水溶液状態で最も長期間安定な６−メチル−２−ピリジル−Ｎ−アセチル−１−チオ−β−Ｄ−グルコサミニド〔Ｎ−アッセイＮＡＧニットーボー（ニットーボーメディカル（株）商品名）で用いられている基質〕（以下６−ＭＰＴ−ＮＡＧＳと略記する。）と、本発明のヒドロキシアルキルピリジン誘導体のうち従来品と同じ位置に置換基を持つ６−ヒドロキシメチル−２−ピリジル−Ｎ−アセチル−１−チオ−β−Ｄ−グルコサミニド（化合物［４］）との水溶液状態での安定性をｐＨ４.５〜１０の範囲で比較した。
【００５２】
（操作法）
６−ＭＰＴ−ＮＡＧＳと化合物［４］を夫々精製水に溶解し、２０ｍＭの基質原液を調製した。同原液と、５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ４.５，５.０，５.５，６.０）、５０ｍＭ Ｎ,Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸緩衝液（ｐＨ７.０）又は５０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８.０，９.０，１０.０）とを各々１：１で混合して、各ｐＨの基質溶液を調製し、１０℃で１６日間保存した。同基質溶液について、調製直後と１６日目の３４０ｎｍのＯＤ値（吸光度）を測定した。
（結果）
各基質溶液の調製直後のＯＤ値、１６日目のＯＤ値、及び１６日目のＯＤ値から調製直後のＯＤ値を差し引いたＯＤ値変化量（ΔＯＤ値）を表１に併せて示す。
【００５３】
【表１】
表１の結果に基づいて作成したｐＨとΔＯＤ値の関係を表すグラフを図１に示す。尚、図中、−●−は、従来品の６−ＭＰＴ−ＮＡＧＳについて得られたグラフを、また、−◆−は化合物［４］について得られたグラフをそれぞれ示す。
表１及び図１の結果から、本発明のヒドロキシアルキルピリジン誘導体は、従来のＮＡＧの基質である６−ＭＰＴ−ＮＡＧＳに比べて、水溶液中で良好な安定性を有していることが判る。特に、ＮＡＧの至適ｐＨ付近での安定性は、従来品に比べて著しく向上しているので、本発明のヒドロキシアルキルピリジン誘導体がＮＡＧの基質として好ましいものであることが判る。
実験例２ 本発明化合物の水溶液状態での長期保存安定性の検討
従来品中、水溶液状態で最も長期間安定な６−ＭＰＴ−ＮＡＧＳと、本発明の化合物［１］〜［４］とのｐＨ８.０の溶液中で安定性を比較した。
実験例１と同様にして調製した、従来品と化合物［１］〜［４］の基質溶液（２５ｍＭ ホウ酸緩衝液、ｐＨ８.０）を１０℃で保存し、各々の調製直後、保存後８日目、保存後１６日目、保存後６０日目、保存後９０日目の３４０ｎｍのＯＤ値を測定した。
【００５５】
（結果）
結果を表２に示す。
【００５６】
【表２】
また、表２の結果に基づいて作成した、保存日数とＯＤ値の関係を表すグラフを図２に示す。尚、図２に於いて、−○−は従来品について得られた結果を、−◆−は化合物［１］について得られた結果を、−●−は化合物［２］について得られた結果を、−△−は化合物［３］について得られた結果を、−×−は化合物［４］について得られた結果をそれぞれ示す。
表２及び図２の結果から明らかな如く、本発明のヒドロキシアルキルピリジン誘導体は、従来品の６−ＭＰＴ−ＮＡＧＳに比較して水溶液中での長期保存安定性が著しく向上していることが判る。言い換えれば、本発明のヒドロキシアルキルピリジン誘導体は、所謂液状試薬用のＮＡＧ活性測定用基質として好適なものであることが判る。
【００５８】
実施例６ ３−ヒドロキシメチル−２−ピリジル−Ｎ−アセチル−１−チオ−β−Ｄ−グルコサミニド（化合物［１］）を基質として用いたＮ−アセチルグルコサミニダーゼ活性の測定
（検体）
ヒト胎盤由来ＮＡＧ（シグマ社品）を生理食塩水で適宜希釈して調製したもの３４検体を用いた。
（試薬）
第１試薬溶液
１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ４.４０、ａｔ２５℃）。
第２試薬溶液
化合物［１］を４１.７ｍＭ含有するホウ酸緩衝液（ｐＨ８.０）。
【００５９】
（操作法）
第１試薬溶液１.８ｍｌと検体０.１ｍｌとを混合し、３７℃で５分間インキュベートした後、これに第２試薬溶液０.６ｍｌを加えると同時に３４０ｎｍにおける吸光度の測定を開始し、吸光度を１分毎に５分間測定した。得られた測定値から１分間当たりの吸光度変化量（ΔＡ）を求めた。又、試薬ブランク（ΔＢ）は、検体の代わりに生理食塩水を用いた以外、同じ試薬を用い、同様の操作を行って測定した。得られたΔＡ及びΔＢを下記の式に代入し、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ活性値を算出した。
検体のＮ−アセチルグルコサミニダーゼ活性（ｕ／Ｌ）＝
（ΔＡ−ΔＢ）×反応時の総液量×１０6／分子吸光係数×検体液量
ΔＡ ：検体の３４０ｎｍの１分間当たりの吸光度変化量
ΔＢ ：試薬ブランクの３４０ｎｍの１分間当たりの吸光度変化量
反応時の総液量 ：２.５（ｍｌ）
分子吸光係数 ：８３５４
検体液量 ：０.１（ｍｌ）
【００６０】
実施例７ ４−ヒドロキシメチル−２−ピリジル−Ｎ−アセチル−１−チオ−β−Ｄ−グルコサミニド（化合物［２］）を基質として用いたＮ−アセチルグルコサミニダーゼ活性の測定
（検体）実施例６と同じ
（試薬）
第１試薬溶液
実施例６と同じ
第２試薬溶液
化合物［２］を４１.７ｍＭ含有するホウ酸緩衝液（ｐＨ８.０）
【００６１】
（操作法）
上記の試薬を用いた以外は実施例６の測定方法と同じ操作方法により測定を行い、得られたΔＡとΔＢとを下記の式に代入し、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ活性値を算出した。
検体のＮ−アセチルグルコサミニダーゼ活性（ｕ／Ｌ）＝
（ΔＡ−ΔＢ）×反応時の総液量×１０6／分子吸光係数×検体液量
ΔＡ ：検体の３４０ｎｍの１分間当たりの吸光度変化量
ΔＢ ：試薬ブランクの３４０ｎｍの１分間当たりの吸光度変化量
反応時の総液量 ：２.５（ｍｌ）
分子吸光係数 ：８３９７
検体液量 ：０.１（ｍｌ）
【００６２】
実施例８ ５−ヒドロキシメチル−２−ピリジル−Ｎ−アセチル−１−チオ−β−Ｄ−グルコサミニド（化合物［３］）を用いたＮ−アセチルグルコサミニダーゼ活性の測定
（検体）実施例６と同じ
（試薬）
第１試薬溶液
実施例６と同じ
第２試薬溶液
化合物［３］を４１.７ｍＭ含有するホウ酸緩衝液（ｐＨ８.０）
【００６３】
（操作法）
上記の試薬を用いた以外は実施例６の測定方法と同じ操作方法により測定を行い、得られたΔＡとΔＢとを下記の式に代入し、Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ活性値を算出した。
検体のＮ−アセチルグルコサミニダーゼ活性（ｕ／Ｌ）＝
（ΔＡ−ΔＢ）×反応時の総液量×１０6／分子吸光係数×検体液量
ΔＡ ：検体の３４０ｎｍの１分間当たりの吸光度変化量
ΔＢ ：試薬ブランクの３４０ｎｍの１分間当たりの吸光度変化量
反応時の総液量 ：２.５（ｍｌ）
分子吸光係数 ：８０４９
検体液量 ：０.１（ｍｌ）
【００６４】
参考例１ 市販品によるＮ−アセチルグルコサミニダーぜ活性の測定
市販のＮ−アセチルグルコサミニダーゼ活性測定試薬（Ｎ−アッセイＮＡＧニットーボー：ニットーボーメディカル(株)商品名）を用いて実施例６、７、８でＮ−アセチルグルコサミニダーゼ活性測定を行った３４検体についてＮ−アセチルグルコサミニダーゼ活性の測定を行った。尚、測定操作は、商品に添付の現品説明書に記載の標準操作法に従って行った。
【００６５】
又、実施例６、７及び８で得られた各検体の活性測定値と参考例１で得られた活性測定値との相関図を図３〜５に夫々示す。また、これら測定値を統計的処理して得られた回帰直線及び相関係数（ｒ）は以下の如くであった。
１．Ｘ：参考例１で得られたＮＡＧ活性値、Ｙ：実施例６で得られたＮＡＧ活性値。
回帰直線式：Ｙ＝０.９３Ｘ−０.２４
相関係数（ｒ）：０.９９３
２．Ｘ：参考例１で得られたＮＡＧ活性値、Ｙ：実施例７で得られたＮＡＧ活性値。
回帰直線式：Ｙ＝０.９０Ｘ＋０.４７
相関係数（ｒ）：０.９９３
３．Ｘ：参考例１で得られたＮＡＧ活性値、Ｙ：実施例８で得られたＮＡＧ活性値。
回帰直線式：Ｙ＝０.８４Ｘ＋０.８１
相関係数（ｒ）：０.９９３
以上の結果並びに図３〜５の結果から、本発明のヒドロキシアルキルピリジン誘導体を基質として用いるＮＡＧ活性測定法により、市販品と良好な相関関係を有するＮＡＧ活性値が得られることが判る。
【００６６】
実施例９、直線性の検討
ヒト胎盤由来ＮＡＧ（シグマ社品）を生理食塩水で１０段階に希釈したもの（希釈率1/10〜１）を検体とし、実施例６〜８の試薬を夫々用い、同様の操作を行って、本発明のＮＡＧ活性測定方法の検量線の直線性の検討を行った。
実施例６の試薬を用いて得られた結果を図６に、実施例７の試薬を用いて得られた結果を図７に、また、実施例８の試薬を用いて得られた結果を図８に夫々示す。
図６〜図８の結果から明らかな如く、本発明のＮＡＧ活性測定方法の検量線は原点を通る良好な直線性を示していることが判る。
【００６７】
【発明の効果】
以上述べた如く、本発明は、新規ヒドロキシアルキルピリジン誘導体、この誘導体を基質として用いるＮＡＧ活性測定方法及びＮＡＧ活性測定試薬を提供するものである。本発明のヒドロキシアルキルピリジン誘導体は、水溶性に優れていると共に、非酵素的分解が少ないため、酸性からアルカリ性の広い領域に渡って、水溶液中に於ける安定性が極めて高く、特に本発明のヒドロキシアルキルピリジン誘導体を含む溶液のｐＨを７以上に設定すれば（好ましくはｐＨ７〜１０）、水溶液状態で少なくとも３ヶ月以上の長期に渡って安定であるというＮＡＧ活性測定用基質として極めて優れた性質を有している。
また、本発明のヒドロキシアルキルピリジン誘導体は、ＮＡＧ等の作用によりヒドロキシアルキルピリジンチオール誘導体を遊離するが、この誘導体はビリルビン等の生体成分による影響を回避できる紫外領域波長での測定が可能であると共に、極大吸収波長が自動分析機の設定波長と殆ど同じであるため、これを基質として用いるＮＡＧ活性測定法及び試薬は、用手法のみならず汎用の自動分析機へも容易に応用できるという効果を奏する。従って、本発明は斯業に貢献するところ極めて大なる発明である。
【００６８】
【図面の簡単な説明】
【図１】実験例１で得られた、ｐＨとＯＤ値変化量（ΔＯＤ値）との関係を表すグラフである。
【図２】実験例２で得られた保存日数とＯＤ値との関係を表すグラフである。
【図３】実施例６で得られたＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ（以下、ＮＡＧと略記する。）活性測定値と、参考例１で得られたＮＡＧ活性測定値との相関図である。
【図４】実施例７で得られたＮＡＧ活性測定値と、参考例１で得られたＮＡＧ活性測定値との相関図である。
【図５】実施例８で得られたＮＡＧ活性測定値と、参考例１で得られたＮＡＧ活性測定値との相関図である。
【図６】実施例９で得られた、本発明のＮＡＧ活性測定法の検量線の直線性を示す図である。
【図７】実施例９で得られた、本発明のＮＡＧ活性測定法の検量線の直線性を示す図である。
【図８】実施例９で得られた、本発明のＮＡＧ活性測定法の検量線の直線性を示す図である。
【００６９】
【符号の簡単な説明】
図１に於いて、−●−は従来品の６−メチル−２−ピリジル−Ｎ−アセチル−１−チオ−β−Ｄ−グルコサミニド（以下６−ＭＰＴ−ＮＡＧＳと略記する。）を用いて得られた結果を、−◆−は化合物［４］を用いて得られた結果を夫々示す。
図２に於いて、−○−は従来品の６−ＭＰＴ−ＮＡＧＳを用いて得られた結果を、−◆−は化合物［１］を用いて得られた結果を、−●−は化合物［２］を用いて得られた結果を、−△−は化合物［３］を用いて得られた結果を、−×−は化合物［４］を用いて得られた結果を夫々示す。
Claims (4)
- 一般式［１］
- ＧがＮ−アセチルグルコサミン残基である請求項１のヒドロキシアルキルピリジン誘導体。
- 請求項１に記載のヒドロキシアルキルピリジン誘導体を基質として用いることを特徴とする、Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼの活性測定方法。
- 請求項１に記載のヒドロキシアルキルピリジン誘導体を含んでなる、Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼの活性測定用試薬。
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