JP4225721B2 - アルカリプロテアーゼ - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は高い比活性及び酸化剤耐性を有し、洗浄剤配合酵素として有用な変異アルカリプロテアーゼ及びそれをコードする遺伝子に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
プロテアーゼは、衣料用洗剤をはじめとする各種洗浄剤、化粧料、浴用剤等のトイレタリー分野、食品改質剤をはじめとする食品分野、消化助剤や消炎剤といった医薬品等の多分野で利用されている。その中でも最も大量に工業生産され市場規模が大きいのは洗剤用アルカリプロテアーゼである。
【０００３】
衣料等の汚れはタンパク質だけでなく、脂質、固体粒子など複数の成分が含まれていることがほとんどであり、実質的な複合汚れに対して洗浄力の高い洗浄剤が望まれている。かかる観点から、本発明者らは、高濃度の脂肪酸存在下でもプロテアーゼ活性を保持し、タンパク質だけでなく皮脂等の汚れを含む複合汚れに対しても優れた洗浄力を示すバチルス属細菌の生産する分子量約４３，０００のアルカリプロテアーゼを見出し、先に特許出願した（ＷＯ９９／１８２１８）。
【０００４】
また、分子量約４３，０００のアルカリプロテアーゼは他のバチルス属細菌からもいくつか見出されているが、これらは従来からのズブチリシンタイプのセリンプロテアーゼよりも非常に高い酸化剤耐性を有しており、酸化耐性アルカリプロテアーゼとして新しいズブチリシンサブファミリーを形成するものと提唱されている（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ. ２７９、３１３−３１９、２０００）。
【０００５】
しかし、反応効率を向上させる為に比活性が高く、高濃度の酸化剤に対しても安定なより強い酸化剤耐性を示すアルカリプロテアーゼが求められていた。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは前記アルカリプロテアーゼの変異による新たな酵素の探索を行ってきたが、ズブチリシンに代表されるセリンプロテアーゼと前記アルカリプロテアーゼとは、酵素学的性質に差異が認められ、さらに検討を加えた結果、前記アルカリプロテアーゼの特性を保持し、比活性を向上させる或いは更に高い酸化剤耐性を付加するには、ある種のアルカリプロテアーゼにおいて、当該アミノ酸配列の特定位置に特定のアミノ酸残基が必要であることを見出した。
【０００７】
すなわち、本発明は、配列番号１の（ａ）２５１位、（ｂ）２５６位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基が欠失又は下記アミノ酸残基；
（ａ）位置：アスパラギン、グリシン、アラニン、アスパラギン酸、スレオニン、イソロイシン、バリン、ロイシン、グルタミン残基、
（ｂ）位置：リジン、セリン、グルタミン、フェニルアラニン、バリン、アルギニン、チロシン、ロイシン、イソロイシン、スレオニン、メチオニン、システイン、トリプトファン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、プロリン又はアラニン残基、
から選ばれたアルカリプロテアーゼ、及びそれをコードする遺伝子を提供するものである。
【０００８】
また本発明は該アルカリプロテアーゼをコードする遺伝子、該遺伝子を含有する組換えベクター、及び該ベクターを含有する形質転換体を提供するものである。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明のアルカリプロテアーゼは、上記のように、配列番号１の（ａ）２５１位、（ｂ）２５６位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基が欠失又は下記アミノ酸残基；
（ａ）位置：アスパラギン、グリシン、アラニン、アスパラギン酸、スレオニン、イソロイシン、バリン、ロイシン、グルタミン残基、（ｂ）位置：リジン、セリン、グルタミン、フェニルアラニン、バリン、アルギニン、チロシン、ロイシン、イソロイシン、スレオニン、メチオニン、システイン、トリプトファン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、プロリン又はアラニン残基、から選ばれたものである。
【００１０】
すなわち、本発明のアルカリプロテアーゼは、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するアルカリプロテアーゼにおける前記（ａ）及び（ｂ）から選ばれる位置のアミノ酸残基又は他種アルカリプロテアーゼのアミノ酸配列の当該位置に相当する位置のアミノ酸残基が欠失又は特定のアミノ酸残基であるプロテアーゼを意味し、これらは野生型、野生型の変異体或いは人為的に変異を施した変異体であってもよい。
【００１１】
ここで、「他種アルカリプロテアーゼ」としては、野生型又は野生型の変異体であってもよく、酸化剤耐性を有し、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）法による分子量が４３，０００±２，０００であることが好ましく、配列番号１に示すアミノ酸配列と６０％以上、好ましくは８０％以上の相同性をもつアミノ酸配列を有するものが挙げられる。特に好ましくは配列番号１に示すアミノ酸配列と８０％以上の相同性をもつアミノ酸配列を有し、ｐＨ８以上のアルカリ性領域で作用する、酸化剤耐性を有する、５０℃、ｐＨ１０で１０分間処理したとき８０％以上の残存活性を示す、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量が４３，０００±２，０００である酵素が挙げられる。ここで、酸化剤耐性を有するとは、当該アルカリプロテアーゼを５０ｍＭ過酸化水素、５ｍＭ塩化カルシウムを含む２０ｍＭブリットンロビンソン緩衝液（ｐＨ１０）中で、２０℃２０分間の放置後の残存活性が少なくとも５０％以上を保持していることをいう。
【００１２】
ここで、「配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するアルカリプロテアーゼ」としては、ＫＰ４３〔バチルス エスピーＫＳＭ−ＫＰ４３（ＦＥＲＭ ＢＰ−６５３２）由来、ＷＯ９９／１８２１８〕が挙げられ、「配列番号１に示すアミノ酸配列と６０％以上の相同性をもつアミノ酸配列を有するアルカリプロテアーゼ」としては、例えば配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するプロテアーゼＫＰ９８６０〔バチルス エスピーＫＳＭ−ＫＰ９８６０（ＦＥＲＭ ＢＰ−６５３４）由来、ＷＯ９９／１８２１８〕、配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するプロテアーゼＥ−１〔バチルス Ｎｏ．Ｄ−６（ＦＥＲＭ Ｐ−１５９２）由来、ＪＰ７４０７１０〕、配列番号４で示されるアミノ酸配列を有するプロテアーゼＹａ〔バチルス エスピーＹ（ＦＥＲＭ ＢＰ−１０２９）由来、ＪＰ８６１２１０〕、配列番号５で示されるアミノ酸配列を有するプロテアーゼＳＤ５２１〔バチルス ＳＤ５２１株（ＦＥＲＭ Ｐ−１１１６２）由来、ＪＰ９１０８２１〕、配列番号６で示されるアミノ酸配列を有するプロテアーゼＡ−１（ＮＣＩＢ１２２８９由来、ＷＯ８８０１２９３）、配列番号７で示されるアミノ酸配列を有するプロテアーゼＡ−２（ＮＣＩＢ１２５１３由来、ＷＯ８８０１２９３）、又は配列番号１〜７と８０％以上、好ましくは８７％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上の相同性を有するアルカリプロテアーゼが挙げられる。
なお、アミノ酸配列の相同性は、リップマン−パーソン（Lipman-Pearson）法（Science, 227,1435,1985）によって計算される。
【００１３】
また、「相当する位置のアミノ酸残基」を特定する方法としては、例えばリップマン−パーソン法等の公知のアルゴリズムを用いてアミノ酸配列を比較することにより行うことができる。プロテアーゼのアミノ酸配列をこのような方法で整列させることにより、相同アミノ酸残基の各プロテアーゼにおける配列中の位置を決めることが可能である。相同位置は、三次元構造中で同位置に存在すると考えられ、対象のプロテアーゼの特異的機能に関して類似した効果を有することが推定できる。
【００１４】
すなわち、（ａ）配列番号１の２５１位のアミノ酸残基はメチオニン残基であるが、その位置に相当する位置のアミノ酸残基は、上記の方法を用いることにより、例えば配列番号３においてはそれぞれ２５０位のメチオニン酸基というように特定することができる。当該アミノ酸残基は、アスパラギン、グリシン、アラニン、アスパラギン酸、スレオニン、イソロイシン、バリン、ロイシン、グルタミン残基であるのが好ましく、アスパラギン、スレオニン、イソロイシン、バリン、ロイシン、グルタミンであるのが特に好ましい。
【００１５】
（ｂ）配列番号１の２５６位のアミノ酸残基はメチオニン残基であるが、ここで、その位置に相当する位置のアミノ酸残基は、上記の方法を用いることにより、例えば配列番号３においてはそれぞれ２５５位のメチオニン残基というように特定することができる。当該アミノ酸残基は、グルタミン、アラニン、バリン、セリン、ロイシン、アスパラギン、グルタミン酸、アスパラギン酸残基であるのが好ましく、グルタミン、アラニン、バリン、セリン、アスパラギン残基であるのが特に好ましい。
【００１６】
プロテアーゼＫＰ４３のアミノ酸配列（配列番号１）の２５１位（ａ）、２５６位（ｂ）に相当する位置及びアミノ酸残基の具体例を、上記「他種アルカリプロテアーゼ」のうちの好適に用いられるもので示す（表１）。
【００１７】
【表１】

【００１８】
また、本発明アルカリプロテアーゼにおけるアミノ酸残基の欠失、（ａ）又は（ｂ）の選択は、２個所以上が同時になされていていもよい。
【００１９】
本発明のアルカリプロテアーゼが変異体である場合、変異を施す前のアルカリプロテアーゼ（親アルカリプロテアーゼということがある）としては、「配列番号１で示されるアミノ酸配列を有するプロテアーゼ」又は上述した「他種アルカリプロテアーゼ」として示したものが該当し、これに目的部位の変異を施すことにより本発明のアルカリプロテアーゼが得られる。例えばプロテアーゼＫＰ４３の配列番号１で示されるアミノ酸配列の前記（ａ）及び（ｂ）から選ばれる位置のアミノ酸残基又は他種アルカリプロテアーゼのアミノ酸配列、具体的には配列番号２〜７で示されるアミノ酸配列の前記位置に相当する位置のアミノ酸残基を欠失又は他のアミノ酸残基に置換することにより得られる。
【００２０】
本発明アルカリプロテアーゼは、例えば以下の方法により得ることができる。すなわち、クローニングされた親アルカリプロテアーゼをコードする遺伝子に対して変異を与え、得られた変異遺伝子を用いて適当な宿主を形質転換し、当該組換え宿主を培養することにより得られる。親アルカリプロテアーゼをコードする遺伝子のクローニングは、一般的な遺伝子組換え技術を用いればよく、例えばＷＯ９９／１８２１８、ＪＰ９０１１２８、ＷＯ９８／５６９２７記載の方法に従って行えばよい。
【００２１】
親アルカリプロテアーゼをコードする遺伝子の変異手段としては、一般的に行われているランダム変異や部異特異的変異の方法がいずれも採用できる。より具体的には、例えば宝酒造社のSite-Directed Mutagenesis System Mutan-Super Express Kmキット等を用いて行うことができる。また、リコンビナントＰＣＲ（polymerase chain reaction）法（PCR protocols, Academic press, New York, 1990）を用いることによって、遺伝子の任意の配列を他の遺伝子の該任意の配列に相当する配列と置換することが可能である。
【００２２】
得られた変異遺伝子を用いた本発明プロテアーゼの生産方法は、例えば当該変異遺伝子を安定に増幅できるＤＮＡベクターに連結させる、或いは当該変異遺伝子を安定に維持できる染色体ＤＮＡ上に導入させるなどの方法で本発明の変異プロテアーゼをコードするＤＮＡを安定に増幅し、さらに該遺伝子を安定にかつ効率よく発現させることが可能である宿主に導入し、変異プロテアーゼを生産させる方法が採用できる。この条件を満たす宿主としては例えばバチルス属細菌、大腸菌、カビ、酵母、放線菌などが挙げられる。
【００２３】
かくして得られる本発明のアルカリプロテアーゼは、アルカリ性領域において優れた比活性を有し、強い酸化剤耐性を有し、各種洗浄剤組成物配合用酵素として有用である。例えば、配列番号１のアミノ酸配列を有するプロテアーゼを親株とする変異プロテアーゼは、下記の理化学的性質を有する。
（ｉ）作用ｐＨ範囲：
ｐＨ４〜１３の広い範囲で作用し、ｐＨ６〜１２で最適ｐＨ活性値の８０％以上を示す。
（ii）安定ｐＨ範囲：
４０℃、３０分の処理条件でｐＨ６〜１１の範囲で安定である。
（iii）脂肪酸の影響：
オレイン酸によってカゼイン分解活性の阻害を受けない。
【００２４】
【実施例】
［プロテアーゼ活性測定法−カゼイン法］
カゼイン１％（ｗ／ｖ）を含む５０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ１０）１．０ｍＬを３０℃で５分間保温した後、０．１ｍＬの酵素溶液を加え、１５分間反応を行う。反応停止液（０．１１Ｍトリクロロ酢酸−０．２２Ｍ酢酸ナトリウム−０．３３Ｍ酢酸）を２．０mL加え、室温で３０分間放置したのち、濾過を行い、濾液中の酸可溶タンパク質をＬｏｗｒｙらの方法（Ｊ．Ｂｉｏｌ. Ｃｈｅｍ．、１９３、２６５−２７５、１９８１）によって定量した。すなわち、濾液にアルカリ性銅溶液［１％酒石酸ナトリウムカリウム：１％硫酸銅：１％炭酸ナトリウム＝１：１：１００］を２．５ｍＬ添加して室温で１０分間放置後、希釈フェノール液（フェノール試薬（関東化学）を脱イオン水で２倍希釈）０．２５ｍＬを添加して３０分間３０℃で保温したのち、６６０ｎｍにおける吸光度を測定した。酵素１単位は、上記反応にて１分間に１ｍｍｏｌのチロシンに相当する酸可溶性タンパク質分解物を遊離させるのに必要な酵素量とした。
【００２５】
［プロテアーゼ活性測定法−合成基質法］
合成基質（Ｌｅｕ-Ｓｅｒ-Ｔｈｒ-Ａｒｇ-ｐ-ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｄｅ、ペプチド研究所）６μＭを含む１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ１０．５）５０μＬに５０μＬの酵素溶液を加え、３０℃中で１５分間反応を行う。反応液の吸光度４１４nmを経過時間ごとに測定し、単位時間あたりの吸光度４１４nmの変化値からプロテアーゼ活性を求めた。
【００２６】
実施例１
プロテアーゼ構造遺伝子の終止コドンまでを含む約１．５ｋｂの範囲に対しランダムに変異を与えることとした。先ず、本１．５ｋｂを増幅できるプライマー（5'−GCGATGTTAAGTCAGCAACAAGC-3'（配列番号８）, 5'-CTATTAATTCACAATTGCCAACGAG（配列番号９））を用いＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応液（１００μＬ）中には鋳型ＤＮＡを５ｎｇ、リン酸化プライマーを２０ｐｍｏｌ、各ｄＮＴＰを２０ｎｍｏｌ、１μｍｏｌのトリス塩酸緩衝液(ｐＨ８．３）、５μｍｏｌの塩化カリウム、０．１５μｍｏｌの塩化マグネシウム、２．５ｕｎｉｔｓのＴａｑＤＮＡポリメラーゼを含んでいた。ＰＣＲの反応条件は、９４℃において５分間放置し鋳型を変性させた後、９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で１．５分間を１サイクルとしてこれを３０サイクル行った。ＰＣＲ product purificaton Kit（ベーリンガーマンハイム社）によってＰＣＲ産物を精製し１００μＬの滅菌水で溶出させた。引き続き、１μＬの溶出液を使用して２回目のＰＣＲを行った。ＰＣＲの条件は鋳型ＤＮＡ以外は全て１回目のＰＣＲ条件と同じとした。２回目のＰＣＲ後に１回目と同様にＰＣＲ産物を精製し１００μＬの滅菌水で溶出させた。
【００２７】
増幅ＤＮＡ断片のベクターへの組み込みはＴａｋａｒａ社のＬＡＴａｑを用いたポリメラーゼ反応による方法によって行った。即ち、２回目の精製溶出液３５μＬにＬＡＴａｑ用の緩衝液（１０倍濃縮液）を５μＬ、ｄＮＴＰ溶液を８μＬ、ＬＡＴａｑＤＮＡポリメラーゼを０．５μＬ、さらに鋳型としてプラスミドｐＨＡ６４ＴＳ（発現ベクターにプロテアーゼ構造遺伝子を連結したもの）を２０ｎｇ添加後、最終液量を５０μＬにし、９４℃１分間、５５℃１分間、７２℃４分間を３０サイクルの条件でＰＣＲ反応を行った。その後エタノール沈澱によってＰＣＲ産物を回収した。このＰＣＲ産物はプライマー位置の５'末端側にニックを有するプラスミドの形状を成しており、このニック部分を連結させるために、さらにＴ４リガーゼ（Ｔaｋaｒa社）による結合反応処理を行った。
【００２８】
次に、上記のリガーゼ反応液１０μＬを用いてBacillus subtilis ＩＳＷ１２１４株の形質転換を行ったところ約４×１０⁵個の形質転換体が取得された。そこでＩＳＷ１２１４株の形質転換体をスキムミルク含有培地（スキムミルク１％、バクトトリプトン１％、塩化ナトリウム１％、酵母エキス０．５％、寒天１．５％、テトラサイクリン７．５μｇ／ｍＬ）上に生育させ、プロテアーゼ分泌量を反映しているスキムミルク溶解斑の形成状態を観察した。その結果、野生型プラスミドによる形質転換体よりも明らかに大きな溶解斑を形成する形質転換体を検出した。
【００２９】
これらの形質転換体を培養し、培養上清よりプロテアーゼを精製したところ、比活性が向上していることことが判った。そこで、これらの変異酵素をコードする遺伝子の塩基配列を決定したところ、配列番号１に示すプロテアーゼの２５１位或いは２５６位のメチオニンがグルタミン或いはロイシンに置換している変異酵素であることが明らかになった。これらの変異はランダム変異の導入によって行われたので、次に２５１位或いは２５６位を上記のアミノ酸以外のアミノ酸に置換することを目的に部位特異的変異導入法による変異酵素の造成を試みた。
【００３０】
部位特異的変異の導入の方法はＯＤＡ法（Hashimoto-Gotoh et al.、Gene、 152、271-276、1995）を基にしてＴａｋａｒａ社のSite-directed Mutagenesis System Mutan-Super Express Km Kitのプロトコールに準じて行った。２５１位を代えるために5'-AAATATGCATACXXXGGTGGAACGTC-3'（配列番号１０）からなるプライマーを256位を代えるために5'-GGAACGTCCXXXGCTACACCGATC-3'（配列番号１１）からなるプライマーを使用した(ＸはATGCの混合)。
【００３１】
実施例２
プロテアーゼ活性画分の調製は、実施例１で得られた形質転換体をＡ培地（ ３％ ポリペプトンS（日本製薬）、０．５％ 酵母エキス、１％魚肉エキス（和光純薬）、０．１５％ リン酸二カリウム、0.02％ 硫酸マグネシウム７水和物、マルトース ４％、テトラサイクリン 7.5μｇ/ｍＬ）にて３０℃、６０時間培養し、得られた培養上清に９０％飽和となるように硫酸アンモニウムを添加し、タンパク質を塩析した。塩析で得られたサンプルを２ｍＭの塩化カルシウムを含有する１０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解した後、同緩衝液にて一晩透析を行なった。透析膜中の画分を２ｍＭの塩化カルシウムを含有する１０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したＤＥＡＥ Ｂｉｏ−ＧｅｌＡ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に添着させ、非吸着のプロテアーゼ活性画分を回収した。さらに活性画分を同緩衝液で平衡化したＳＰ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ５５０Ｗ（Ｔｏｓｏｈ）に添着させ、０−５０ｍＭの塩化ナトリウムを含む緩衝液を用いて吸着したタンパク質を溶出し、プロテアーゼ活性画分を得た。この画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動し、ほぼ均一なタンパク質としてプロテアーゼが得られていることを確認した。タンパク質濃度の測定は牛血清アルブミン(バイオラッド社製)を標準タンパク質として用いてＬｏｗｒｙらの方法に準じて行った。
【００３２】
実施例３
実施例２で得られた精製した各変異プロテアーゼの活性をカゼイン法によって測定した。各変異プロテアーゼの単位タンパク質量あたりの活性（比活性）の測定結果を図１に示した。本発明の変異アルカリプロテアーゼは親アルカリプロテアーゼに比べ高い比活性を有していた。
【００３３】
実施例４
実施例２で得られた精製した各変異プロテアーゼを３％の過酸化水素水を含有する１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ１０．５）２ｍＬ中に５０μＬずつ添加し、３０℃で３０分間放置した。余剰の過酸化水素を除くため充分量のカタラーゼ（ベーリンガーマンハイム社）を加えた後、残存プロテアーゼ活性を合成基質法にて測定した。各変異プロテアーゼの過酸化水素水処理後の残存活性を処理前の活性を１００％として相対値で図２に示した。本発明の変異アルカリプロテアーゼは親アルカリプロテアーゼに比較しより高い酸化剤耐性を有していた。
【００３４】
【発明の効果】
本発明によれば、反応効率が高く（高比活性）、強い酸化剤耐性を有する洗剤用アルカリプロテアーゼを提供できる。
【００３５】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】各変異アルカリプロテアーゼの相対比活性を示す図である。
【図２】各変異アルカリプロテアーゼの酸化剤処理後の相対残存活性を示す図である。

Claims (7)

1. 配列番号１の（ａ）２５１位、（ｂ）２５６位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基が下記アミノ酸残基；
   （ａ）位置：スレオニン、イソロイシン、バリン、グルタミン残基、
   （ｂ）位置：グルタミン残基、
   から選ばれたアルカリプロテアーゼ。
2. 配列番号１に示すアミノ酸配列又はこれと９０％以上の相同性をもつアミノ酸配列を有するアルカリプロテアーゼにおいて、配列番号１の（ａ）２５１位、（ｂ）２５６位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基が下記アミノ酸残基；
   （ａ）位置：スレオニン、イソロイシン、バリン、グルタミン残基、
   （ｂ）位置：グルタミン残基、
   から選ばれたアルカリプロテアーゼ。
3. 配列番号２〜７から選ばれるアミノ酸配列を有するアルカリプロテアーゼ又は配列番号２〜７から選ばれるアミノ酸配列と９０％以上の相同性をもつアミノ酸配列を有するアルカリプロテアーゼにおいて、配列番号１の（ａ）２５１位、（ｂ）２５６位又はこれに相当する位置のアミノ酸残基が下記アミノ酸残基；
   （ａ）位置：スレオニン、イソロイシン、バリン、グルタミン残基、
   （ｂ）位置：グルタミン残基、
   から選ばれたアルカリプロテアーゼ。
4. 請求項１〜３記載のアルカリプロテアーゼをコードする遺伝子。
5. 請求項４記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
6. 請求項５記載の組換えベクターを含有する形質転換体。
7. 宿主が微生物である請求項６記載の形質転換体。

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