JP4324365B2 - アルカリプロテアーゼ - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、産業用酵素、特に洗剤用酵素として有用な新規アルカリプロテアーゼ及びこれをコードする遺伝子に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
プロテアーゼは、衣料用洗剤をはじめとする各種洗浄剤、化粧料、浴用剤、食品改質剤、消化補助剤或いは消炎剤といった様々な用途、分野で利用され、工業用酵素の中で最も生産量が多い。中でもアルカリプロテアーゼは、洗剤用酵素として、洗浄力の向上に不可欠な一成分として重要な役割を果たしてきている。
【０００３】
現在用いられている洗剤用アルカリプロテアーゼには、バチルス属細菌由来で、ズブチリシンファミリーに属し、分子量２８ｋＤａ付近の、サビナーゼ（登録商標；ノボザイム社製）、カンナーゼ（登録商標；ノボザイム社製）、デュラザイム（登録商標；ノボザイム社製）、マキサカル（登録商標；ジェネンコア社製）、ブラップ（登録商標；ヘンケル社製）、ＫＡＰ（花王社製）（特許文献１、特許文献２、非特許文献１参照）や、同様にバチルス属細菌由来であり、分子量が４３ｋＤａ付近で、酸化剤耐性を有するアルカリプロテアーゼの一群が知られている（特許文献３参照）。
【０００４】
しかしながら、これらのアルカリプロテアーゼは、アルカリ耐性、界面活性剤耐性、酸化剤耐性、低温活性、耐熱性、洗浄性、低い基質特異性、キレート剤耐性、金属イオン耐性等において一長一短のあるものであり、また、上記アルカリプロテアーゼのように分子量が２８〜４５ｋＤａ付近のものは、製造プロセスにおいて、培養液や酵素溶液の濃縮に用いる限外濾過膜から酵素が漏出して、濃縮収率を下げるという問題があった。
【０００５】
本発明は、上記のような洗剤用アルカリプロテアーゼ或いは従来の真性ズブチリシンと比べて分子量が大きく、且つアミノ酸配列において同一性が低い新たな洗剤用アルカリプロテアーゼ並びにこれをコードする遺伝子を提供することを目的とする。
【０００６】
【特許文献１】
特開平４−３４９８８２号公報
【特許文献２】
特表平８−５０８６４３号公報
【特許文献３】
国際公開第９９／１８２１８号パンフレット
【非特許文献１】
Guptaら Appl. Microbiol. Biotechnol. 59, 15-32, 2002
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、好アルカリ性バチルス属細菌が生産する新規なプロテアーゼをを探索すべくスクリーニングを行ったところ、分子量の大きなアルカリプロテアーゼを生産している幾つかの微生物を見出し、さらに当該微生物からアルカリプロテアーゼコードする遺伝子をクローン化し、これを用いることにより洗剤用酵素として有用なアルカリプロテアーゼを工業的に製造できることを見出した。
【０００８】
すなわち本発明は、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質；
（ａ）配列番号１〜４より選ばれるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）（ａ）の各アミノ酸配列において、１若しくは２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つアルカリプロテアーゼ活性を有するタンパク質、及び配列番号１のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有し、且つアルカリプロテアーゼ活性を有するタンパク質、当該タンパク質をコードする遺伝子、当該遺伝子を含有する組換えベクター並びに該組換えベクターを含む形質転換体を提供するものである。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明のタンパク質（以下、「アルカリプロテアーゼ」ともいう）は、（ａ）配列番号１〜４より選ばれるアミノ酸配列からなるタンパク質、（ｂ）（ａ）の各アミノ酸配列において、１若しくは２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つアルカリプロテアーゼ活性を有するタンパク質、又は配列番号１のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有し、且つアルカリプロテアーゼ活性を有するタンパク質であり、本発明の遺伝子は、当該タンパク質をコードするＤＮＡである。
【００１０】
ここで、（ａ）のアミノ酸配列において、１若しくは２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列とは、配列番号１〜４の各アミノ酸配列と等価のアミノ酸配列を意味し、１若しくは数個、好ましくは１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、依然としてアルカリプロテアーゼ活性を保持する配列をいい、付加には、両末端への１〜数個のアミノ酸の付加が含まれる。
尚、当該等価のアミノ酸配列をコードする塩基配列は、部位特異的突然変異誘発法等の公知の手法を利用して調製することができる。例えば、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット[ Mutan-super Express Km キット（Takara）]等を用いて変異を導入すればよい。
【００１１】
本発明の配列番号１〜４のアミノ酸配列からなるタンパク質は、アミノ酸配列において互いに類似するプロテアーゼであり、配列番号１のアミノ酸配列と配列番号２、３及び４のアミノ酸配列とは、それぞれ９５．０％、９０．５％、８２．６％の同一性を有する。
すなわち、本発明のアルカリプロテアーゼは、配列番号１のアミノ酸配列において相当する配列を適切にアライメントした時、８０％以上の同一性を有するアルカリプロテアーゼを包含するものであり、配列番号１〜４のアミノ酸配列における同一性が、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上であるものが望ましい。
【００１２】
配列番号１〜４のアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼを他の公知であるアルカリプロテアーゼのアミノ酸配列と比較した場合、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｆｉｌｉｓ 由来のマイナーセリンプロテアーゼ（Ｖｐｒ）と５４〜５７％の同一性を示すにすぎない。また、この他に同一性を示すようなアミノ酸配列も見当たらない。これらの結果は、本発明のアルカリプロテアーゼが新規な酵素であることを示唆するものである。
尚、ここでいう同一性の検索はＧＥＮＥＴＹＸ−ＷＩＮ（ソフトウェア開発）のサーチホモロジ−プログラムを用いて算出できる。
【００１３】
本発明の遺伝子は、上記の通り、配列番号１〜４より選ばれるアミノ酸配列からなるタンパク質、当該アミノ酸配列と等価のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号１のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有し、且つアルカリプロテアーゼ活性を有するタンパク質をコードするものであるが、例えば、配列番号５の第４５７番目から第２４２４番目までの塩基配列で示されるＤＮＡ、配列番号６の第４５７番目から第２４２４番目までの塩基配列で示されるＤＮＡ、配列番号７の第４５７番目から第２４２４番目までの塩基配列で示されるＤＮＡ、配列番号８の第４５４番目から第２４２１番目までの塩基配列で示されるＤＮＡが挙げられ、好ましくは、（ａ）配列番号５〜８より選ばれる塩基配列で示されるＤＮＡ、又は（ｂ）（ａ）の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つアルカリプロテアーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。
【００１４】
ここで「ストリンジエントな条件下」とは、例えば「Molecular cloning - a Laboratory manual 2nd edition」(Sambrookら、1989)に記載の条件等が挙げられる。例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ 塩化ナトリウム、０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．５％ ＳＤＳ、５×デンハート及び１００ｍｇ／ｍＬニシン***ＤＮＡを含む溶液にプローブとともに６５℃で８〜１６時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件が挙げられる。
【００１５】
本発明のアルカリプロテアーゼは、分子量４３ｋＤａ付近の酸化剤耐性を有するアルカリプロテアーゼを生産する公知のバチルス属細菌の染色体ＤＮＡからクローニングすることにより大量に生産することができる。
すなわち、配列番号１のアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼについては、例えばバチルス エスピー ＫＳＭ−ＫＰ４３株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６５３２）、配列番号２のアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼについては、例えばバチルス エスピー ＫＳＭ−９８６５株（ＦＥＲＭ Ｐ−１８５６６）、配列番号３のアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼについては、例えばバチルス エスピー ＫＳＭ−ＫＰ９８６０株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６５３４）、配列番号４のアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼについては、例えばバチルス エスピーＮＣＩＭＢ１２２８９株の染色体ＤＮＡからクローニングし、適当なベクターと宿主菌を用いて大量に生産することができる。
【００１６】
本発明の遺伝子は、上述したアルカリプロテアーゼ産生菌、例えばBacillus属に属する微生物、好ましくはバチルス エスピー ＫＳＭ−ＫＰ４３株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６５３２）、ＫＳＭ−９８６５株（ＦＥＲＭ Ｐ−１８５６６）、ＫＳＭ−ＫＰ９８６０株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６５３４）、ＮＣＩＭＢ１２２８９株等から、例えばショットガン法、ＰＣＲ法を用いることよりクローニングすることができる。
【００１７】
本発明遺伝子を用いてアルカリプロテアーゼを生産するには、目的とする宿主内で遺伝子を発現するのに適した任意のベクターに、上記アルカリプロテアーゼ遺伝子（例えば、配列番号５〜８の塩基配列で示されるＤＮＡ）を組込み、該組換えベクターを用いて宿主を形質転換し、得られた形質転換体を培養し、当該培養液からアルカリプロテアーゼを採取すればよい。
培養は微生物が資化可能な炭素源、窒素源その他の必須栄養素を含む培地に接種し、常法に従って行えばよい。
【００１８】
かくして得られた培養物中からのアルカリプロテアーゼの採取及び精製は、一般の方法に準じて行うことができる。即ち、培養物から遠心分離又は濾過することで菌体を除き、得られた培養上清液から常法手段により目的酵素を濃縮することができる。このようにして得られた酵素液又は乾燥粉末はそのまま用いることもできるが更に公知の方法により結晶化や造粒化することができる。
【００１９】
本発明のアルカリプロテアーゼの特徴としては、次のような性質が好ましい。すなわち、分子量７２，０００±２，０００（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法）、合成基質（Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−ｐＮＡ）を用いた場合、最適反応ｐＨを１０−１１付近（炭酸緩衝液）、最適温度を４５℃付近に有し、耐熱性は４５℃付近まで安定（ｐＨ１０、１５分間の処理）である。
【００２０】
【実施例】
実施例１ バチルス エスピー ＫＳＭ−ＫＰ４３株由来のアルカリプロテアーゼＦＴの精製
バチルス エスピー ＫＳＭ−ＫＰ４３株を６．０％（ｗ／ｖ） ポリペプトンＳ（日本製薬）、０．１％ 酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ）、０．１％ＫＨ2ＰＯ4、０．０２％ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、５．０％マルトース、１．５％ Ｎａ2ＣＯ3から成る培地に接種し、３０℃で３日間振盪培養を行った。菌体を遠心分離により除去し上清を得た後、氷冷下にて８０％飽和となるように硫酸アンモニウムを添加し塩析を行った。生じた沈殿を遠心分離により集め、５ｍＭの塩化カルシウムを含む１０ｍＭトリス塩酸塩緩衝液（緩衝液Ａ：ｐＨ７．５）に溶解した後、同緩衝液にて一晩透析を行った。透析内液を、あらかじめ、緩衝液Ａにて平衡化しておいたＤＥＡＥ トヨパール ６５０Ｃ（東ソー：２．５×１２ｃｍ）に添着した。次に０．５Ｍ 塩化ナトリウムまでの濃度勾配法により吸着タンパク質の溶出を行い、０．２５Ｍの塩化ナトリウム濃度付近にプロテアーゼ活性を示す画分を得た。この画分を集め、緩衝液Ａにて透析後、同緩衝液にて平衡化しておいたＳＰ トヨパール ５５０Ｃ（東ソー：２．５×１２ｃｍ）に添着した。次いで０．５Ｍ 塩化ナトリウムまでの濃度勾配法により吸着タンパク質の溶出を行い、０．３５Ｍの塩化ナトリウム濃度付近にプロテアーゼ活性を示す画分を得た。この画分をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）法により分析した結果、アルカリプロテアーゼＦＴは分子量７２，０００±２，０００の均一なタンパク質バンドとして検出された。
【００２１】
実施例２ アルカリプロテアーゼＦＴのＮ末アミノ酸配列の決定
実施例１において精製されたアルカリプロテアーゼ溶液をメタノールで処理したＰｒｏｓｏｒｂ ｆｉｌｔｅｒ（アプライドバイオシステム）に吸着させ、プロテインシーケエンサー（４７６Ａ型：アプライドバイオシステム）によりＮ末端アミノ酸配列を決定した。その結果、Ｍｅｔ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ＩＩｅ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｇｌｙの２０残基のアミノ酸配列が得られた。
【００２２】
実施例３ アルカリプロテアーゼＦＴ遺伝子のクローニング
バチルス エスピー ＫＳＭ−ＫＰ４３株をＬＢに０．０５％炭酸ナトリウムを添加した培地に接種し、３０℃で適当な時間振盪培養を行い菌体を集めた。斎藤と三浦の方法（Biochim. Biophys. Acata, 72, 619-629, 1963）に準じ菌体からゲノムＤＮＡを調製し、ＥｃｏＲＩで部分分解を行った。ＬＡ ＰＣＲ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｃｌｏｎｉｎｇキット（Ｔａｋａｒａ）中のＥｃｏＲＩカセットに上記部分分解断片を連結させ、実施例２で決定したＮ末アミノ酸配列をもとに合成したプライマーＡ（配列番号９）とキット付属のプライマーＣ１を用いてＰＣＲを行った。反応は、カセットを連結したＤＮＡ断片（１．０〜５０ｎｇ）を鋳型とし１０〜２０ｐｍｏｌの各プライマーを用い（５０μＬ反応系）、９４℃１分間の熱変性後、９４℃３０秒、４５℃２分間、７２℃１分間を１サイクルとし３０サイクル行った。得られた増幅ＤＮＡ断片をＨｉｇｈ Ｐｕｒｅ ＰＣＲ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ キット（ロシュ）にて精製し、１００倍希釈したもの１μＬを鋳型に１０〜２０ｐｍｏｌのＮ末アミノ酸配列をもとに合成したプライマーＢ（配列番号１０）とキット付属のプライマーＣ２を添加し（５０μＬ反応系）、上記条件と同様にＰＣＲを行った。増幅した約８６０ｂｐのＤＮＡ断片の塩基配列はＢｉｇＤｙｅTM Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ（アプライドバイオシステム）及び３７７ＤＮＡシーケンサー（アプライドバイオシステム）を用いて決定した。得られた塩基配列を基に上流及び下流方向の塩基配列決定に適したプライマーを合成し、先に調製したＥｃｏＲＩカセットを鋳型にＰＣＲを行い全塩基配列決定した。
決定した配列を基に構造遺伝子上流の推定プロモーター領域から終始コドン下流のインバーティッドリピート配列を含む領域を増幅するためにプライマーＣ（配列番号１１）及びプライマーＤ（配列番号１２）を合成した。バチルス エスピー ＫＳＭ−ＫＰ４３株のゲノムＤＮＡ（０．１〜１．０ｎｇ）を鋳型とし１０〜２０ｐｍｏｌのプライマーＣ及びＤを用いてＰＣＲを行った。反応は９４℃で３分間の熱変性後、９４℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃３分間を１サイクルとし３０サイクル行った。得られたＰＣＲ増幅断片を精製し、ＴａＫａＲａ ＢＫＬ キット（Ｔａｋａｒａ）にて末端平滑化とリン酸化を行った後、ＳｍａＩ及びアルカリフォスファターゼ（ロシュ）処理を行ったプラスミドｐＨＹ３００ＰＬＫ（Ｔａｋａｒａ）に結合し、組換えプラスミドｐＨＹＦＴを調製した。
【００２３】
実施例４ バチルス エスピー ＫＳＭ−９８６５株由来のアルカリプロテアーゼＳＦ遺伝子のクローニング
バチルス エスピー ＫＳＭ−９８６５株から実施例３と同様にゲノムＤＮＡを調製した。これを鋳型としてアルカリプロテアーゼＳＦをコードする遺伝子の推定プロモーター領域の配列を利用し合成したプライマーＥ（配列番号１３）及び終始コドン下流の配列を利用し合成したプライマーＦ（配列番号１４:５'末端にはＰｓｔＩリンカーを付与）を添加し、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ）を用いてプロテアーゼ遺伝子領域を増幅した。反応は９４℃で２分間熱変性後、９６℃２０秒、５２℃３０秒、７２℃５分を１サイクルとして３０サイクルを行った。得られたＰＣＲ増幅断片を精製し、プライマーＥ、Ｆ及び塩基配列決定の過程で得られた情報を基に構築したプライマーを用いて塩基配列を決定した。さらに精製増幅断片をＰｓｔＩにて処理し、同様
に処理したプラスミドｐＨＹ３００ＰＬＫに組込みｐＨＹＳＦを作製した。
【００２４】
実施例５ バチルス エスピー ＫＳＭ−９８６０株由来のアルカリプロテアーゼＳＺ遺伝子のクローニング
バチルス エスピー ＫＳＭ−ＫＰ９８６０株のゲノムＤＮＡを実施例３と同様に調製した後、これを鋳型としプライマーＧ及びＨ（配列番号１５及び１６）を用いてＥｘＴａｑ（Ｔａｋａｒａ）によりＰＣＲを行った。反応は９４℃で２分間鋳型ＤＮＡを変性させた後、９４℃１分間、５０℃１分間、７２℃１分３０秒間を１サイクルとし３０サイクル行った。その結果、約１ｋｂのＤＮＡ増幅断片が認められた。ＰＣＲ産物を精製し、プライマーＧ及びＨを用いて塩基配列の解析を行った。次にインバースＰＣＲにより全構造遺伝子の塩基配列を決定した。即ち、ＫＳＭ−ＫＰ９８６０株のゲノムＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ或いはＢｇｌIIにより３７℃にて完全分解した後、７０℃で１５分間処理し制限酵素を熱失活させた。その後、反応液と等量のＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ キット ｖｅｒ．２（Ｔａｋａｒａ）を加え、１６℃で１昼夜ライゲーション反応を行い、インバースＰＣＲ用の鋳型を調製した。約１ｋｂの部分遺伝子配列からプライマーＩ及びＪ（配列番号１７及び１８）を合成し、得られたインバースＰＣＲ用の鋳型を用いてＬａＴａｑ（Ｔａｋａｒａ）によりＰＣＲを行った。反応は９４℃で２分間鋳型ＤＮＡを変性させた後、９４℃１分間、５０℃１分間、７２℃４分間を１サイクルとし３０サイクル行った。その結果、ＥｃｏＲI分解物のセルフライゲーションＤＮＡを鋳型としたＰＣＲにより、約２．２ｋｂのＤＮＡ増幅断片、又、ＢｇｌII分解物のセルフライゲーションＤＮＡを鋳型としたＰＣＲにより、約２ｋｂのＤＮＡ増幅断片が認められた。得られたＰＣＲ産物を精製し、プライマーＩ及びＪを用いて塩基配列の解析を行った。その結果、３２９３ｂｐの塩基配列が決定され、プロモーター領域からターミネーター領域を含む遺伝子領域を増幅出来るプライマーＫ及びＬ（配列番号１９及び２０）を合成した。その際にプライマーＫの５’末端にはＳａｌＩリンカーをプライマーＬの５’末端側にＸｂａＩリンカーを付与した。
ＫＳＭ−ＫＰ９８６０株のゲノムＤＮＡを鋳型としプライマーＫ及びＬを用いてＰｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅによりＰＣＲを行った。反応は９４℃で２分間鋳型ＤＮＡを変性させた後、９４℃１分間、５５℃１分間、７２℃３分間を１サイクルとし、３０サイクル行った。その結果、約２．８ｋｂのＤＮＡ増幅断片が認められた。ＰＣＲ産物を精製し、得られた約２．８ｋｂのＤＮＡ断片を、ＳａｌＩ、ＸｂａＩにより処理し、同様に処理したプラスミドｐＨＹ３００ＰＬＫを混合した後、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（東洋紡）により、ライゲーション反応を行い、ｐＨＹＳＺを作製した。
【００２５】
実施例６ バチルス エスピー ＮＣＩＭＢ１２２８９株由来のアルカリプロテアーゼＮＶ遺伝子のクローニング
前記、バチルス エスピー ＫＳＭ−ＫＰ４３株、バチルス エスピー ＫＳＭ−ＫＰ９８６０株、バチルス エスピー ＫＳＭ−９８６５株由来のアルカリプロテアーゼをコードする遺伝子間の同一性検索の結果からプライマーＭ及びＮ（配列番号２１及び２２）を合成した。バチルス エスピーＮＣＩＭＢ１２２８９株のゲノムＤＮＡを鋳型としてプライマーＭ及びＮを用いてＥｘＴａｑによりＰＣＲを行った。反応は９４℃で２分間鋳型ＤＮＡを変性させた後、９４℃１分間、５５℃１分間、７２℃２分間を１サイクルとし３０サイクル行った。ＰＣＲ産物を精製し、プライマーＭ及びＮを用いて約２ｋｂのＤＮＡ増幅断片の塩基配列解析を行った。次いで実施例５と同様にインバースＰＣＲによりプロモーター、ターミネーター領域を含めた全構造遺伝子の塩基配列を決定した。即ち、ＮＣＩＭＢ１２２８９株のゲノムＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＢｇｌＩＩ或いはＰｓｔＩにより３７℃にて完全分解した後、７０℃で１５分間処理し制限酵素を熱失活させた。その後、１６℃で１昼夜セルフライゲーション反応を行い、インバースＰＣＲ用の鋳型を調製した。合成したプライマーＯ、Ｐ及びＱ（配列番号２３−２５）を用い、ＬａＴａｑによりＰＣＲを行った。ＥｃｏＲＩ分解物のセルフライゲーションＤＮＡ及びＢｇｌＩＩ分解物のセルフライゲーションＤＮＡに対してはプライマーＯ及びＱをＰｓｔＩ分解物のセルフライゲーションＤＮＡに対してはプライマーＰ及びＱを用いた。反応条件は９４℃で２分間鋳型ＤＮＡを変性させた後、９４℃１分間、５５℃１分間、７２℃４分間を１サイクルとし３０サイクル行った。その結果、ＥｃｏＲＩ分解物のセルフライゲーションＤＮＡを鋳型としたＰＣＲにより、約２ｋｂのＤＮＡ増幅断片、ＢｇｌＩＩ分解物のセルフライゲーションＤＮＡを鋳型としたＰＣＲにより、約３ｋｂのＤＮＡ増幅断片、又、ＰｓｔＩ分解物のセルフライゲーションＤＮＡを鋳型としたＰＣＲにより、約３ｋｂのＤＮＡ増幅断片がそれぞれ認められた。得られたＰＣＲ産物を精製し、プライマーＯ及びＱを用いて塩基配列の解析を行った。次いで実施例５と同様に合成したプライマーＲ及びＳ（配列番号２６及び２７）とＮＣＩＭＢ１２２８９株のゲノムＤＮＡを鋳型にしＰＣＲを行い、最終的にｐＨＹＮＶを作製した。
【００２６】
実施例７ アルカリプロテアーゼの組換え生産
ｐＨＹＦＴ、ｐＨＹＳＦ、ｐＨＹＳＺ及びｐＨＹＮＶを用いて、ＫＳＭ−９８６５株の変異株（分子量２８ｋＤａ、７２ｋＤａの２種類のアルカリプロテアーゼ遺伝子を破壊した株）をエレクトロポレーション法で形質転換処理した。スキムミルク含有アルカリＬＢ寒天培地（０．０５％炭酸ナトリウム並びに１５ｐｐｍテトラサイクリンを含む）に塗沫し、スキムミルク溶解斑の有無からプロテアーゼ遺伝子が導入された形質転換体を選抜した。得られた各形質転換体を５ｍLの種母培地[６．０％（ｗ／ｖ）ポリペプトンＳ、０．１％酵母エキス、１．０％マルトース、０．０２％硫酸マグネシウム７水和物、０．１％リン酸２水素カリウム、０．３％無水炭酸ナトリウム、３０ｐｐｍテトラサイクリン]に植菌し、３０℃で１６時間振盪培養を行った。この種母培養液を３０ｍLの主培地[８％ポリペプトンＳ、０．３％酵母エキス、１０％マルトース、０．０４％硫酸マグネシウム７水和物、０．２％リン酸２水素カリウム、１．５％無水炭酸ナトリウム、３０ｐｐｍテトラサイクリン]に１％（ｖ／ｖ）植菌し、３０℃で３日間振盪培養を行った。
【００２７】
実施例８ 組換えアルカリプロテアーゼの精製
実施例７で得られたＫＰ４３株由来の組換えプロテアーゼＦＴを含む培養液８０ｍＬを０．２Ｍ塩化カリウム含有の５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）にて平衡化しておいたＳｕｐｅｒＱトヨパール６５０Ｍカラム（東ソー：２．５×１４ｃｍ）へ添着した。同緩衝液で非吸着タンパク質を溶出させた後、０．２〜０．４Ｍ塩化カリウムまでの濃度勾配法により吸着タンパク質の溶出を行った。その結果、０．３Ｍ塩化カリウム付近にプロテアーゼ活性を含む画分が溶出された。この画分に０．７５Ｍになるように硫酸アンモニウムを添加し、予め０．７５Ｍ硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）にて平衡化しておいたフェニルトヨパールカラム（東ソー：２．５×８ｃｍ）に添着させた。同緩衝液にて非吸着タンパク質を溶出させた後、０．７５Ｍ〜硫酸アンモニウム無添加までの濃度勾配法により吸着タンパク質の溶出を行った。その結果、０．２５Ｍ以下の硫酸アンモニウム付近にプロテアーゼ活性を示す画分を得た。この画分のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った結果、分子量約７２０００のほぼ均一なタンパク質バンドを検出した。上記の精製法によりＫＰ４３株由来の組換えプロテアーゼは、活性収率８４％、約４倍に精製され、比活性１０２Ｕ／ｍｇであった。実施例７で得られたいずれの培養液からも同様の操作により各精製プロテアーゼを得ることができた。
【００２８】
実施例９ 組換えアルカリプロテアーゼの酵素学的性質
実施例８で得られた精製アルカリプロテアーゼの活性を測定する場合は合成基質法により行った。即ち、０．２５ｍＬの０．１Ｍ緩衝液、０．０２５ｍＬの５０ｍＭＡＡＰＬ（N-succinyl-Ala-Ala-Pro-Leu-p-nitroanilide）、０．２ｍＬの脱イオン水からなる反応液を３０℃で５分間、恒温した後、適当に希釈した酵素液を０．０２５ｍＬ添加し、反応を開始した。３０℃で１０分間恒温した後、２ｍＬの５％(w/v)クエン酸を添加し、反応を停止した。次いで反応中に生成されたｐ−ニトロアニリンの４２０ｎｍにおける吸光度を測定した。酵素１単位（Ｕ）は、上記反応条件下において１分間に１μｍｏＬのｐ−ニトロアニリンを生成する量とした。
【００２９】
（１）最適反応ｐＨ
ｐＨ４−１２．５の各緩衝液中にて酵素反応を行った結果、いずれの酵素もｐＨ１０．５の炭酸緩衝液において最も高い分解活性を示した。
【００３０】
（２）最適温度
５０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ１０）中、５〜６０℃の範囲で酵素反応を行った結果、いずれの酵素も４０〜４５℃において最も高い分解活性を示した。また、反応液に２ｍＭ塩化カルシウムを添加しても最大活性を与える反応温度は変化せず、活性化も殆ど起こらないことが特徴であった。
【００３１】
（３）耐熱性
５０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ１０）中、２０〜５５℃の範囲で各酵素を１５分間恒温した。その後、氷冷し酵素反応を行った結果、いずれの酵素も４０℃までは安定であった。また、５ｍＭ塩化カルシウムを添加し、恒温処理した場合においても同様な結果であった。
【００３２】
【発明の効果】
本発明のアルカリプロテアーゼは、最適温度が中低温域にあることから洗剤用酵素として有用であり、且つ従来のズブチリシンとは異なり分子量が大きいことから、製造プロセスにおいて、培養液や酵素溶液の濃縮に用いる限外濾過膜から酵素が漏出することによって濃縮収率が低下することがない。
【００３３】
【配列表】
【発明の属する技術分野】
本発明は、産業用酵素、特に洗剤用酵素として有用な新規アルカリプロテアーゼ及びこれをコードする遺伝子に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
プロテアーゼは、衣料用洗剤をはじめとする各種洗浄剤、化粧料、浴用剤、食品改質剤、消化補助剤或いは消炎剤といった様々な用途、分野で利用され、工業用酵素の中で最も生産量が多い。中でもアルカリプロテアーゼは、洗剤用酵素として、洗浄力の向上に不可欠な一成分として重要な役割を果たしてきている。
【０００３】
現在用いられている洗剤用アルカリプロテアーゼには、バチルス属細菌由来で、ズブチリシンファミリーに属し、分子量２８ｋＤａ付近の、サビナーゼ（登録商標；ノボザイム社製）、カンナーゼ（登録商標；ノボザイム社製）、デュラザイム（登録商標；ノボザイム社製）、マキサカル（登録商標；ジェネンコア社製）、ブラップ（登録商標；ヘンケル社製）、ＫＡＰ（花王社製）（特許文献１、特許文献２、非特許文献１参照）や、同様にバチルス属細菌由来であり、分子量が４３ｋＤａ付近で、酸化剤耐性を有するアルカリプロテアーゼの一群が知られている（特許文献３参照）。
【０００４】
しかしながら、これらのアルカリプロテアーゼは、アルカリ耐性、界面活性剤耐性、酸化剤耐性、低温活性、耐熱性、洗浄性、低い基質特異性、キレート剤耐性、金属イオン耐性等において一長一短のあるものであり、また、上記アルカリプロテアーゼのように分子量が２８〜４５ｋＤａ付近のものは、製造プロセスにおいて、培養液や酵素溶液の濃縮に用いる限外濾過膜から酵素が漏出して、濃縮収率を下げるという問題があった。
【０００５】
本発明は、上記のような洗剤用アルカリプロテアーゼ或いは従来の真性ズブチリシンと比べて分子量が大きく、且つアミノ酸配列において同一性が低い新たな洗剤用アルカリプロテアーゼ並びにこれをコードする遺伝子を提供することを目的とする。
【０００６】
【特許文献１】
特開平４−３４９８８２号公報
【特許文献２】
特表平８−５０８６４３号公報
【特許文献３】
国際公開第９９／１８２１８号パンフレット
【非特許文献１】
Guptaら Appl. Microbiol. Biotechnol. 59, 15-32, 2002
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、好アルカリ性バチルス属細菌が生産する新規なプロテアーゼをを探索すべくスクリーニングを行ったところ、分子量の大きなアルカリプロテアーゼを生産している幾つかの微生物を見出し、さらに当該微生物からアルカリプロテアーゼコードする遺伝子をクローン化し、これを用いることにより洗剤用酵素として有用なアルカリプロテアーゼを工業的に製造できることを見出した。
【０００８】
すなわち本発明は、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質；
（ａ）配列番号１〜４より選ばれるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）（ａ）の各アミノ酸配列において、１若しくは２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つアルカリプロテアーゼ活性を有するタンパク質、及び配列番号１のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有し、且つアルカリプロテアーゼ活性を有するタンパク質、当該タンパク質をコードする遺伝子、当該遺伝子を含有する組換えベクター並びに該組換えベクターを含む形質転換体を提供するものである。
【０００９】
【発明の実施の形態】
本発明のタンパク質（以下、「アルカリプロテアーゼ」ともいう）は、（ａ）配列番号１〜４より選ばれるアミノ酸配列からなるタンパク質、（ｂ）（ａ）の各アミノ酸配列において、１若しくは２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つアルカリプロテアーゼ活性を有するタンパク質、又は配列番号１のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有し、且つアルカリプロテアーゼ活性を有するタンパク質であり、本発明の遺伝子は、当該タンパク質をコードするＤＮＡである。
【００１０】
ここで、（ａ）のアミノ酸配列において、１若しくは２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列とは、配列番号１〜４の各アミノ酸配列と等価のアミノ酸配列を意味し、１若しくは数個、好ましくは１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列であって、依然としてアルカリプロテアーゼ活性を保持する配列をいい、付加には、両末端への１〜数個のアミノ酸の付加が含まれる。
尚、当該等価のアミノ酸配列をコードする塩基配列は、部位特異的突然変異誘発法等の公知の手法を利用して調製することができる。例えば、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット[ Mutan-super Express Km キット（Takara）]等を用いて変異を導入すればよい。
【００１１】
本発明の配列番号１〜４のアミノ酸配列からなるタンパク質は、アミノ酸配列において互いに類似するプロテアーゼであり、配列番号１のアミノ酸配列と配列番号２、３及び４のアミノ酸配列とは、それぞれ９５．０％、９０．５％、８２．６％の同一性を有する。
すなわち、本発明のアルカリプロテアーゼは、配列番号１のアミノ酸配列において相当する配列を適切にアライメントした時、８０％以上の同一性を有するアルカリプロテアーゼを包含するものであり、配列番号１〜４のアミノ酸配列における同一性が、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上であるものが望ましい。
【００１２】
配列番号１〜４のアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼを他の公知であるアルカリプロテアーゼのアミノ酸配列と比較した場合、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｆｉｌｉｓ 由来のマイナーセリンプロテアーゼ（Ｖｐｒ）と５４〜５７％の同一性を示すにすぎない。また、この他に同一性を示すようなアミノ酸配列も見当たらない。これらの結果は、本発明のアルカリプロテアーゼが新規な酵素であることを示唆するものである。
尚、ここでいう同一性の検索はＧＥＮＥＴＹＸ−ＷＩＮ（ソフトウェア開発）のサーチホモロジ−プログラムを用いて算出できる。
【００１３】
本発明の遺伝子は、上記の通り、配列番号１〜４より選ばれるアミノ酸配列からなるタンパク質、当該アミノ酸配列と等価のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号１のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有し、且つアルカリプロテアーゼ活性を有するタンパク質をコードするものであるが、例えば、配列番号５の第４５７番目から第２４２４番目までの塩基配列で示されるＤＮＡ、配列番号６の第４５７番目から第２４２４番目までの塩基配列で示されるＤＮＡ、配列番号７の第４５７番目から第２４２４番目までの塩基配列で示されるＤＮＡ、配列番号８の第４５４番目から第２４２１番目までの塩基配列で示されるＤＮＡが挙げられ、好ましくは、（ａ）配列番号５〜８より選ばれる塩基配列で示されるＤＮＡ、又は（ｂ）（ａ）の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つアルカリプロテアーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。
【００１４】
ここで「ストリンジエントな条件下」とは、例えば「Molecular cloning - a Laboratory manual 2nd edition」(Sambrookら、1989)に記載の条件等が挙げられる。例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ 塩化ナトリウム、０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．５％ ＳＤＳ、５×デンハート及び１００ｍｇ／ｍＬニシン***ＤＮＡを含む溶液にプローブとともに６５℃で８〜１６時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件が挙げられる。
【００１５】
本発明のアルカリプロテアーゼは、分子量４３ｋＤａ付近の酸化剤耐性を有するアルカリプロテアーゼを生産する公知のバチルス属細菌の染色体ＤＮＡからクローニングすることにより大量に生産することができる。
すなわち、配列番号１のアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼについては、例えばバチルス エスピー ＫＳＭ−ＫＰ４３株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６５３２）、配列番号２のアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼについては、例えばバチルス エスピー ＫＳＭ−９８６５株（ＦＥＲＭ Ｐ−１８５６６）、配列番号３のアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼについては、例えばバチルス エスピー ＫＳＭ−ＫＰ９８６０株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６５３４）、配列番号４のアミノ酸配列からなるアルカリプロテアーゼについては、例えばバチルス エスピーＮＣＩＭＢ１２２８９株の染色体ＤＮＡからクローニングし、適当なベクターと宿主菌を用いて大量に生産することができる。
【００１６】
本発明の遺伝子は、上述したアルカリプロテアーゼ産生菌、例えばBacillus属に属する微生物、好ましくはバチルス エスピー ＫＳＭ−ＫＰ４３株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６５３２）、ＫＳＭ−９８６５株（ＦＥＲＭ Ｐ−１８５６６）、ＫＳＭ−ＫＰ９８６０株（ＦＥＲＭ ＢＰ−６５３４）、ＮＣＩＭＢ１２２８９株等から、例えばショットガン法、ＰＣＲ法を用いることよりクローニングすることができる。
【００１７】
本発明遺伝子を用いてアルカリプロテアーゼを生産するには、目的とする宿主内で遺伝子を発現するのに適した任意のベクターに、上記アルカリプロテアーゼ遺伝子（例えば、配列番号５〜８の塩基配列で示されるＤＮＡ）を組込み、該組換えベクターを用いて宿主を形質転換し、得られた形質転換体を培養し、当該培養液からアルカリプロテアーゼを採取すればよい。
培養は微生物が資化可能な炭素源、窒素源その他の必須栄養素を含む培地に接種し、常法に従って行えばよい。
【００１８】
かくして得られた培養物中からのアルカリプロテアーゼの採取及び精製は、一般の方法に準じて行うことができる。即ち、培養物から遠心分離又は濾過することで菌体を除き、得られた培養上清液から常法手段により目的酵素を濃縮することができる。このようにして得られた酵素液又は乾燥粉末はそのまま用いることもできるが更に公知の方法により結晶化や造粒化することができる。
【００１９】
本発明のアルカリプロテアーゼの特徴としては、次のような性質が好ましい。すなわち、分子量７２，０００±２，０００（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法）、合成基質（Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−ｐＮＡ）を用いた場合、最適反応ｐＨを１０−１１付近（炭酸緩衝液）、最適温度を４５℃付近に有し、耐熱性は４５℃付近まで安定（ｐＨ１０、１５分間の処理）である。
【００２０】
【実施例】
実施例１ バチルス エスピー ＫＳＭ−ＫＰ４３株由来のアルカリプロテアーゼＦＴの精製
バチルス エスピー ＫＳＭ−ＫＰ４３株を６．０％（ｗ／ｖ） ポリペプトンＳ（日本製薬）、０．１％ 酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ）、０．１％ＫＨ2ＰＯ4、０．０２％ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、５．０％マルトース、１．５％ Ｎａ2ＣＯ3から成る培地に接種し、３０℃で３日間振盪培養を行った。菌体を遠心分離により除去し上清を得た後、氷冷下にて８０％飽和となるように硫酸アンモニウムを添加し塩析を行った。生じた沈殿を遠心分離により集め、５ｍＭの塩化カルシウムを含む１０ｍＭトリス塩酸塩緩衝液（緩衝液Ａ：ｐＨ７．５）に溶解した後、同緩衝液にて一晩透析を行った。透析内液を、あらかじめ、緩衝液Ａにて平衡化しておいたＤＥＡＥ トヨパール ６５０Ｃ（東ソー：２．５×１２ｃｍ）に添着した。次に０．５Ｍ 塩化ナトリウムまでの濃度勾配法により吸着タンパク質の溶出を行い、０．２５Ｍの塩化ナトリウム濃度付近にプロテアーゼ活性を示す画分を得た。この画分を集め、緩衝液Ａにて透析後、同緩衝液にて平衡化しておいたＳＰ トヨパール ５５０Ｃ（東ソー：２．５×１２ｃｍ）に添着した。次いで０．５Ｍ 塩化ナトリウムまでの濃度勾配法により吸着タンパク質の溶出を行い、０．３５Ｍの塩化ナトリウム濃度付近にプロテアーゼ活性を示す画分を得た。この画分をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）法により分析した結果、アルカリプロテアーゼＦＴは分子量７２，０００±２，０００の均一なタンパク質バンドとして検出された。
【００２１】
実施例２ アルカリプロテアーゼＦＴのＮ末アミノ酸配列の決定
実施例１において精製されたアルカリプロテアーゼ溶液をメタノールで処理したＰｒｏｓｏｒｂ ｆｉｌｔｅｒ（アプライドバイオシステム）に吸着させ、プロテインシーケエンサー（４７６Ａ型：アプライドバイオシステム）によりＮ末端アミノ酸配列を決定した。その結果、Ｍｅｔ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ＩＩｅ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｇｌｙの２０残基のアミノ酸配列が得られた。
【００２２】
実施例３ アルカリプロテアーゼＦＴ遺伝子のクローニング
バチルス エスピー ＫＳＭ−ＫＰ４３株をＬＢに０．０５％炭酸ナトリウムを添加した培地に接種し、３０℃で適当な時間振盪培養を行い菌体を集めた。斎藤と三浦の方法（Biochim. Biophys. Acata, 72, 619-629, 1963）に準じ菌体からゲノムＤＮＡを調製し、ＥｃｏＲＩで部分分解を行った。ＬＡ ＰＣＲ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｃｌｏｎｉｎｇキット（Ｔａｋａｒａ）中のＥｃｏＲＩカセットに上記部分分解断片を連結させ、実施例２で決定したＮ末アミノ酸配列をもとに合成したプライマーＡ（配列番号９）とキット付属のプライマーＣ１を用いてＰＣＲを行った。反応は、カセットを連結したＤＮＡ断片（１．０〜５０ｎｇ）を鋳型とし１０〜２０ｐｍｏｌの各プライマーを用い（５０μＬ反応系）、９４℃１分間の熱変性後、９４℃３０秒、４５℃２分間、７２℃１分間を１サイクルとし３０サイクル行った。得られた増幅ＤＮＡ断片をＨｉｇｈ Ｐｕｒｅ ＰＣＲ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ キット（ロシュ）にて精製し、１００倍希釈したもの１μＬを鋳型に１０〜２０ｐｍｏｌのＮ末アミノ酸配列をもとに合成したプライマーＢ（配列番号１０）とキット付属のプライマーＣ２を添加し（５０μＬ反応系）、上記条件と同様にＰＣＲを行った。増幅した約８６０ｂｐのＤＮＡ断片の塩基配列はＢｉｇＤｙｅTM Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ（アプライドバイオシステム）及び３７７ＤＮＡシーケンサー（アプライドバイオシステム）を用いて決定した。得られた塩基配列を基に上流及び下流方向の塩基配列決定に適したプライマーを合成し、先に調製したＥｃｏＲＩカセットを鋳型にＰＣＲを行い全塩基配列決定した。
決定した配列を基に構造遺伝子上流の推定プロモーター領域から終始コドン下流のインバーティッドリピート配列を含む領域を増幅するためにプライマーＣ（配列番号１１）及びプライマーＤ（配列番号１２）を合成した。バチルス エスピー ＫＳＭ−ＫＰ４３株のゲノムＤＮＡ（０．１〜１．０ｎｇ）を鋳型とし１０〜２０ｐｍｏｌのプライマーＣ及びＤを用いてＰＣＲを行った。反応は９４℃で３分間の熱変性後、９４℃３０秒、５５℃３０秒、７２℃３分間を１サイクルとし３０サイクル行った。得られたＰＣＲ増幅断片を精製し、ＴａＫａＲａ ＢＫＬ キット（Ｔａｋａｒａ）にて末端平滑化とリン酸化を行った後、ＳｍａＩ及びアルカリフォスファターゼ（ロシュ）処理を行ったプラスミドｐＨＹ３００ＰＬＫ（Ｔａｋａｒａ）に結合し、組換えプラスミドｐＨＹＦＴを調製した。
【００２３】
実施例４ バチルス エスピー ＫＳＭ−９８６５株由来のアルカリプロテアーゼＳＦ遺伝子のクローニング
バチルス エスピー ＫＳＭ−９８６５株から実施例３と同様にゲノムＤＮＡを調製した。これを鋳型としてアルカリプロテアーゼＳＦをコードする遺伝子の推定プロモーター領域の配列を利用し合成したプライマーＥ（配列番号１３）及び終始コドン下流の配列を利用し合成したプライマーＦ（配列番号１４:５'末端にはＰｓｔＩリンカーを付与）を添加し、Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ）を用いてプロテアーゼ遺伝子領域を増幅した。反応は９４℃で２分間熱変性後、９６℃２０秒、５２℃３０秒、７２℃５分を１サイクルとして３０サイクルを行った。得られたＰＣＲ増幅断片を精製し、プライマーＥ、Ｆ及び塩基配列決定の過程で得られた情報を基に構築したプライマーを用いて塩基配列を決定した。さらに精製増幅断片をＰｓｔＩにて処理し、同様
に処理したプラスミドｐＨＹ３００ＰＬＫに組込みｐＨＹＳＦを作製した。
【００２４】
実施例５ バチルス エスピー ＫＳＭ−９８６０株由来のアルカリプロテアーゼＳＺ遺伝子のクローニング
バチルス エスピー ＫＳＭ−ＫＰ９８６０株のゲノムＤＮＡを実施例３と同様に調製した後、これを鋳型としプライマーＧ及びＨ（配列番号１５及び１６）を用いてＥｘＴａｑ（Ｔａｋａｒａ）によりＰＣＲを行った。反応は９４℃で２分間鋳型ＤＮＡを変性させた後、９４℃１分間、５０℃１分間、７２℃１分３０秒間を１サイクルとし３０サイクル行った。その結果、約１ｋｂのＤＮＡ増幅断片が認められた。ＰＣＲ産物を精製し、プライマーＧ及びＨを用いて塩基配列の解析を行った。次にインバースＰＣＲにより全構造遺伝子の塩基配列を決定した。即ち、ＫＳＭ−ＫＰ９８６０株のゲノムＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ或いはＢｇｌIIにより３７℃にて完全分解した後、７０℃で１５分間処理し制限酵素を熱失活させた。その後、反応液と等量のＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ キット ｖｅｒ．２（Ｔａｋａｒａ）を加え、１６℃で１昼夜ライゲーション反応を行い、インバースＰＣＲ用の鋳型を調製した。約１ｋｂの部分遺伝子配列からプライマーＩ及びＪ（配列番号１７及び１８）を合成し、得られたインバースＰＣＲ用の鋳型を用いてＬａＴａｑ（Ｔａｋａｒａ）によりＰＣＲを行った。反応は９４℃で２分間鋳型ＤＮＡを変性させた後、９４℃１分間、５０℃１分間、７２℃４分間を１サイクルとし３０サイクル行った。その結果、ＥｃｏＲI分解物のセルフライゲーションＤＮＡを鋳型としたＰＣＲにより、約２．２ｋｂのＤＮＡ増幅断片、又、ＢｇｌII分解物のセルフライゲーションＤＮＡを鋳型としたＰＣＲにより、約２ｋｂのＤＮＡ増幅断片が認められた。得られたＰＣＲ産物を精製し、プライマーＩ及びＪを用いて塩基配列の解析を行った。その結果、３２９３ｂｐの塩基配列が決定され、プロモーター領域からターミネーター領域を含む遺伝子領域を増幅出来るプライマーＫ及びＬ（配列番号１９及び２０）を合成した。その際にプライマーＫの５’末端にはＳａｌＩリンカーをプライマーＬの５’末端側にＸｂａＩリンカーを付与した。
ＫＳＭ−ＫＰ９８６０株のゲノムＤＮＡを鋳型としプライマーＫ及びＬを用いてＰｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅによりＰＣＲを行った。反応は９４℃で２分間鋳型ＤＮＡを変性させた後、９４℃１分間、５５℃１分間、７２℃３分間を１サイクルとし、３０サイクル行った。その結果、約２．８ｋｂのＤＮＡ増幅断片が認められた。ＰＣＲ産物を精製し、得られた約２．８ｋｂのＤＮＡ断片を、ＳａｌＩ、ＸｂａＩにより処理し、同様に処理したプラスミドｐＨＹ３００ＰＬＫを混合した後、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（東洋紡）により、ライゲーション反応を行い、ｐＨＹＳＺを作製した。
【００２５】
実施例６ バチルス エスピー ＮＣＩＭＢ１２２８９株由来のアルカリプロテアーゼＮＶ遺伝子のクローニング
前記、バチルス エスピー ＫＳＭ−ＫＰ４３株、バチルス エスピー ＫＳＭ−ＫＰ９８６０株、バチルス エスピー ＫＳＭ−９８６５株由来のアルカリプロテアーゼをコードする遺伝子間の同一性検索の結果からプライマーＭ及びＮ（配列番号２１及び２２）を合成した。バチルス エスピーＮＣＩＭＢ１２２８９株のゲノムＤＮＡを鋳型としてプライマーＭ及びＮを用いてＥｘＴａｑによりＰＣＲを行った。反応は９４℃で２分間鋳型ＤＮＡを変性させた後、９４℃１分間、５５℃１分間、７２℃２分間を１サイクルとし３０サイクル行った。ＰＣＲ産物を精製し、プライマーＭ及びＮを用いて約２ｋｂのＤＮＡ増幅断片の塩基配列解析を行った。次いで実施例５と同様にインバースＰＣＲによりプロモーター、ターミネーター領域を含めた全構造遺伝子の塩基配列を決定した。即ち、ＮＣＩＭＢ１２２８９株のゲノムＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ、ＢｇｌＩＩ或いはＰｓｔＩにより３７℃にて完全分解した後、７０℃で１５分間処理し制限酵素を熱失活させた。その後、１６℃で１昼夜セルフライゲーション反応を行い、インバースＰＣＲ用の鋳型を調製した。合成したプライマーＯ、Ｐ及びＱ（配列番号２３−２５）を用い、ＬａＴａｑによりＰＣＲを行った。ＥｃｏＲＩ分解物のセルフライゲーションＤＮＡ及びＢｇｌＩＩ分解物のセルフライゲーションＤＮＡに対してはプライマーＯ及びＱをＰｓｔＩ分解物のセルフライゲーションＤＮＡに対してはプライマーＰ及びＱを用いた。反応条件は９４℃で２分間鋳型ＤＮＡを変性させた後、９４℃１分間、５５℃１分間、７２℃４分間を１サイクルとし３０サイクル行った。その結果、ＥｃｏＲＩ分解物のセルフライゲーションＤＮＡを鋳型としたＰＣＲにより、約２ｋｂのＤＮＡ増幅断片、ＢｇｌＩＩ分解物のセルフライゲーションＤＮＡを鋳型としたＰＣＲにより、約３ｋｂのＤＮＡ増幅断片、又、ＰｓｔＩ分解物のセルフライゲーションＤＮＡを鋳型としたＰＣＲにより、約３ｋｂのＤＮＡ増幅断片がそれぞれ認められた。得られたＰＣＲ産物を精製し、プライマーＯ及びＱを用いて塩基配列の解析を行った。次いで実施例５と同様に合成したプライマーＲ及びＳ（配列番号２６及び２７）とＮＣＩＭＢ１２２８９株のゲノムＤＮＡを鋳型にしＰＣＲを行い、最終的にｐＨＹＮＶを作製した。
【００２６】
実施例７ アルカリプロテアーゼの組換え生産
ｐＨＹＦＴ、ｐＨＹＳＦ、ｐＨＹＳＺ及びｐＨＹＮＶを用いて、ＫＳＭ−９８６５株の変異株（分子量２８ｋＤａ、７２ｋＤａの２種類のアルカリプロテアーゼ遺伝子を破壊した株）をエレクトロポレーション法で形質転換処理した。スキムミルク含有アルカリＬＢ寒天培地（０．０５％炭酸ナトリウム並びに１５ｐｐｍテトラサイクリンを含む）に塗沫し、スキムミルク溶解斑の有無からプロテアーゼ遺伝子が導入された形質転換体を選抜した。得られた各形質転換体を５ｍLの種母培地[６．０％（ｗ／ｖ）ポリペプトンＳ、０．１％酵母エキス、１．０％マルトース、０．０２％硫酸マグネシウム７水和物、０．１％リン酸２水素カリウム、０．３％無水炭酸ナトリウム、３０ｐｐｍテトラサイクリン]に植菌し、３０℃で１６時間振盪培養を行った。この種母培養液を３０ｍLの主培地[８％ポリペプトンＳ、０．３％酵母エキス、１０％マルトース、０．０４％硫酸マグネシウム７水和物、０．２％リン酸２水素カリウム、１．５％無水炭酸ナトリウム、３０ｐｐｍテトラサイクリン]に１％（ｖ／ｖ）植菌し、３０℃で３日間振盪培養を行った。
【００２７】
実施例８ 組換えアルカリプロテアーゼの精製
実施例７で得られたＫＰ４３株由来の組換えプロテアーゼＦＴを含む培養液８０ｍＬを０．２Ｍ塩化カリウム含有の５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）にて平衡化しておいたＳｕｐｅｒＱトヨパール６５０Ｍカラム（東ソー：２．５×１４ｃｍ）へ添着した。同緩衝液で非吸着タンパク質を溶出させた後、０．２〜０．４Ｍ塩化カリウムまでの濃度勾配法により吸着タンパク質の溶出を行った。その結果、０．３Ｍ塩化カリウム付近にプロテアーゼ活性を含む画分が溶出された。この画分に０．７５Ｍになるように硫酸アンモニウムを添加し、予め０．７５Ｍ硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）にて平衡化しておいたフェニルトヨパールカラム（東ソー：２．５×８ｃｍ）に添着させた。同緩衝液にて非吸着タンパク質を溶出させた後、０．７５Ｍ〜硫酸アンモニウム無添加までの濃度勾配法により吸着タンパク質の溶出を行った。その結果、０．２５Ｍ以下の硫酸アンモニウム付近にプロテアーゼ活性を示す画分を得た。この画分のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った結果、分子量約７２０００のほぼ均一なタンパク質バンドを検出した。上記の精製法によりＫＰ４３株由来の組換えプロテアーゼは、活性収率８４％、約４倍に精製され、比活性１０２Ｕ／ｍｇであった。実施例７で得られたいずれの培養液からも同様の操作により各精製プロテアーゼを得ることができた。
【００２８】
実施例９ 組換えアルカリプロテアーゼの酵素学的性質
実施例８で得られた精製アルカリプロテアーゼの活性を測定する場合は合成基質法により行った。即ち、０．２５ｍＬの０．１Ｍ緩衝液、０．０２５ｍＬの５０ｍＭＡＡＰＬ（N-succinyl-Ala-Ala-Pro-Leu-p-nitroanilide）、０．２ｍＬの脱イオン水からなる反応液を３０℃で５分間、恒温した後、適当に希釈した酵素液を０．０２５ｍＬ添加し、反応を開始した。３０℃で１０分間恒温した後、２ｍＬの５％(w/v)クエン酸を添加し、反応を停止した。次いで反応中に生成されたｐ−ニトロアニリンの４２０ｎｍにおける吸光度を測定した。酵素１単位（Ｕ）は、上記反応条件下において１分間に１μｍｏＬのｐ−ニトロアニリンを生成する量とした。
【００２９】
（１）最適反応ｐＨ
ｐＨ４−１２．５の各緩衝液中にて酵素反応を行った結果、いずれの酵素もｐＨ１０．５の炭酸緩衝液において最も高い分解活性を示した。
【００３０】
（２）最適温度
５０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ１０）中、５〜６０℃の範囲で酵素反応を行った結果、いずれの酵素も４０〜４５℃において最も高い分解活性を示した。また、反応液に２ｍＭ塩化カルシウムを添加しても最大活性を与える反応温度は変化せず、活性化も殆ど起こらないことが特徴であった。
【００３１】
（３）耐熱性
５０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ１０）中、２０〜５５℃の範囲で各酵素を１５分間恒温した。その後、氷冷し酵素反応を行った結果、いずれの酵素も４０℃までは安定であった。また、５ｍＭ塩化カルシウムを添加し、恒温処理した場合においても同様な結果であった。
【００３２】
【発明の効果】
本発明のアルカリプロテアーゼは、最適温度が中低温域にあることから洗剤用酵素として有用であり、且つ従来のズブチリシンとは異なり分子量が大きいことから、製造プロセスにおいて、培養液や酵素溶液の濃縮に用いる限外濾過膜から酵素が漏出することによって濃縮収率が低下することがない。
【００３３】
【配列表】
Claims (9)
- 以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質：
（ａ）配列番号１〜４より選ばれるアミノ酸配列からなるタンパク質、
（ｂ）（ａ）の各アミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つアルカリプロテアーゼ活性を有するタンパク質。 - 配列番号１のアミノ酸配列と８２．６％以上の同一性を有し、且つアルカリプロテアーゼ活性を有するタンパク質。
- 配列番号１〜４のアミノ酸配列のいずれかと９０％以上の同一性を有する、請求項２記載のタンパク質。
- 請求項１〜３のいずれか１項記載のタンパク質をコードする遺伝子。
- 以下の（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡからなるアルカリプロテアーゼ遺伝子；
（ａ）配列番号５〜８より選ばれる塩基配列で示されるＤＮＡ、
（ｂ）（ａ）の各塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つアルカリプロテアーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。 - 請求項４又は５記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
- 請求項６記載の組換えベクターを含む形質転換体。
- 宿主が微生物である請求項７記載の形質転換体。
- さらに以下の性質を有する、請求項１〜３のいずれか１項記載のタンパク質：
（１）分子量７２，０００±２，０００（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法）、
（２）合成基質（Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−ｐＮＡ）を用いた場合、以下の性質を示す
最適反応ｐＨ： １０〜１１
最適温度： ４０〜４５℃（ｐＨ１０、１５分間の処理）
耐熱性： ４０℃まで安定（ｐＨ１０、１５分間の処理）、
及び
（３）２ｍＭカルシウム存在下及び非存在下で当該最適温度及び耐熱性を有する。
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