JP4159878B2 - 組換えトリプシンの製造方法 - Google Patents
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Description
本発明は、トリプシンの組換え製造方法に関する。この目的のために、短縮型プロペプチド配列を有するトリプシノーゲンは、好ましくは、組換え宿主細胞において発現され、未切断形態で培養培地に分泌される。続いて、プロペプチド配列は、活性トリプシンを形成するために制御様式で切断される。
a)好ましくは分泌を媒介するシグナルペプチドと融合されて、分泌可能形態のプロペプチド配列内にエンテロキナーゼ認識部位を有するトリプシノーゲンをコードする組換え核酸で宿主細胞を形質転換する工程、
b)組換え核酸の発現および培養培地への発現産物の分泌を可能にする条件下で宿主細胞を培養する工程、ここで、該条件は、プロペプチド配列の自己触媒的切断が少なくとも実質的に妨げられるように選択される、
c)培養培地から発現産物を単離する工程、
d)プロペプチド配列を切断して、活性トリプシンを形成する工程、および
e)任意に、非切断トリプシノーゲン分子と活性トリプシンとを分離する工程
を含むトリプシンの組換え製造方法により達成される。
a)シグナルペプチド配列と融合され、エンテロキナーゼ認識配列に短縮されるプロペプチドを含むブタ由来のチモーゲン前駆体トリプシノーゲンをコードする組換え核酸で宿主細胞を形質転換する工程、ここで当該切断部位は所定のバッファー条件下で組換えトリプシンにより切断されるか、または自己触媒切断され、このプロセスにおいて、短縮型トリプシノーゲンは活性トリプシンを形成するために切断されうる、
b)短縮型トリプシノーゲンが可溶性形態で存在し、培養培地に分泌されるが、自己触媒活性化が実質的に妨げられるように、酸性pH、好ましくはpH3〜4で発現期の間、宿主細胞を培養する工程、
c)培養上清から短縮型組換えトリプシノーゲンを単離し、組換えトリプシンまたは自己触媒切断により短縮型トリプシノーゲンの効果的な切断を可能にする条件下でそれを活性化する工程および
d)任意に、非切断トリプシノーゲン分子と活性トリプシンとを分離する工程、
により特徴づけられる。
組換えDNA技術
Sambrook,J.ら(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New Yorkに記載の標準法を使用して、DNAを操作した。分子生物学的試薬を製造業者の使用説明書に従って使用した。
精製トリプシンのタンパク質測定を、280nmの吸光度を測定することにより行なった。1cm通過長についてのA 1%/280nmに対して13.6の値を使用した。
タンパク質[mg/ml]=(10[mg/ml]*ΔAサンプル *希釈)/13.6
Pichia pastorisおよびその発現ベクターを扱うための使用説明書として、Invitrogenのカタログおよび指示マニュアルを使用した。短縮型組換えトリプシノーゲンを発現するためのベクターは、Invitrogen由来のベクターpPICZαAおよびpPIC9Kに基づく。
酵母における発現のために最適化コドン用法を使用した完全な組換えトリプシノーゲンの遺伝子合成
本発明の方法を提供するための好ましい方法の1つは、コドン最適化遺伝子配列の合成である。酵母における発現のために各コドンを最適化するために、完全な組換えトリプシノーゲンをコードする約700bp遺伝子の完全なデノボ合成を行なうことが必要であった。必要な場合、配列番号:1のブタトリプシノーゲンのアミノ酸配列の再翻訳において縮重コードを利用することにより、各コドンを最適化することが可能であった。この目的のために、遺伝子を、54〜90個のヌクレオチド長を有する18個のオリゴヌクレオチドに分けた。オリゴヌクレオチドを、その5'末端および3'末端が隣接するオリゴヌクレオチドと相補的な様式でそれぞれ重複するセンス鎖および逆鎖断片の代わりの配列として設計した。それぞれの場合において、続くPCR反応におけるアニーリング反応において非特異的結合が大いに妨げられるように、重複領域を選択した。遺伝子の5'末端および3'末端のオリゴヌクレオチドを、配列番号:2の合成遺伝子の発現ベクターへの後での挿入のために使用されうる制限エンドヌレアーゼの認識部位を有するコード領域の上流および下流に与えた。したがって、制限エンドヌクレアーゼEcoRIの認識部位を上流に組み込み、制限エンドヌクレアーゼのXbaIの認識部位を下流に組み込んだ。オリゴヌクレオチドの配列を、配列番号:3〜20に示す。
短縮型トリプシノーゲン遺伝子の作製
エンテロペプチダーゼエンテロキナーゼAsp-Asp-Asp-Asp-Lysの認識配列に対するコドンおよびEcoRI制限エンドヌクレアーゼ認識配列のためにPichia pastorisの発現ベクターにクローニングするのに必要なコドンGlu-Pheのみが、短縮型組換えトリプシノーゲンのN末端でプロペプチドの配列として残るように、天然トリプシノーゲンの最初の20アミノ酸に対するコドンを、配列番号:21の特別に設計した5'プライマーにより欠失した。この欠失を、配列番号:21の5'プライマーおよび配列番号:20の3'プライマーを用いる完全な組換えトリプシノーゲンのための遺伝子のPCR断片におけるPCR反応により導入した。短縮型組換えトリプシノーゲンのDNA配列およびアミノ酸配列を、配列番号:22および配列番号:23にそれぞれ示す。
遺伝子合成により作製される完全な組換えトリプシノーゲンおよびPichia pastorisの発現ベクターへの短縮型組換えトリプシノーゲンのPCR断片のクローニング
EcoRIおよびXbaI(Roche Diagnostics GmbH)を用いてPCR断片を再切断し、再び単離し(QIAquick Gel Extraction Kit/Qiagen)、続いてEcoRIおよびXbaI(Roche Diagnostics GmbH)を用いて線形化し、QIAquick Gel Extraction Kit/Qiagenを用いて単離した発現ベクターpPICZαA(Invitrogen)の断片にライゲートした。この1μl(20ng)のベクター断片および3μl(100ng)のPCR断片に対して、1μlの10×リガーゼバッファー(Sambrookら、1989 B.27)、1μlのT4 DNAリガーゼ、4μlの滅菌H2O再蒸留をピペットで取り、注意深く混合し、一晩16℃でインキュベートした。このベクターにおいて、合成遺伝子は、メタノールを用いて誘導されうるAOX 1プロモーター(Pichia pastoris由来のアルコールオキシダーゼ1のためのプロモーター) (Mallinckrodt Baker B.D.)の制御下にあり、Saccharomyces cerevisiae由来のα因子のシグナルペプチドの後ろの正しいリーディングフレームに位置する。このことを確認し、プラスミドを単離するために、次に、5μlのライゲーション混合物を大腸菌XL1Blue(Stratagene)のコンピテント細胞(Hanahan(1983) 200μlに形質転換した。30分の氷上でのインキュベーションに続き、熱ショック(42℃で90秒)を行なった。続いて細胞を1ml LB培地に移し、表現型発現のためにLB培地で1時間37℃にてインキュベートした。この形質転換混合物のアリコートを、選択マーカーとして100μg/mlのZeocinを用いるLBプレート上で培養し、37℃で15時間インキュベートした。プラスミドを増殖クローンから単離し(Sambrook, J.ら(1989) Molecular cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York)、次に制限解析および配列決定により、エラーのない塩基配列について確認した。完全な組換えトリプシノーゲンまたは短縮型組換えトリプシノーゲンの合成遺伝子を含むこの様式で形成された発現ベクターを、pTRYP-9(図1を参照)およびpTRYP-11(図2を参照)と名づけた。
Pichia pastoris X-33、GS115またはKM71HへのpTRYP-9およびpTRYP-11の形質転換、続くゲノムへの組込みのために、ベクターを、SacI (Roche Diagnostics GmbH)を用いて最初に線形化した。Gene Pulser II(Biorad)を用いるエレクトロポレーションにより、形質転換を行なった。このために、Pichia pastorisのコロニーを、5mlのYPD培地(Invitrogen)を用いて接種し、攪拌しながら一晩30℃でインキュベートした。続いて一晩培養物を200mlの新鮮なYPD培地(Invitrogen)に1:2000で再び接種し、OD600が1.3〜1.5に達するまで攪拌しながら一晩30℃でインキュベートした。細胞を遠心分離し(1500×g/5分)、ペレットを200mlの氷冷滅菌水中(0℃)で再懸濁した。細胞を再び遠心分離し(1500×g/5分)、100mlの氷冷滅菌水(0℃)中で再懸濁した。細胞を再び遠心分離し、10mlの氷冷(0℃)1Mソルビトール (ICN)中で再懸濁した。細胞を再び遠心分離し、0.5mlの氷冷(0℃)1Mソルビトール (ICN)中で再懸濁した。このように単離した細胞を氷上に保ち、直ちに形質転換に使用した。
3mlのBMGY培地(Invitrogen)に陽性クローンを接種し、攪拌しながら30℃で一晩インキュベートした。続いて、ODを600nmで測定し、得られるOD600が1になるように、10ml のBMMY培地(Invitrogen) pH3.0に再接種した。BMMY培地(Invitrogen) pH3.0はメタノールを含み(Mallinckrodt Baker B.V.)、AOX1プロモーターを介して完全な組換えトリプシノーゲンまたは短縮型組換えトリプシノーゲンの発現を誘導する。
各々の発現培養物から500μlを取り、OD600を決定し、細胞を遠心分離した。培養上清を保管し、OD600に対して適切な量のY-PERTM(50〜300μl/Pierce)中で細胞ペレットを溶解のために再懸濁し、室温で1時間振盪した。続いて、ライゼートを遠心分離して細胞デブリを分離し(15000×g/5分)、上清を新鮮な反応容器に移した。10μlのライゼートおよび10μlの培養上清をSDSポリアクリルアミドゲルに適用し、電場をかけることによりタンパク質をサイズに従って分離した。
複数の形質転換による発現収量の増大
組換え短縮型トリプシノーゲンを有する発現実験由来の最良クローンを、前記のようにエレクトロポレーションのために再び調製し、再び1μgの線形pTRYP-11ベクターDNAで形質転換し、1000〜2000μg/ml Zeocin(Invitrogen)を含むYPDS寒天プレート(Invitrogen)上で形質転換混合物を培養した。このことは、発現ベクターpTRYP-11のいくつかのコピー、およびよってまたそれぞれ耐性遺伝子(この場合Zeocin(登録商標))のいくつかのコピーをゲノムに組込んだクローンのみが増殖しうるように選択プレッシャーを増大する。Zeocin (登録商標)耐性タンパク質は、Streptoalloteichus hindustanus由来のブレオマイシン遺伝子の産物であり(Calmels, T.ら、(1991); Drocourt, D.ら、(1990))、これは化学量論濃度比でZeocin (登録商標)に結合し、したがってZeocin (登録商標)に対する細胞耐性を作製する。YPDS寒天プレート中のZeocin (登録商標) の濃度が高いほど、定量的にZeocin (登録商標)に結合し、したがって増殖を可能にするために、より耐性なタンパク質が細胞によって産生されるはずである。これは、耐性遺伝子の複数のコピーがゲノムに組込まれる場合に、特に可能である。クローンを、上記のようにラスターMDプレート上に再び接種した。続いて、これらのクローンを、上記のようにトリプシノーゲン発現および分泌に対して順番に確認した。
第2の選択圧を用いることによる発現収量の増大
2000μg/mlを超えるZeocin (登録商標)濃度の増大は、短縮型組換えトリプシノーゲンの改善された発現収量をもたらさなかった。組換え短縮トリプシノーゲンをコードし、かつ酵母における発現に対してコドン最適化されている配列番号:22の遺伝子の発現クローンにおける遺伝子コピー数のさらなる増大のために、さらなる発現ベクターを、第2の選択プレッシャーにより最も高い発現収量を有する実施例3および4で調製した発現クローンのゲノム、好ましくはG418(Roche Diagnostics GmbH)に組込んだ。
培養上清からのトリプシノーゲンの単離および活性化
6.1
培養上清を精密濾過、遠心分離または濾過により細胞から分離した。トリプシノーゲンをフェニルセファロース高速フロー(Pharmacia)におけるクロマトグラフィーにより精製した。pH2〜4の範囲でクロマトグラフィーを行なった。20mMのCaCl2の存在下でpHを7〜8に再緩衝させることにより、自己触媒活性を開始した。この自己触媒活性は、pHを2〜4の範囲に戻すように変化させることにより再度終結させうる。活性トリプシンをベンズアミドセファロース(例えば、SP-Sepharose(登録商標)、ff) (Pharmacia/パッケージ挿入)におけるクロマトグラフィーまたはイオン交換体により精製した。自己分解を避けるために、トリプシンをpH1.5〜3で保管する。精製したトリプシンの比活性は180〜200U/mgタンパク質である。
5〜30mMの塩化カルシウム(pH3.5)を含む酢酸アンモニウムバッファー(5〜20mM)を用いて約1:2〜1:4の比で全発酵ブロスを希釈し、カチオン交換体 (例えば、Streamline(登録商標) SP, XL) を用いる拡張ベッド(expanded bed)クロマトグラフィー(McCornick(1993);EP 0 699 687)により精製する。この場合において、細胞の存在下でクロマトグラフィーを行なう。細胞をクロマトグラフィー工程により同時に分離する。続いて、手順は実施例6.1に記載された通りである(再緩衝化/活性化など)。
活性測定
25℃の100mM Tris pH8.0、20mM CaCl2中のChromozym TRY (Pentapharm Ltd)を用いて、トリプシンの活性を決定した。光度測定を405nmで行なう。
YPD: 酵母ペプトンデキストロース
YPDS: 酵母ペプトンデキストロースソルビトール
BMGY: 緩衝化グリセロール複合培地
BMMY: 緩衝化メタノール複合培地
SDS: ドデシル硫酸ナトリウム
Claims (5)
- a)宿主細胞であるピキア・パストリス(Pichia pastoris)を、該宿主細胞により分泌可能な形態のプロペプチド配列内にエンテロキナーゼ認識部位を有するトリプシノーゲンをコードする配列番号:22に示される核酸を含む組換え核酸で形質転換する工程、
b)組換え核酸の発現および培養培地への発現産物の分泌を可能にする酸性条件下で宿主細胞を培養する工程、
c)培養培地から発現産物を単離する工程、
d)プロペプチド配列を切断して、活性トリプシンを形成させる工程、および
e)任意に、非切断トリプシノーゲン分子と活性トリプシンとを分離する工程、
を含むトリプシンの組換え製造方法。 - ピキア・パストリス(Pichia pastoris)の細胞における、配列番号:22の組換え核酸の発現および培養培地への発現産物の分泌のための、プロペプチド配列内にエンテロキナーゼ認識部位を有するトリプシノーゲンをコードする、配列番号:22の組換え核酸の使用。
- 請求項2記載の核酸で、または該核酸の少なくとも1つのコピーを含有してなるベクターで形質転換されていることを特徴とする組換えピキア・パストリス(Pichia pastoris)細胞。
- ピキア・パストリス(Pichia pastoris)の細胞における、配列番号:23の組換えトリプシノーゲンの発現および培養培地への発現産物の分泌のための、配列番号:23のトリプシノーゲンをコードする組換え核酸の使用。
- 前記トリプシノーゲンが、配列番号:23のポリペプチド配列からなる、請求項1記載の製造方法。
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