CZ303658B6

CZ303658B6 - Zpusob rekombinantní produkce trypsinu

Info

Publication number: CZ303658B6
Application number: CZ20032337A
Authority: CZ
Inventors: Müller@Rainer; Glaser@Stephan; Geipel@Frank; Thalhofer@Johann-Peter; Rexer@Bernhard; Schneider@Claus; Ratka@Michael; Ronning@Stephanie; Eckstein@Hellmut; Giessel@Claudia
Original assignee: F. Hoffmann-La Roche Ag
Priority date: 2001-02-01
Filing date: 2002-02-01
Publication date: 2013-02-06
Also published as: US20080064084A1; US20040203095A1; ATE310092T1; DK1399568T3; CA2437342A1; WO2002061064A2; CN1545553B; CN1545553A; WO2002061064A3; EP1399568A2; CZ20032337A3; JP2004520049A; CA2437342C; EP1399568B1; US7666629B2; JP4159878B2; US7276605B2; DE50204952D1

Abstract

Zpusob rekombinantní produkce trypsinu, který zahrnuje kroky: a) transformace hostitelské bunky rekombinantní nukleovou kyselinou, která kóduje trypsinogen s rozpoznávacím místem pro enterokinázu v propeptidové sekvenci ve forme, která muze být sekretována hostitelskou bunkou, b) kultivace hostitelské bunky za kyselých podmínek umoznujících expresi rekombinantní nukleové kyseliny a sekreci produktu exprese do kultivacního média, pricemz podmínky jsou vybrány tak, ze je zabráneno autokatalytickému stepení propeptidové sekvence, c) izolace produktu exprese z kultivacního média, d) stepení propeptidové sekvence za vytvorení aktivního trypsinu a poprípade e) oddelení nestepených molekul trypsinogenu od aktivního trypsinu.

Description

Způsob rekombinantní produkce trypsinu

Oblast techniky

Vynález se týká způsobu rekombinantní produkce trypsinu. Při tomto postupu se trypsinogen se zkrácenou propeptidovou sekvencí exprimuje v rekombinantní hostitelské buňce a v neštěpené formě sekretuje do kultivačního média. Následně se propeptidová sekvence kontrolovaným způsobem štěpí, za vytvoření aktivního trypsinu.

Dosavadní stav techniky

Trypsin je serinová proteáza, která kata lyžuje hydrolytické štěpení peptidů v karboxylové skupině bazických aminokyselin argininu a lysinu (Keil B., 1971). Trypsin z hovězího pankreatu byl jedním z prvních proteolytických enzymů, které mohly být použity v čisté formě a v adekvátních množstvích pro přesné chemické a enzymové studie (Northrop et al., 1948). Následně bylo také možné, izolovat proteázy, které mohou být zařazeny do trypsinové rodiny, z jiných vyšších obratlovců (prase - Charles et al. 1963 / ovce - Bricteux-Gregoire et al. (1966); Travis (1968) / krocan - Ryan (1965) / člověk - Travis et al. (1969 a další). V této době byly také izolovány první enzymy, náležící do trypsinové rodiny, ze dvou druhů streptomycet (Morihara a Tsuzuki (1968); Trop a Birk (1968); Wahlby a Engstrom (1968); Wahlby (1968; Juraseket al. (1969)).

Enzym je syntetizován v pankreatických buňkách obratlovců, jako inaktivní prekurzor, trypsino25 gen, a následně je přeměněn na aktivní formu štěpením propeptidu (Northrop et al, (1948), Desnuelle (1959)). První molekuly trypsinogenu byly aktivovány přirozeně enteropeptídázou enterokinázou, která hydrolyzuje peptidovou vazbu mezi (Asp.tj-Lys-^-IIe, což odštěpuje propeptid (Keil (1971)). Rozpoznávací sekvence enterokinázy (Asp₄)-Lys je umístěna přímo na C-konci propeptidu, téměř u všech, drive známých, molekul trypsinogenu (Light et al. (1980)). Proces aktivace může být také proveden autokatalyticky při fyziologických hodnotách pH, protože lysin je umístěn na C-terminální straně rozpoznávací sekvence enterokinázy a tak může být peptidová vazba Lys-^-Ile, také hydrolyzována trypsinem (Light et al. (1980)).

Trypsin byl vždycky zajímavou proteázou pro biotechnologické aplikace, díky jeho snadné dostupnosti z různých savců, vysoké specifitě (štěpí pouze na C-terminální straně lysinu nebo argininu) spolu s vysokou specifickou aktivitou (~ 150 U/mg) a jeho dobré stabilitě během skladování. Trypsin je zejména používán pro tryptické štěpení peptidů na malé části pro sekvenování, pro uvolnění adherentních buněk z potažených misek pro buněčné kultury a pro štěpení fúzních proteinů na cílový peptid a fúzní složku, pro aktivaci propeptidů (např. trypsinogenu na trypsin) a pro rekombinantní produkci peptidových hormonů (např. proinzulinu na inzulín, viz také WO 99/10 503). Trypsin je také součástí některých farmaceutických přípravků (mastí, dražé a aerosolů pro inhalaci („Rotě Liste“, 1997; The United States Pharmacopeia, The National Formulary, USP23-NF18, 1995)). Jelikož použití enzymů ze zvířecích zdrojů není již v mnoha případech povoleno (možná kontaminace infekčními činidly), musí být pro žádané biotechno45 logické aplikace poskytnuty molekuly rekombínantního trypsinu z mikrobiálních hostitelů. Existuje několik způsobů pro produkci rekombínantního trypsinu z různých organismů.

Graf, L. et al (1987 až 1988) popisuje expresi a sekreci krysích trypsinových a trypsinogenových mutantů v E. coli. Za účelem sekrece molekul trypsinogenu do periplazmy E. coli, je přirozená signální sekvence trypsinogenu nahrazena signální sekvencí bakteriální alkalické fosfatázy (phoA). Sekretované inaktivní molekuly trypsinogenu jsou izolovány z periplazmy a jsou aktivovány enzymovým štěpením, použitím purifikované enterokinázy.

- 1 CZ 303658 B6

Vasquez, J. R. et al. (1989) popisuje expresi a sekreci anionického krysího trypsinu a trypsinových mutantů v E, coli. Za účelem exprimovat a sekretovat molekuly aktivního trypsinu do periplazmy E. coli, je přirozený prepro segment trypsinogenu (signální sekvence a aktivační peptid) nahrazen signální sekvencí bakteriální alkalické fosfatázy (phoA) a je použit phoA promotor, který může být regulován fosfátem. Aktivní trypsin je izolován z periplazmy. Výtěžek je však velmi nízký (cca 1 mg/l).

Higaki, J. N. et al. (1989) popisuje expresi a sekreci trypsinu a trypsinových mutantů do periplazmy E. coli, použitím tac promotoru a signální sekvence hisJ S.typhimurium. Výtěžek aktivního trypsinu je cca. 0,3 mg/l. Objemový výtěžek aktivního anionického krysího trypsinu může být zvýšen na přibližně 50 mg/l, pomocí fermentace s vysokou hustotou buněk (Yee, L. a Blanch, H. W., (1993)). Autoři však poukazují na problémy v expresi a sekreci aktivního trypsinu v E. coli. Enzymaticky aktivní trypsin je vytvořen v periplazmě E. coli po štěpení signální sekvence a proteinovým sbalením nativního trypsinu se vytváří 6 disulfidových můstků. Tvorba aktivního trypsinu je pro buňku toxická, protože aktivní trypsin hydrolyzuje periplazmatické proteiny E. coli, které lyžují buňky. Kromě toho, je v periplazmě E.coli zabráněno proteinovému sbalení trypsinu a zejména správné nativní tvorbě 6 disulfidových můstků. Tento systém není vhodný pro izolaci relativně velkých množství trypsinu (> 10 mg; Willett, W. S. et al., (1995)).

Za účelem produkovat větší množství trypsinu (50 až 100 mg) pro rentgenové krystalografické studie, je v kvasinkách produkován inaktivní trypsinogenový prekurzor, pod kontrolou regulovatelného ADH/G APDH promotoru aje sekreto ván pomocí fúze s vedoucí sekvencí kvasinkového a faktoru. Expresní produkt, sekretovaný do média, je kvantitativně přeměněn in vitro na trypsin, pomocí enterokinázy. Výtěžek je 10 až 15 mg/l (Hedstrom, L. et al. (1992)).

DNA sekvence jsou popsány v EP 0 597 681, které kódují matumí hovězí trypsin a hovězí trypsinogen, s reziduem iniciačního meth tóninu. Navíc, je popsána exprese v E. coli, ale není vysvětlena strategie, jak je v E.coli vytvořen aktivní trypsin.

Způsob produkce trypsinu z prasečího pankreatu nebo jeho derivátu v Aspergillus rekombinantním způsobem, je popsán ve WO 97/00 316. Pro transformaci je použit vektor, který kóduje trypsinogen nebo jeho derivát, který je N-koncově fúzován k funkčnímu signálnímu peptidů. Avšak, kvasinkové kultury dosahují vyšších koncentrací biomasy, ve srovnání s kulturami Aspergillus a rostou podstatně rychleji a proto může být výtěžek specifické exprese u kvasinkové buňky nižší než pro buňky Aspergillus, za účelem dosažení výtěžků, které jsou potřebné pro ekonomický způsob exprese.

Způsob rekombinantní produkce prekurzorů zymogenů proteáz, které obsahují autokatalytické štěpící místo, které se přirozeně nevyskytujeme popsáno ve WO 99/10 503. Tento způsob zahrnuje expresi prekurzorů zymogenů v E. coli, ve formě inkluzních tělísek, s následnou purifikací a renaturací za podmínek, při kterých je vytvořena proteázová část prekurzorů zymogenů, ve své přirozené konformaci a ke štěpení renaturováného prekurzorů zymogenů poté dochází autokatalyticky. Nevýhodou tohoto způsobu jsou velké ztráty, které se často vyskytují během renaturace a velké objemy, kteréjsou vyžadovány pro průmyslovou výrobu.

Rekombinantní produkce trypsinových analog v Pichia pastoris je popsána ve WO 00/17 332. Pro transformaci je použit vektor, který kóduje analog trypsinogenu (derivát hovězího trypsinogenu), ve kterém byla C-koncová aminokyselina lysin mutací změněna za jinou aminokyselinu (kromě argininu nebo lysinu) a který je N terminálně fúzován k funkčnímu signálnímu peptidů. V tomto způsobu jsou analogy trypsinu sekretována do média v rozpustné formě a díky vložené mutaci nejsou také aktivována a dále degradována nežádoucí autokatalýzou, dokonce při relativně vysokých hodnotách pH fermentačního procesu. Pro aktivaci je poté použita aminopeptidáza. Nevýhodou tohoto způsobu je však potřeba odstranit další aminopeptidázy, které mohou mít nevýhodné vedlejší aktivity pro následné použití trypsinu ve finálním procesu.

. 9 _

Exprese genů trypsinogenu, vyskytujících se přirozeně v přírodě, v Pichia pastoris je popsána ve WO 01/55 429. Za účelem vyhnutí se autokatalytické aktivaci je fermentace v příkladu prováděna v méně kyselé oblasti pH při cca 6. To je tedy mimo optimální pH oblast, která zabraňuje autokatalytické aktivaci během dlouhých časů v expresní fázi. Dalšími nevýhodami tohoto způsobu jsou geny pro trypsinogen, které nejsou kodónově optimalizovány pro expresi v Pichia pastoris a přispívají k nízkým výtěžkům exprese.

Vynález řeší problém poskytnutí způsobu rekombinantní produkce trypsinu, při němž jsou alespoň částečně eliminovány nevýhody dosavadního stavu techniky a který dovoluje, aby byl io získán aktivní trypsin jednoduchým způsobem s vysokým výtěžkem a aktivitou. Zejména by mělo být možné izolovat intermediámí trypsinogen v rozpustné formě z kultivačního média exprese hostitele, přičemž trypsinogen by během fermentace a purifikace neměl podléhat ve významné míře autokatalytické aktivaci. Dále by mělo být možné následně aktivovat trypsinogen autokatalyticky anebo přídavkem rekombinantní ho trypsinu.

Podstata vynálezu

Tento problém je vyřešen způsobem rekombinantní produkce trypsinu podle vynálezu, jehož podstatou je, že zahrnuje kroky:

a) transformace hostitelské buňky rekombinantní nukleovou kyselinou, která kóduje trypsinogen s rozpoznávacím místem pro enterokinázu v propeptidové sekvenci ve formě, která může být sekretována hostitelskou buňkou,

b) kultivace hostitelské buňky za kyselých podmínek umožňujících expresi rekombinantní nukleové kyseliny a sekreci produktu exprese do kultivačního média, přičemž podmínky jsou vybrány tak, že je zabráněno autokatalytickému štěpení propeptidové sekvence,

c) izolace produktu exprese z kultivačního média,

d) štěpení propeptidové sekvence za vytvoření aktivního trypsinu a popřípadě

e) oddělení neštěpených molekul trypsinogenu od aktivního trypsinu.

Hostitelské buňky použité ve způsobu podle vynálezu mohou být eukaryotické nebo prokaryotické hostitelské buňky, jako ty, které jsou známy z dosavadního stavu techniky. Hostitelské buňky jsou výhodně eukaryotické buňky, zejména výhodně buňky plísní a nej výhodněji kvasinkové buňky. Vhodné příklady kvasinkových buněk jsou Pichia pastoris, Hansenula polymorpha, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombae, přičemž methylotrofní kvasinky jako je Pichia pastoris nebo Hansenula polymorpha a zejména Pichia pastoris jsou použity přednostně.

Jc vhodné použít hostitelské buňky, které jsou schopné exnrimovat rekombinantní nukleovou kyselinu a sekretovat expresní produkt do kultivačního média za podmínek, za kterých je přinejmenším ve významné míře a výhodně v podstatě kvantitativně zabráněno autokatalytickému štěpení propeptidové sekvence. Takové podmínky výhodně zahrnují kyselou hodnotu pH kultivačního média, zejména výhodně hodnotu pH v rozmezí mezi 3 a 4. Trypsinogen je stabilní při kyselejších hodnotách pH a zejména při hodnotách pH do 4, zatímco trypsin je autokatalyticky aktivován v neutrálním nebo alkalickém médiu (Keil, B. (1971)).

Za vhodných podmínek prováděná kultivace podle vynálezu zabraňuje předčasné aktivací rekombinantního trypsinogenu sekretovaného hostitelskými buňkami, a to také může v podstatné míře zabránit další degradaci výsledného trypsinu až na inaktivní peptidy. Stabilita rekombinant-3 CZ 303658 B6 ního trypsinogenu za kultivačních podmínek je důležitá, protože exprese by měla být doprovázena sekrecí. Má se za to, že v tomto spojení je sekrece z hostitelské buňky přemístěním trypsinogenu zcytoplazmy pres buněčnou membránu do kultivačního média. Toto je většinou uskutečněno pomocí N-terminální fúze trypsinogenu s funkčním signálním peptidem. Příklady vhodných signálních peptidů jsou známé signální peptidy z kvasinek a zejména výhodný je signální peptid a faktoru ze Saccharomyces cerevisiae. Je však samozřejmě možné, použít jiné signální peptidy např. signální peptid, který přirozeně kontroluje sekreci trypsinogenu.

Za účelem vylepšit výtěžek exprese rekombinantního trypsinu je výhodné použít rekombinantní nukleovou kyselinu s optimalizovaným využitím kodonů pro příslušné hostitelské buňky. Podle toho je výhodné použít nukleovou kyselinu pro kvasinkové buňky, která má optimalizované využití kodonů pro kvasinky. Takové nukleové kyseliny, které mají optimalizované využití kodonů, mohou být například vytvořeny syntetizováním jednotlivých oligonukleotidů paralelně a jejich následným spojením.

Způsob podle vynálezu je v podstatě vhodný pro produkci jakýchkoliv typů rekombinantního trypsinu za předpokladu, že příslušný trypsinogen, který je sekreto ván jako expresní produkt hostitelskými buňkami, je za kultivačních podmínek v podstatě stabilní. Způsob je vhodně použit pro produkci trypsinu z obratlovců, zejména ze savců, takových, jako prasata, ovce nebo lidé. Zejmé20 na výhodně je produkován prasečí trypsin.

Navíc je přednostní, že je použita taková rekombinantní nukleová kyselina, která kóduje trypsínogen se zkrácenou propeptidovou sekvencí. Trypsinogenem je rozuměn protein, který, ačkoliv vytváří v podstatě správnou proteinovou strukturu, nemá žádnou nebo má velmi malou proteoly25 tickou aktivitu, v porovnání s aktivním trypsinem, která je výhodně alespoň 5-krát a zejména výhodně alespoň 10-krát nižší, než proteolytická aktivita aktivní formy. Přirozená délka propeptidové části, např. v případě prasečího trypsinogenu 25 aminokyselin, je výhodně zkrácena na propeptidovou sekvenci, která sestává pouze z rozpoznávací sekvence pro enteropeptidázu např, enterokinázu např. aminokyselinová sekvence Asp-Asp-Asp-Asl-Lys. Dle volby, může být k N-konci rozpoznávací sekvence enterokinázy připojeno několik dalších aminokyselin, nutných pro klonování, např. do 5 aminokyselin.

Bylo zjištěno, že exprese zkráceného rekombinantního trypsinogenu podle vynálezu, obsahujícího aminokyseliny Glu-Phe, připojené z důvodu klonování k N-konci rozpoznávacího místa enterokinázy, vede k značně vyšším výtěžkům, než je tomu v případě exprese přirozeného trypsinogenu, ve způsobu podle vynálezu. Z tohoto důvodu jev konkrétní přednostní formě způsobu podle vynálezu použita rekombinantní nukleová kyselina, jejíž nukleotidová sekvence je ukázaná v SEQ ID NO.22, která kóduje prasečí trypsinogen se zkrácenou propeptidovou sekvencí.

Ve způsobu podle vynálezu je exprese rekombinantního trypsinogenu výhodně kontrolována i nd ukováte lnou, expresi kontrolující sekvencí. Z tohoto důvodu může být nárůst hostitelských buněk proveden před indukcí exprese, za podmínek, které jsou výhodné nebo optimální pro růst hostitelských buněk. Proto například může růst probíhat pri pH 5 až 7, zejména při pH 5 až 6 až do předem stanovené optické hustoty, během níž je sekvence regulovatelná kontroly exprese potlačena. Exprese může být poté indukována změnou teploty anebo přídavkem induktoru. Příkladem přednostní sekvence kontrolované exprese je AOX 1 - promotor z Pichia pastoris, který může být indukován methanolem, který je zejména vhodný pro indukovatelnou expresi v methy lotrofních kvasinkách. Kultivační podmínky jsou výhodně změněny před indukcí sekvence kontrolované exprese takovým způsobem, který například změní pH na oblast 3 až 4, kde se

5o trypsinogen vytvořený expresí rekombinantní nukleové kyseliny akumuluje v intaktní formě v kultivačním médiu.

Kultivační podmínky ve způsobu podle vynálezu jsou vybrány tak, že je do značné míry zabráněno autokatalytickému štěpení propeptidové sekvence. Po izolaci produktu exprese z kultivačního média může být propeptidová sekvence odštěpena za kontrolovaných podmínek. Toto štěpení

-4 CZ 303658 B6 může být například provedeno přídavkem rekombinantního trypsinu anebo autokatalytickým štěpením. V tomto spojení je autokatalytickým štěpením rozuměna aktivace rekombinantního trypsinogenu sebou samým, která může být dle volby urychlena přídavkem malých množství rekombinantního trypsinu ale bez přídavku cizího proteinu. V tomto způsobu není nutné použít s další cizí protein, který je obvykle odvozen ze surového materiálu z živočišných zdrojů a musí být následně znovu odstraněn, což může způsobit nežádoucí štěpení v následné aplikaci. K autokatalytické aktivaci výhodně dochází pri pH v rozmezí 7 až 8. Toto zajišťuje, že trypsinogen, vytvořený během exprese, může být prvně vysoce purifikován v silně kyselé oblasti a aktivace může být specificky spuštěna pufrováním, výhodně v přítomnosti malých množství např. 20 mM io CaCl₂ do neutrální až slabě bazické oblasti pH. Aktivace může být zastavena změnou pH, znovu do silně kyselé oblasti. Trypsin může být například purifikován ionexovou chromatografií na takovém ionexu, jako SP -Sepharosa^XL nebo benzamidin-Sepharosa.

Za účelem purifikovat produkt exprese z kultivačního média může být kultivační supematant 15 prvně oddělen od buněk, jak je popsáno v příkladu 6.1. Následná purifikace zahrnující autokatalytickou aktivaci trypsinogenu je výhodně provedena vhodnými chromatografickým i purifikačními postupy. V zejména přednostní formě je provedena chromatografíe, jak je popsáno v přikladu

6.2, bez předcházející separace buněk, kde ke kultivačnímu médiu, stále obsahujícímu buňky, je přidán pufr, obsahující vápenaté ionty, o finální koncentraci vápníku 1 až 30 mM. Následně jsou provedeny kroky (c), (d) a dle volby (e) způsobu podle vynálezu například, využívající vhodné chromatografické purifikační postupy a krok pufrování, pro autokatalytické štěpení produktu exprese.

Zejména přednostní forma způsobu podle vynálezu je tedy charakterizována:

a) Transformováním hostitelské buňky rekombinantní nukleovou kyselinou, která kóduje zymogenní prekurzorový trypsinogen z prasete, který je fúzován se signální peptidovou sekvencí a obsahuje propeptid, který je zkrácen na rozpoznávací místo enterokinázy, kde toto štěpné místo je štěpeno rekombinantním trypsinem neboje štěpeno autokatalyticky za určitých pufrovacích podmínek a zkrácený trypsinogen může být v tomto postupu štěpen za vytvoření aktivního trypsinu,

b) Kultivováním hostitelské buňky během fáze exprese při kyselém pH, výhodně pH 3 až 4 tak, že zkrácený trypsinogen je přítomen v rozpustné formě a je sekretován do kultivačního média ale autokatalytické aktivaci je do značné míry zabráněno,

c) Izolací zkráceného rekombinantního trypsinogenu z kultivačního supematantu a jeho aktivací za podmínek, které dovolují účinné štěpení zkráceného trypsinogenu rekombinantním trypsinem nebo autokatalytickým štěpením a

d) Dle volby oddělením neštěpených molekul trypsinogenu od aktivního trypsinu.

Zkrácení propeptidu popsané v tomto vynálezu má pozitivní účinek zejména na expresi a autokatalytickou aktivaci. Kromě toho, po autokatalytické aktivaci se nežádoucí, další autolýza zvyšuje značně při pH > 4,0 během růstové fáze a expresní fáze kultury.

Další zvýšení ve výtěžku exprese ve způsobu podle vynálezu může být dosaženo transformováním hostitelské buňky několika vektory, kde každý z nich obsahuje rekombinantní nukleovou kyselinu, jak je uvedeno výše, kde vektory obsahují různé selekční markéry, např. Zeocin a G418. Kultivace za násobných selekčních podmínek překvapivě dovoluje, aby se dále podstatně zvýšil výtěžek exprese rekombinantního trypsinogenu.

Dalším předmětem vynálezu je rekombinantní nukleová kyselina, která kóduje trypsinogen, který má rozpoznávací místo pro enterokinázu v propeptidové sekvenci, kde propeptidová sekvence je vzhledem k přirozené propeptidové sekvenci zkrácena a je výhodně fúzována se signální peptido- 5 CZ 303658 B6 vou sekvencí. Zkrácená propeptidová sekvence podle vynálezu výhodně sestává z rozpoznávacího místa pro enterokinázu, které má aminokyselinovou sekvenci Asp-Asp-Asp-Asp-Lys a dle volby má až 5 dalších aminokyselin, umístěných na jeho N-konci. Nukleová kyselina podle vynálezu má zejména výhodně nukleotidovou sekvenci, ukázanou v SEQ ID NO.22.

Nukleová kyselina podle vynálezu je výhodně v operačním spojení s regulovatelnou sekvencí kontrolované exprese, což je například vhodná sekvence kontrolované exprese pro expresi genu v kvasinkových buňkách, taková jako AOX1 promotor z Pichia pastoris.

io Vynález se také týká rekombinantního vektoru, který obsahuje alespoň jednu kopii rekombinantní nukleové kyseliny, jak je uvedeno výše. Vektor je výhodně takový vektor, který je vhodný pro expresi genu v kvasinkových buňkách. Příklady takových vektorů jsou popsány v Sambrook et al., Molecular cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.

Kromě rekombinantní nukleové kyseliny obsahuje vektor další vhodné genetické prvky pro případné zamýšlené použití a zejména gen pro selekční markér. Zejména výhodně použité jsou vektory, které mohou být v buňce přítomny v násobných kopiích, zejména vektory, které mohou být integrovány v mnohonásobné formě do genomu hostitelské buňky. Vynález se také týká kombinací vektorů, kde každý z nich obsahuje gen pro různý selekční markér a které mohou být současně propagovány v hostitelské buňce.

Kromě toho, se vynález týká rekombinantní buňky, která je transformována nukleovou kyselinou podle vynálezu nebo vektorem podle vynálezu. Rekombinantní buňka je výhodně kvasinková buňka, zejména methylotrofní kvasinková buňka, taková, jako Pichia pastoris nebo Hansenula polymorpha.

Nakonec se vynález týká rekombinantního trypsinogenu, který je kódován nukleovou kyselinou podle vynálezu. Rekombinantní trypsinogen má propeptidovou sekvenci, která je ve srovnání s přirozenou propeptidovou sekvencí zkrácena a obsahuje rozpoznávací místo pro enterokinázu. Rekombinantní trypsinogen podle vynálezu má výhodně aminokyselinovou sekvenci, ukázanou v SEQ ID NO. 23.

Přehled obrázků na výkresech

Předkládaný vynález je také objasněn následujícími obrázky.

Obrázek 1: ukazuje plazmidovou mapu expresního plazmidu pTRYP-9, obsahujícího kom40 pletní rekombinantní trypsinogen,

Obrázek 2: ukazuje plazmidovou mapu expresního plazmidu pTRYP-11, obsahujícího zkrácený rekombinantní trypsinogen (sh-trypsinogen) a gen markéru pro rezistenci k Zeocinu (ZeoR),

Obrázek 3: ukazuje plazmidovou mapu expresního plazmidu pTRYP-13, obsahujícího zkrácený rekombinantní trypsinogen (sh-trypsinogen) a gen markéru (KanR) pro rezistenci ke kanamycinu / G418.

-6CZ 303658 B6

Příklady provedení vynálezu

Způsoby:

Techniky rekombinantní DNA

Pro manipulaci s DNA byly použity standardní způsoby, jak je popsáno v Sambrook, J. et al. (1989) v Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold io Spring Harbor, New York. Molekulámě-biologické reagencie byly použity podle návodů výrobce.

Stanovení proteinu

Stanovení proteinu purifikovaného trypsinu bylo provedeno měřením absorbance pri 280 nm.

Hodnota 13,6 byla použita pro A 1 % / 280 nm pro 1 cm silnou kyvetu.

Výpočet:

Protein [mg/ml] = (10 [mg/ml]* AA_vzorek * ředění) /13,6

Pichia pastoris a expresní vektory pro Pichia pastoris

Pro zacházení s Pichia pastoris a expresními vektory byly jako instrukce použity katalogy 25 a instrukční manuály od Invitrogenu. Vektory pro expresy zkráceného rekombinantního trypsinogenu jsou založeny na vektorech pPICZaA a pPIC9K od Invitrogenu.

Příklad 1

Syntéza genu kompletního rekombinantního trypsinogenu s využitím optimalizovaných kodonů pro expresi v kvasinkách

Jedním z přednostních způsobů pro provedení způsobu podle vynálezu je syntetizovat kodonově 35 optimalizovanou sekvenci genu. Za účelem optimalizovat každý kodón pro expresi v kvasinkách, bylo nezbytné provést kompletní de novo syntézu genu o cca 700 pb, který kóduje kompletní rekombinantní trypsinogen. Bylo-li to nutné, bylo možné optimalizovat každý kodón využitím degenerativního kódu v opětovné translaci sekvence aminokyseliny prasečího trypsinogenu podle

SEQ ID NO. 1. Pro tento účel byl gen rozdělen do 18 oligonukleotidů, které byly dlouhé 54 až 40 90 nukleotidů. Oligonukleotidy byly navrženy tak, že střídavá sekvence fragmentů kódujícího řetězce a komplementárního vlákna, jejichž 5' a 3' konce se navzájem komplementárně překrývají se sousedními oligonukleotidy. Překrývající se oblast byla vybrána v každém případě takovým způsobem, aby se do značné míry zabránilo nespecifické vazbě během reakce rozpoznávání v následné PCR reakci. Oligonukleotidy na 5' a 3' konci genu byly poskytnuty proti směru a po sméru kódující oblasti s rozpoznávacími místy pro restrikční endonukieázy, které by mohly být použity pro pozdější inzerci syntetického genu podle SEQ ID NO.2 do expresních vektorů. Takto bylo tedy proti směru vloženo rozpoznávací místo pro restrikční endonukleázu EcoRI a po směru bylo vloženo rozpoznávací místo pro restrikční endonukleázu Xbal. Sekvence oligonukleotidů jsou ukázány v SEQ ID NO.3 až 20.

Syntéza genu byla provedena pomocí PCR reakce. Kódující oblast byla proto prvně rozdělena do tří segmentů (oligonukleotidy 3 až 8, 9 až 14, 15 až 20) a tyto segmenty byly vytvořeny v oddělených PCR reakcích, použitím překrývajících se komplementárních oligonukleotidů. V tomto postupu byl fragment genu v každém kroku prodloužen až do té doby, kdy byl vytvořen produkt

- 7 CZ 303658 B6 celkové délky, který byl amplifikován v následujících cyklech. Teplota připojení byla vybrána podle překrývající se oblasti s nejnižŠí teplotou tání.

Tyto tři segmenty byly následně analyzovány pomocí elektroforézy v agarosovém gelu, produk5 ty, které měly očekávanou délku byly izolovány z gelu použitím QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen) a byly syntetizovány za vytvoření kompletního genového produktu v další PCR reakci. Prvních 5 cyklů byly PCR reakce provedeny bez přídavku primerů na 5' konci a 3' konci celého genu, takže ze začátku bylo z těchto tří segmentů tvořeno několik fragmentů genového produktu o očekávané délce. Teplota připojení byla vybrána podle překrývající se oblasti s nejnižŠí teploto tou tání. Poté byly přidány koncové primery a teplota připojení byla zvýšena podle teploty připojení příměru s nejnižŠí teplotou tání. Fragment genu očekávané délky byl amplifikován v dalších cyklech. PCR fragment byl zkontrolován sekvenováním.

Příklad 2

Příprava zkráceného trypsinogenového genu

Kodóny prvních 20 aminokyselin přirozeně se vyskytujícího trypsinogenu byly odstraněny pomocí speciálně navrženého 5' primerů podle SEQ ID NO. 21 tak, aby jako N-koncová propeptidová sekvence zkráceného rekombinantního trypsinogenu zůstaly pouze kodóny rozpoznávací sekvence enteropeptidázy enterokinázy Asp-Asp-Asp-Asp-Lys a kodóny Glu-Phe, nutné pro klonování do expresních vektorů pro Pichia pastoris, kvůli rozpoznávacímu místu restrikční endonukleázy EcoRI. Delece byla vnesena pomocí PCR reakce PCR fragmentu genu, kódujícího kompletní rekombinantní trypsinogen, použitím 5' primerů podle SEQ ID NO.21 a 3' příměru podle SEQ ID NO.20. DNA sekvence zkráceného rekombinantního trypsinogenu je ukázána v SEQ ID NO. 22 a aminokyselinová sekvence zkráceného rekombinantního trypsinogenu je ukázána v SEQ ID NO. 23.

Příklad 3

Klonování PCR fragmentů kompletního rekombinantního trypsinogenu, vytvořeného syntézou genu a klonování zkráceného rekombinantního trypsinogenu do expresních vektorů pro Pichia pastoris

PCR fragmenty byly znovu štěpeny EcoRI a Xbal (Roche Diagnostics GmbEI), znovu izolovány (QIAquick Gel Extraction Kit/Qiagen) a následně byly ligovány do fragmentu expresního vektoru pPICZaA (Invitrogen), linearizovaného EcoRI a Xbal (Roche Diagnostics GmbH) a izolovaného QIAquick Gel Extraction Kit/Qiagen. Poté bylo pipetováno 1 μΙ (20 ng) fragmentu vektoru a 3 μΐ (100 ng) PCR fragmentu, 1 μΐ 10 x ligázového pufru (Sambrook et al., 1989 B.27), 1 μΐ T4 DNA ligasy, 4 μΐ sterilní H₂O_redesti_OVané, směs byla opatrně promíchána a byla inkubována přes noc při 16 °C. V tomto vektoru je syntetický gen pod kontrolou AOX 1 promotoru (promotor pro alkoholoxidázu l z Pichia pastoris), který může být indukován methanolem (Mallin45 ckrodt Baker B.V.) a je umístěn ve správném čtecím rámci za signálním peptidem a faktoru z Saccharomyces cerevisiae. Za účelem kontroly a izolace plazmidu, bylo 5 μΐ ligační směsi poté transformováno do 200 μΐ kompetentních buněk (Hanahan (1983) E. coli XLlBiue (Stratagene). Po 30 min inkubaci na ledu následoval teplotní šok (90 sek při 42 °C). Následně byly buňky přeneseny do 1 ml LB média a byly inkubovány 1 hodinu při 37 °C v LB médiu pro fenotypickou expresi. Alikvoty této transformace byly naneseny na misky s LB médiem, za použití 100 μg/ml

Zeocinu, jako selekčního markéru a byly inkubovány 15 hodin při 37 °C. Z narostlých kolonií byly izolovány plazmidy (Sambrook, J. et al. (1989) In. Molecular cloning: A Laboratory

Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York) a byla ověřena bezchybnost sekvence bází pomocí restrikční analýzy a sekvenování. Expresní vektory vytvořené

-8CZ 303658 B6 tímto způsobem, které obsahují syntetický gen pro kompletní rekombinantní trypsinogen nebo pro zkrácený rekombinantní trypsinogen, byly pojmenovány pTRYP-9 (viz obr. 1) a pTRYP-11 (viz obr. 2).

Transformace pTRYP-9 a pTRYP-11 do Pichia pastorís

Pro transformaci pTRYP-9 a pTRYP-11 do Pichia pastorís X-33, GS115 nebo KM71H s následnou integrací do genomu, byl vektor prvně linearizován Sací (Roche Diagnostics GmbH). Transformace byla provedena elektroporací, použitím Gene Pulser 11 (Biorad). Pro toto bylo io kolonií Pichia pastorís inokulováno 5 ml YPD média (Invitrogen) a bylo inkubováno přes noc při °C za třepání. Pomocí této kultury narostlé přes noc bylo následně znovu inokulováno 200 ml čerstvého YPD média (Invitrogen) 1:2000 a bylo inkubováno za třepání přes noc při 30 °C, dokud nebylo dosaženo OD₆₀o 1,3 až 1,5. Buňky byly poté odstředěny (1500 x g / 5 minut) a peleta byla resuspendována v 200 ml ledově studené, sterilní vodě (0 °C). Buňky byly znovu odstředěny (1500 x g / 5 minut) a byly resuspendovány ve 100 ml ledově studené, sterilní vody (0 °C). Buňky byly znovu odstředěny a resuspendovány v 10 ml ledově studeného (0 °C) 1 M sorbitolu (ICN). Buňky byly znovu odstředěny a resuspendovány v 0,5 ml ledově studeného (0 °C) 1 M sorbitolu (ICN). Takto izolované buňky byly uchovávány na ledu a ihned použity pro transformaci.

pl buněk bylo smícháno s cca 1 pg linearizované pTRYP-9 nebo pTRYP-11 vektorové DNA a celá směs byla přenesena do ledově studené (0 °C) elektroporační kyvety a byla inkubována na ledu po dalších 5 minut. Následně byla kyveta umístěna do Gene Pusler II (Biorad) a transformace byla prováděna při 1 kV, 1 kQ a 25 pF. Po elektroporací byla směs smíchána s 1 ml l M sorbitolu (ICN) a následně bylo 100 až 150 pl rozetřeno na misku s YPDS agarem (Invitrogen), obsahujícím 100 pg/ml Zeocinu (Invitrogen). Misky byly následně inkubovány 2 až 4 dny při 30 °C.

Klony byly znovu inokulovány na miskách s rastrem MD (= minimální dextrosa) a dále analyzo30 vány. Narostlé klony byly odebrány, resuspendovány ve 20 pl sterilní vody, lyžovány (1 hodinu, 30 °C, 10 min, -80 °C) 17,5 U lytikázy (Roche Diagnostics GmbH) a pomocí PCR byly přímo analyzovány, zda obsahují správně integrovanou trypsinogenovou expresní kazetu.

Klony, u kterých došlo během transformace k integraci kompletní expresní kazety do genomu, byly použity pro expresní experimenty.

Exprese kompletního a zkráceného rekombinantního trypsinogenu

Pozitivní klony byly inokulovány ve 3 ml BMGY média (Invitrogen) a inkubovány přes noc při

30 °C za třepání. Následně bylo stanoveno OD při 600 nm a tyto klony byly znovu inokulovány v 10 ml BMMY média (Invitrogen) pH 3,0 tak, aby výsledné OD₆₀₀ bylo 1. BMMY médium (Invitrogen) pH 3,0 obsahuje methanol (Mallinckrodt Baker B.V.), který indukuje expresi kompletního nebo zkráceného rekombinantního trypsinogenu, prostřednictvím AOX1 promotoru.

Kultivační nádoby byly za třepání inkubovány při 30 ^CC, Každých 24 hodin byly odebírány vzorky, bylo stanoveno OD₆oo, pro kontrolu exprese, pomocí SDS elektroforézy v polyakrylamidovém gelu, byl odebrán alikvot kompletního a zkráceného rekombinantního trypsinogenu a každý byl doplněn 0,5% methanolem (Mallinckrodt Baker B.V.) pro další indukci. Expresní experimenty byly prováděny po 72 hodin.

-9CZ 303658 B6

Analýza exprese kompletního a zkráceného rekombinantního trypsinogenu pomocí SDS elektroforézy v gelu

Z každé exprimující kultury bylo odebráno 500 μΙ, bylo stanoveno OD₆₀o a buňky byly odstředěny. Kultivační supematant byl uložen a buněčná peleta byla kvůli lyži resuspendována v příslušném množství Y-PER™ (50 až 300 μΙ/Pierce) pro OD₆₀₀ a byla třepána po 1 hodinu při laboratorní teplotě. Následně byl lyzát odstředěn, aby se oddělily buněčné zbytky (15000 x g / 5 minut) a supematant byl přenesen do čistých reakčních nádobek. 10 μΐ lyzátu a 10 μΐ kultivační ního supematantu bylo naneseno na SDS polyakrylamidový gel a proteiny byly aplikováním elektrického pole rozděleny podle velikosti.

Překvapivě bylo možné identifikovat slabé zóny v kultivačních supematantech klonů, obsahujících kompletní rekombinantní trypsinogen, stejně jako u klonů, obsahující zkrácený rekombi15 nantní trypsinogen, který se nevyskytoval v kontrolních klonech. Kontrolními klony se rozumí X33 buňky Pichia pastoris, které byly transformovány výchozím vektorem pPICZaA a které rostly a byly indukovány podobně, jako klony exprimující trypsinogen. Migrační vlastnosti nových proteinových zón v exprimujících klonech odpovídají vypočítané molekulové hmotnosti aje mírně vyšší než je molekulová hmotnost hovězího trypsinu, který byl nanesen jako kontrolní markér. Tato mírná odlišnost ve velikosti naznačuje na neaktivovaný trypsinogen.

Překvapivě, rekombinantní zkrácený trypsinogen byl exprimován významně silněji než rekombinantní kompletní trypsinogen.

Příklad 4

Zvýšení výtěžku exprese násobnou transformací

Nejlepší klony z expresních experimentů s rekombinantním zkráceným trypsinogenem byly znovu připraveny pro elektroporaci, jakje popsáno výše, a byly znovu transformovány 1 pg linearizované pTRYP-11 vektorové DNA a transformační směs byla nanesena na misky s YPDS agarem (Invitrogen), obsahující 1000 až 2000 pg/ml Zeocinu (Invitrogen). Toto zvyšuje selekční tlak takovým způsobem, že rostou pouze ty klony, které mají ve svém genomu integrováno něko35 lik kopií expresního vektoru pTRYP-11 a tím také několik kopií příslušného genu pro rezistenci (v tomto případě pro Zeocin®). Protein zodpovědný za rezistenci k Zeocinu® je produkt bleomycinového genu ze Streptoalloteichus hindustanus (Calmels, T. et al., (1991); Drocourt, D. et al., (1990)), který váže Zeocin® ve stechiometrickém koncentračním poměru a tím tvoří buňku rezistentní k Zeocinu®. Čím vyšší je koncentrace Zeocinu® na miskách s YPDS agarem, tím vyšší množství proteinu, zajišťujícího rezistenci, musí být buňkou vytvořeno, aby umožnilo kvantitativně vázat Zeocin® a tím i růst. Toto je mezí jiným možné tehdy, když jsou v genomu integrovány násobné kopie genu pro rezistenci. Klony byly znovu inokulovány na MD miskách s rastrem, jakje popsáno výše.

Následně byly tyto klony ověřeny, zda exprimují a sekretují trypsinogen, jak je popsáno výše.

Překvapivě, bylo po tomto měření možné identifikovat klony, které měly značně zvýšený výtěžek exprese zkráceného rekombinantního trypsinogenu, sekretovaného do kultivačního supematantu po elektroforéze v SDS polyakrylamidovém gelu.

- 10CZ 303658 B6

Příklad 5

Zvýšení výtěžku exprese použitím druhého selekčního tlaku

Zvýšení koncentrace Zeocinu® nad 2000 pg/ml nevedlo k zlepšení výtěžku exprese zkráceného rekombinantního trypsinogenu. Za účelem dále zvýšit počet kopií genu v expresních klonech genu podle SEQ ID NO. 22, který kóduje rekombinantní zkrácený trypsinogen a je kodonově optimalizován pro expresi v kvasinkách, byly integrovány další expresní vektory do genomu io expresních klonů, připravených v příkladech 3 a 4, které mají nejvyšší výtěžek exprese prostřednictvím druhého selekčního tlaku, výhodně G418 (Roche Díagnostics GmbH).

Pro tento účel je expresní kazeta z pTRYP-l 1, obsahující část AOX1 promotoru, gen pro signální peptid a faktoru Saccharomyces cerevisiae, kodonově optimalizovaný gen pro rekombinantní zkrácený trypsinogen podle SEQ ID NO.22, vyštěpena restrikčními endonukleázami Sací a Xbal z pTRYP-l 1, restrikční směs je rozdělena na 1% agarózovém gelu a z gelu je izolován fragment o 1693 pb (QIAquick Gel Extraction Kit/Qiagen). Současně byl pomocí Sací a Notl štěpen vektor pPIC9K (Invitrogen), restrikční směs byla rozdělena na 1 % agarózovém gelu a z gelu byl izolován fragment vektoru o 8956 pb (QIAquick Gel Extraction Kit/Qiagen), Xbal přečnívající fragment z pTRYP-l 1 a Notl přečnívající fragment z pPlC9K byly doplněny pomocí Klenowovy polymerázy (Roche Díagnostics GmbH), za vytvoření tupých konců, podle návodu výrobce.

Následně, dva fragmenty získané tímto způsobem, byly ligovány, jak je popsáno výše. Ligační směsí byla transformována E. coli XL1 Blue (Stratagene), jak je popsáno výše (klony obsahující plazmid byly selektovány na miskách s 100 pg/ml ampicilinu na miskách s živným médiem) a tyto klony byly pomocí restrikčních analýz a sekvenovány ověřeny. Expresní vektor, vytvořený tímto způsobem, byl pojmenován pTRYP-13 (viz obr. 3).

Integrace expresního vektoru pTRYP-13 do genomu Pichie pastoris byla selektována proso střednictvím G418 (Roche Díagnostics GmbH).

Klony, které měly nejvyšší výtěžek exprese trypsinogenu z násobné transformace s pTRYP-l l (Zeocínová rezistence) byly připraveny pro elektroporací, jak je popsáno výše a transformovány 1 pg fragmentu vektoru pTRYP-13 (G418 rezistence), linearizovaným Sáli (Roche Díagnostics

GmbH). Transformační směs byla následně uložena na 1 až 3 dny při 4 °C v 1 M sorbitolu (1CN) (pro vytvoření G418 rezistence), poté bylo 100 až 200 μΐ naneseno na misky s YPD (Invitrogen), obsahující l, 2 a 4 mg/ml G418 (Roche Díagnostics GmbH) a inkubovány 3 až 5 dnů při 30 °C. Výsledné klony, výhodně z misek s YPD s nejvyšší koncentrací G418, byly znovu testovány na zvýšení exprese zkráceného rekombinantního trypsinogenu, použitím SDS eletroforézy v poly40 akrylamidovém gelu, jak je popsáno výše.

Po tomto postupu bylo překvapivě možno znovu identifikovat klony, které vykazují zvýšený výtěžek exprese zkráceného rekombinantního trypsinogenu v kultivačním supematantu po SDS elektroforéze v polyakrylamidovém gelu.

Příklad 6

Izolace trypsinogenu z kultivačního supematantu a aktivace

6.1

Kultivační supematant byl od buněk oddělen pomocí mikrofiltrace, centrifugace nebo filtrace.

Trypsinogen byl purifikován pomocí chromatografie na fenyl Sepharose fast flow (Pharmacia).

Chromatografie byla provedena v oblasti pH 2 až 4. Autokatalytická aktivace byla spuštěna pufrováním pH na 7 až 8 v přítomnosti 20 mM CaCL. Tato autokatalytická aktivace může být zastavena opětovnou změnou pH zpět do oblasti 2 až 4. Aktivní trypsin byl purifikován chromatografií na benzamidinové Sepharose (např. SP-Sepharose®XL, fí) (Pharmacia/package insert) nebo na ionexu. Trypsin je skladován při pH 1,5 až 3, aby se zabránilo autolýzi. Specifická akti5 vita purifi kovaného trypsinu je 180 až 200 U/mg proteinu.

6.2

Celé fermentační médium je nareděno v poměru přibližně 1:2 až 1:4 pufrem octanu amonného io (5až20mM) obsahujícího 5 až 30 mM chloridu vápenatého, pH 3,5 a purifikovaného prostřednictvím chromatografie na expandovaném loži (expanded bed chromatography; McComick (1993); EP 0 699 687) použitím kationtového iontoměniče (např. Streamline@SP, XL). V tomto případě byla chromatografie provedena za přítomnosti buněk. Buňky jsou současně rozděleny pomocí chromatografie. Následuje postup, který je popsán v příkladu 6,1 (pufrování/aktivace t5 atd.).

Příklad 7

Stanovení aktivity

Aktivita trypsinu byla stanovena použitím Chromozym TRY (Pentapharm Ltd) ve 100 mM Tris pH 8,0, 20 mM CaCl₂ při 25 °C. Fotometrické měření je provedeno při 405 nm.

Zkratky:

YPD:

YPDS:

BMGY:

BMMY: SDS:

kvasničný dextrózový pepton kvasničný dextrózový sorbitolový pepton pufrované glycerolové komplexní médium pufrované methanolové komplexní médium dodecylsulfát sodný

Seznam literárních citací:

Bricteuz-Gregoire, Schyns R., Florkin M (1966) Biochim. Biophys. Acta 127: pp 277

Calmels T., Parriche M., DurandH., Tiraby G. (1991), Curr. Genet. 20: pp 309

Charles M., Rovery M., Guidoni A., Desnuelle P. (1963) Biochim. Biophys. Acta 69: pp 115 až 40 129

Desnuelle P. (1959)

Enzymes 2^nd Edition vol 4 Editor Boyer, Acad. Press NY. pp. 119

Drocourt, D., Calmels T., Reynes J. P., Baron M., Tiraby G. (1990), Nucleic Acid Research 18: pp 4009

Graf L., Craík C. S., Patthy A., Roczniak S., Fletterick RJ., Rutter WJ. (1987) Bioehem. 26: pp. 2616

Graf L., Jancso A., Szilagyi L., Hegyi G., Pinter K., Naray-Szabo G., Hepp J., Mehzihradszky

K., Rutter W. J. (1988) Proč. Nati. Acad. Sci USA 85, pp 4961

- 12 CZ 303658 B6

Hanahan(1983)

J. MoL Biol., 166: pp557

Higaki J. N., Evnin L. B., Craik C. S. (1989) Biochem. 28; pp 9256

Hedstrom L., Szilagyi L., Rutter W. J. (1992) Science 255: pp 1249

Jurasek L., Fackre D. Smillie L. B. (1969) Biochem. Biophys. Res. Commun 37: pp. 99 io Keil B. (1971)

The Enzyme Vol II, 3^rd Edition, Editor Boyer, Acad. Press N. Y. pp 249 až 275

Light A., Savithari H. S„ Liepnieks J. J. (1980) Analytical Biochemístry 106: pp 199 až 206

McCornick D. K., Bio/Technol. 11 (1993), 1059: Expanded Bed Absorption, Principles and Methods, Amersham Pharmacia Biotech, Edition AB, ISBN 91—630—5519—8;

Morihara K. and Tszzuki J. (1969) Arch Biochem Biophys 126: pp 971

Northrop J. H., Kunitz M., Herriott R. (1948)

Crystallíne Enzymes, 2^nd Edition, Columbia Univ. Press NY RyanC.A. (1965)

Arch Biochem Biophys 110: pp 169

Sambrook, J., Fritsch E. F., Maniatis T. (1989)

In. Motecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press,

Cold Spring Harbor, New York

Travis J. (1968)

Biochem Biophys Res Commun. 30: pp 730

Travis J. and Roberts R. C. (1969) Biochemístry 8: pp 2884

Trop M. and Birk Y. (1968) Biochem. J. 109: pp 475

Wahlby S. and Engstrom L. (1968) Biochim. Biophys. Acta 151: pp 402

Vasquez, J. R., Evnin L. B„ Higaki J. N. Craik C. S. (1989) J. Cell. Biochem. 39: pp. 265

Wahlby S.( 1968)

Biochim. Biophys. Acta 151: pp 394

Willett, W. S., Gillmor S. A., Perona J. J., Fletterick R. J.. Craik C S (1995) Biochem. 34: pp 2172

Yee, L. and Blanch, H. W. (1993) Biotechnol. Bioeng. 41: pp. 781 až 790

WO 97/00 316 (NOVO NORDISK AS/Wóldike Helle, Kjeldsen Thomas) A PROCESS FOR PRODUCING TRYPSIN

WO 99/10 503 (ROCHE DIAGNOSTICS/Kopetzki Ehrhard, Hopfher Karl-Peter, Bode Wolfram, Huber Robert)

- 15 CZ 303658 B6

ZYMOGENIC PROTEÁZE PREKURZOR THAT CAN BE AUTOKATALYTICALL ACTIVATED AND THEIR USE.

WO 00/17 332 (ELI LILLY AND COMPANY/Hanquier Jose Michael, Hershberger Charles Lee, ? Desplancq Dominique, Larson Jeffrey) PRODUCTION OF SOLUBLE RECOMBINANT

TRYPSINOGEN ANALOGS

WO 01/55 429 (POLYMUN SCIENTIFIC IMMUNBIOLOGISCHE FORSCHUNG GMBH/Mattanovich Diethard, Katinger Hermann, Hohenblum Hubertus, Naschberger Stefan, io Weik Robert) METHOD FOR THE MANUFACTURE RECOMBINANT TRYPSIN

EP 0 597 691 (ELI LILLY AND COMPANY/Greaney Michael Gerard, Roštech Paul Robert) EXPRESSION VECTORS FOR THE BOVÍNE TRYPSIN AND TRYPSINOGEN AND HOST CELLS TRANSFORMED THEREWITH

EP 0 699 687 (MITSUBISHI PHARMA CORPORATION/Noda Munehiro, Sumi Akinori, Ohm ura Takao, Yokoyama Kazmasa)

PROCESS FOR PURIFYING RECOMBINANT HUMAN SÉRUM ALBUMIN

Claims

1. Způsob rekombinantní produkce trypsinu, vyznačující se tím, že zahrnuje kroky:

a) transformace hostitelské buňky rekombinantní nukleovou kyselinou, která kóduje trypsinogen s rozpoznávacím místem pro enterokinázu v propeptidové sekvenci ve formě, která může být

30 sekretována hostitelskou buňkou,

b) kultivace hostitelské buňky za kyselých podmínek umožňujících expresi rekombinantní nukleové kyseliny a sekreci produktu exprese do kultivačního média, přičemž podmínky jsou vybrány tak, zeje zabráněno autokatalytickému štěpení propeptidové sekvence,

c) izolace produktu exprese z kultivačního média,

d) štěpení propeptidové sekvence za vytvoření aktivního trypsinu

40 a popřípadě

e) oddělení neštěpených molekul trypsinogenu od aktivního trypsinu.

2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se jako hostitelské buňky použijí

45 kvasinkové buňky.

3. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že se jako hostitelské buňky použije buňka Pichia pastoris nebo Hansenula polymorpha.

50

4. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že se použije rekombinantní nukleová kyselina, která kóduje trypsinogen fúzovaný k signálnímu peptidu, který zprostředkovává sekreci.

- 14 CZ 303658 B6

5. Způsob podle kteréhokoliv z nároků laž4, vyznačující se tím, že se použijí rekombinantní nukleové kyseliny s optimalizovaným využitím kodónů pro příslušnou hostitelskou buňku podle nároku 1.

5

6. Způsob podle kteréhokoliv z nároků laž5, vyznačující se tím, žcse použije rekombinantní nukleová kyselina, která kóduje trypsinogen s propeptidovou sekvencí zkrácenou tak, že sestává z rozpoznávací sekvence pro enteropeptidázu, popřípadě s až 5 aminokyselinami připojenými k N-konci rozpoznávací sekvence pro enteropeptidázu.

io

7. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6, vyznačující se t í m , že se použije rekombinantní nukleová kyselina, která kóduje prasečí trypsinogen.

8. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7, vyznačující se tím, že se použije rekombinantní nukleová kyselina, která má nukleotidovou sekvenci SEQ ID NO. 22.

9. Způsob podle kteréhokoliv z nároků laž8, vyznačující se tím, že se exprese rekombinantní nukleové kyseliny provádí při pH 3 až 4.

10. Způsob podle nároku 9, vyznačující se tím, že před expresí rekombinantní

20 nukleové kyseliny se hostitelská buňka kultivuje za podmínek, kteréjsou optimální pro její růst.

11. Způsob podle nároku 10, vyznačující se tím, že před expresí rekombinantní nukleové kyseliny se hostitelská buňka kultivuje pří pH 5 až 7 až do předem stanovené optické denzity a poté se indukuje exprese rekombinantní nukleové kyseliny.

12. Způsob podle kteréhokoliv z nároků lažll, vyznačující se tím, že odštěpování propeptidové sekvence se provádí přídavkem rekombínantního trypsinu a/nebo autokatalytickým štěpením.

30 13. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 12, vyznačující se tím, že kultivační médium obsahující hostitelské buňky se smíchá s pufrem obsahujícím vápenaté ionty a následně se provedou kroky c), d) a popřípadě e).

12 stránek sekvencí