CZ303658B6 - Zpusob rekombinantní produkce trypsinu - Google Patents
Zpusob rekombinantní produkce trypsinu Download PDFInfo
- Publication number
- CZ303658B6 CZ303658B6 CZ20032337A CZ20032337A CZ303658B6 CZ 303658 B6 CZ303658 B6 CZ 303658B6 CZ 20032337 A CZ20032337 A CZ 20032337A CZ 20032337 A CZ20032337 A CZ 20032337A CZ 303658 B6 CZ303658 B6 CZ 303658B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- expression
- trypsinogen
- recombinant
- trypsin
- nucleic acid
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6427—Chymotrypsins (3.4.21.1; 3.4.21.2); Trypsin (3.4.21.4)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
Zpusob rekombinantní produkce trypsinu, který zahrnuje kroky: a) transformace hostitelské bunky rekombinantní nukleovou kyselinou, která kóduje trypsinogen s rozpoznávacím místem pro enterokinázu v propeptidové sekvenci ve forme, která muze být sekretována hostitelskou bunkou, b) kultivace hostitelské bunky za kyselých podmínek umoznujících expresi rekombinantní nukleové kyseliny a sekreci produktu exprese do kultivacního média, pricemz podmínky jsou vybrány tak, ze je zabráneno autokatalytickému stepení propeptidové sekvence, c) izolace produktu exprese z kultivacního média, d) stepení propeptidové sekvence za vytvorení aktivního trypsinu a poprípade e) oddelení nestepených molekul trypsinogenu od aktivního trypsinu.
Description
Způsob rekombinantní produkce trypsinu
Oblast techniky
Vynález se týká způsobu rekombinantní produkce trypsinu. Při tomto postupu se trypsinogen se zkrácenou propeptidovou sekvencí exprimuje v rekombinantní hostitelské buňce a v neštěpené formě sekretuje do kultivačního média. Následně se propeptidová sekvence kontrolovaným způsobem štěpí, za vytvoření aktivního trypsinu.
Dosavadní stav techniky
Trypsin je serinová proteáza, která kata lyžuje hydrolytické štěpení peptidů v karboxylové skupině bazických aminokyselin argininu a lysinu (Keil B., 1971). Trypsin z hovězího pankreatu byl jedním z prvních proteolytických enzymů, které mohly být použity v čisté formě a v adekvátních množstvích pro přesné chemické a enzymové studie (Northrop et al., 1948). Následně bylo také možné, izolovat proteázy, které mohou být zařazeny do trypsinové rodiny, z jiných vyšších obratlovců (prase - Charles et al. 1963 / ovce - Bricteux-Gregoire et al. (1966); Travis (1968) / krocan - Ryan (1965) / člověk - Travis et al. (1969 a další). V této době byly také izolovány první enzymy, náležící do trypsinové rodiny, ze dvou druhů streptomycet (Morihara a Tsuzuki (1968); Trop a Birk (1968); Wahlby a Engstrom (1968); Wahlby (1968; Juraseket al. (1969)).
Enzym je syntetizován v pankreatických buňkách obratlovců, jako inaktivní prekurzor, trypsino25 gen, a následně je přeměněn na aktivní formu štěpením propeptidu (Northrop et al, (1948), Desnuelle (1959)). První molekuly trypsinogenu byly aktivovány přirozeně enteropeptídázou enterokinázou, která hydrolyzuje peptidovou vazbu mezi (Asp.tj-Lys-^-IIe, což odštěpuje propeptid (Keil (1971)). Rozpoznávací sekvence enterokinázy (Asp4)-Lys je umístěna přímo na C-konci propeptidu, téměř u všech, drive známých, molekul trypsinogenu (Light et al. (1980)). Proces aktivace může být také proveden autokatalyticky při fyziologických hodnotách pH, protože lysin je umístěn na C-terminální straně rozpoznávací sekvence enterokinázy a tak může být peptidová vazba Lys-^-Ile, také hydrolyzována trypsinem (Light et al. (1980)).
Trypsin byl vždycky zajímavou proteázou pro biotechnologické aplikace, díky jeho snadné dostupnosti z různých savců, vysoké specifitě (štěpí pouze na C-terminální straně lysinu nebo argininu) spolu s vysokou specifickou aktivitou (~ 150 U/mg) a jeho dobré stabilitě během skladování. Trypsin je zejména používán pro tryptické štěpení peptidů na malé části pro sekvenování, pro uvolnění adherentních buněk z potažených misek pro buněčné kultury a pro štěpení fúzních proteinů na cílový peptid a fúzní složku, pro aktivaci propeptidů (např. trypsinogenu na trypsin) a pro rekombinantní produkci peptidových hormonů (např. proinzulinu na inzulín, viz také WO 99/10 503). Trypsin je také součástí některých farmaceutických přípravků (mastí, dražé a aerosolů pro inhalaci („Rotě Liste“, 1997; The United States Pharmacopeia, The National Formulary, USP23-NF18, 1995)). Jelikož použití enzymů ze zvířecích zdrojů není již v mnoha případech povoleno (možná kontaminace infekčními činidly), musí být pro žádané biotechno45 logické aplikace poskytnuty molekuly rekombínantního trypsinu z mikrobiálních hostitelů. Existuje několik způsobů pro produkci rekombínantního trypsinu z různých organismů.
Graf, L. et al (1987 až 1988) popisuje expresi a sekreci krysích trypsinových a trypsinogenových mutantů v E. coli. Za účelem sekrece molekul trypsinogenu do periplazmy E. coli, je přirozená signální sekvence trypsinogenu nahrazena signální sekvencí bakteriální alkalické fosfatázy (phoA). Sekretované inaktivní molekuly trypsinogenu jsou izolovány z periplazmy a jsou aktivovány enzymovým štěpením, použitím purifikované enterokinázy.
- 1 CZ 303658 B6
Vasquez, J. R. et al. (1989) popisuje expresi a sekreci anionického krysího trypsinu a trypsinových mutantů v E, coli. Za účelem exprimovat a sekretovat molekuly aktivního trypsinu do periplazmy E. coli, je přirozený prepro segment trypsinogenu (signální sekvence a aktivační peptid) nahrazen signální sekvencí bakteriální alkalické fosfatázy (phoA) a je použit phoA promotor, který může být regulován fosfátem. Aktivní trypsin je izolován z periplazmy. Výtěžek je však velmi nízký (cca 1 mg/l).
Higaki, J. N. et al. (1989) popisuje expresi a sekreci trypsinu a trypsinových mutantů do periplazmy E. coli, použitím tac promotoru a signální sekvence hisJ S.typhimurium. Výtěžek aktivního trypsinu je cca. 0,3 mg/l. Objemový výtěžek aktivního anionického krysího trypsinu může být zvýšen na přibližně 50 mg/l, pomocí fermentace s vysokou hustotou buněk (Yee, L. a Blanch, H. W., (1993)). Autoři však poukazují na problémy v expresi a sekreci aktivního trypsinu v E. coli. Enzymaticky aktivní trypsin je vytvořen v periplazmě E. coli po štěpení signální sekvence a proteinovým sbalením nativního trypsinu se vytváří 6 disulfidových můstků. Tvorba aktivního trypsinu je pro buňku toxická, protože aktivní trypsin hydrolyzuje periplazmatické proteiny E. coli, které lyžují buňky. Kromě toho, je v periplazmě E.coli zabráněno proteinovému sbalení trypsinu a zejména správné nativní tvorbě 6 disulfidových můstků. Tento systém není vhodný pro izolaci relativně velkých množství trypsinu (> 10 mg; Willett, W. S. et al., (1995)).
Za účelem produkovat větší množství trypsinu (50 až 100 mg) pro rentgenové krystalografické studie, je v kvasinkách produkován inaktivní trypsinogenový prekurzor, pod kontrolou regulovatelného ADH/G APDH promotoru aje sekreto ván pomocí fúze s vedoucí sekvencí kvasinkového a faktoru. Expresní produkt, sekretovaný do média, je kvantitativně přeměněn in vitro na trypsin, pomocí enterokinázy. Výtěžek je 10 až 15 mg/l (Hedstrom, L. et al. (1992)).
DNA sekvence jsou popsány v EP 0 597 681, které kódují matumí hovězí trypsin a hovězí trypsinogen, s reziduem iniciačního meth tóninu. Navíc, je popsána exprese v E. coli, ale není vysvětlena strategie, jak je v E.coli vytvořen aktivní trypsin.
Způsob produkce trypsinu z prasečího pankreatu nebo jeho derivátu v Aspergillus rekombinantním způsobem, je popsán ve WO 97/00 316. Pro transformaci je použit vektor, který kóduje trypsinogen nebo jeho derivát, který je N-koncově fúzován k funkčnímu signálnímu peptidů. Avšak, kvasinkové kultury dosahují vyšších koncentrací biomasy, ve srovnání s kulturami Aspergillus a rostou podstatně rychleji a proto může být výtěžek specifické exprese u kvasinkové buňky nižší než pro buňky Aspergillus, za účelem dosažení výtěžků, které jsou potřebné pro ekonomický způsob exprese.
Způsob rekombinantní produkce prekurzorů zymogenů proteáz, které obsahují autokatalytické štěpící místo, které se přirozeně nevyskytujeme popsáno ve WO 99/10 503. Tento způsob zahrnuje expresi prekurzorů zymogenů v E. coli, ve formě inkluzních tělísek, s následnou purifikací a renaturací za podmínek, při kterých je vytvořena proteázová část prekurzorů zymogenů, ve své přirozené konformaci a ke štěpení renaturováného prekurzorů zymogenů poté dochází autokatalyticky. Nevýhodou tohoto způsobu jsou velké ztráty, které se často vyskytují během renaturace a velké objemy, kteréjsou vyžadovány pro průmyslovou výrobu.
Rekombinantní produkce trypsinových analog v Pichia pastoris je popsána ve WO 00/17 332. Pro transformaci je použit vektor, který kóduje analog trypsinogenu (derivát hovězího trypsinogenu), ve kterém byla C-koncová aminokyselina lysin mutací změněna za jinou aminokyselinu (kromě argininu nebo lysinu) a který je N terminálně fúzován k funkčnímu signálnímu peptidů. V tomto způsobu jsou analogy trypsinu sekretována do média v rozpustné formě a díky vložené mutaci nejsou také aktivována a dále degradována nežádoucí autokatalýzou, dokonce při relativně vysokých hodnotách pH fermentačního procesu. Pro aktivaci je poté použita aminopeptidáza. Nevýhodou tohoto způsobu je však potřeba odstranit další aminopeptidázy, které mohou mít nevýhodné vedlejší aktivity pro následné použití trypsinu ve finálním procesu.
. 9 _
Exprese genů trypsinogenu, vyskytujících se přirozeně v přírodě, v Pichia pastoris je popsána ve WO 01/55 429. Za účelem vyhnutí se autokatalytické aktivaci je fermentace v příkladu prováděna v méně kyselé oblasti pH při cca 6. To je tedy mimo optimální pH oblast, která zabraňuje autokatalytické aktivaci během dlouhých časů v expresní fázi. Dalšími nevýhodami tohoto způsobu jsou geny pro trypsinogen, které nejsou kodónově optimalizovány pro expresi v Pichia pastoris a přispívají k nízkým výtěžkům exprese.
Vynález řeší problém poskytnutí způsobu rekombinantní produkce trypsinu, při němž jsou alespoň částečně eliminovány nevýhody dosavadního stavu techniky a který dovoluje, aby byl io získán aktivní trypsin jednoduchým způsobem s vysokým výtěžkem a aktivitou. Zejména by mělo být možné izolovat intermediámí trypsinogen v rozpustné formě z kultivačního média exprese hostitele, přičemž trypsinogen by během fermentace a purifikace neměl podléhat ve významné míře autokatalytické aktivaci. Dále by mělo být možné následně aktivovat trypsinogen autokatalyticky anebo přídavkem rekombinantní ho trypsinu.
Podstata vynálezu
Tento problém je vyřešen způsobem rekombinantní produkce trypsinu podle vynálezu, jehož podstatou je, že zahrnuje kroky:
a) transformace hostitelské buňky rekombinantní nukleovou kyselinou, která kóduje trypsinogen s rozpoznávacím místem pro enterokinázu v propeptidové sekvenci ve formě, která může být sekretována hostitelskou buňkou,
b) kultivace hostitelské buňky za kyselých podmínek umožňujících expresi rekombinantní nukleové kyseliny a sekreci produktu exprese do kultivačního média, přičemž podmínky jsou vybrány tak, že je zabráněno autokatalytickému štěpení propeptidové sekvence,
c) izolace produktu exprese z kultivačního média,
d) štěpení propeptidové sekvence za vytvoření aktivního trypsinu a popřípadě
e) oddělení neštěpených molekul trypsinogenu od aktivního trypsinu.
Hostitelské buňky použité ve způsobu podle vynálezu mohou být eukaryotické nebo prokaryotické hostitelské buňky, jako ty, které jsou známy z dosavadního stavu techniky. Hostitelské buňky jsou výhodně eukaryotické buňky, zejména výhodně buňky plísní a nej výhodněji kvasinkové buňky. Vhodné příklady kvasinkových buněk jsou Pichia pastoris, Hansenula polymorpha, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombae, přičemž methylotrofní kvasinky jako je Pichia pastoris nebo Hansenula polymorpha a zejména Pichia pastoris jsou použity přednostně.
Jc vhodné použít hostitelské buňky, které jsou schopné exnrimovat rekombinantní nukleovou kyselinu a sekretovat expresní produkt do kultivačního média za podmínek, za kterých je přinejmenším ve významné míře a výhodně v podstatě kvantitativně zabráněno autokatalytickému štěpení propeptidové sekvence. Takové podmínky výhodně zahrnují kyselou hodnotu pH kultivačního média, zejména výhodně hodnotu pH v rozmezí mezi 3 a 4. Trypsinogen je stabilní při kyselejších hodnotách pH a zejména při hodnotách pH do 4, zatímco trypsin je autokatalyticky aktivován v neutrálním nebo alkalickém médiu (Keil, B. (1971)).
Za vhodných podmínek prováděná kultivace podle vynálezu zabraňuje předčasné aktivací rekombinantního trypsinogenu sekretovaného hostitelskými buňkami, a to také může v podstatné míře zabránit další degradaci výsledného trypsinu až na inaktivní peptidy. Stabilita rekombinant-3 CZ 303658 B6 ního trypsinogenu za kultivačních podmínek je důležitá, protože exprese by měla být doprovázena sekrecí. Má se za to, že v tomto spojení je sekrece z hostitelské buňky přemístěním trypsinogenu zcytoplazmy pres buněčnou membránu do kultivačního média. Toto je většinou uskutečněno pomocí N-terminální fúze trypsinogenu s funkčním signálním peptidem. Příklady vhodných signálních peptidů jsou známé signální peptidy z kvasinek a zejména výhodný je signální peptid a faktoru ze Saccharomyces cerevisiae. Je však samozřejmě možné, použít jiné signální peptidy např. signální peptid, který přirozeně kontroluje sekreci trypsinogenu.
Za účelem vylepšit výtěžek exprese rekombinantního trypsinu je výhodné použít rekombinantní nukleovou kyselinu s optimalizovaným využitím kodonů pro příslušné hostitelské buňky. Podle toho je výhodné použít nukleovou kyselinu pro kvasinkové buňky, která má optimalizované využití kodonů pro kvasinky. Takové nukleové kyseliny, které mají optimalizované využití kodonů, mohou být například vytvořeny syntetizováním jednotlivých oligonukleotidů paralelně a jejich následným spojením.
Způsob podle vynálezu je v podstatě vhodný pro produkci jakýchkoliv typů rekombinantního trypsinu za předpokladu, že příslušný trypsinogen, který je sekreto ván jako expresní produkt hostitelskými buňkami, je za kultivačních podmínek v podstatě stabilní. Způsob je vhodně použit pro produkci trypsinu z obratlovců, zejména ze savců, takových, jako prasata, ovce nebo lidé. Zejmé20 na výhodně je produkován prasečí trypsin.
Navíc je přednostní, že je použita taková rekombinantní nukleová kyselina, která kóduje trypsínogen se zkrácenou propeptidovou sekvencí. Trypsinogenem je rozuměn protein, který, ačkoliv vytváří v podstatě správnou proteinovou strukturu, nemá žádnou nebo má velmi malou proteoly25 tickou aktivitu, v porovnání s aktivním trypsinem, která je výhodně alespoň 5-krát a zejména výhodně alespoň 10-krát nižší, než proteolytická aktivita aktivní formy. Přirozená délka propeptidové části, např. v případě prasečího trypsinogenu 25 aminokyselin, je výhodně zkrácena na propeptidovou sekvenci, která sestává pouze z rozpoznávací sekvence pro enteropeptidázu např, enterokinázu např. aminokyselinová sekvence Asp-Asp-Asp-Asl-Lys. Dle volby, může být k N-konci rozpoznávací sekvence enterokinázy připojeno několik dalších aminokyselin, nutných pro klonování, např. do 5 aminokyselin.
Bylo zjištěno, že exprese zkráceného rekombinantního trypsinogenu podle vynálezu, obsahujícího aminokyseliny Glu-Phe, připojené z důvodu klonování k N-konci rozpoznávacího místa enterokinázy, vede k značně vyšším výtěžkům, než je tomu v případě exprese přirozeného trypsinogenu, ve způsobu podle vynálezu. Z tohoto důvodu jev konkrétní přednostní formě způsobu podle vynálezu použita rekombinantní nukleová kyselina, jejíž nukleotidová sekvence je ukázaná v SEQ ID NO.22, která kóduje prasečí trypsinogen se zkrácenou propeptidovou sekvencí.
Ve způsobu podle vynálezu je exprese rekombinantního trypsinogenu výhodně kontrolována i nd ukováte lnou, expresi kontrolující sekvencí. Z tohoto důvodu může být nárůst hostitelských buněk proveden před indukcí exprese, za podmínek, které jsou výhodné nebo optimální pro růst hostitelských buněk. Proto například může růst probíhat pri pH 5 až 7, zejména při pH 5 až 6 až do předem stanovené optické hustoty, během níž je sekvence regulovatelná kontroly exprese potlačena. Exprese může být poté indukována změnou teploty anebo přídavkem induktoru. Příkladem přednostní sekvence kontrolované exprese je AOX 1 - promotor z Pichia pastoris, který může být indukován methanolem, který je zejména vhodný pro indukovatelnou expresi v methy lotrofních kvasinkách. Kultivační podmínky jsou výhodně změněny před indukcí sekvence kontrolované exprese takovým způsobem, který například změní pH na oblast 3 až 4, kde se
5o trypsinogen vytvořený expresí rekombinantní nukleové kyseliny akumuluje v intaktní formě v kultivačním médiu.
Kultivační podmínky ve způsobu podle vynálezu jsou vybrány tak, že je do značné míry zabráněno autokatalytickému štěpení propeptidové sekvence. Po izolaci produktu exprese z kultivačního média může být propeptidová sekvence odštěpena za kontrolovaných podmínek. Toto štěpení
-4 CZ 303658 B6 může být například provedeno přídavkem rekombinantního trypsinu anebo autokatalytickým štěpením. V tomto spojení je autokatalytickým štěpením rozuměna aktivace rekombinantního trypsinogenu sebou samým, která může být dle volby urychlena přídavkem malých množství rekombinantního trypsinu ale bez přídavku cizího proteinu. V tomto způsobu není nutné použít s další cizí protein, který je obvykle odvozen ze surového materiálu z živočišných zdrojů a musí být následně znovu odstraněn, což může způsobit nežádoucí štěpení v následné aplikaci. K autokatalytické aktivaci výhodně dochází pri pH v rozmezí 7 až 8. Toto zajišťuje, že trypsinogen, vytvořený během exprese, může být prvně vysoce purifikován v silně kyselé oblasti a aktivace může být specificky spuštěna pufrováním, výhodně v přítomnosti malých množství např. 20 mM io CaCl2 do neutrální až slabě bazické oblasti pH. Aktivace může být zastavena změnou pH, znovu do silně kyselé oblasti. Trypsin může být například purifikován ionexovou chromatografií na takovém ionexu, jako SP -Sepharosa^XL nebo benzamidin-Sepharosa.
Za účelem purifikovat produkt exprese z kultivačního média může být kultivační supematant 15 prvně oddělen od buněk, jak je popsáno v příkladu 6.1. Následná purifikace zahrnující autokatalytickou aktivaci trypsinogenu je výhodně provedena vhodnými chromatografickým i purifikačními postupy. V zejména přednostní formě je provedena chromatografíe, jak je popsáno v přikladu
6.2, bez předcházející separace buněk, kde ke kultivačnímu médiu, stále obsahujícímu buňky, je přidán pufr, obsahující vápenaté ionty, o finální koncentraci vápníku 1 až 30 mM. Následně jsou provedeny kroky (c), (d) a dle volby (e) způsobu podle vynálezu například, využívající vhodné chromatografické purifikační postupy a krok pufrování, pro autokatalytické štěpení produktu exprese.
Zejména přednostní forma způsobu podle vynálezu je tedy charakterizována:
a) Transformováním hostitelské buňky rekombinantní nukleovou kyselinou, která kóduje zymogenní prekurzorový trypsinogen z prasete, který je fúzován se signální peptidovou sekvencí a obsahuje propeptid, který je zkrácen na rozpoznávací místo enterokinázy, kde toto štěpné místo je štěpeno rekombinantním trypsinem neboje štěpeno autokatalyticky za určitých pufrovacích podmínek a zkrácený trypsinogen může být v tomto postupu štěpen za vytvoření aktivního trypsinu,
b) Kultivováním hostitelské buňky během fáze exprese při kyselém pH, výhodně pH 3 až 4 tak, že zkrácený trypsinogen je přítomen v rozpustné formě a je sekretován do kultivačního média ale autokatalytické aktivaci je do značné míry zabráněno,
c) Izolací zkráceného rekombinantního trypsinogenu z kultivačního supematantu a jeho aktivací za podmínek, které dovolují účinné štěpení zkráceného trypsinogenu rekombinantním trypsinem nebo autokatalytickým štěpením a
d) Dle volby oddělením neštěpených molekul trypsinogenu od aktivního trypsinu.
Zkrácení propeptidu popsané v tomto vynálezu má pozitivní účinek zejména na expresi a autokatalytickou aktivaci. Kromě toho, po autokatalytické aktivaci se nežádoucí, další autolýza zvyšuje značně při pH > 4,0 během růstové fáze a expresní fáze kultury.
Další zvýšení ve výtěžku exprese ve způsobu podle vynálezu může být dosaženo transformováním hostitelské buňky několika vektory, kde každý z nich obsahuje rekombinantní nukleovou kyselinu, jak je uvedeno výše, kde vektory obsahují různé selekční markéry, např. Zeocin a G418. Kultivace za násobných selekčních podmínek překvapivě dovoluje, aby se dále podstatně zvýšil výtěžek exprese rekombinantního trypsinogenu.
Dalším předmětem vynálezu je rekombinantní nukleová kyselina, která kóduje trypsinogen, který má rozpoznávací místo pro enterokinázu v propeptidové sekvenci, kde propeptidová sekvence je vzhledem k přirozené propeptidové sekvenci zkrácena a je výhodně fúzována se signální peptido- 5 CZ 303658 B6 vou sekvencí. Zkrácená propeptidová sekvence podle vynálezu výhodně sestává z rozpoznávacího místa pro enterokinázu, které má aminokyselinovou sekvenci Asp-Asp-Asp-Asp-Lys a dle volby má až 5 dalších aminokyselin, umístěných na jeho N-konci. Nukleová kyselina podle vynálezu má zejména výhodně nukleotidovou sekvenci, ukázanou v SEQ ID NO.22.
Nukleová kyselina podle vynálezu je výhodně v operačním spojení s regulovatelnou sekvencí kontrolované exprese, což je například vhodná sekvence kontrolované exprese pro expresi genu v kvasinkových buňkách, taková jako AOX1 promotor z Pichia pastoris.
io Vynález se také týká rekombinantního vektoru, který obsahuje alespoň jednu kopii rekombinantní nukleové kyseliny, jak je uvedeno výše. Vektor je výhodně takový vektor, který je vhodný pro expresi genu v kvasinkových buňkách. Příklady takových vektorů jsou popsány v Sambrook et al., Molecular cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.
Kromě rekombinantní nukleové kyseliny obsahuje vektor další vhodné genetické prvky pro případné zamýšlené použití a zejména gen pro selekční markér. Zejména výhodně použité jsou vektory, které mohou být v buňce přítomny v násobných kopiích, zejména vektory, které mohou být integrovány v mnohonásobné formě do genomu hostitelské buňky. Vynález se také týká kombinací vektorů, kde každý z nich obsahuje gen pro různý selekční markér a které mohou být současně propagovány v hostitelské buňce.
Kromě toho, se vynález týká rekombinantní buňky, která je transformována nukleovou kyselinou podle vynálezu nebo vektorem podle vynálezu. Rekombinantní buňka je výhodně kvasinková buňka, zejména methylotrofní kvasinková buňka, taková, jako Pichia pastoris nebo Hansenula polymorpha.
Nakonec se vynález týká rekombinantního trypsinogenu, který je kódován nukleovou kyselinou podle vynálezu. Rekombinantní trypsinogen má propeptidovou sekvenci, která je ve srovnání s přirozenou propeptidovou sekvencí zkrácena a obsahuje rozpoznávací místo pro enterokinázu. Rekombinantní trypsinogen podle vynálezu má výhodně aminokyselinovou sekvenci, ukázanou v SEQ ID NO. 23.
Přehled obrázků na výkresech
Předkládaný vynález je také objasněn následujícími obrázky.
Obrázek 1: ukazuje plazmidovou mapu expresního plazmidu pTRYP-9, obsahujícího kom40 pletní rekombinantní trypsinogen,
Obrázek 2: ukazuje plazmidovou mapu expresního plazmidu pTRYP-11, obsahujícího zkrácený rekombinantní trypsinogen (sh-trypsinogen) a gen markéru pro rezistenci k Zeocinu (ZeoR),
Obrázek 3: ukazuje plazmidovou mapu expresního plazmidu pTRYP-13, obsahujícího zkrácený rekombinantní trypsinogen (sh-trypsinogen) a gen markéru (KanR) pro rezistenci ke kanamycinu / G418.
-6CZ 303658 B6
Příklady provedení vynálezu
Způsoby:
Techniky rekombinantní DNA
Pro manipulaci s DNA byly použity standardní způsoby, jak je popsáno v Sambrook, J. et al. (1989) v Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold io Spring Harbor, New York. Molekulámě-biologické reagencie byly použity podle návodů výrobce.
Stanovení proteinu
Stanovení proteinu purifikovaného trypsinu bylo provedeno měřením absorbance pri 280 nm.
Hodnota 13,6 byla použita pro A 1 % / 280 nm pro 1 cm silnou kyvetu.
Výpočet:
Protein [mg/ml] = (10 [mg/ml]* AAvzorek * ředění) /13,6
Pichia pastoris a expresní vektory pro Pichia pastoris
Pro zacházení s Pichia pastoris a expresními vektory byly jako instrukce použity katalogy 25 a instrukční manuály od Invitrogenu. Vektory pro expresy zkráceného rekombinantního trypsinogenu jsou založeny na vektorech pPICZaA a pPIC9K od Invitrogenu.
Příklad 1
Syntéza genu kompletního rekombinantního trypsinogenu s využitím optimalizovaných kodonů pro expresi v kvasinkách
Jedním z přednostních způsobů pro provedení způsobu podle vynálezu je syntetizovat kodonově 35 optimalizovanou sekvenci genu. Za účelem optimalizovat každý kodón pro expresi v kvasinkách, bylo nezbytné provést kompletní de novo syntézu genu o cca 700 pb, který kóduje kompletní rekombinantní trypsinogen. Bylo-li to nutné, bylo možné optimalizovat každý kodón využitím degenerativního kódu v opětovné translaci sekvence aminokyseliny prasečího trypsinogenu podle
SEQ ID NO. 1. Pro tento účel byl gen rozdělen do 18 oligonukleotidů, které byly dlouhé 54 až 40 90 nukleotidů. Oligonukleotidy byly navrženy tak, že střídavá sekvence fragmentů kódujícího řetězce a komplementárního vlákna, jejichž 5' a 3' konce se navzájem komplementárně překrývají se sousedními oligonukleotidy. Překrývající se oblast byla vybrána v každém případě takovým způsobem, aby se do značné míry zabránilo nespecifické vazbě během reakce rozpoznávání v následné PCR reakci. Oligonukleotidy na 5' a 3' konci genu byly poskytnuty proti směru a po sméru kódující oblasti s rozpoznávacími místy pro restrikční endonukieázy, které by mohly být použity pro pozdější inzerci syntetického genu podle SEQ ID NO.2 do expresních vektorů. Takto bylo tedy proti směru vloženo rozpoznávací místo pro restrikční endonukleázu EcoRI a po směru bylo vloženo rozpoznávací místo pro restrikční endonukleázu Xbal. Sekvence oligonukleotidů jsou ukázány v SEQ ID NO.3 až 20.
Syntéza genu byla provedena pomocí PCR reakce. Kódující oblast byla proto prvně rozdělena do tří segmentů (oligonukleotidy 3 až 8, 9 až 14, 15 až 20) a tyto segmenty byly vytvořeny v oddělených PCR reakcích, použitím překrývajících se komplementárních oligonukleotidů. V tomto postupu byl fragment genu v každém kroku prodloužen až do té doby, kdy byl vytvořen produkt
- 7 CZ 303658 B6 celkové délky, který byl amplifikován v následujících cyklech. Teplota připojení byla vybrána podle překrývající se oblasti s nejnižŠí teplotou tání.
Tyto tři segmenty byly následně analyzovány pomocí elektroforézy v agarosovém gelu, produk5 ty, které měly očekávanou délku byly izolovány z gelu použitím QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen) a byly syntetizovány za vytvoření kompletního genového produktu v další PCR reakci. Prvních 5 cyklů byly PCR reakce provedeny bez přídavku primerů na 5' konci a 3' konci celého genu, takže ze začátku bylo z těchto tří segmentů tvořeno několik fragmentů genového produktu o očekávané délce. Teplota připojení byla vybrána podle překrývající se oblasti s nejnižŠí teploto tou tání. Poté byly přidány koncové primery a teplota připojení byla zvýšena podle teploty připojení příměru s nejnižŠí teplotou tání. Fragment genu očekávané délky byl amplifikován v dalších cyklech. PCR fragment byl zkontrolován sekvenováním.
Příklad 2
Příprava zkráceného trypsinogenového genu
Kodóny prvních 20 aminokyselin přirozeně se vyskytujícího trypsinogenu byly odstraněny pomocí speciálně navrženého 5' primerů podle SEQ ID NO. 21 tak, aby jako N-koncová propeptidová sekvence zkráceného rekombinantního trypsinogenu zůstaly pouze kodóny rozpoznávací sekvence enteropeptidázy enterokinázy Asp-Asp-Asp-Asp-Lys a kodóny Glu-Phe, nutné pro klonování do expresních vektorů pro Pichia pastoris, kvůli rozpoznávacímu místu restrikční endonukleázy EcoRI. Delece byla vnesena pomocí PCR reakce PCR fragmentu genu, kódujícího kompletní rekombinantní trypsinogen, použitím 5' primerů podle SEQ ID NO.21 a 3' příměru podle SEQ ID NO.20. DNA sekvence zkráceného rekombinantního trypsinogenu je ukázána v SEQ ID NO. 22 a aminokyselinová sekvence zkráceného rekombinantního trypsinogenu je ukázána v SEQ ID NO. 23.
Příklad 3
Klonování PCR fragmentů kompletního rekombinantního trypsinogenu, vytvořeného syntézou genu a klonování zkráceného rekombinantního trypsinogenu do expresních vektorů pro Pichia pastoris
PCR fragmenty byly znovu štěpeny EcoRI a Xbal (Roche Diagnostics GmbEI), znovu izolovány (QIAquick Gel Extraction Kit/Qiagen) a následně byly ligovány do fragmentu expresního vektoru pPICZaA (Invitrogen), linearizovaného EcoRI a Xbal (Roche Diagnostics GmbH) a izolovaného QIAquick Gel Extraction Kit/Qiagen. Poté bylo pipetováno 1 μΙ (20 ng) fragmentu vektoru a 3 μΐ (100 ng) PCR fragmentu, 1 μΐ 10 x ligázového pufru (Sambrook et al., 1989 B.27), 1 μΐ T4 DNA ligasy, 4 μΐ sterilní H2OredestiOVané, směs byla opatrně promíchána a byla inkubována přes noc při 16 °C. V tomto vektoru je syntetický gen pod kontrolou AOX 1 promotoru (promotor pro alkoholoxidázu l z Pichia pastoris), který může být indukován methanolem (Mallin45 ckrodt Baker B.V.) a je umístěn ve správném čtecím rámci za signálním peptidem a faktoru z Saccharomyces cerevisiae. Za účelem kontroly a izolace plazmidu, bylo 5 μΐ ligační směsi poté transformováno do 200 μΐ kompetentních buněk (Hanahan (1983) E. coli XLlBiue (Stratagene). Po 30 min inkubaci na ledu následoval teplotní šok (90 sek při 42 °C). Následně byly buňky přeneseny do 1 ml LB média a byly inkubovány 1 hodinu při 37 °C v LB médiu pro fenotypickou expresi. Alikvoty této transformace byly naneseny na misky s LB médiem, za použití 100 μg/ml
Zeocinu, jako selekčního markéru a byly inkubovány 15 hodin při 37 °C. Z narostlých kolonií byly izolovány plazmidy (Sambrook, J. et al. (1989) In. Molecular cloning: A Laboratory
Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York) a byla ověřena bezchybnost sekvence bází pomocí restrikční analýzy a sekvenování. Expresní vektory vytvořené
-8CZ 303658 B6 tímto způsobem, které obsahují syntetický gen pro kompletní rekombinantní trypsinogen nebo pro zkrácený rekombinantní trypsinogen, byly pojmenovány pTRYP-9 (viz obr. 1) a pTRYP-11 (viz obr. 2).
Transformace pTRYP-9 a pTRYP-11 do Pichia pastorís
Pro transformaci pTRYP-9 a pTRYP-11 do Pichia pastorís X-33, GS115 nebo KM71H s následnou integrací do genomu, byl vektor prvně linearizován Sací (Roche Diagnostics GmbH). Transformace byla provedena elektroporací, použitím Gene Pulser 11 (Biorad). Pro toto bylo io kolonií Pichia pastorís inokulováno 5 ml YPD média (Invitrogen) a bylo inkubováno přes noc při °C za třepání. Pomocí této kultury narostlé přes noc bylo následně znovu inokulováno 200 ml čerstvého YPD média (Invitrogen) 1:2000 a bylo inkubováno za třepání přes noc při 30 °C, dokud nebylo dosaženo OD60o 1,3 až 1,5. Buňky byly poté odstředěny (1500 x g / 5 minut) a peleta byla resuspendována v 200 ml ledově studené, sterilní vodě (0 °C). Buňky byly znovu odstředěny (1500 x g / 5 minut) a byly resuspendovány ve 100 ml ledově studené, sterilní vody (0 °C). Buňky byly znovu odstředěny a resuspendovány v 10 ml ledově studeného (0 °C) 1 M sorbitolu (ICN). Buňky byly znovu odstředěny a resuspendovány v 0,5 ml ledově studeného (0 °C) 1 M sorbitolu (ICN). Takto izolované buňky byly uchovávány na ledu a ihned použity pro transformaci.
pl buněk bylo smícháno s cca 1 pg linearizované pTRYP-9 nebo pTRYP-11 vektorové DNA a celá směs byla přenesena do ledově studené (0 °C) elektroporační kyvety a byla inkubována na ledu po dalších 5 minut. Následně byla kyveta umístěna do Gene Pusler II (Biorad) a transformace byla prováděna při 1 kV, 1 kQ a 25 pF. Po elektroporací byla směs smíchána s 1 ml l M sorbitolu (ICN) a následně bylo 100 až 150 pl rozetřeno na misku s YPDS agarem (Invitrogen), obsahujícím 100 pg/ml Zeocinu (Invitrogen). Misky byly následně inkubovány 2 až 4 dny při 30 °C.
Klony byly znovu inokulovány na miskách s rastrem MD (= minimální dextrosa) a dále analyzo30 vány. Narostlé klony byly odebrány, resuspendovány ve 20 pl sterilní vody, lyžovány (1 hodinu, 30 °C, 10 min, -80 °C) 17,5 U lytikázy (Roche Diagnostics GmbH) a pomocí PCR byly přímo analyzovány, zda obsahují správně integrovanou trypsinogenovou expresní kazetu.
Klony, u kterých došlo během transformace k integraci kompletní expresní kazety do genomu, byly použity pro expresní experimenty.
Exprese kompletního a zkráceného rekombinantního trypsinogenu
Pozitivní klony byly inokulovány ve 3 ml BMGY média (Invitrogen) a inkubovány přes noc při
30 °C za třepání. Následně bylo stanoveno OD při 600 nm a tyto klony byly znovu inokulovány v 10 ml BMMY média (Invitrogen) pH 3,0 tak, aby výsledné OD600 bylo 1. BMMY médium (Invitrogen) pH 3,0 obsahuje methanol (Mallinckrodt Baker B.V.), který indukuje expresi kompletního nebo zkráceného rekombinantního trypsinogenu, prostřednictvím AOX1 promotoru.
Kultivační nádoby byly za třepání inkubovány při 30 CC, Každých 24 hodin byly odebírány vzorky, bylo stanoveno OD6oo, pro kontrolu exprese, pomocí SDS elektroforézy v polyakrylamidovém gelu, byl odebrán alikvot kompletního a zkráceného rekombinantního trypsinogenu a každý byl doplněn 0,5% methanolem (Mallinckrodt Baker B.V.) pro další indukci. Expresní experimenty byly prováděny po 72 hodin.
-9CZ 303658 B6
Analýza exprese kompletního a zkráceného rekombinantního trypsinogenu pomocí SDS elektroforézy v gelu
Z každé exprimující kultury bylo odebráno 500 μΙ, bylo stanoveno OD60o a buňky byly odstředěny. Kultivační supematant byl uložen a buněčná peleta byla kvůli lyži resuspendována v příslušném množství Y-PER™ (50 až 300 μΙ/Pierce) pro OD600 a byla třepána po 1 hodinu při laboratorní teplotě. Následně byl lyzát odstředěn, aby se oddělily buněčné zbytky (15000 x g / 5 minut) a supematant byl přenesen do čistých reakčních nádobek. 10 μΐ lyzátu a 10 μΐ kultivační ního supematantu bylo naneseno na SDS polyakrylamidový gel a proteiny byly aplikováním elektrického pole rozděleny podle velikosti.
Překvapivě bylo možné identifikovat slabé zóny v kultivačních supematantech klonů, obsahujících kompletní rekombinantní trypsinogen, stejně jako u klonů, obsahující zkrácený rekombi15 nantní trypsinogen, který se nevyskytoval v kontrolních klonech. Kontrolními klony se rozumí X33 buňky Pichia pastoris, které byly transformovány výchozím vektorem pPICZaA a které rostly a byly indukovány podobně, jako klony exprimující trypsinogen. Migrační vlastnosti nových proteinových zón v exprimujících klonech odpovídají vypočítané molekulové hmotnosti aje mírně vyšší než je molekulová hmotnost hovězího trypsinu, který byl nanesen jako kontrolní markér. Tato mírná odlišnost ve velikosti naznačuje na neaktivovaný trypsinogen.
Překvapivě, rekombinantní zkrácený trypsinogen byl exprimován významně silněji než rekombinantní kompletní trypsinogen.
Příklad 4
Zvýšení výtěžku exprese násobnou transformací
Nejlepší klony z expresních experimentů s rekombinantním zkráceným trypsinogenem byly znovu připraveny pro elektroporaci, jakje popsáno výše, a byly znovu transformovány 1 pg linearizované pTRYP-11 vektorové DNA a transformační směs byla nanesena na misky s YPDS agarem (Invitrogen), obsahující 1000 až 2000 pg/ml Zeocinu (Invitrogen). Toto zvyšuje selekční tlak takovým způsobem, že rostou pouze ty klony, které mají ve svém genomu integrováno něko35 lik kopií expresního vektoru pTRYP-11 a tím také několik kopií příslušného genu pro rezistenci (v tomto případě pro Zeocin®). Protein zodpovědný za rezistenci k Zeocinu® je produkt bleomycinového genu ze Streptoalloteichus hindustanus (Calmels, T. et al., (1991); Drocourt, D. et al., (1990)), který váže Zeocin® ve stechiometrickém koncentračním poměru a tím tvoří buňku rezistentní k Zeocinu®. Čím vyšší je koncentrace Zeocinu® na miskách s YPDS agarem, tím vyšší množství proteinu, zajišťujícího rezistenci, musí být buňkou vytvořeno, aby umožnilo kvantitativně vázat Zeocin® a tím i růst. Toto je mezí jiným možné tehdy, když jsou v genomu integrovány násobné kopie genu pro rezistenci. Klony byly znovu inokulovány na MD miskách s rastrem, jakje popsáno výše.
Následně byly tyto klony ověřeny, zda exprimují a sekretují trypsinogen, jak je popsáno výše.
Překvapivě, bylo po tomto měření možné identifikovat klony, které měly značně zvýšený výtěžek exprese zkráceného rekombinantního trypsinogenu, sekretovaného do kultivačního supematantu po elektroforéze v SDS polyakrylamidovém gelu.
- 10CZ 303658 B6
Příklad 5
Zvýšení výtěžku exprese použitím druhého selekčního tlaku
Zvýšení koncentrace Zeocinu® nad 2000 pg/ml nevedlo k zlepšení výtěžku exprese zkráceného rekombinantního trypsinogenu. Za účelem dále zvýšit počet kopií genu v expresních klonech genu podle SEQ ID NO. 22, který kóduje rekombinantní zkrácený trypsinogen a je kodonově optimalizován pro expresi v kvasinkách, byly integrovány další expresní vektory do genomu io expresních klonů, připravených v příkladech 3 a 4, které mají nejvyšší výtěžek exprese prostřednictvím druhého selekčního tlaku, výhodně G418 (Roche Díagnostics GmbH).
Pro tento účel je expresní kazeta z pTRYP-l 1, obsahující část AOX1 promotoru, gen pro signální peptid a faktoru Saccharomyces cerevisiae, kodonově optimalizovaný gen pro rekombinantní zkrácený trypsinogen podle SEQ ID NO.22, vyštěpena restrikčními endonukleázami Sací a Xbal z pTRYP-l 1, restrikční směs je rozdělena na 1% agarózovém gelu a z gelu je izolován fragment o 1693 pb (QIAquick Gel Extraction Kit/Qiagen). Současně byl pomocí Sací a Notl štěpen vektor pPIC9K (Invitrogen), restrikční směs byla rozdělena na 1 % agarózovém gelu a z gelu byl izolován fragment vektoru o 8956 pb (QIAquick Gel Extraction Kit/Qiagen), Xbal přečnívající fragment z pTRYP-l 1 a Notl přečnívající fragment z pPlC9K byly doplněny pomocí Klenowovy polymerázy (Roche Díagnostics GmbH), za vytvoření tupých konců, podle návodu výrobce.
Následně, dva fragmenty získané tímto způsobem, byly ligovány, jak je popsáno výše. Ligační směsí byla transformována E. coli XL1 Blue (Stratagene), jak je popsáno výše (klony obsahující plazmid byly selektovány na miskách s 100 pg/ml ampicilinu na miskách s živným médiem) a tyto klony byly pomocí restrikčních analýz a sekvenovány ověřeny. Expresní vektor, vytvořený tímto způsobem, byl pojmenován pTRYP-13 (viz obr. 3).
Integrace expresního vektoru pTRYP-13 do genomu Pichie pastoris byla selektována proso střednictvím G418 (Roche Díagnostics GmbH).
Klony, které měly nejvyšší výtěžek exprese trypsinogenu z násobné transformace s pTRYP-l l (Zeocínová rezistence) byly připraveny pro elektroporací, jak je popsáno výše a transformovány 1 pg fragmentu vektoru pTRYP-13 (G418 rezistence), linearizovaným Sáli (Roche Díagnostics
GmbH). Transformační směs byla následně uložena na 1 až 3 dny při 4 °C v 1 M sorbitolu (1CN) (pro vytvoření G418 rezistence), poté bylo 100 až 200 μΐ naneseno na misky s YPD (Invitrogen), obsahující l, 2 a 4 mg/ml G418 (Roche Díagnostics GmbH) a inkubovány 3 až 5 dnů při 30 °C. Výsledné klony, výhodně z misek s YPD s nejvyšší koncentrací G418, byly znovu testovány na zvýšení exprese zkráceného rekombinantního trypsinogenu, použitím SDS eletroforézy v poly40 akrylamidovém gelu, jak je popsáno výše.
Po tomto postupu bylo překvapivě možno znovu identifikovat klony, které vykazují zvýšený výtěžek exprese zkráceného rekombinantního trypsinogenu v kultivačním supematantu po SDS elektroforéze v polyakrylamidovém gelu.
Příklad 6
Izolace trypsinogenu z kultivačního supematantu a aktivace
6.1
Kultivační supematant byl od buněk oddělen pomocí mikrofiltrace, centrifugace nebo filtrace.
Trypsinogen byl purifikován pomocí chromatografie na fenyl Sepharose fast flow (Pharmacia).
Chromatografie byla provedena v oblasti pH 2 až 4. Autokatalytická aktivace byla spuštěna pufrováním pH na 7 až 8 v přítomnosti 20 mM CaCL. Tato autokatalytická aktivace může být zastavena opětovnou změnou pH zpět do oblasti 2 až 4. Aktivní trypsin byl purifikován chromatografií na benzamidinové Sepharose (např. SP-Sepharose®XL, fí) (Pharmacia/package insert) nebo na ionexu. Trypsin je skladován při pH 1,5 až 3, aby se zabránilo autolýzi. Specifická akti5 vita purifi kovaného trypsinu je 180 až 200 U/mg proteinu.
6.2
Celé fermentační médium je nareděno v poměru přibližně 1:2 až 1:4 pufrem octanu amonného io (5až20mM) obsahujícího 5 až 30 mM chloridu vápenatého, pH 3,5 a purifikovaného prostřednictvím chromatografie na expandovaném loži (expanded bed chromatography; McComick (1993); EP 0 699 687) použitím kationtového iontoměniče (např. Streamline@SP, XL). V tomto případě byla chromatografie provedena za přítomnosti buněk. Buňky jsou současně rozděleny pomocí chromatografie. Následuje postup, který je popsán v příkladu 6,1 (pufrování/aktivace t5 atd.).
Příklad 7
Stanovení aktivity
Aktivita trypsinu byla stanovena použitím Chromozym TRY (Pentapharm Ltd) ve 100 mM Tris pH 8,0, 20 mM CaCl2 při 25 °C. Fotometrické měření je provedeno při 405 nm.
Zkratky:
YPD:
YPDS:
BMGY:
BMMY: SDS:
kvasničný dextrózový pepton kvasničný dextrózový sorbitolový pepton pufrované glycerolové komplexní médium pufrované methanolové komplexní médium dodecylsulfát sodný
Seznam literárních citací:
Bricteuz-Gregoire, Schyns R., Florkin M (1966) Biochim. Biophys. Acta 127: pp 277
Calmels T., Parriche M., DurandH., Tiraby G. (1991), Curr. Genet. 20: pp 309
Charles M., Rovery M., Guidoni A., Desnuelle P. (1963) Biochim. Biophys. Acta 69: pp 115 až 40 129
Desnuelle P. (1959)
Enzymes 2nd Edition vol 4 Editor Boyer, Acad. Press NY. pp. 119
Drocourt, D., Calmels T., Reynes J. P., Baron M., Tiraby G. (1990), Nucleic Acid Research 18: pp 4009
Graf L., Craík C. S., Patthy A., Roczniak S., Fletterick RJ., Rutter WJ. (1987) Bioehem. 26: pp. 2616
Graf L., Jancso A., Szilagyi L., Hegyi G., Pinter K., Naray-Szabo G., Hepp J., Mehzihradszky
K., Rutter W. J. (1988) Proč. Nati. Acad. Sci USA 85, pp 4961
- 12 CZ 303658 B6
Hanahan(1983)
J. MoL Biol., 166: pp557
Higaki J. N., Evnin L. B., Craik C. S. (1989) Biochem. 28; pp 9256
Hedstrom L., Szilagyi L., Rutter W. J. (1992) Science 255: pp 1249
Jurasek L., Fackre D. Smillie L. B. (1969) Biochem. Biophys. Res. Commun 37: pp. 99 io Keil B. (1971)
The Enzyme Vol II, 3rd Edition, Editor Boyer, Acad. Press N. Y. pp 249 až 275
Light A., Savithari H. S„ Liepnieks J. J. (1980) Analytical Biochemístry 106: pp 199 až 206
McCornick D. K., Bio/Technol. 11 (1993), 1059: Expanded Bed Absorption, Principles and Methods, Amersham Pharmacia Biotech, Edition AB, ISBN 91—630—5519—8;
Morihara K. and Tszzuki J. (1969) Arch Biochem Biophys 126: pp 971
Northrop J. H., Kunitz M., Herriott R. (1948)
Crystallíne Enzymes, 2nd Edition, Columbia Univ. Press NY RyanC.A. (1965)
Arch Biochem Biophys 110: pp 169
Sambrook, J., Fritsch E. F., Maniatis T. (1989)
In. Motecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press,
Cold Spring Harbor, New York
Travis J. (1968)
Biochem Biophys Res Commun. 30: pp 730
Travis J. and Roberts R. C. (1969) Biochemístry 8: pp 2884
Trop M. and Birk Y. (1968) Biochem. J. 109: pp 475
Wahlby S. and Engstrom L. (1968) Biochim. Biophys. Acta 151: pp 402
Vasquez, J. R., Evnin L. B„ Higaki J. N. Craik C. S. (1989) J. Cell. Biochem. 39: pp. 265
Wahlby S.( 1968)
Biochim. Biophys. Acta 151: pp 394
Willett, W. S., Gillmor S. A., Perona J. J., Fletterick R. J.. Craik C S (1995) Biochem. 34: pp 2172
Yee, L. and Blanch, H. W. (1993) Biotechnol. Bioeng. 41: pp. 781 až 790
WO 97/00 316 (NOVO NORDISK AS/Wóldike Helle, Kjeldsen Thomas) A PROCESS FOR PRODUCING TRYPSIN
WO 99/10 503 (ROCHE DIAGNOSTICS/Kopetzki Ehrhard, Hopfher Karl-Peter, Bode Wolfram, Huber Robert)
- 15 CZ 303658 B6
ZYMOGENIC PROTEÁZE PREKURZOR THAT CAN BE AUTOKATALYTICALL ACTIVATED AND THEIR USE.
WO 00/17 332 (ELI LILLY AND COMPANY/Hanquier Jose Michael, Hershberger Charles Lee, ? Desplancq Dominique, Larson Jeffrey) PRODUCTION OF SOLUBLE RECOMBINANT
TRYPSINOGEN ANALOGS
WO 01/55 429 (POLYMUN SCIENTIFIC IMMUNBIOLOGISCHE FORSCHUNG GMBH/Mattanovich Diethard, Katinger Hermann, Hohenblum Hubertus, Naschberger Stefan, io Weik Robert) METHOD FOR THE MANUFACTURE RECOMBINANT TRYPSIN
EP 0 597 691 (ELI LILLY AND COMPANY/Greaney Michael Gerard, Roštech Paul Robert) EXPRESSION VECTORS FOR THE BOVÍNE TRYPSIN AND TRYPSINOGEN AND HOST CELLS TRANSFORMED THEREWITH
EP 0 699 687 (MITSUBISHI PHARMA CORPORATION/Noda Munehiro, Sumi Akinori, Ohm ura Takao, Yokoyama Kazmasa)
PROCESS FOR PURIFYING RECOMBINANT HUMAN SÉRUM ALBUMIN
Claims (12)
1. Způsob rekombinantní produkce trypsinu, vyznačující se tím, že zahrnuje kroky:
a) transformace hostitelské buňky rekombinantní nukleovou kyselinou, která kóduje trypsinogen s rozpoznávacím místem pro enterokinázu v propeptidové sekvenci ve formě, která může být
30 sekretována hostitelskou buňkou,
b) kultivace hostitelské buňky za kyselých podmínek umožňujících expresi rekombinantní nukleové kyseliny a sekreci produktu exprese do kultivačního média, přičemž podmínky jsou vybrány tak, zeje zabráněno autokatalytickému štěpení propeptidové sekvence,
c) izolace produktu exprese z kultivačního média,
d) štěpení propeptidové sekvence za vytvoření aktivního trypsinu
40 a popřípadě
e) oddělení neštěpených molekul trypsinogenu od aktivního trypsinu.
2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se jako hostitelské buňky použijí
45 kvasinkové buňky.
3. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že se jako hostitelské buňky použije buňka Pichia pastoris nebo Hansenula polymorpha.
50
4. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že se použije rekombinantní nukleová kyselina, která kóduje trypsinogen fúzovaný k signálnímu peptidu, který zprostředkovává sekreci.
- 14 CZ 303658 B6
5. Způsob podle kteréhokoliv z nároků laž4, vyznačující se tím, že se použijí rekombinantní nukleové kyseliny s optimalizovaným využitím kodónů pro příslušnou hostitelskou buňku podle nároku 1.
5
6. Způsob podle kteréhokoliv z nároků laž5, vyznačující se tím, žcse použije rekombinantní nukleová kyselina, která kóduje trypsinogen s propeptidovou sekvencí zkrácenou tak, že sestává z rozpoznávací sekvence pro enteropeptidázu, popřípadě s až 5 aminokyselinami připojenými k N-konci rozpoznávací sekvence pro enteropeptidázu.
io
7. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6, vyznačující se t í m , že se použije rekombinantní nukleová kyselina, která kóduje prasečí trypsinogen.
8. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7, vyznačující se tím, že se použije rekombinantní nukleová kyselina, která má nukleotidovou sekvenci SEQ ID NO. 22.
9. Způsob podle kteréhokoliv z nároků laž8, vyznačující se tím, že se exprese rekombinantní nukleové kyseliny provádí při pH 3 až 4.
10. Způsob podle nároku 9, vyznačující se tím, že před expresí rekombinantní
20 nukleové kyseliny se hostitelská buňka kultivuje za podmínek, kteréjsou optimální pro její růst.
11. Způsob podle nároku 10, vyznačující se tím, že před expresí rekombinantní nukleové kyseliny se hostitelská buňka kultivuje pří pH 5 až 7 až do předem stanovené optické denzity a poté se indukuje exprese rekombinantní nukleové kyseliny.
12. Způsob podle kteréhokoliv z nároků lažll, vyznačující se tím, že odštěpování propeptidové sekvence se provádí přídavkem rekombínantního trypsinu a/nebo autokatalytickým štěpením.
30 13. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 12, vyznačující se tím, že kultivační médium obsahující hostitelské buňky se smíchá s pufrem obsahujícím vápenaté ionty a následně se provedou kroky c), d) a popřípadě e).
12 stránek sekvencí
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP01102342 | 2001-02-01 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CZ20032337A3 CZ20032337A3 (cs) | 2004-04-14 |
CZ303658B6 true CZ303658B6 (cs) | 2013-02-06 |
Family
ID=8176376
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CZ20032337A CZ303658B6 (cs) | 2001-02-01 | 2002-02-01 | Zpusob rekombinantní produkce trypsinu |
Country Status (10)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US7276605B2 (cs) |
EP (1) | EP1399568B1 (cs) |
JP (1) | JP4159878B2 (cs) |
CN (1) | CN1545553B (cs) |
AT (1) | ATE310092T1 (cs) |
CA (1) | CA2437342C (cs) |
CZ (1) | CZ303658B6 (cs) |
DE (1) | DE50204952D1 (cs) |
DK (1) | DK1399568T3 (cs) |
WO (1) | WO2002061064A2 (cs) |
Families Citing this family (20)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7276605B2 (en) * | 2001-02-01 | 2007-10-02 | Roche Diagnostics Operations, Inc. | Method for producing recombinant trypsin |
DE60328802D1 (de) | 2002-08-30 | 2009-09-24 | Novozymes Inc | Verfahren zur herstellung von säugetier-trypsinen |
PL1926749T3 (pl) * | 2005-09-14 | 2011-12-30 | Sanofi Aventis Deutschland | Cięcie prekursorów insuliny przez wariant trypsyny |
MX2011006268A (es) * | 2009-01-06 | 2011-10-06 | Nestec Sa | Procesamiento de macronutrientes. |
CN101967469B (zh) * | 2009-07-28 | 2012-11-14 | 上海雅心生物技术有限公司 | 一种高稳定性的重组胰蛋白酶的生产及应用 |
MY161867A (en) | 2009-09-10 | 2017-05-15 | Biocon Ltd | Novel fusion proteins and method of expression thereof |
WO2012104099A1 (en) | 2011-02-04 | 2012-08-09 | Glucometrix Ag | Process for the production of recombinant trypsin |
CN103805584B (zh) * | 2012-11-12 | 2016-08-24 | 宜昌东阳光长江药业股份有限公司 | 一种重组胰蛋白酶纯化方法 |
CN103405756B (zh) * | 2013-07-10 | 2014-12-24 | 浙江众益制药股份有限公司 | 药物组合物复方消化酶胶囊(ii)及其制备方法 |
ES2932304T3 (es) | 2014-04-17 | 2023-01-17 | Biogen Ma Inc | Composiciones y métodos para la modulación del empalme de SMN2 en un sujeto |
CN104046605A (zh) * | 2014-05-29 | 2014-09-17 | 中国科学院广州能源研究所 | 一种嗜温耐乙醇β-葡萄糖苷酶及其编码基因和应用 |
WO2016040748A1 (en) | 2014-09-12 | 2016-03-17 | Ionis Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for detection of smn protein in a subject and treatment of a subject |
JP6686361B2 (ja) * | 2014-11-26 | 2020-04-22 | 東ソー株式会社 | 細胞回収のための標本作製方法 |
US10851371B2 (en) | 2015-04-10 | 2020-12-01 | Ionis Pharmaceuticals, Inc. | Modulation of SMN expression |
EP3471779A4 (en) | 2016-06-16 | 2020-07-08 | Ionis Pharmaceuticals, Inc. | COMBINATIONS FOR MODULATING THE SMN EXPRESSION |
CN106350497B (zh) * | 2016-11-24 | 2019-07-16 | 天津大学 | 一种胰蛋白酶及其制备方法与应用 |
CN110511916B (zh) * | 2019-08-06 | 2021-06-01 | 杭州浦泰生物科技有限公司 | 一种重组胰蛋白酶的生产工艺 |
BR112022016238A2 (pt) | 2020-02-28 | 2022-10-11 | Ionis Pharmaceuticals Inc | Compostos e métodos para modular smn2 |
CN115216463B (zh) * | 2022-06-15 | 2023-08-15 | 武汉瀚海新酶生物科技有限公司 | 具有稳定性的重组胰蛋白酶及其制备方法和应用 |
WO2024110426A1 (en) | 2022-11-23 | 2024-05-30 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Method for increasing recombinant protein expression |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0597681A1 (en) * | 1992-11-13 | 1994-05-18 | Eli Lilly And Company | Expression vectors for the bovine trypsin and trypsinogen and host cells transformed therewith |
WO1997000316A1 (en) * | 1995-06-16 | 1997-01-03 | Novo Nordisk A/S | A process for producing trypsin (trypsinogen) |
WO2000017332A1 (en) * | 1998-09-21 | 2000-03-30 | Eli Lilly And Company | Production of soluble recombinant trypsinogen analogs |
Family Cites Families (36)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE249282C (cs) | ||||
US4851341A (en) * | 1986-12-19 | 1989-07-25 | Immunex Corporation | Immunoaffinity purification system |
US5011912A (en) * | 1986-12-19 | 1991-04-30 | Immunex Corporation | Hybridoma and monoclonal antibody for use in an immunoaffinity purification system |
US5298599A (en) * | 1988-12-30 | 1994-03-29 | Oklahoma Medical Research Foundation | Expression and purification of recombinant soluble tissue factor |
US7247453B1 (en) * | 1988-12-30 | 2007-07-24 | Oklahoma Medical Research Foundation | Calcium binding recombinant antibody against protein C |
US6433142B1 (en) * | 1989-08-08 | 2002-08-13 | Genetics Institute, Llc | Megakaryocyte stimulating factors |
US5646016A (en) * | 1991-02-06 | 1997-07-08 | Genetics Institute, Inc. | Peptide and protein fusions to thioredoxin, thioredoxin-like molecules, and modified thioredoxin-like molecules |
US5472692A (en) * | 1993-07-02 | 1995-12-05 | New England Deaconess Hospital Corporation | Pro-urokinase mutants |
EP0699687B1 (en) * | 1994-08-31 | 2004-01-28 | Mitsubishi Pharma Corporation | Process for purifying recombinant human serum albumin |
US5760189A (en) * | 1995-06-02 | 1998-06-02 | Genetics Institute, Inc. | Protein recovery & purification methods |
CN1187849A (zh) * | 1995-06-16 | 1998-07-15 | 诺沃挪第克公司 | 产生胰蛋白酶(胰蛋白酶原)的方法 |
US5945328A (en) | 1995-06-16 | 1999-08-31 | Novo Nordisk A/S | Process for producing trypsin (trypsinogen) |
US6261561B1 (en) * | 1996-04-19 | 2001-07-17 | Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine | Method of stimulating an immune response by administration of host organisms that express intimin alone or as a fusion protein with one or more other antigens |
GB9609702D0 (en) * | 1996-05-09 | 1996-07-10 | Royal Free Hosp School Med | Anticoagulant peptides |
EP0970207B1 (en) * | 1997-02-10 | 2009-04-01 | Genentech, Inc. | Heregulin variants |
US20030207402A1 (en) | 1997-08-22 | 2003-11-06 | Erhard Kopetzki | Autocatalytically activatable zymogenic precursors of proteases and their use |
EP1012307B1 (de) | 1997-08-22 | 2005-05-04 | Roche Diagnostics GmbH | Autokatalytisch aktivierbare zymogene vorstufen von proteasen und deren verwendung |
US6159722A (en) * | 1997-12-03 | 2000-12-12 | Boehringer Mannheim Gmbh | Chimeric serine proteases |
US6486303B1 (en) * | 1998-04-14 | 2002-11-26 | University Of Medicine & Dentistry Of New Jersey | Method for making hormone heterodimers |
US6087558A (en) * | 1998-07-22 | 2000-07-11 | Prodigene, Inc. | Commercial production of proteases in plants |
CN100480266C (zh) * | 1998-10-16 | 2009-04-22 | 拜奥根Idec马萨诸塞公司 | 干扰素-β融合蛋白及用途 |
US7029909B1 (en) * | 1998-11-20 | 2006-04-18 | Fuso Pharmaceutical Industries, Ltd. | Protein expression vector and utilization thereof |
US20020102709A1 (en) * | 1999-02-19 | 2002-08-01 | Tetsuya Ishikawa | Collagen-binding physiologically active polypeptide |
US6485957B1 (en) * | 1999-04-30 | 2002-11-26 | Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. | DNA encoding the human serine protease EOS |
US6420157B1 (en) * | 1999-04-30 | 2002-07-16 | Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. | Zymogen activation system |
US6458564B1 (en) * | 1999-08-31 | 2002-10-01 | Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. | DNA encoding the human serine protease T |
AU7053500A (en) * | 1999-09-15 | 2001-04-17 | Eli Lilly And Company | Chymotrypsin-free trypsin |
US7351549B2 (en) * | 2000-01-24 | 2008-04-01 | Polymun Scientific Immunbiologische Forschung Gmbh | Method for the manufacture of recombinant trypsin |
WO2001055429A2 (en) | 2000-01-24 | 2001-08-02 | Polymun Scientific Immunbiologische Forschung Gmbh | Method for the manufacture of recombinant trypsin |
EP1326882A2 (en) * | 2000-06-19 | 2003-07-16 | Dyax Corp. | Enterokinase cleavage sequences and their use |
US6821755B2 (en) * | 2000-07-27 | 2004-11-23 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Preparation of a recombinant protein in a prokaryotic host cell |
US6831059B2 (en) * | 2000-10-20 | 2004-12-14 | Allergan, Inc. | Compositions and methods for treating gonadotrophin related illnesses |
US6632638B1 (en) * | 2000-11-17 | 2003-10-14 | Amgen, Inc. | Enhanced solubility of recombinant proteins using Uracil DNA glycosylase inhibitor |
BR0116381A (pt) * | 2000-12-20 | 2004-02-25 | Hoffmann La Roche | Conjugado, composição farmacêutica que compreende o mesmo e sua utilização, processo para o tratamento profilático e/ou terapêutico de distúrbios, processo para a preparação de um conjugado, compostos e glicoproteìnas de eritropoetina |
US7276605B2 (en) * | 2001-02-01 | 2007-10-02 | Roche Diagnostics Operations, Inc. | Method for producing recombinant trypsin |
KR20040011480A (ko) * | 2001-03-22 | 2004-02-05 | 덴드레온 샌 디에고 엘엘씨 | 세린 프로테아제 cvsp14를 암호화하는 핵산 분자,암호화된 폴리펩티드 및 이에 근거한 방법 |
-
2002
- 2002-02-01 US US10/470,508 patent/US7276605B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-02-01 CN CN02805619.1A patent/CN1545553B/zh not_active Expired - Lifetime
- 2002-02-01 CZ CZ20032337A patent/CZ303658B6/cs not_active IP Right Cessation
- 2002-02-01 JP JP2002561621A patent/JP4159878B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2002-02-01 CA CA2437342A patent/CA2437342C/en not_active Expired - Fee Related
- 2002-02-01 DE DE50204952T patent/DE50204952D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2002-02-01 DK DK02716713T patent/DK1399568T3/da active
- 2002-02-01 WO PCT/EP2002/001072 patent/WO2002061064A2/de active IP Right Grant
- 2002-02-01 EP EP02716713A patent/EP1399568B1/de not_active Expired - Lifetime
- 2002-02-01 AT AT02716713T patent/ATE310092T1/de active
-
2007
- 2007-09-11 US US11/853,483 patent/US7666629B2/en not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0597681A1 (en) * | 1992-11-13 | 1994-05-18 | Eli Lilly And Company | Expression vectors for the bovine trypsin and trypsinogen and host cells transformed therewith |
WO1997000316A1 (en) * | 1995-06-16 | 1997-01-03 | Novo Nordisk A/S | A process for producing trypsin (trypsinogen) |
WO2000017332A1 (en) * | 1998-09-21 | 2000-03-30 | Eli Lilly And Company | Production of soluble recombinant trypsinogen analogs |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20080064084A1 (en) | 2008-03-13 |
US20040203095A1 (en) | 2004-10-14 |
ATE310092T1 (de) | 2005-12-15 |
DK1399568T3 (da) | 2006-03-27 |
CA2437342A1 (en) | 2002-08-08 |
WO2002061064A2 (de) | 2002-08-08 |
CN1545553B (zh) | 2011-09-21 |
CN1545553A (zh) | 2004-11-10 |
WO2002061064A3 (de) | 2003-12-24 |
EP1399568A2 (de) | 2004-03-24 |
CZ20032337A3 (cs) | 2004-04-14 |
JP2004520049A (ja) | 2004-07-08 |
CA2437342C (en) | 2013-08-06 |
EP1399568B1 (de) | 2005-11-16 |
US7666629B2 (en) | 2010-02-23 |
JP4159878B2 (ja) | 2008-10-01 |
US7276605B2 (en) | 2007-10-02 |
DE50204952D1 (de) | 2005-12-22 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US7666629B2 (en) | Method for producing recombinant trypsin | |
KR101304958B1 (ko) | 트립신 변이체에 의한 인슐린 전구체의 절단 | |
US5716834A (en) | Cloned factor C cDNA of the Singapore horseshoe crab, Carcinoscorpius rotundicauda and purification of factor C proenzyme | |
JP4964284B2 (ja) | 組換えで発現されるカルボキシペプチダーゼbおよびその精製 | |
KR100714116B1 (ko) | 췌장의 프로카복시펩티다제 b를 사용한 인슐린의 제조 | |
EP1538203B1 (en) | Recombinantly expressed carboxypeptidase B and purification thereof | |
EP1334183B1 (en) | NOVEL SOLUBLE ENDOPROTEASES FOR THE i IN VITRO /i PROCESSING OF RECOMBINANT PROTEINS |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MK4A | Patent expired |
Effective date: 20220201 |