CN1187849A - 产生胰蛋白酶(胰蛋白酶原)的方法 - Google Patents
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Abstract
可以通过以下方法用丝状真菌产生胰蛋白酶(胰蛋白酶原):用包含编码胰蛋白酶原或其衍生物的DNA序列(其N末端融合到编码信号肽的DNA序列上)的载体转化丝状真菌;在合适的培养基中培养转化的丝状真菌以产生胰蛋白酶原;从培养物中回收胰蛋白酶原和/或胰蛋白酶。
Description
发明领域
本发明涉及一种用丝状真菌产生胰蛋白酶的方法和在这些方法中使用的DNA序列。
发明背景
在最近几年,转化包括黑曲霉、米曲霉和构巢曲霉在内的丝状真菌的技术已经得到了发展。美国4,885,249(Allelix)以引入携带编码选择性标记之基因的质粒为例,描述了转化黑曲霉的一般方法。
这种方法一般用于来源于其它微生物源的蛋白质的表达和产生,但是也用这样的***产生了哺乳动物蛋白质。
然而,得到的经验是胰蛋白酶(尤其哺乳动物的胰蛋白酶)仅以极低的水平得到表达。
发明概要
已惊奇地发现,当编码所选择的胰蛋白酶原基因在曲霉菌种(Aspergillus sp.)中表达时,与那些明显从其它微生物***分泌的胰蛋白酶的水平相比,分泌的胰蛋白酶的水平增加了数倍。
因此,本发明涉及用丝状真菌产生胰蛋白酶(胰蛋白酶原)或其衍生物的方法,该方法包括:(a)用重组DNA载体转化丝状真菌宿主有机体,所述重组DNA载体包含编码胰蛋白酶原或其衍生物的DNA序列,该序列N末端融合到编码信号肽的DNA序列上;所述信号肽可以是得自真菌(如米曲霉TAKA淀粉酶基因)的天然序列或另一信号序列或这种信号肽的衍生物;(b)在有利于胰蛋白酶原表达以及胰蛋白酶原和胰蛋白酶分泌到培养基中的条件下,在合适的培养基中培养转化的丝状真菌宿主有机体;以及,(c)从培养基中回收胰蛋白酶原或胰蛋白酶或其衍生物。
在本文的上下文中,术语″衍生物″用来指一种多肽,其是通过适当修饰编码天然胰蛋白酶/信号肽的DNA序列从天然胰蛋白酶或信号肽(当情况可能如此时)衍生而来,所述修饰的结果是:在C末端或N末端之一或两者上添加一个或多个氨基酸、在天然氨基酸序列的一个或多个不同位点上取代一个或多个氨基酸、在天然氨基酸序列的C或N末端之一或两者上或在天然氨基酸序列的一个或多个不同位点上缺失一个或多个氨基酸、或者在天然氨基酸序列的一个或多个位点上***一个或多个氨基酸。这种DNA序列的修饰可以用本领域熟知的方法实现。
术语″丝状真菌″旨在包括藻状菌纲、接合菌纲、子囊菌纲、担子菌纲和半知菌类,其中包含如曲霉属、青霉属、木霉属、镰刀菌属和腐质霉属之类的丝孢菌类。
信号序列的存在用于指导所表达的胰蛋白酶原或其衍生物有效地进入宿主细胞的分泌途径,以便胰蛋白酶原或胰蛋白酶能够容易地从培养基中分离(至少一些回收的产物是成熟的胰蛋白酶,因为从细胞分泌的胰蛋白酶原经历自动成熟过程或者由宿主细胞产生的蛋白酶使其成熟的过程)。
在本发明中,信号序列似乎不是关键的,已进行了许多试验,如TAKA淀粉酶(参见EP 0 238 023)、PTRYP胰蛋白酶以及人HTRYPI胰蛋白酶和HTRYPII信号序列(Okayama等,酶学方法154,3-28(1987),Emi等,基因41,305-310,(1986))。
用本发明方法产生的胰蛋白酶(胰蛋白酶原)是任何来源的胰蛋白酶,尤其是哺乳动物的胰蛋白酶,如猪、牛和人胰蛋白酶。
本发明还包括某些编码猪胰蛋白酶(胰蛋白酶原)的DNA序列和其能够表达胰蛋白酶(具有保持的它们的生物学活性)的等位基因。
此外,本发明还涉及包含所说的DNA序列的载体和以其转化的宿主。
表和附图简要描述
参照实施例和附图,说明书的下列部分将更详细地描述本发明,其中:
图1显示有关pHW470构建的步骤;
图2显示有关pHW473构建的步骤;以及,
图3显示有关pHW874构建的步骤。
发明详述
正如已指出的一样,本发明第一方面涉及用丝状真菌产生胰蛋白酶(胰蛋白酶原)或其衍生物的方法,该方法包括:(a)用重组DNA载体转化丝状真菌宿主有机体,所述重组DNA载体包含编码胰蛋白酶原或其衍生物的DNA序列,该序列N末端融合到编码信号肽的DNA序列上;所述信号肽可以是得自真菌(如米曲霉TAKA淀粉酶基因)的天然序列或另一信号序列或这种信号肽的衍生物;(b)在有利于胰蛋白酶原表达以及胰蛋白酶原和胰蛋白酶分泌到培养基中的条件下,在合适的培养基中培养转化的丝状真菌宿主有机体;以及,(c)从培养基中回收胰蛋白酶原或胰蛋白酶或其衍生物。
所说载体还可以包含编码有利于基因表达之功能(典型地是启动子、转录起始位点、转录终止和聚腺苷酸化功能)的DNA序列。
其前面可以存在如本领域已知的上游激活序列和增强子序列的启动子可以是在曲霉菌种(如米曲霉和黑曲霉)中显示出强转录活性的任何DNA序列,并且可以得自编码细胞外或细胞内蛋白质的基因,所述蛋白质例如淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶或糖酵解酶。
合适的启动子的实例是那些得自编码米曲霉TAKA淀粉酶、Rhizomucormiehei天冬氨蛋白酶、黑曲霉的中性α-淀粉酶、黑曲霉的酸稳定α-淀粉酶、黑曲霉的葡萄糖淀粉酶、Rhizomucor miehei的脂肪酶或米曲霉的碱性蛋白酶的基因的启动子。得自编码糖酵解酶的基因的启动子的实例是米曲霉丙糖磷酸盐异构酶、ADH和PGK启动子。
用作宿主有机体的丝状真菌优选地选自曲霉菌种,例如黑曲霉、泡盛曲霉或米曲霉。
终止和聚腺苷酸化序列可以适当地从与启动子相同的来源得到。
用于转化宿主有机体的技术可以从转化构巢曲霉方法(在例如Yelton等,美国科学院学报81,1984,pp.1470-1474,或EP 0 215 594中描述)适当地修改得到;从转化黑曲霉方法(在例如Buxton等,基因37,1985,pp.207-215或US 4,885,249中描述)适当地修改得到;或从转化米曲霉方法(在EP 238023中描述)适当地修改得到。在本发明的方法中,可以用包含编码选择性标记的DNA序列载体***转化米曲霉或黑曲霉,所述选择性标记能够在转化时掺入宿主有机体的基因组中,但是,其既不能在转化之前由宿主表达,也不能以允许在选择性条件下生长的足够的量表达。然后,可以基于所掺入的选择性标记选择转化体并与非转化体分离。
合适的选择性标记可以来源于构巢曲霉或黑曲霉argB基因、构巢曲霉trpC基因、构巢曲霉amdS基因、粗糙脉孢菌pyr4或DHFR基因、或者黑曲霉或米曲霉niaD基因。
用于本发明的优选的选择性标记来源于构巢曲霉或者黑曲霉amdS或argB基因。如果选择argB作为选择性标记,那么ArgB-突变菌株(其不表达ArgB基因)必须用作宿主有机体。另一方面,amdS基因在野生型米曲霉或黑曲霉菌株(其不能以允许在选择性条件下生长的足够的量表达这一基因)中可以用作选择性标记。
信号序列可以选自来源于胰蛋白酶原基因本身的信号序列,或选自编码如米曲霉TAKA淀粉酶、Rhizomucor miehei天冬氨蛋白酶、黑曲霉的中性α-淀粉酶、黑曲霉的酸稳定α-淀粉酶、黑曲霉的葡萄糖淀粉酶、Rhizomucor miehei的脂肪酶或米曲霉的碱性蛋白酶的基因。编码糖酵解酶的基因的实例是米曲霉丙糖磷酸盐异构酶、ADH和PGK。也可以使用这些信号序列的组合体和/或变体。
编码胰蛋白酶原(其融合进信号序列以及启动子和终止序列)的基因可以***到包含选择性标记的载体中,或者它可以***到引入到宿主细胞中的单独的载体中。所述载体可以是线性的或者是封闭的环形分子。
用于培养转化的宿主细胞的培养基可以是任何适于培养丝状真菌的常规培养基。转化体通常是稳定的且在缺少选择压力的情况下也可以培养。然而,如果发现转化体是不稳定的,那么引入细胞的选择标记可以用于选择。
利用熟知的方法,可以方便地从培养基中回收由宿主细胞产生的胰蛋白酶原或胰蛋白酶。这些方法包括:通过离心或过滤从培养基中分离细胞;借助于硫酸铵之类的盐沉淀培养基中的蛋白质组分;接着采用离子交换色谱、亲和性色谱等之类的色谱分析方法。
本发明还包括某些编码猪胰蛋白酶(胰蛋白酶原)的DNA序列和其能够表达胰蛋白酶(具有保持的它们的生物学活性)的等位基因。
本发明的第二方面涉及包含所说的DNA序列的载体。
本发明也包括用上述载体转化过的宿主。所述宿主可以是动物或微生物来源的,如哺乳动物细胞系、细菌、酵母或者真菌,尤其是丝状真菌来源的。
最后,本发明涉及一种重组产生猪胰蛋白酶的方法,该方法包括:(a)用重组DNA载体转化宿主,所述重组DNA载体包含编码猪胰蛋白酶原或其衍生物的DNA序列,该序列N末端融合到编码信号肽的DNA序列上,所述信号肽可以是天然序列或另一信号序列或这种信号肽的衍生物;(b)在有利于猪胰蛋白酶原表达和分泌到培养基中的条件下,在合适的培养基中培养转化的宿主;以及,(c)从培养基中回收猪胰蛋白酶原或胰蛋白酶或其衍生物。
用下列实施例进一步说明本发明,这些实施例决不构成对所要求的本发明的范围的限制。材料和方法实施例实施例1人胰蛋白酶原I和II eDNA的克隆
从按照Okayama等(酶学方法154,3-28(1987))方法构建的人胰的cDNA文库中,我们分离出了编码两种主要的人胰蛋白酶原同工酶(TRYI和TRYII)的eDNA克隆。Emi等(基因41,305-310,(1986))的序列用来选择用于分离的探针:NOR 948:5′GCCCCCAACGATCTTGTCATCATCATC 3′SEQ ID NO:3NOR 949:5′GTTCAGAGTCTTCCTGTCGTATTGGGG 3′SEQ ID NO:4
NOR 948是TRYI和TRYII共有的,NOR 949是对TRYII特异的。按照Emi等(基因41,305-310,(1986))的报道,分离出的全长克隆具有Emi等公开的序列。这儿将质粒pHW468命名为TRYI,将质粒pHW469命名为TRYII。实施例2猪胰蛋白酶原cDNA的克隆
利用标准方法(Maniatis 1982)从猪胰腺中纯化得到mRNA。从mRNA中制备eDNA,纯化eDNA,并且利用cDNA的λgtll克隆***(得自Amersham,英国)将cDNA***到λgtll。制备噬菌体、平板接种细胞、用λgtll感染、扩增以及筛选按照制造者说明和标准技术(Maniatis 1982)进行。如上所述,将寡核苷酸NOR 948用于噬斑筛选。
分离和扩增阳性噬斑。用EcoRl消化分离的λgtll DNA,利用大肠杆菌JM101转化体的氨苄青霉素选择,将***的cDNA克隆进EcoRI切割的pBluescript SK(Stratagene)。DNA测序分析(Sequenase,美国生物化学公司)显示:所选择的质粒包含与已知的猪胰蛋白酶氨基酸序列(Hermodson等,生物化学12,3146-3153(1973))相容的cDNA序列。从130bp(覆盖N末端)和740bp(覆盖C末端)的2个EcoRI片段获得猪前胰蛋白酶原信号肽的缺乏顶N-末端的几乎全部序列。所产生的质粒命名为p185,其序列在SEQ ID NO:1中显示。实施例3人胰蛋白酶原I和II在米曲霉中的表达
在曲霉属中表达人胰蛋白酶原I和II的载体如图1和图2的概述进行构建。BamHl-PvuII接头:NOR971:5′GATCCACCATGAATCCACTCCTGATCCTTACCTTTGTGGCAG 3′NOR972:3′ GTGGTACTTAGGTGAGGACTAGGAATGGAAACACCGTC 5′SEQ ID NO: 5
将cDNA连接到真菌表达载体p777(其在EP 0 238 023中描述)中的BamH1位点上。普通的接头覆盖TRYI信号序列的头11个氨基酸,仅在位置3与TRYII有区别,其以亮氨酸取代其天然序列中的脯氨酸。序列的余下部分是两物种的天然部分。
用EP238023中描述的步骤,将胰蛋白酶原表达载体pHW470和pHW473转化到米曲霉IFO4177或其蛋白酶的缺失衍生物A1560-T40中。如WO93/00426的描述通过采用pToC 186的共转化实施在乙酰胺上的选择。
使转化体在YPD培养基(Sherman等,酵母遗传学方法,冷泉港实验室,1981)中生长3-4天,并采用抗猪胰蛋白酶产生的多克隆抗体用SDS-PAGE和Western印迹分析上清液中的新蛋白质种类,其没有检测出人胰蛋白酶种类。然而,利用L-BAPNA(L-苯甲酰-精氨酰-对硝基苯胺)作为底物的活性测定令人信服地表明:TRYI和TRYII从米曲霉表达,另外,所述两种蛋白也从米曲霉的上清液纯化得到。实施例4猪胰蛋白酶在米曲霉中的表达
如图3的概述构建猪胰蛋白酶原在曲霉属中表达的载体。为了将TAKA淀粉酶信号的头18个氨基酸与猪胰蛋白酶信号的最后4个氨基酸连接,我们利用了Banl-EcoRI接头:226/223:5′GCACCGGCCGCGGTGGCCTTCCCGACCGACGATGACGACAAGATCGTCGGCGGG3′ GCCGGCGCCACCGGAAGGGCTGGCTGCTACTGCTGTTCTAGCAGCCGCCC225/224:TACACGTGTGCAGCGAACTCGATCCCTTACCAGGTCTCGCTG 3′ 96 bATGTGCACACGTCGCTTGAGCTAGGGAATGGTCCAGAGCGACTTAA 5′ 99 bSEQ ID NO: 6
上述融合体也具有TAKA淀粉酶启动子的一部分和胰蛋白酶基因的N末端。胰蛋白酶基因的C末端区在Sub2中连接到其上,保持所采取的方向。最终的表达载体(pHW874)具有作为功能性元件的TAKA淀粉酶启动子和AMG终止子。这些元件得自pHD414(其在EP 0 505 311中描述)。
如实施例3的描述,将猪胰蛋白酶表达载体pHW874转化进米曲霉。如实施例3的描述,使转化体在YPD培养基中生长,并用SDS-PAGE-Western和用L-BAPNA裂解分析该转化体。在这种情况下,在Western印迹上可见预期大小的猪胰蛋白酶原和成熟胰蛋白酶的明显带,其相当于用L-BAPNA的活性测量。说明书中所引用的参考文献美国4,885,249(Allelix)Okayama等,酶学方法154,3-28(1987)Emi等,基因41,305-310,(1986)Yelton等,美国科学院学报81,1984,pp.1470-1474EP 0 215 594Buxton等,基因37,1985,pp.207-215US 4,885,249EP 0 238 023Hermodson等,生物化学12,3146-3153(1973)WO 93/00426。Sherman等,酵母遗传学方法,冷泉港实验室,1981EP 0 505 311
序列表(1)一般信息:(i)申请人:
(A)姓名:Novo Nordi sk A/S
(B)街道:Novo Alle
(C)城市:Bagsvaerd
(E)国家:丹麦
(F)邮政编码(ZIP):DK-2880
(G)电话:+45 44448888
(H)传真:+45 44493256(ii)发明名称:产生胰蛋白酶(胰蛋白酶原)的方法(iii)序列数:6(iv)计算机可读形式:
(A)介质类型:软盘
(B)计算机:IBM PC兼容机
(C)操作***:PC-DOS/MS-DOS
(D)软件:PatentIn Release #1.0,1.30版本(EPO)(2)SEQ ID NO:1的信息:(i)序列特征:
(A)长度:897个碱基对
(B)类型:核酸
(C)链型:单链
(D)拓扑结构:线性(ii)分子类型:cDNA(iii)假设:否(iv)反义:否(v)原始来源:
(A)有机体:Sus scrofa
(F)组织类型:胰(ix)特征:
(A)名称/关键词:CDS
(B)位置:4..744(xi)序列描述:SEQ ID NO:1:GGA ATT CCG AAC ACC TTT GTC TTG CTT GCG CTC CTG GGA GCT GCT GTT 48
Ile Pro Asn Thr Phe Val Leu Leu Ala Leu Leu Gly Ala Ala Val
1 5 10 15GCT TTC CCC ACG GAT GAT GAT GAC AAG ATC GTC GGG GGT TAC ACC TGT 96Ala Phe Pro Thr Asp Asp Asp Asp Lys Ile Val Gly Gly Tyr Thr Cys
20 25 30GCA GCA AAT TCC ATT CCC TAC CAG GTG TCC CTG AAT TCT GGC TCC CAC 144Ala Ala Asn Ser Ile Pro Tyr Gln Val Ser Leu Asn Ser Gly Ser His
35 40 45TTC TGT GGT GGG TCC CTC ATC AAC AGC CAG TGG GTG GTG TCT GCT GCT 192Phe Cys Gly Gly Ser Leu Ile Asn Ser Gln Trp Val Val Ser Ala Ala
50 55 60CAC TGC TAC AAG TCC CGA ATC CAG GTG CGT CTG GGA GAA CAC AAC ATC 240His Cys Tyr Lys Ser Arg Ile Gln Val Arg Leu Gly Glu His Asn Ile
65 70 75GAC GTC CTT GAG GGC AAT GAG CAA TTC ATC AAT GCC GCC AAG ATC ATC 288Asp Val Leu Glu Gly Asn Glu Gln Phe Ile Asn Ala Ala Lys Ile Ile80 85 90 95ACC CAC CCC AAT TTC AAT GGA AAT ACC TTA GAT AAC GAC ATC ATG CTG 336Thr His Pro Asn Phe Asn Gly Asn Thr Leu Asp Asn Asp Ile Met Leu
100 105 110ATT AAA CTG AGC TCA CCT GCC ACT CTC AAC AGT CGA GTA GCA ACT GTC 384Ile Lys Leu Ser Ser Pro Ala Thr Leu Asn Ser Arg Val Ala Thr Val
115 120 125TCA CTG CCA AGA TCT TGT GCA GCT GCT GGT ACC GAG TGT CTC ATC TCT 432Ser Leu Pro Arg Ser Cys Ala Ala Ala Gly Thr Glu Cys Leu Ile Ser
130 135 140GGC TGG GGC AAC ACC AAA AGC AGT GGC TCC AGC TAC CCT TCG CTC CTG 480Gly Trp Gly Asn Thr Lys Ser Ser Gly Ser Ser Tyr Pro Ser Leu Leu
145 150 155CAA TGC CTG AAG GCC CCC GTC CTA AGT GAC AGT TCT TGC AAG AGT TCC 528Gln Cys Leu Lys Ala Pro Val Leu Ser Asp Ser Ser Cys Lys Ser Ser160 165 170 175TAC CCA GGC CAG ATC ACC GGA AAC ATG ATC TGT GTC GGC TTC CTG GAG 576Tyr Pro Gly Gln Ile Thr Gly Asn Met Ile Cys Val Gly Phe Leu Glu
180 185 190GGT GGT AAG GAT TCT TGC CAG GGA GAC TCT GGT GGC CCC GTG GTC TGC 624Gly Gly Lys Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Val Val Cys
195 200 205AAT GGA CAG CTC CAG GGT ATT GTC TCT TGG GGC TAT GGC TGC GCC CAG 672Asn Gly Gln Leu Gln Gly Ile Val Ser Trp Gly Tyr Gly Cys Ala Gln
210 215 220AAA AAC AAG CCT GGG GTC TAC ACC AAG GTC TGC AAC TAT GTG AAC TGG 720Lys Asn Lys Pro Gly Val Tyr Thr Lys Val Cys Asn Tyr Val Asn Trp
225 230 235ATT CAG CAG ACC ATC GCT GCC AAC TAAAGAATTT CATTTCTTCA TGACTCTTCC 774Ile Gln Gln Thr Ile Ala Ala Asn240 245CTTTAGTCAT CTTCACCTTC CTCCCATCCT GCGAACAGCA TCTAAATAAA AACATTTTGA 834CCTGTACCAG CATCTAAATA AAAACATTTT GAGCTGTACC CAAAAAAAAA AAAAAGGAAT 894TCC 897(2)SEQ ID NO:2的信息:
(i)序列特征:
(A)长度:247个氨基酸
(B)类型:氨基酸
(D)拓扑结构:线性
(ii)分子类型:蛋白质
(xi)序列描述:SEQ ID NO:2:Ile Pro Asn Thr Phe Val Leu Leu Ala Leu Leu Gly Ala Ala Val Ala1 5 10 15Phe Pro Thr Asp Asp Asp Asp Lys Ile Val Gly Gly Tyr Thr Cys Ala
20 25 30Ala Asn Ser Ile Pro Tyr Gln Val Ser Leu Asn Ser Gly Ser His Phe
35 40 45Cys Gly Gly Ser Leu Ile Asn Ser Gln Trp Val Val Ser Ala Ala His
50 55 60Cys Tyr Lys Ser Arg Ile Gln Val Arg Leu Gly Glu His Asn Ile Asp65 70 75 80Val Leu Glu Gly Asn Glu Gln Phe Ile Asn Ala Ala Lys Ile Ile Thr
85 90 95His Pro Asn Phe Asn Gly Asn Thr Leu Asp Asn Asp Ile Met Leu Ile
100 105 110Lys Leu Ser Ser Pro Ala Thr Leu Asn Ser Arg Val Ala Thr Val Ser
115 120 125Leu Pro Arg Ser Cys Ala Ala Ala Gly Thr Glu Cys Leu Ile Ser Gly
130 135 140Trp Gly Asn Thr Lys Ser Ser Gly Ser Ser Tyr Pro Ser Leu Leu Gln145 150 155 160Cys Leu Lys Ala Pro Val Leu Ser Asp Ser Ser Cys Lys Ser Ser Tyr
165 170 175Pro Gly Gln Ile Thr Gly Asn Met Ile Cys Val Gly Phe Leu Glu Gly
180 185 190Gly Lys Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Val Val Cys Asn
195 200 205Gly Gln Leu Gln Gly Ile Val Ser Trp Gly Tyr Gly Cys Ala Gln Lys
210 215 220Asn Lys Pro Gly Val Tyr Thr Lys Val Cys Asn Tyr Val Asn Trp Ile225 230 235 240Gln Gln Thr Ile Ala Ala Asn
245(2)SEQ ID NO:3信息:(i)序列特征:
(A)长度:27个碱基对
(B)类型:核酸
(C)链型:单链
(D)拓扑结构:线性(ii)分子类型:DNA探针(iii)假设:是(iv)反义:否GCCCCCAACG ATCTTGTCAT CATCATC(2)SEQ ID NO:4信息:(i)序列特征:
(A)长度:27个碱基对
(B)类型:核酸
(C)链型:单链
(D)拓扑结构:线性
(ii)分子类型:DNA探针
(iii)假设:是
(iv)反义:否GTTCAGAGTC TTCCTGTCGT ATTGGGG(2)SEQ ID NO:5信息:
(i)序列特征:
(A)长度:42个碱基对
(B)类型:核酸
(C)链型:单链
(D)拓扑结构:线性
(ii)分子类型:DNA接头
(iii)假设:是
(iv)反义:否GATCCACCAT GAATCCACTC CTGATCCTTA CCTTTGTGGC AG(2)SEQ ID NO:6信息:
(i)序列特征:
(A)长度:96个碱基对
(B)类型:核酸
(C)链型:单链
(D)拓扑结构:线性
(ii)分子类型:DNA接头
(iii)假设:是
(iv)反义:否GCACCGGCCG CGGTGGCCTT CCCGACCGAC GATGACGACA AGATCGTCGG CGGGTACACGTGTGCAGCGA ACTCGATCCC TTACCAGGTC TCGCTG
Claims (16)
1.一种用丝状真菌产生胰蛋白酶或其衍生物的方法,该方法包括:(a)用重组DNA载体转化丝状真菌宿主有机体,所述重组DNA载体包含编码胰蛋白酶原或其衍生物的DNA序列,该序列N末端融合到编码信号肽的DNA序列上;(b)在有利于胰蛋白酶原表达和分泌到培养基中的条件下,在合适的培养基中培养转化的丝状真菌宿主有机体;以及,(c)从培养基中回收胰蛋白酶原或胰蛋白酶或其衍生物。
2.按照权利要求1的方法,其中所说的丝状真菌是曲霉菌种(Aspergillus sp.)。
3.按照权利要求2的方法,其中所说的曲霉菌种是黑曲霉或米曲霉。
4.按照权利要求3的方法,其中所说的DNA载体还包含启动子,该启动子选自由黑曲霉淀粉酶启动子和米曲霉TAKA淀粉酶启动子组成的组。
5.按照权利要求1至4之任一的方法,其中所说的信号序列选自包括天然胰蛋白酶原信号序列、黑曲霉淀粉酶信号和米曲霉TAKA淀粉酶信号的组。
6.按照权利要求1至5之任一的方法,其中所说的胰蛋白酶原是动物来源的,尤其是哺乳动物来源的。
7.权利要求6的方法,其中所说的哺乳动物是人或猪。
8.按照权利要求1至5之任一的方法,其中所说的胰蛋白酶原是微生物来源的,尤其是细菌或真菌来源的。
9.一种DNA序列,该序列编码猪胰蛋白酶原并基本上具有在SEQ ID:1中给出的序列。
10.一种包含按照权利要求9的DNA序列的载体。
11.一种用权利要求10的载体转化的宿主。
12.权利要求11的宿主,其是哺乳动物宿主。
13.权利要求11的宿主,其是微生物宿主。
14.权利要求13的宿主,其是酵母或真菌。
15.权利要求14的宿主,其是丝状真菌。
16.一种重组产生猪胰蛋白酶的方法,该方法包括:(a)用重组DNA载体转化宿主,所述重组DNA载体包含编码猪胰蛋白酶原或其衍生物的DNA序列,该序列N末端融合到编码信号肽的DNA序列上,所述信号肽可以是天然序列或另一信号序列或这种信号肽的衍生物;(b)在有利于猪胰蛋白酶原表达和分泌到培养基中的条件下,在合适的培养基中培养转化的宿主;以及,(c)从培养基中回收猪胰蛋白酶原或胰蛋白酶或其衍生物。
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1996
- 1996-06-10 CN CN 96194807 patent/CN1187849A/zh active Pending
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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CN104694522A (zh) * | 2015-02-16 | 2015-06-10 | 中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所 | 一种重组乙酰化阳离子型胰蛋白酶的制备方法及其应用 |
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COR | Change of bibliographic data |
Free format text: CORRECT: APPLICANT; FROM: NOVO NORDISK A/S TO: NUOWOQIMEIZI CO.,LTD. |
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C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |