JP4005633B2 - Ｆ型ボツリヌス毒素およびその用途 - Google Patents
Ｆ型ボツリヌス毒素およびその用途 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4005633B2 JP4005633B2 JP50279897A JP50279897A JP4005633B2 JP 4005633 B2 JP4005633 B2 JP 4005633B2 JP 50279897 A JP50279897 A JP 50279897A JP 50279897 A JP50279897 A JP 50279897A JP 4005633 B2 JP4005633 B2 JP 4005633B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- polypeptide
- botulinum toxin
- fusion protein
- amino acids
- chromatography column
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 108010069038 botulinum toxin type F Proteins 0.000 title claims description 22
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 70
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 59
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 55
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 47
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims abstract description 41
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims abstract description 41
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 claims abstract description 35
- 239000003053 toxin Substances 0.000 claims abstract description 35
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 claims abstract description 35
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims abstract description 24
- 230000007888 toxin activity Effects 0.000 claims abstract description 11
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 10
- 108030001720 Bontoxilysin Proteins 0.000 claims description 62
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 40
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims description 39
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 33
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 28
- 229940053031 botulinum toxin Drugs 0.000 claims description 23
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 20
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 20
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 20
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 16
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 claims description 14
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 claims description 13
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 11
- 230000036039 immunity Effects 0.000 claims description 11
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 6
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 5
- 101710117520 Botulinum neurotoxin type F Proteins 0.000 claims description 4
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims description 4
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims 7
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 32
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 17
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 17
- 241000193155 Clostridium botulinum Species 0.000 description 13
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 11
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 10
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 7
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 7
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 6
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 5
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 5
- 229940125575 vaccine candidate Drugs 0.000 description 5
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 4
- 101710175625 Maltose/maltodextrin-binding periplasmic protein Proteins 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 4
- 231100001103 botulinum neurotoxin Toxicity 0.000 description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 4
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 4
- 239000002581 neurotoxin Substances 0.000 description 4
- 231100000618 neurotoxin Toxicity 0.000 description 4
- 241001112695 Clostridiales Species 0.000 description 3
- 241000193403 Clostridium Species 0.000 description 3
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 3
- 108010055044 Tetanus Toxin Proteins 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 108010030074 endodeoxyribonuclease MluI Proteins 0.000 description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 3
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 108010006035 Metalloproteases Proteins 0.000 description 2
- 102000005741 Metalloproteases Human genes 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 108010057266 Type A Botulinum Toxins Proteins 0.000 description 2
- 239000000370 acceptor Substances 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N methanone Chemical compound O=[14CH2] WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 2
- 229940031348 multivalent vaccine Drugs 0.000 description 2
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 229940118376 tetanus toxin Drugs 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- ITFICYZHWXDVMU-IPTZIORSSA-N (2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-4-amino-2-[[(2S,3S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-6-amino-2-[[(2S,3S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-1-[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-amino-4-carboxybutanoyl]amino]acetyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-methylpentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-sulfanylpropanoyl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]amino]-3-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-3-methylpentanoyl]amino]-4-oxobutanoyl]amino]-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]pentanedioic acid Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC2=CNC3=CC=CC=C32)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H]4CCCN4C(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N ITFICYZHWXDVMU-IPTZIORSSA-N 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000856 Amylose Polymers 0.000 description 1
- 208000003508 Botulism Diseases 0.000 description 1
- 241000186542 Clostridium baratii Species 0.000 description 1
- 241000193171 Clostridium butyricum Species 0.000 description 1
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 101150034814 F gene Proteins 0.000 description 1
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 101710138657 Neurotoxin Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 208000033952 Paralysis flaccid Diseases 0.000 description 1
- 208000005374 Poisoning Diseases 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 241001672648 Vieira Species 0.000 description 1
- OIPILFWXSMYKGL-UHFFFAOYSA-N acetylcholine Chemical compound CC(=O)OCC[N+](C)(C)C OIPILFWXSMYKGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004373 acetylcholine Drugs 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000007059 acute toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000403 acute toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 1
- AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N alumane Chemical class [AlH3] AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 238000006664 bond formation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000007665 chronic toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000160 chronic toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 208000028331 flaccid paralysis Diseases 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000009920 food preservation Methods 0.000 description 1
- 108060003552 hemocyanin Proteins 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 125000000896 monocarboxylic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- 230000006764 neuronal dysfunction Effects 0.000 description 1
- 239000002858 neurotransmitter agent Substances 0.000 description 1
- 239000000863 peptide conjugate Substances 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 231100000572 poisoning Toxicity 0.000 description 1
- 230000000607 poisoning effect Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000012743 protein tagging Effects 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
- C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/33—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Clostridium (G)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Oncology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
本発明は、Ｆ型ボツリヌス毒素、Ｆ型ボツリヌス神経毒素のフラグメント、組み換え手段によるそのフラグメントの産生、およびそのフラグメントをコード化する合成遺伝子に関する。特に、本発明は、ヒトまたは動物においてＦ型ボツリヌス神経毒素（BoNT/F）に対して保護的である、免疫学的応答を誘発し得る新規のポリペプチドフラグメント、およびそのフラグメントを含むワクチンに関する。
ボツリヌス神経毒素（BoNTs）は、脊椎動物において強力な神経麻痺効果を発揮する高分子量タンパク質（約150,000 Da）である。それらは、Clostridium属に属する嫌気性グラム陽性細菌により合成される。BoNTを産生するクロストリジウムの大部分がClostridium Botulinumとして分類される。しかし、最近、Clostridium baratiおよびClostridium butyricumに類似する単離体がBoNTを産生することが示された。抗原性を基準として、BoNTはA〜Gと称される7つの異なるタイプに細分された。7つの全ての神経毒素（BoNT/A〜BoNT/G）は一本鎖150,000 Da分子として合成され、続いて切断されて少なくとも一つのジスルフィド架橋により結合される重（H）鎖（約100,000 Da）および軽（L）鎖（約50,000 Da）からなる、より強力な二本鎖形態になる。
BoNTの作用は3つの異なる相を含む。第1の相において、毒素は、標的化神経細胞の外表面上のアクセプターに結合する。続いて、エネルギー依存性内在化工程により毒素またはその一部が細胞に入る。その後、毒素の活性部分が、神経抹消において神経伝達物質であるアセチルコリンの細胞内放出をブロックして弛緩性麻痺を引き起こすことにより神経細胞機能不全を引き起こす。Ｌ鎖は、細胞被毒の原因となる触媒活性を有し、そしてH鎖は、毒素の細胞への結合およびその後の内在化を媒介することにより、この部分を細胞質に送達する。
7つ全てのBoNTの全アミノ酸配列は、その主要なアミノ酸配列における驚くべき分岐が示されていることが既知である。（Minton,N.P.（1995）、Current Topics in Microbiology and Immunology、第195巻：161〜187頁）。すなわち、異なる血清型中の配列同一性は通常40％を超えず、相同の領域は、全類似性をほとんど示さないアミノ酸領域が挿入された別々のドメインに局在化されている。異なるL鎖（平均サイズ439）の間において、63のアミノ酸が完全に保存される。H鎖（平均サイズ843）を通じて、97アミノ酸が同一である。最も顕著な保存領域は、L鎖とH鎖との間のジスルフィド結合形成に関与する二つのシステイン残基；メタロプロテアーゼ活性に関与するL鎖内のヒスチジンリッチモチーフ；および膜架橋潜在性を有するとして同定された領域に隣接して見い出される高度に保存されたPYI/VXALNモチーフを含む。毒素中の配列分岐の最も顕著な領域は、それぞれのH鎖のCOOH末端に局在化されている（BoNT/Aの上流のアミノ酸1124）。これは、このドメインが神経毒素結合に関与し、そして異なる毒素が神経細胞表面上の異なるアクセプターを標的にするという概念に一致するようである。
西洋諸国における近年の食品保存プロセスの有効性は、ボツリスムの発生を極めてまれにした。しかし、食品産業における試験生物としてのC.ｂotulinumの頻繁な使用、および神経生化学者によるこの毒素の使用の増加は、ヒトワクチンに対する必要性を増加させた。これらのワクチンの処方は1950年代初期から殆ど変化しておらず：神経毒素の部分的精製製剤がホルムアルデヒド処理によりトキソイド化され、そして沈殿したアルミニウム塩に吸収される。このような方法論を用いて、ヒト免疫化のための多価ワクチン（ABCDEまたはABEFに対する）が現在入手可能である。このようなワクチンは、低免疫応答、およびトキソイド製剤中の高い割合（60〜90％）の汚染タンパク質によるバッチ間のかなりの変不利益を被る。従って、最近の研究は、毒素をほぼ均質に精製するための手順の開発に集中している。しかし、ワクチンの製造における精製毒素の使用は、第1に、それらを高含量下に製造しなくてはならないこと、第2に、毒素から活性状態への逆転の可能性を防止するために低レベルのホルムアルデヒドの存在を必要とすることという不利益を被る。
他の生物および毒素に対するサブユニットワクチンの産生が、多くの実験機関により研究されている。この作業は、最も既知の毒素サブタイプ、すなわちAおよびBを焦点として、Ａ型またはＢ型の毒素に対する特異的な免疫性を生じる新規のワクチンが得られた。しかし新規のワクチンは、他の毒素サブタイプに対する保護を提供し得ない。
ワクチン成分の組み換え製造は、ワクチンの純度および製造量を大きく進展させた。A.J.Makoffら、Bio／Technilogy、第7巻、1989年10月、l043〜1046頁に、E.coli中での破傷風毒素フラグメントの発現、ならびにその精製およびワクチンとしての潜在的な用途が記載されている。それにもかかわらず、その記載されている技術は、宿主細胞から精製されたワクチン成分を回収するために数多くの工程を必要とする。
本発明の一つの目的は、Ｆ型ボツリヌス毒素に対するワクチンを製造することである。別の目的は、ワクチンの製造を簡単にすることである。さらなる目的は、ボツリヌス毒素ワクチンの産物を改良することである。本発明のなおさらなる目的は、存在するワクチンおよび製造法における問題および／または制限を克服するまたは少なくとも緩和することである。
本発明の第1の局面によれば、Ｆ型ボツリヌス毒素への保護免疫性を誘導するボツリヌス毒素活性を含まないポリペプチドが提供される。このポリペプチドは、Ｆ型毒素に対するワクチンの製造に有用であり、多価ワクチンのような従来技術の組成物と対照的に、トキソイドではなく、ホルムアルデヒドでの予備処理を必要としない。従来技術の組成物と対照的に、このポリペプチドはまた、通常は、毒素そのものより小さいサイズである。
本発明の第1の局面の実施態様は、
（a）ボツリヌス毒素活性を有さないこと、および
（b）哺乳動物において、Ｆ型ボツリヌス毒素に対して保護的である免疫学的応答を誘発し得ること
を特徴とするポリペプチドを提供する。
「免疫性」および「免疫学的応答」と共に用いられる用語「保護的」は、活性なボツリヌス毒素Ｆによるチャレンジから生き延びるための増加した能力を示すために用いられる。この増加は、代表的には、毒素によるチャレンジの際の毒素に対する抗体の増加した力価または毒素に対する抗体を産生する増大した能力により媒介される。この用語は、任意の量の毒素に対する絶対的な保護を示すことを意図しない。
従って、本発明は、Ｆ型ボツリヌス毒素に対する、従来利用できなかった特異的な保護を提供する。
特定の実施態様において、本発明は、アミノ酸848〜1278（配列番号1）由来のC.botulinum株Langeland BoNT/Fのアミノ酸配列を含むが、メタロプロテアーゼ活性および毒素内在化（それぞれアミノ酸1〜439および440〜847の間において見い出される）に必要なL鎖およびHNエピトープのアミノ酸配列を欠失しているペプチドまたはペプチド結合体；ヒトまたは他の動物に投与した場合にBoNT/Fに対して保護的である免疫応答を誘導し得るペプチドを提供する。
より特定の実施態様において、本発明のペプチドは、Clostridium botulinum株LangelandのBoNT/Fのアミノ酸配列の848〜1278（配列番号１）由来のアミノ酸の配列のみから実質的に成るか、またはBoNT/Fのアミノ酸1〜847ではない別のアミノ酸配列との融合ペプチドの形態の配列から成る。用語「別のアミノ酸配列」は、完全なタンパク質ならびに使用者の要求に適切な比較的短いアミノ酸配列を含むことが当業者により理解される。必要に応じて、他のアミノ酸配列は、他の免疫性または標識化を提供する目的のために、または宿主細胞中のポリペプチドの発現を改変するために、上記の配列に融合して含まれる非C.botulinumである抗原性タンパク質である。
本発明の別の実施態様において、ポリペプチドは、ボツリヌス毒素活性を有さずそしてＦ型毒素に対する保護免疫性を誘導し得るＦ型ボツリヌス神経毒素のフラグメントまたは誘導体を含む。このフラグメントは、トキソイドを有さず、ホルムアルデヒドを含まず、そして700アミノ酸より少なく、好ましくは500アミノ酸より少ない長さを有する。
本発明のさらなる特別な実施態様において、フラグメントは、
（a）Ｆ型ボツリヌス毒素のアミノ酸848〜1278（配列番号1）、
（b）Ｆ型ボツリヌス毒素のアミノ酸848〜991（配列番号2）、
（c）Ｆ型ボツリヌス毒素のアミノ酸992〜l135（配列番号3）、および
（d）Ｆ型ボツリヌス毒素のアミノ酸1136〜1278（配列番号4）
から選択される。
本発明はまた、繰り返し部分において共に結合しているＦ型ボツリヌス毒素の複数のフラグメントを含む合成ポリペプチドである、毒素誘導体にも関する。この誘導体は、上記のフラグメントの二量体を含み得る。
本発明の第1の局面はまた、ボツリヌス毒素活性を有さず、そしてボツリヌス毒素に対して保護免疫性を誘導し得、それらのプロセシングを容易にするために適合される組成物である、ポリペプチド組成物を提供する。このことは、結果として得られるワクチンにおいて望ましくない任意の成分の混合物からポリペプチドを分離しなくてはならないので、ワクチンの製造において有利である。このような適合した組成物は、
（1）ボツリヌス毒素活性を有さずそしてボツリヌス毒素に対して保護免疫性を誘導し得ないポリペプチド；および
（2）組成物の精製のために適合されたポリペプチド
を含む。
例えば、成分（2）は、水溶液からの組成物の精製を容易にするために適合され、そして必要に応じて抗体、抗体の結合領域、イオン交換カラムに結合するように適合されたポリペプチド、アフィニティークロマトグラフィーカラムに結合するように適合されたポリペプチドまたは精製リガンドを含む。
この組成物は、好ましくは、例えば融合ポリペプチドの形態で、成分（1）および（2）を含む単一のポリペプチドを含むか、またはそれから成る。
組成物の使用において、組成物を発現する溶解された細胞由来の上清のような混合物からの組成物の抽出は、迅速で簡単なプロセスにされる。組成物において、成分（1）のワクチン接種特性が実質的に保持される、すなわち組成物の精製後にさらなる改変の必要なくして、特に成分（2）を除去する必要なくして、組成物がワクチン中で用いられることは特に有利である。組成物の成分（1）の候補として、本発明の第1の局面により先に記載された全てのポリペプチドが適切である。さらに、毒素活性を有さない、破傷風毒素のフラグメントが適切である。
従って、本発明の特別な実施態様によるポリペプチドは、
（a）Ｆ型ボツリヌス神経毒素のアミノ酸848〜1278（配列番号1）と
（b）精製部分
との融合タンパク質を含む。
アフィニティークロマトグラフィーカラムに結合するように精製部分が適合されることが好ましい。代表的な精製部分は、50〜500のアミノ酸を含む。特定の実施態様において、融合タンパク質は、精製部分としてマルトース結合タンパク質を含む。この融合タンパク質は、アフィニティークロマトグラフィーカラムを用いる精製に特に適切であり、以下に記載するように有用なワクチン接種特性を有することがわかった。
第2の局面によれば、本発明は、本発明の第1の局面のポリペプチドおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む、ボツリヌス毒素に対するワクチンを提供する。
適切なキャリアは、ワクチンの調製における当業者に公知である。本明細書中以下に記載される実施態様において、キャリアは、フロイントアジュバントを含む。別の適切なキャリア成分は沈殿したミョウバン塩である。
本発明の第3の局面において、本発明のポリペプチドをコードする組み換えDNAが提供される。このような組み換えDNAは、従来、二本鎖配列の各末端で標的化されているプライマーを用いて、所望の配列、例えばBoNT/F848〜1278をコードするDNAのPCR増幅により提供される。必要に応じて、PCRで用いられるテンプレート配列は、天然のクロストリジウムの遺伝子を表わす。しかし、本発明の好ましい実施態様において、使用される配列は、天然クロストリジウムタンパク質と同じアミノ酸をコードするが、コドンの用法が変化している合成配列である。合成遺伝子は少なくとも40％のGC含量、好ましくは少なくとも45％、そして最も好ましくは少なくとも50％を有することが好ましい。
このような合成配列の場合、本発明の一つの実施態様において、その構築中に、DNAフラグメントの先端に位置する組み込まれた適切な制限エンドヌクレアーゼ認識部位の使用を通して、選択された発現プラスミドへの挿入が達成される。
どのような手段によっても、BoNT/Fペプチドをコードする組み換えDNAが生成され、それが適切な発現ベクター中に連結し、所望であればこの段階で、配列をコードする所望の融合ペプチドへの遺伝子融合が生じ、そして得られるベクターが、適切な細胞株、例えば、E.coliまたはPichia pastorisのような酵母に導入される。所望の産物を産生する細胞株は、確立された手順、例えばウエスタンブロッティングまたはELISAを通して選択される。
本発明の第４および第５の局面は、それぞれ、第３の局面のDNAを組み込むプラスミドベクター、およびそのプラスミドを含み、そしてDNAを発現する細胞株を提供する。
本発明はまた、活性なワクチン接種剤の精製が、精製のために適合されたポリペプチド配列と組み合わされてその発現により容易化される、毒素ワクチンの製造のための方法を提供する。従って、本発明の第6の局面は毒素ワクチンの製造のための方法を提供する。このワクチンは毒素活性を有さずそして毒素に対する保護免疫性を誘導し得るワクチン接種ポリペプチドを含み、ここでこの方法は、融合タンパク質、上記のワクチン接種ポリペプチドを含む上記の融合タンパク質および精製部分をコードするDNA配列を宿主細胞中で発現する工程、この融合タンパク質を含む宿主細胞から抽出物を得る工程、およびそこから融合タンパク質を精製する工程を包含する。
本発明の第6の局面の好ましい実施態様において、本発明の第1の局面のポリペプチドを含むワクチンを製造する方法であって、以下の工程：
（a）融合タンパク質をコードするDNAを宿主細胞中で発現する工程であって、このタンパク質が（i）ボツリヌス毒素のフラグメントであって、このフラグメントは毒素活性を有さずそしてボツリヌス毒素に対する保護免疫性を誘導し得るボツリヌス毒素のフラグメント、および（ii）アフィニティークロマトグラフィーカラムに結合するように適合された精製部分との融合である、工程、
（b）上記の宿主細胞から、融合タンパク質を含む抽出物を得る工程、および
（c）アフィニティークロマトグラフィーカラムを用いて融合タンパク質を精製する工程
を含む方法が提供される。
本発明の実施態様の使用において、融合タンパク質が、基質を用いる溶出によりカラムから除去される。この方法は、必要に応じて、融合タンパク質を解裂する工程、および毒素フラグメントを保持する工程を包含する。この方法は、特異的にＦ型毒素を用いるが、全ての他のボツリヌス毒素および破傷風毒素に対してもまた適用される。
この方法により、本発明は、他のクロストリジウムタンパク質による汚染を含まないボツリヌス毒素Ｆ型フラグメントの調製を可能にする。これらは、Clostridium細菌の培養物由来の従来技術の製剤をしばしば汚染するものである。
得られる融合タンパク質または毒素フラグメントは、代表的には、実質的に純粋な形態であり、そしていくつかの簡単な工程においてワクチンまたは他の薬学的組成物中に組み込むのに適切である。
BoNT/F由来ペプチドを含む特定の融合タンパク質の作成が、BoNT/Fの最初の単離において有用であり、それに続く切断は必要に応じてBoNT/F関連ペプチドを精製するために用いられることに注目すべきである。翻訳の補助のためにBoNT/FをコードするDNAの５'末端にコドンが付加される場合、これらのアミノ酸は、必要に応じて、例えば、ペプチドの分泌またはより簡潔には翻訳を開始するためのNH2末端メチオニンの付加をもたらすために用いられるような、最終的なペプチドのNH2末端にて保持される。
本発明の第7の局面は、薬学的組成物を作製する方法であって、以下：
（a）融合タンパク質をコードするDNAを宿主細胞中で発現する工程であって、上記のタンパク質が（i）毒素活性を有さず、そしてボツリヌス毒素に対する保護免疫性を誘導し得るボツリヌス毒素またはそのフラグメント、と（ii）アフィニティークロマトグラフィーカラムに結合するように適合された精製部分との融合である、工程、
（b）上記の宿主細胞から、融合タンパク質を含む抽出物を得る工程、
（c）アフィニティークロマトグラフィーカラムを用いて融合タンパク質を精製する工程、および
（d）精製された融合タンパク質を薬学的組成物に組み込む工程
を包含する方法を提供する。
典型的に50〜500のアミノ酸を含む精製部分は、水溶性であり、アフィニティークロマトグラフィーカラムに結合する。
本発明者らは、精製部分を保持する融合タンパク質は、Ｆ型ボツリヌス毒素に対するワクチンの製造において有利であることを発見した。ワクチン活性は融合タンパク質中に見い出されるので、精製タンパク質はワクチン製造の前に除去される必要はなく、従って製造プロセスが簡略化される。精製タンパク質が、アフィニティークロマトグラフィーカラムを用いて結合しかつ精製し得る球状の水溶性タンパク質であることが好ましい。精製タンパク質が高度に免疫原性であることがさらに好ましい。従って、特に好ましい融合タンパク質は、毒素活性を有さないボツリヌス毒素のフラグメント、免疫原性領域、およびアフィニティークロマトグラフィーカラムに結合するように適合された精製領域を含む。
用語、免疫原性領域は、ヒトまたは他の動物の免疫系の刺激を誘導することが既知であるタンパク質中のアミノ酸の配列を記載するために上記で用いられる。このような免疫原性領域の例は、キーホールリムペットヘモシアニンを含む。
本発明のさらなる局面は、融合タンパク質を含む薬剤、本発明のワクチンおよび組成物を用いる哺乳動物のワクチン接種の方法、および本発明のポリペプチド、ワクチンおよび組成物に対して惹起される抗血清を提供する。
ここで以下に本発明の特定の実施態様を記載し、これは以下の図面により図示される。
図１：BoNT毒素の３つの主要なドメインを示す。数字は、C. botulinum Langeland株のBoNT/F中のこれらの３つのドメインに隣接するアミノ酸の位置を示す；
図２：合成遺伝子ブロックがPCRによりアセンブリされる方法の概略図を表す；
図３：作成された組換えプラスミド（pFHC206）の例を示し、ここで図５中の合成DNAフラグメントは発現プラスミドpMal-C2中に挿入されている；
図４：MBP-BoNT/F848-1278組換えタンパク質で免疫したマウスで得たBoNT/Fに対する抗体力価を示す。
配列番号５は、HCフラグメントをコードするClostridium botulinum Ｆ型Langeland株由来のBoNT/F遺伝子領域のヌクレオチド配列を示す。
配列番号６は、BoNT/F HCフラグメントをコードする合成DNA配列を示し、これは、E. coliの高度に発現する遺伝子で最も頻繁に使用されるコドンを用いる。BoNT/F Ser848に対応するコドンは、ヌクレオチド12位から始まる。これは、NH2末端メチオニンコドンを特定するコドンならびにNdeIおよびBamHIの制限部位によってプロセシングされる。Asn1278のコドンはヌクレオチド1302位で開始し、そして翻訳終結コドン（nt 1305〜1308）およびXbaIの制限部位が続く。
実施例
高度に発現されたE. coli遺伝子により利用されるコドンを用いるBoNT/FのH C をコードする合成DNAフラグメントの作製
BoNT/F848-1278をコードする合成配列は、DNASTAR Inc（Madison, USA）のREVTRANSプログラムを用いるBoNT/Fアミノ酸配列の逆翻訳により設計された。使用したコドンコードは、「強度発現E. coli逆翻訳コード」（SECOLI.RTC）であった。次いで、構築を容易にするため、多くの変更を行って、BamHIおよびNdeIの唯一の隣接近位部位、XbaIの遠位隣接部位、およびHpaI、MluI、およびSplIの内部部位を含むフラグメントの長さに沿って戦略ポイントにおいて制限酵素認識部位を導入した。次いで、本質的にその他の文献（Sandhuら（1992）Biotechniques 12:14-16）に記載されている様な手順により、100merのオリゴヌクレオチドをオーバーラップさせることによりこの遺伝子を構築した。
簡潔に言うと、この遺伝子は４つの異なるブロック（Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤ）として構築され、それぞれのサイズは約350bpである。各ブロックは、４つの100merの改変オリゴヌクレオチドからアセンブリされており、これらは互いに20のヌクレオチドでオーバーラップしている。これら４つのオリゴヌクレオチドをPCRにおいて用いて、複合c.350 bpの2本鎖DNAフラグメントを作製した。このフラグメントを続いて20merの隣接プライマーを用いて増幅した。次いで、各ブロックの増幅フラグメントをプラスミドpCRII（Invitrogen Corp.）中に直接クローン化した。４ブロック全ての隣接プライマーは、それらを続いて隣接フラグメント中へのアセンブリができるような制限酵素部位を含むように設計した。従って、ブロックＡはBamHI（5'）とHpaI（3'）で、ブロックＢはHpaI（5'）とMluI（3'）で、ブロックＣはMluI（5'）とSplI（3'）で、ブロックＤはSplL（5'）とXbaI（3'）で隣接した。従って、各ブロックは適切な酵素での切断によりそれらのそれぞれのpCRII由来組換えプラスミドから放出され、そして単離したフラグメントを、BamHIおよびXbaIを用いて切断したpMTL23（Chambersら（1988年）、Gene 68:139-149）プラスミドDNAに連結した。次いで、４つのブロック全てが予測される順序で挿入されているクローンを選択した。これは、ルーチンの方法（Manlatisら（1989年）、Molecular Cloning a Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press）を用いるヌクレオチド配列決定により確認し、そして設計したpFHC23と称するプラスミドを得た。
C. botulinum Langeland株のBoNT/FのH C プチド（848〜1278）の作製
C. botulinumのBoNT/Fに対するワクチン候補物は、HCフラグメント、アミノ酸848-1278をコードする合成遺伝子のフラグメントを発現することにより産生した。このDNAフラグメントを、約1.3 kb BamHI-XhoI制限フラグメントとしてプラスミドpFHC23から単離し、そしてpUC9（VieiraおよびMessing（1982）、Gene 19:259-268）の唯一のBamHIとSalIとの間に挿入し、プラスミドpFHC29を作製した。次いでこのインサートをEcoRI-XbaIフラグメントとしてpFHC29から再単離し、そして市販の発現ベクターpMal-c2（New England Biolabs）の同等の部位の間に挿入し、最終プラスミドpFHC206を得た。得られたプラスミドは、マルトース結合タンパク質（MBP）をコードするベクターを有する融合タンパク質としてBoNT/F848-1278を発現した。
融合タンパク質産物（MBP-BoNT/F848-1278）は、pFHC206を含む細胞株から以下の様式により調製した。pFHC206を含むE. coliを１リットルの培地（0.8Mソルビトール、0.6％カザミノ酸、50μg/mLアンピシリンを補充したM9）中で、37℃で振騰しながら（200rpm）、OD600が1.0に達するまで培養した。この時点で、IPTGを最終濃度1mMで添加し、そして27℃でさらに４時間振騰を続けた。遠心分離（5000×ｇ）により細胞を採取し、溶解緩衝液（Protein Fusion and Purification System, New England Biolabs）20mL中で再懸濁し、そして超音波により細胞を破砕した。180mLのSephacel S100含有GPCカラムに溶解物をアプライし、排出画分中のタンパク質を回収した。次いで、この画分中のMBP-BoNT/F H848-1278融合タンパク質を穏やかに振騰しながら（10rpm）３時間にわたってAmylose樹脂（New England Laboratories）４〜６mL容量で室温で吸着させた。次いで、組換え融合タンパク質を、5mMマルトース含有緩衝液（0.01M Tris HCl、pH7.0）中に溶出した。溶出したタンパク質をAmicon PM30メンブレンフィルターを用いて濃縮した。
ワクチン候補物の毒性
ワクチン融合ペプチド候補物の毒性を、４匹のマウスの群への総組換えMBP-BoNT/F848-1278タンパク質の25μg量の腹腔内接種により測定した。このワクチン候補物は耐性に優れ、マウスは接種後２週間まで急性または慢性の毒性の兆候を示さなかった。
ワクチン候補物に対する抗体応答
ワクチン候補物を、４匹のマウスの群に完全なフロイントアジュバント中で腹腔内接種により投与し、そしてその後さらに３回２週間間隔で追加（booster）接種を行った。精製したC. botulinum Langeland株のBoNT/Fに対する抗体応答を、ELISAによりモニターした（図４）。
毒素チャレンジに対する防御
MBP-BoNT/F848-1278融合タンパク質で免疫した動物を、種々の用量の精製したC. botulinum Langeland株のBoNT/Fで腹腔内チャレンジに供した。12 LD50以上の用量で、コントロールの非免疫マウスは全て24時間以内に死亡した。免疫群のマウスは全て、2.4×104 LD50までのチャレンジでは生存していた。初回の1.8 LD50のチャレンジで生存していた免疫したマウスの内の１匹は、その後のさらなる106 LD50のチャレンジに対して免疫性を示した。
本発明は、C. botulinum Langeland株から単離したBoNT/Fのフラグメント（アミノ酸848-1278など）のワクチンとしての使用を提供する。このフラグメントは、その免疫原性特性を保持するが、MBPとなお融合しており、さらなる精製工程は不要である。この組換え融合タンパク質は、25μgまでの用量でマウスに毒性がないことが明らかである。反復用量により、BoNT/Fチャレンジに対して動物を防御する有意な抗体応答が産生された。ワクチンとして、これは、ホルムアルデヒド処理によりトキソイド化される神経毒素を上回るいくつかの利点を提供する。最も注目されるのは、それがより簡単に、および活性な毒素非存在のためにより低レベルの汚染物質で調製され得ることである。他の汚染C. botulinumタンパク質の非存在、および部分的にトキソイド化された物質はまた、これをワクチン適用のために本質的に、より安全にし、そして反応原性（reactogenic）をより小さくする。
配列表
(1)一般的情報：
(i)出願人：
(A)名称：マイクロバイオロジカル リサーチ オーソリティ
(B)番地：ポートン ダウン，センター フォア アプライド マイクロバイオロジー アンド リサーチ
(C)市：サリスバリー
(D)州：ウィルトシャー
(E)国：イギリス国
(F)郵便番号：SP4 0JG
(A)名称：ニゲル ピーター ミントン
(B)番地：モバーリー ロード 27
(C)市：サリスバリー
(D)州：ウィルトシャー
(E)国：イギリス国
(F)郵便番号：SP1 3BZ
(A)名称：マイケル ジェイムズ エルモア
(B)番地：イーストロップ レーン，セイント メアリーズ コート ８
(C)市：ベイジングストーク
(D)州：ハンツ
(E)国：イギリス国
(F)郵便番号：RG21 4AT
(A)名称：マーガレット ランブル マウチライン
(B)番地：セムリー，ベイカーズ ヒル，スリー ドーマーズ
(C)市：シャフテスバリー
(D)州：ドーセット
(E)国：イギリス国
(F)郵便番号：SP7 9BQ
(A)名称：ブラディミール アーティモビッチ パセチニック
(B)番地：カッパー ビーチ クローズ １
(C)市：シリュートン
(D)州：ウィルトシャー
(E)国：イギリス国
(F)郵便番号：SP4 4HU
(ii)発明の名称：Ｆ型ボツリヌス毒素およびその用途
(iii)配列数：６
(iv)コンピューター読み出し形態：
(A)媒体型：フロッピー ディスク
(B)コンピューター：IBM PC 互換用
(C)OS：PC-DOS/MS-DOS
(D)ソフトウェア：パテントイン リリース ナンバー1.0，バージョン ナンバー1.30（EPO）
(2)配列番号１の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：４３１アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ペプチド
(xi)配列：配列番号１：
(2)配列番号２の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：１４４アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ペプチド
(xi)配列：配列番号２：
(2)配列番号３の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：１４４アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ペプチド
(xi)配列：配列番号３：
(2)配列番号４の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：１４３アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ペプチド
(xi)配列：配列番号４：
(2)配列番号５の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：１２９３塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：二本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：DNA(genomic)
(xi)配列：配列番号５：
(2)配列番号６の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：１３１３塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：二本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：DNA(genomic)
(xi)配列：配列番号６：
ボツリヌス神経毒素（BoNTs）は、脊椎動物において強力な神経麻痺効果を発揮する高分子量タンパク質（約150,000 Da）である。それらは、Clostridium属に属する嫌気性グラム陽性細菌により合成される。BoNTを産生するクロストリジウムの大部分がClostridium Botulinumとして分類される。しかし、最近、Clostridium baratiおよびClostridium butyricumに類似する単離体がBoNTを産生することが示された。抗原性を基準として、BoNTはA〜Gと称される7つの異なるタイプに細分された。7つの全ての神経毒素（BoNT/A〜BoNT/G）は一本鎖150,000 Da分子として合成され、続いて切断されて少なくとも一つのジスルフィド架橋により結合される重（H）鎖（約100,000 Da）および軽（L）鎖（約50,000 Da）からなる、より強力な二本鎖形態になる。
BoNTの作用は3つの異なる相を含む。第1の相において、毒素は、標的化神経細胞の外表面上のアクセプターに結合する。続いて、エネルギー依存性内在化工程により毒素またはその一部が細胞に入る。その後、毒素の活性部分が、神経抹消において神経伝達物質であるアセチルコリンの細胞内放出をブロックして弛緩性麻痺を引き起こすことにより神経細胞機能不全を引き起こす。Ｌ鎖は、細胞被毒の原因となる触媒活性を有し、そしてH鎖は、毒素の細胞への結合およびその後の内在化を媒介することにより、この部分を細胞質に送達する。
7つ全てのBoNTの全アミノ酸配列は、その主要なアミノ酸配列における驚くべき分岐が示されていることが既知である。（Minton,N.P.（1995）、Current Topics in Microbiology and Immunology、第195巻：161〜187頁）。すなわち、異なる血清型中の配列同一性は通常40％を超えず、相同の領域は、全類似性をほとんど示さないアミノ酸領域が挿入された別々のドメインに局在化されている。異なるL鎖（平均サイズ439）の間において、63のアミノ酸が完全に保存される。H鎖（平均サイズ843）を通じて、97アミノ酸が同一である。最も顕著な保存領域は、L鎖とH鎖との間のジスルフィド結合形成に関与する二つのシステイン残基；メタロプロテアーゼ活性に関与するL鎖内のヒスチジンリッチモチーフ；および膜架橋潜在性を有するとして同定された領域に隣接して見い出される高度に保存されたPYI/VXALNモチーフを含む。毒素中の配列分岐の最も顕著な領域は、それぞれのH鎖のCOOH末端に局在化されている（BoNT/Aの上流のアミノ酸1124）。これは、このドメインが神経毒素結合に関与し、そして異なる毒素が神経細胞表面上の異なるアクセプターを標的にするという概念に一致するようである。
西洋諸国における近年の食品保存プロセスの有効性は、ボツリスムの発生を極めてまれにした。しかし、食品産業における試験生物としてのC.ｂotulinumの頻繁な使用、および神経生化学者によるこの毒素の使用の増加は、ヒトワクチンに対する必要性を増加させた。これらのワクチンの処方は1950年代初期から殆ど変化しておらず：神経毒素の部分的精製製剤がホルムアルデヒド処理によりトキソイド化され、そして沈殿したアルミニウム塩に吸収される。このような方法論を用いて、ヒト免疫化のための多価ワクチン（ABCDEまたはABEFに対する）が現在入手可能である。このようなワクチンは、低免疫応答、およびトキソイド製剤中の高い割合（60〜90％）の汚染タンパク質によるバッチ間のかなりの変不利益を被る。従って、最近の研究は、毒素をほぼ均質に精製するための手順の開発に集中している。しかし、ワクチンの製造における精製毒素の使用は、第1に、それらを高含量下に製造しなくてはならないこと、第2に、毒素から活性状態への逆転の可能性を防止するために低レベルのホルムアルデヒドの存在を必要とすることという不利益を被る。
他の生物および毒素に対するサブユニットワクチンの産生が、多くの実験機関により研究されている。この作業は、最も既知の毒素サブタイプ、すなわちAおよびBを焦点として、Ａ型またはＢ型の毒素に対する特異的な免疫性を生じる新規のワクチンが得られた。しかし新規のワクチンは、他の毒素サブタイプに対する保護を提供し得ない。
ワクチン成分の組み換え製造は、ワクチンの純度および製造量を大きく進展させた。A.J.Makoffら、Bio／Technilogy、第7巻、1989年10月、l043〜1046頁に、E.coli中での破傷風毒素フラグメントの発現、ならびにその精製およびワクチンとしての潜在的な用途が記載されている。それにもかかわらず、その記載されている技術は、宿主細胞から精製されたワクチン成分を回収するために数多くの工程を必要とする。
本発明の一つの目的は、Ｆ型ボツリヌス毒素に対するワクチンを製造することである。別の目的は、ワクチンの製造を簡単にすることである。さらなる目的は、ボツリヌス毒素ワクチンの産物を改良することである。本発明のなおさらなる目的は、存在するワクチンおよび製造法における問題および／または制限を克服するまたは少なくとも緩和することである。
本発明の第1の局面によれば、Ｆ型ボツリヌス毒素への保護免疫性を誘導するボツリヌス毒素活性を含まないポリペプチドが提供される。このポリペプチドは、Ｆ型毒素に対するワクチンの製造に有用であり、多価ワクチンのような従来技術の組成物と対照的に、トキソイドではなく、ホルムアルデヒドでの予備処理を必要としない。従来技術の組成物と対照的に、このポリペプチドはまた、通常は、毒素そのものより小さいサイズである。
本発明の第1の局面の実施態様は、
（a）ボツリヌス毒素活性を有さないこと、および
（b）哺乳動物において、Ｆ型ボツリヌス毒素に対して保護的である免疫学的応答を誘発し得ること
を特徴とするポリペプチドを提供する。
「免疫性」および「免疫学的応答」と共に用いられる用語「保護的」は、活性なボツリヌス毒素Ｆによるチャレンジから生き延びるための増加した能力を示すために用いられる。この増加は、代表的には、毒素によるチャレンジの際の毒素に対する抗体の増加した力価または毒素に対する抗体を産生する増大した能力により媒介される。この用語は、任意の量の毒素に対する絶対的な保護を示すことを意図しない。
従って、本発明は、Ｆ型ボツリヌス毒素に対する、従来利用できなかった特異的な保護を提供する。
特定の実施態様において、本発明は、アミノ酸848〜1278（配列番号1）由来のC.botulinum株Langeland BoNT/Fのアミノ酸配列を含むが、メタロプロテアーゼ活性および毒素内在化（それぞれアミノ酸1〜439および440〜847の間において見い出される）に必要なL鎖およびHNエピトープのアミノ酸配列を欠失しているペプチドまたはペプチド結合体；ヒトまたは他の動物に投与した場合にBoNT/Fに対して保護的である免疫応答を誘導し得るペプチドを提供する。
より特定の実施態様において、本発明のペプチドは、Clostridium botulinum株LangelandのBoNT/Fのアミノ酸配列の848〜1278（配列番号１）由来のアミノ酸の配列のみから実質的に成るか、またはBoNT/Fのアミノ酸1〜847ではない別のアミノ酸配列との融合ペプチドの形態の配列から成る。用語「別のアミノ酸配列」は、完全なタンパク質ならびに使用者の要求に適切な比較的短いアミノ酸配列を含むことが当業者により理解される。必要に応じて、他のアミノ酸配列は、他の免疫性または標識化を提供する目的のために、または宿主細胞中のポリペプチドの発現を改変するために、上記の配列に融合して含まれる非C.botulinumである抗原性タンパク質である。
本発明の別の実施態様において、ポリペプチドは、ボツリヌス毒素活性を有さずそしてＦ型毒素に対する保護免疫性を誘導し得るＦ型ボツリヌス神経毒素のフラグメントまたは誘導体を含む。このフラグメントは、トキソイドを有さず、ホルムアルデヒドを含まず、そして700アミノ酸より少なく、好ましくは500アミノ酸より少ない長さを有する。
本発明のさらなる特別な実施態様において、フラグメントは、
（a）Ｆ型ボツリヌス毒素のアミノ酸848〜1278（配列番号1）、
（b）Ｆ型ボツリヌス毒素のアミノ酸848〜991（配列番号2）、
（c）Ｆ型ボツリヌス毒素のアミノ酸992〜l135（配列番号3）、および
（d）Ｆ型ボツリヌス毒素のアミノ酸1136〜1278（配列番号4）
から選択される。
本発明はまた、繰り返し部分において共に結合しているＦ型ボツリヌス毒素の複数のフラグメントを含む合成ポリペプチドである、毒素誘導体にも関する。この誘導体は、上記のフラグメントの二量体を含み得る。
本発明の第1の局面はまた、ボツリヌス毒素活性を有さず、そしてボツリヌス毒素に対して保護免疫性を誘導し得、それらのプロセシングを容易にするために適合される組成物である、ポリペプチド組成物を提供する。このことは、結果として得られるワクチンにおいて望ましくない任意の成分の混合物からポリペプチドを分離しなくてはならないので、ワクチンの製造において有利である。このような適合した組成物は、
（1）ボツリヌス毒素活性を有さずそしてボツリヌス毒素に対して保護免疫性を誘導し得ないポリペプチド；および
（2）組成物の精製のために適合されたポリペプチド
を含む。
例えば、成分（2）は、水溶液からの組成物の精製を容易にするために適合され、そして必要に応じて抗体、抗体の結合領域、イオン交換カラムに結合するように適合されたポリペプチド、アフィニティークロマトグラフィーカラムに結合するように適合されたポリペプチドまたは精製リガンドを含む。
この組成物は、好ましくは、例えば融合ポリペプチドの形態で、成分（1）および（2）を含む単一のポリペプチドを含むか、またはそれから成る。
組成物の使用において、組成物を発現する溶解された細胞由来の上清のような混合物からの組成物の抽出は、迅速で簡単なプロセスにされる。組成物において、成分（1）のワクチン接種特性が実質的に保持される、すなわち組成物の精製後にさらなる改変の必要なくして、特に成分（2）を除去する必要なくして、組成物がワクチン中で用いられることは特に有利である。組成物の成分（1）の候補として、本発明の第1の局面により先に記載された全てのポリペプチドが適切である。さらに、毒素活性を有さない、破傷風毒素のフラグメントが適切である。
従って、本発明の特別な実施態様によるポリペプチドは、
（a）Ｆ型ボツリヌス神経毒素のアミノ酸848〜1278（配列番号1）と
（b）精製部分
との融合タンパク質を含む。
アフィニティークロマトグラフィーカラムに結合するように精製部分が適合されることが好ましい。代表的な精製部分は、50〜500のアミノ酸を含む。特定の実施態様において、融合タンパク質は、精製部分としてマルトース結合タンパク質を含む。この融合タンパク質は、アフィニティークロマトグラフィーカラムを用いる精製に特に適切であり、以下に記載するように有用なワクチン接種特性を有することがわかった。
第2の局面によれば、本発明は、本発明の第1の局面のポリペプチドおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む、ボツリヌス毒素に対するワクチンを提供する。
適切なキャリアは、ワクチンの調製における当業者に公知である。本明細書中以下に記載される実施態様において、キャリアは、フロイントアジュバントを含む。別の適切なキャリア成分は沈殿したミョウバン塩である。
本発明の第3の局面において、本発明のポリペプチドをコードする組み換えDNAが提供される。このような組み換えDNAは、従来、二本鎖配列の各末端で標的化されているプライマーを用いて、所望の配列、例えばBoNT/F848〜1278をコードするDNAのPCR増幅により提供される。必要に応じて、PCRで用いられるテンプレート配列は、天然のクロストリジウムの遺伝子を表わす。しかし、本発明の好ましい実施態様において、使用される配列は、天然クロストリジウムタンパク質と同じアミノ酸をコードするが、コドンの用法が変化している合成配列である。合成遺伝子は少なくとも40％のGC含量、好ましくは少なくとも45％、そして最も好ましくは少なくとも50％を有することが好ましい。
このような合成配列の場合、本発明の一つの実施態様において、その構築中に、DNAフラグメントの先端に位置する組み込まれた適切な制限エンドヌクレアーゼ認識部位の使用を通して、選択された発現プラスミドへの挿入が達成される。
どのような手段によっても、BoNT/Fペプチドをコードする組み換えDNAが生成され、それが適切な発現ベクター中に連結し、所望であればこの段階で、配列をコードする所望の融合ペプチドへの遺伝子融合が生じ、そして得られるベクターが、適切な細胞株、例えば、E.coliまたはPichia pastorisのような酵母に導入される。所望の産物を産生する細胞株は、確立された手順、例えばウエスタンブロッティングまたはELISAを通して選択される。
本発明の第４および第５の局面は、それぞれ、第３の局面のDNAを組み込むプラスミドベクター、およびそのプラスミドを含み、そしてDNAを発現する細胞株を提供する。
本発明はまた、活性なワクチン接種剤の精製が、精製のために適合されたポリペプチド配列と組み合わされてその発現により容易化される、毒素ワクチンの製造のための方法を提供する。従って、本発明の第6の局面は毒素ワクチンの製造のための方法を提供する。このワクチンは毒素活性を有さずそして毒素に対する保護免疫性を誘導し得るワクチン接種ポリペプチドを含み、ここでこの方法は、融合タンパク質、上記のワクチン接種ポリペプチドを含む上記の融合タンパク質および精製部分をコードするDNA配列を宿主細胞中で発現する工程、この融合タンパク質を含む宿主細胞から抽出物を得る工程、およびそこから融合タンパク質を精製する工程を包含する。
本発明の第6の局面の好ましい実施態様において、本発明の第1の局面のポリペプチドを含むワクチンを製造する方法であって、以下の工程：
（a）融合タンパク質をコードするDNAを宿主細胞中で発現する工程であって、このタンパク質が（i）ボツリヌス毒素のフラグメントであって、このフラグメントは毒素活性を有さずそしてボツリヌス毒素に対する保護免疫性を誘導し得るボツリヌス毒素のフラグメント、および（ii）アフィニティークロマトグラフィーカラムに結合するように適合された精製部分との融合である、工程、
（b）上記の宿主細胞から、融合タンパク質を含む抽出物を得る工程、および
（c）アフィニティークロマトグラフィーカラムを用いて融合タンパク質を精製する工程
を含む方法が提供される。
本発明の実施態様の使用において、融合タンパク質が、基質を用いる溶出によりカラムから除去される。この方法は、必要に応じて、融合タンパク質を解裂する工程、および毒素フラグメントを保持する工程を包含する。この方法は、特異的にＦ型毒素を用いるが、全ての他のボツリヌス毒素および破傷風毒素に対してもまた適用される。
この方法により、本発明は、他のクロストリジウムタンパク質による汚染を含まないボツリヌス毒素Ｆ型フラグメントの調製を可能にする。これらは、Clostridium細菌の培養物由来の従来技術の製剤をしばしば汚染するものである。
得られる融合タンパク質または毒素フラグメントは、代表的には、実質的に純粋な形態であり、そしていくつかの簡単な工程においてワクチンまたは他の薬学的組成物中に組み込むのに適切である。
BoNT/F由来ペプチドを含む特定の融合タンパク質の作成が、BoNT/Fの最初の単離において有用であり、それに続く切断は必要に応じてBoNT/F関連ペプチドを精製するために用いられることに注目すべきである。翻訳の補助のためにBoNT/FをコードするDNAの５'末端にコドンが付加される場合、これらのアミノ酸は、必要に応じて、例えば、ペプチドの分泌またはより簡潔には翻訳を開始するためのNH2末端メチオニンの付加をもたらすために用いられるような、最終的なペプチドのNH2末端にて保持される。
本発明の第7の局面は、薬学的組成物を作製する方法であって、以下：
（a）融合タンパク質をコードするDNAを宿主細胞中で発現する工程であって、上記のタンパク質が（i）毒素活性を有さず、そしてボツリヌス毒素に対する保護免疫性を誘導し得るボツリヌス毒素またはそのフラグメント、と（ii）アフィニティークロマトグラフィーカラムに結合するように適合された精製部分との融合である、工程、
（b）上記の宿主細胞から、融合タンパク質を含む抽出物を得る工程、
（c）アフィニティークロマトグラフィーカラムを用いて融合タンパク質を精製する工程、および
（d）精製された融合タンパク質を薬学的組成物に組み込む工程
を包含する方法を提供する。
典型的に50〜500のアミノ酸を含む精製部分は、水溶性であり、アフィニティークロマトグラフィーカラムに結合する。
本発明者らは、精製部分を保持する融合タンパク質は、Ｆ型ボツリヌス毒素に対するワクチンの製造において有利であることを発見した。ワクチン活性は融合タンパク質中に見い出されるので、精製タンパク質はワクチン製造の前に除去される必要はなく、従って製造プロセスが簡略化される。精製タンパク質が、アフィニティークロマトグラフィーカラムを用いて結合しかつ精製し得る球状の水溶性タンパク質であることが好ましい。精製タンパク質が高度に免疫原性であることがさらに好ましい。従って、特に好ましい融合タンパク質は、毒素活性を有さないボツリヌス毒素のフラグメント、免疫原性領域、およびアフィニティークロマトグラフィーカラムに結合するように適合された精製領域を含む。
用語、免疫原性領域は、ヒトまたは他の動物の免疫系の刺激を誘導することが既知であるタンパク質中のアミノ酸の配列を記載するために上記で用いられる。このような免疫原性領域の例は、キーホールリムペットヘモシアニンを含む。
本発明のさらなる局面は、融合タンパク質を含む薬剤、本発明のワクチンおよび組成物を用いる哺乳動物のワクチン接種の方法、および本発明のポリペプチド、ワクチンおよび組成物に対して惹起される抗血清を提供する。
ここで以下に本発明の特定の実施態様を記載し、これは以下の図面により図示される。
図１：BoNT毒素の３つの主要なドメインを示す。数字は、C. botulinum Langeland株のBoNT/F中のこれらの３つのドメインに隣接するアミノ酸の位置を示す；
図２：合成遺伝子ブロックがPCRによりアセンブリされる方法の概略図を表す；
図３：作成された組換えプラスミド（pFHC206）の例を示し、ここで図５中の合成DNAフラグメントは発現プラスミドpMal-C2中に挿入されている；
図４：MBP-BoNT/F848-1278組換えタンパク質で免疫したマウスで得たBoNT/Fに対する抗体力価を示す。
配列番号５は、HCフラグメントをコードするClostridium botulinum Ｆ型Langeland株由来のBoNT/F遺伝子領域のヌクレオチド配列を示す。
配列番号６は、BoNT/F HCフラグメントをコードする合成DNA配列を示し、これは、E. coliの高度に発現する遺伝子で最も頻繁に使用されるコドンを用いる。BoNT/F Ser848に対応するコドンは、ヌクレオチド12位から始まる。これは、NH2末端メチオニンコドンを特定するコドンならびにNdeIおよびBamHIの制限部位によってプロセシングされる。Asn1278のコドンはヌクレオチド1302位で開始し、そして翻訳終結コドン（nt 1305〜1308）およびXbaIの制限部位が続く。
実施例
高度に発現されたE. coli遺伝子により利用されるコドンを用いるBoNT/FのH C をコードする合成DNAフラグメントの作製
BoNT/F848-1278をコードする合成配列は、DNASTAR Inc（Madison, USA）のREVTRANSプログラムを用いるBoNT/Fアミノ酸配列の逆翻訳により設計された。使用したコドンコードは、「強度発現E. coli逆翻訳コード」（SECOLI.RTC）であった。次いで、構築を容易にするため、多くの変更を行って、BamHIおよびNdeIの唯一の隣接近位部位、XbaIの遠位隣接部位、およびHpaI、MluI、およびSplIの内部部位を含むフラグメントの長さに沿って戦略ポイントにおいて制限酵素認識部位を導入した。次いで、本質的にその他の文献（Sandhuら（1992）Biotechniques 12:14-16）に記載されている様な手順により、100merのオリゴヌクレオチドをオーバーラップさせることによりこの遺伝子を構築した。
簡潔に言うと、この遺伝子は４つの異なるブロック（Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤ）として構築され、それぞれのサイズは約350bpである。各ブロックは、４つの100merの改変オリゴヌクレオチドからアセンブリされており、これらは互いに20のヌクレオチドでオーバーラップしている。これら４つのオリゴヌクレオチドをPCRにおいて用いて、複合c.350 bpの2本鎖DNAフラグメントを作製した。このフラグメントを続いて20merの隣接プライマーを用いて増幅した。次いで、各ブロックの増幅フラグメントをプラスミドpCRII（Invitrogen Corp.）中に直接クローン化した。４ブロック全ての隣接プライマーは、それらを続いて隣接フラグメント中へのアセンブリができるような制限酵素部位を含むように設計した。従って、ブロックＡはBamHI（5'）とHpaI（3'）で、ブロックＢはHpaI（5'）とMluI（3'）で、ブロックＣはMluI（5'）とSplI（3'）で、ブロックＤはSplL（5'）とXbaI（3'）で隣接した。従って、各ブロックは適切な酵素での切断によりそれらのそれぞれのpCRII由来組換えプラスミドから放出され、そして単離したフラグメントを、BamHIおよびXbaIを用いて切断したpMTL23（Chambersら（1988年）、Gene 68:139-149）プラスミドDNAに連結した。次いで、４つのブロック全てが予測される順序で挿入されているクローンを選択した。これは、ルーチンの方法（Manlatisら（1989年）、Molecular Cloning a Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press）を用いるヌクレオチド配列決定により確認し、そして設計したpFHC23と称するプラスミドを得た。
C. botulinum Langeland株のBoNT/FのH C プチド（848〜1278）の作製
C. botulinumのBoNT/Fに対するワクチン候補物は、HCフラグメント、アミノ酸848-1278をコードする合成遺伝子のフラグメントを発現することにより産生した。このDNAフラグメントを、約1.3 kb BamHI-XhoI制限フラグメントとしてプラスミドpFHC23から単離し、そしてpUC9（VieiraおよびMessing（1982）、Gene 19:259-268）の唯一のBamHIとSalIとの間に挿入し、プラスミドpFHC29を作製した。次いでこのインサートをEcoRI-XbaIフラグメントとしてpFHC29から再単離し、そして市販の発現ベクターpMal-c2（New England Biolabs）の同等の部位の間に挿入し、最終プラスミドpFHC206を得た。得られたプラスミドは、マルトース結合タンパク質（MBP）をコードするベクターを有する融合タンパク質としてBoNT/F848-1278を発現した。
融合タンパク質産物（MBP-BoNT/F848-1278）は、pFHC206を含む細胞株から以下の様式により調製した。pFHC206を含むE. coliを１リットルの培地（0.8Mソルビトール、0.6％カザミノ酸、50μg/mLアンピシリンを補充したM9）中で、37℃で振騰しながら（200rpm）、OD600が1.0に達するまで培養した。この時点で、IPTGを最終濃度1mMで添加し、そして27℃でさらに４時間振騰を続けた。遠心分離（5000×ｇ）により細胞を採取し、溶解緩衝液（Protein Fusion and Purification System, New England Biolabs）20mL中で再懸濁し、そして超音波により細胞を破砕した。180mLのSephacel S100含有GPCカラムに溶解物をアプライし、排出画分中のタンパク質を回収した。次いで、この画分中のMBP-BoNT/F H848-1278融合タンパク質を穏やかに振騰しながら（10rpm）３時間にわたってAmylose樹脂（New England Laboratories）４〜６mL容量で室温で吸着させた。次いで、組換え融合タンパク質を、5mMマルトース含有緩衝液（0.01M Tris HCl、pH7.0）中に溶出した。溶出したタンパク質をAmicon PM30メンブレンフィルターを用いて濃縮した。
ワクチン候補物の毒性
ワクチン融合ペプチド候補物の毒性を、４匹のマウスの群への総組換えMBP-BoNT/F848-1278タンパク質の25μg量の腹腔内接種により測定した。このワクチン候補物は耐性に優れ、マウスは接種後２週間まで急性または慢性の毒性の兆候を示さなかった。
ワクチン候補物に対する抗体応答
ワクチン候補物を、４匹のマウスの群に完全なフロイントアジュバント中で腹腔内接種により投与し、そしてその後さらに３回２週間間隔で追加（booster）接種を行った。精製したC. botulinum Langeland株のBoNT/Fに対する抗体応答を、ELISAによりモニターした（図４）。
毒素チャレンジに対する防御
MBP-BoNT/F848-1278融合タンパク質で免疫した動物を、種々の用量の精製したC. botulinum Langeland株のBoNT/Fで腹腔内チャレンジに供した。12 LD50以上の用量で、コントロールの非免疫マウスは全て24時間以内に死亡した。免疫群のマウスは全て、2.4×104 LD50までのチャレンジでは生存していた。初回の1.8 LD50のチャレンジで生存していた免疫したマウスの内の１匹は、その後のさらなる106 LD50のチャレンジに対して免疫性を示した。
配列表
(1)一般的情報：
(i)出願人：
(A)名称：マイクロバイオロジカル リサーチ オーソリティ
(B)番地：ポートン ダウン，センター フォア アプライド マイクロバイオロジー アンド リサーチ
(C)市：サリスバリー
(D)州：ウィルトシャー
(E)国：イギリス国
(F)郵便番号：SP4 0JG
(A)名称：ニゲル ピーター ミントン
(B)番地：モバーリー ロード 27
(C)市：サリスバリー
(D)州：ウィルトシャー
(E)国：イギリス国
(F)郵便番号：SP1 3BZ
(A)名称：マイケル ジェイムズ エルモア
(B)番地：イーストロップ レーン，セイント メアリーズ コート ８
(C)市：ベイジングストーク
(D)州：ハンツ
(E)国：イギリス国
(F)郵便番号：RG21 4AT
(A)名称：マーガレット ランブル マウチライン
(B)番地：セムリー，ベイカーズ ヒル，スリー ドーマーズ
(C)市：シャフテスバリー
(D)州：ドーセット
(E)国：イギリス国
(F)郵便番号：SP7 9BQ
(A)名称：ブラディミール アーティモビッチ パセチニック
(B)番地：カッパー ビーチ クローズ １
(C)市：シリュートン
(D)州：ウィルトシャー
(E)国：イギリス国
(F)郵便番号：SP4 4HU
(ii)発明の名称：Ｆ型ボツリヌス毒素およびその用途
(iii)配列数：６
(iv)コンピューター読み出し形態：
(A)媒体型：フロッピー ディスク
(B)コンピューター：IBM PC 互換用
(C)OS：PC-DOS/MS-DOS
(D)ソフトウェア：パテントイン リリース ナンバー1.0，バージョン ナンバー1.30（EPO）
(2)配列番号１の情報：
(i)配列の特色：
(A)長さ：４３１アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ペプチド
(xi)配列：配列番号１：
(i)配列の特色：
(A)長さ：１４４アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ペプチド
(xi)配列：配列番号２：
(i)配列の特色：
(A)長さ：１４４アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ペプチド
(xi)配列：配列番号３：
(i)配列の特色：
(A)長さ：１４３アミノ酸
(B)型：アミノ酸
(C)鎖の数：一本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：ペプチド
(xi)配列：配列番号４：
(i)配列の特色：
(A)長さ：１２９３塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：二本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：DNA(genomic)
(xi)配列：配列番号５：
(i)配列の特色：
(A)長さ：１３１３塩基対
(B)型：核酸
(C)鎖の数：二本鎖
(D)トポロジー：直鎖状
(ii)配列の種類：DNA(genomic)
(xi)配列：配列番号６：
Claims (19)
- ボツリヌス毒素活性を有さず、そしてトキソイドを有さないポリペプチドであって、Ｆ型ボツリヌス毒素への保護免疫性を誘導し、該ポリペプチドが、Ｆ型ボツリヌス神経毒素の重鎖のフラグメントまたは誘導体を含み、該フラグメントが：
（ａ）Ｆ型ボツリヌス毒素のアミノ酸８４８〜１２７８、
（ｂ）Ｆ型ボツリヌス毒素のアミノ酸８４８〜９９１、
（ｃ）Ｆ型ボツリヌス毒素のアミノ酸９９２〜１１３５、および
（ｄ）Ｆ型ボツリヌス毒素のアミノ酸１１３６〜１２７８から選択される、
ポリペプチド。 - ポリペプチドであって：
（ａ）ボツリヌス毒素活性を有さないこと、
（ｂ）トキソイドを有さないこと、および
（ｃ）哺乳動物において、Ｆ型ボツリヌス毒素に対して保護的である免疫学的応答を誘発し得、
該ポリペプチドが、Ｆ型ボツリヌス神経毒素の重鎖のフラグメントまたは誘導体を含み、該フラグメントが：
（ａ）Ｆ型ボツリヌス毒素のアミノ酸８４８〜１２７８、
（ｂ）Ｆ型ボツリヌス毒素のアミノ酸８４８〜９９１、
（ｃ）Ｆ型ボツリヌス毒素のアミノ酸９９２〜１１３５、および
（ｄ）Ｆ型ボツリヌス毒素のアミノ酸１１３６〜１２７８から選択される、
ことを特徴とする、ポリペプチド。 - 前記誘導体が、前記フラグメント（ａ）〜（ｄ）の任意の二量体を含む、請求項１または２に記載のポリペプチド。
- ワクチンの製造に用いるポリペプチド組成物であって：
（１）請求項１に記載のポリペプチド；および（２）該組成物の精製を容易にするかまたは向上させるために適合されたポリペプチドを含む、ポリペプチド組成物。 - 前記組成物が（１）と（２）との融合タンパク質を含む、請求項４に記載のポリペプチド組成物。
- 請求項４または５に記載のポリペプチド組成物であって：（１）請求項１〜３のいずれかに記載のポリペプチド；および（２）クロマトグラフィーカラムに結合するように適合されたポリペプチドを含む、ポリペプチド組成物。
- アフィニティークロマトグラフィーカラムに結合するように適合されたポリペプチドを含む、請求項４〜６のいずれかに記載のポリペプチド組成物。
- 請求項５に記載のポリペプチド組成物であって：（ａ）Ｆ型ボツリヌス神経毒素のアミノ酸８４８〜１２７８と（ｂ）精製部分との融合タンパク質を含む、ポリペプチド組成物。
- 薬学的に受容可能なキャリア、および請求項１〜３のいずれかに記載のポリペプチドまたは請求項４〜８のいずれかに記載のポリペプチド組成物を含む、ワクチン。
- 請求項１〜３のいずれかに記載のポリペプチドまたは請求項４〜８のいずれかに記載のポリペプチド組成物をコードする、組み換えＤＮＡ。
- 請求項１〜３のいずれかに記載のポリペプチドまたは請求項４〜８のいずれかに記載のポリペプチド組成物を製造する方法であって：（ａ）融合タンパク質をコードするＤＮＡを宿主細胞中で発現させる工程であって、該タンパク質が（ｉ）Ｆ型ボツリヌス毒素のフラグメントまたは誘導体と（ｉｉ）クロマトグラフィーカラムに結合するように適合された部分との融合物である、工程、（ｂ）該宿主細胞から、該融合タンパク質を含む抽出物を得る工程、および（ｃ）クロマトグラフィーカラムを用いて該融合タンパク質を精製する工程を包含する、方法。
- 前記クロマトグラフィーカラムがアフィニティークロマトグラフィーカラムであり、そして前記融合タンパク質が基質での溶離により該カラムから除去される、請求項１１に記載の方法。
- 前記融合タンパク質を解離する工程、および前記毒素フラグメントまたは誘導体を保持する工程をさらに含む、請求項１１または１２に記載の方法。
- 薬学的組成物の製造方法であって：
（ａ）融合タンパク質をコードするＤＮＡを宿主細胞中で発現する工程であって、該タンパク質は（ｉ）請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリペプチドと（ｉｉ）クロマトグラフィーカラムに結合するように適合された精製部分との融合物である、工程、（ｂ）該宿主細胞から該融合タンパク質を含む抽出物を得る工程、（ｃ）クロマトグラフィーカラムを用いて該融合タンパク質を精製する工程、および（ｄ）該精製された融合タンパク質を薬学的組成物に組み込む工程を包含する、方法。 - 前記精製部分がアフィニティークロマトグラフィーカラムに結合する、請求項１４に記載の方法。
- 薬学的組成物であって：（ａ）融合タンパク質であって、該タンパク質が（ｉ）請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリペプチドと（ｉｉ）クロマトグラフィーカラムに結合するように適合されたポリペプチドとの融合物である融合タンパク質であり、および（ｂ）薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
- 前記融合タンパク質が、アフィニティークロマトグラフィーカラムに結合するように適合されたポリペプチドを含む、請求項１６に記載の薬学的組成物。
- 請求項９に記載のワクチンを含む、ボツリヌス毒素に対して哺乳動物をワクチン接種するためのワクチン。
- 請求項１６〜１７のいずれかに記載の薬学的組成物を含む、ボツリヌス毒素に対して哺乳動物をワクチン接種するためのワクチン。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GBGB9511909.5A GB9511909D0 (en) | 1995-06-12 | 1995-06-12 | Vaccine |
| GB9511909.5 | 1995-06-12 | ||
| PCT/GB1996/001409 WO1996041881A1 (en) | 1995-06-12 | 1996-06-12 | Type f botulinum toxin and use thereof |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11507827A JPH11507827A (ja) | 1999-07-13 |
| JP4005633B2 true JP4005633B2 (ja) | 2007-11-07 |
Family
ID=10775930
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP50279897A Expired - Fee Related JP4005633B2 (ja) | 1995-06-12 | 1996-06-12 | Ｆ型ボツリヌス毒素およびその用途 |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7041792B2 (ja) |
| EP (1) | EP0833919B1 (ja) |
| JP (1) | JP4005633B2 (ja) |
| AT (1) | ATE276366T1 (ja) |
| AU (1) | AU705944B2 (ja) |
| CA (1) | CA2224444C (ja) |
| DE (1) | DE69633389T2 (ja) |
| DK (1) | DK0833919T3 (ja) |
| ES (1) | ES2224171T3 (ja) |
| GB (1) | GB9511909D0 (ja) |
| PT (1) | PT833919E (ja) |
| WO (1) | WO1996041881A1 (ja) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7214787B1 (en) * | 1993-09-21 | 2007-05-08 | United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army | Recombinant vaccine against botulinum neurotoxin |
| DE19735105A1 (de) * | 1997-08-13 | 1999-03-04 | Univ Albert Ludwigs Freiburg | Transportsystem zur Einbringung von Proteinen in Zielzellen mit Hilfe eines Fusionsproteins, Nucleinsäurekonstrukte kodierend für die Komponenten des Transportsystems und Arzneimittel, die Komponenten des Transportsystems umfassen |
| WO2000005252A1 (en) * | 1998-07-22 | 2000-02-03 | Agricultural Research Council | Vaccine comprising a non-toxic immunogenic derivative of clostridium botulinum type d neurotoxin |
| JP2004512004A (ja) * | 1999-05-12 | 2004-04-22 | ユナイテッド ステイツ アーミー メディカル リサーチ アンド マテリエル シーエムディー | ボツリヌス神経毒に対する組換えワクチン |
| US20060073208A1 (en) * | 2004-10-01 | 2006-04-06 | Allergan, Inc. | Cosmetic neurotoxin compositions and methods |
| GB0525213D0 (en) * | 2005-12-12 | 2006-01-18 | Secr Defence | Vaccine |
| EP2672958A1 (en) | 2011-02-08 | 2013-12-18 | Halozyme, Inc. | Composition and lipid formulation of a hyaluronan-degrading enzyme and the use thereof for treatment of benign prostatic hyperplasia |
| KR102175159B1 (ko) * | 2018-12-28 | 2020-11-05 | 대한민국 | 재조합 벡터, 형질전환 대장균, 보툴리눔 d/c형 중쇄 c말단 유래의 재조합 단백질을 포함하는 백신 조성물 및 키트 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4015911A1 (de) * | 1989-09-19 | 1991-03-28 | Max Planck Gesellschaft | Impfstoff gegen die lyme-krankheit |
| US5736139A (en) * | 1989-10-31 | 1998-04-07 | Ochidian Pharmaceuticals, Inc. | Treatment of Clostridium difficile induced disease |
| US6680182B1 (en) | 1992-07-31 | 2004-01-20 | Acambis Research Limited | Expression of recombinant fusion proteins in attenuated bacteria |
| GB9305919D0 (en) | 1993-03-22 | 1993-05-12 | Health Lab Service Board | Botulinum toxin polypeptides and their use as vaccines |
-
1995
- 1995-06-12 GB GBGB9511909.5A patent/GB9511909D0/en active Pending
-
1996
- 1996-06-12 AU AU60121/96A patent/AU705944B2/en not_active Ceased
- 1996-06-12 PT PT96917600T patent/PT833919E/pt unknown
- 1996-06-12 EP EP96917600A patent/EP0833919B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-06-12 DK DK96917600T patent/DK0833919T3/da active
- 1996-06-12 DE DE69633389T patent/DE69633389T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-06-12 WO PCT/GB1996/001409 patent/WO1996041881A1/en active IP Right Grant
- 1996-06-12 US US08/981,087 patent/US7041792B2/en not_active Expired - Fee Related
- 1996-06-12 CA CA2224444A patent/CA2224444C/en not_active Expired - Fee Related
- 1996-06-12 ES ES96917600T patent/ES2224171T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-06-12 JP JP50279897A patent/JP4005633B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1996-06-12 AT AT96917600T patent/ATE276366T1/de active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE69633389D1 (de) | 2004-10-21 |
| DE69633389T2 (de) | 2005-10-27 |
| EP0833919B1 (en) | 2004-09-15 |
| AU6012196A (en) | 1997-01-09 |
| CA2224444A1 (en) | 1996-12-27 |
| GB9511909D0 (en) | 1995-08-09 |
| AU705944B2 (en) | 1999-06-03 |
| JPH11507827A (ja) | 1999-07-13 |
| ATE276366T1 (de) | 2004-10-15 |
| DK0833919T3 (da) | 2005-01-17 |
| US20020081304A1 (en) | 2002-06-27 |
| US7041792B2 (en) | 2006-05-09 |
| PT833919E (pt) | 2005-01-31 |
| ES2224171T3 (es) | 2005-03-01 |
| WO1996041881A1 (en) | 1996-12-27 |
| EP0833919A1 (en) | 1998-04-08 |
| CA2224444C (en) | 2010-02-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU708856B2 (en) | Peptide fragment of the respiratory syncytial virus protein g, immunogenic agent, pharmaceutical composition containing it and preparation process | |
| EP0939818B1 (en) | Recombinant toxin fragments | |
| US8313928B2 (en) | Expression system | |
| JP2981286B2 (ja) | 破傷風トキシンフラグメントｃの発現 | |
| JPH07501687A (ja) | ボレリア・ブルグドルフェリのサブグループのｏｓｐ ａ 蛋白、それをコードしている遺伝子およびワクチン | |
| JP2528815B2 (ja) | 多効果免疫性蛋白質 | |
| KR20070104605A (ko) | 이황화 가교된 이쇄형 단백질의 재조합 발현 | |
| JP2706397B2 (ja) | ボレリア属リポタンパク質のクローニングおよび発現 | |
| JP2004337170A (ja) | ヘリコバクター感染に対する免疫原性組成物、該組成物に用いられるポリぺプチドおよび該ポリぺプチドをコードする核酸配列 | |
| JP4005633B2 (ja) | Ｆ型ボツリヌス毒素およびその用途 | |
| US6444799B1 (en) | P. gingivalis polynucleotides and uses thereof | |
| JPH06511154A (ja) | 組換えＢｏｒｒｅｌｉａタンパクの製造法 | |
| CA2197717C (fr) | Vecteurs de criblage et/ou d'expression fonctionnels chez les mycobacteries | |
| US6287566B1 (en) | Protective peptides neurotoxin of C. botulinum | |
| RU2707129C2 (ru) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ШТАММА Е. coli BL21 Star™(DE3) pET302/NT-His tcpA - ПРОДУЦЕНТА РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА Тср А ХОЛЕРНОГО ВИБРИОНА БИОВАРА ЭЛЬ ТОР | |
| Wang et al. | Preparation of a peptide vaccine against GnRH by a bioprocess system based on asparaginase | |
| KR100425884B1 (ko) | 살모넬라 타이피의 특정 항원성 외부막 단백질을 코딩하는 디엔에이 서열 | |
| JP2004529601A5 (ja) | ||
| Sakurai et al. | New evidence that the Tyr-157 and Tyr-159 residues of staphylococcal exfoliative toxin B are essential for its toxicity | |
| JP4273250B6 (ja) | 組換え毒素フラグメント | |
| KR100237993B1 (ko) | 보렐리아 버그도페리 아군의 ospa 단백질, 유전자 암호화 및 백신 | |
| KR19980075704A (ko) | 헤리코박터 피로리의 항원단백질 CagA를 발현하는 재조합 미생물 | |
| KR19980075705A (ko) | 헤리코박터 피로리의 항원단백질 UreB를 발현하는 재조합 미생물 | |
| WO2001021802B1 (en) | Chlamydia antigens and corresponding dna fragments and uses thereof |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A711 | Notification of change in applicant |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A712 Effective date: 20040324 |
|
| RD02 | Notification of acceptance of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7422 Effective date: 20040817 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20050906 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20051118 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20070320 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20070619 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20070807 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20070824 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100831 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100831 Year of fee payment: 3 |
|
| S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313111 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100831 Year of fee payment: 3 |
|
| R360 | Written notification for declining of transfer of rights |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R360 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100831 Year of fee payment: 3 |
|
| R370 | Written measure of declining of transfer procedure |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R370 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110831 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110831 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120831 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130831 Year of fee payment: 6 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |