JP2004337170A - ヘリコバクター感染に対する免疫原性組成物、該組成物に用いられるポリぺプチドおよび該ポリぺプチドをコードする核酸配列 - Google Patents
ヘリコバクター感染に対する免疫原性組成物、該組成物に用いられるポリぺプチドおよび該ポリぺプチドをコードする核酸配列 Download PDFInfo
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Abstract
【解決手段】i) ヘリコバクター・ピロリ由来のウレアーゼ構造ポリぺプチドの少なくとも1つのサブユニット、もしくはヘリコバクター・フェリスウレアーゼと反応する抗体によって認識されるそれらの断片、および/またはヘリコバクター・フェリス由来のウレアーゼ構造ポリぺプチドの少なくとも1つのサブユニット、もしくはヘリコバクター・ピロリウレアーゼと反応する抗体によって認識されるそれらの断片、ii)および/またはヘリコバクター由来の熱ショック蛋白質(HSP)、すなわちシャペロニン、もしくは該蛋白質の断片を包含する免疫原性組成物。
【選択図】 図1
Description
(Nomura et al, 1991; Parsonnet et al, 1991 )。
i )ヘリコバクター・ピロリ由来のウレアーゼ構造ポリぺプチドの少なくとも1つのサブユニット、もしくはヘリコバクター・フェリスウレアーゼと反応する抗体によって認識されるそれらの断片、および/またはヘリコバクター・フェリス由来のウレアーゼ構造ポリぺプチドの少なくとも1つのサブユニット、もしくはヘリコバクター・ピロリウレアーゼと反応する抗体によって認識されるそれらの断片;
ii)および/またはヘリコバクター由来の熱ショック蛋白質(HSP)、すなわちシャペロニン、もしくはこの蛋白質の断片、
を含有することを特徴とする免疫原性組成物に関する。
90/11360 に記載されている。QIAGEN, USA の“QIAexpress”システムを用いることもできる。さらに、蛋白質を融合蛋白質の形態で用いることは完全に任意である。
i) ヘリコバクター・フェリスウレアーゼおよび上記アクセサリーポリぺプチドをコードする配列、および上述のH.ピロリのHSPをコードする配列;
またはii)配列(i)に相補的な配列;
またはiii)過酷な条件下において、配列(i)もしくは(ii)とハイブリダイズし得る配列;
またはiv)少なくとも10個のヌクレオチドを含む配列(i)、(ii)もしくは(iii)の断片、
を包含することを特徴とする核酸配列に関する。
− 5×SSC;
−50%ホルムアミド、37℃;
または:
− 6×SSC;
−デンハード[Denhard ]培地、68℃。
− 5×SSC;
− 0.1%SDS;
−30もしくは40%、好ましくは30%ホルムアミド、42℃、において上述の配列 (i)、(ii)および (iii)と反応する配列が含まれる。
−上に定義される、この発明によるヌクレオチドプローブ;
−ヘリコバクターの核酸とプローブとのハイブリダイゼーション反応を行なうための適切な培地;
−形成されたあらゆるハイブリッドを検出するための試薬;
を包含することを特徴とするキットにも関する。
パートIの実験手順:
細菌株および培養条件:
H.フェリス(ATCC 49179)を、 5%溶血ウマ血液 (バイオメリュークス)並びに10ng ml-1のバンコマイシン(レダリー研究室)、 2.5μg ml-1のポリミキシンB(ファイザー)、 5μg ml-1のトリメトプリン(シグマ化学株式会社)および 2.5μg ml-1のアンホテリシンB(E.R スキーブ アンド サンズ株式会社)からなる抗生補足物質で補足された血液寒天培地 no.2 (オキソイド)で成育させた。バクテリアを要時調製した寒天プレートで培養し、一番上に蓋を置いて、好気状態下、37℃で 2− 3日間インキュベートした。クローニング実験において用いられる大腸菌株HB101 (ボイヤーおよびルーランド−ダソイックス)およびMC1061(マニアティスら、1983)は、グルコース無添加ルリアブロス[Luria broth]中あるいはルリア寒天培地上において、37℃で、所定の通りに成育した。窒素−制限条件下で成育したバクテリアを、 0.4%(w/v)D−グルコースおよび10mM L−アルギニンを補足したアンモニア無添加M9最小培地(pH 7.4)からなる窒素−制限固形培地上で継代した(キュサックら、1992)。
全ての標準DNAおよび分析は、他に記載された以外は、マニアティスらによって記述された方法に従って行われた (1983)。
全てのゲノムDNAはザルコシル−プロテイナーゼK溶解法(ラビニュー−ラッセルら、1988)によって抽出した。H.フェリスを接種した12枚の血液寒天プレートを、触媒無添加の嫌気性ガスパック(BBL70304 )を用いた嫌気ジャー (BBL)中で、37℃にて 1− 2日保温した。プレートを15%(V/V)グリセロール− 9 %(W/V)ショ糖溶液50mlに集め、(ソルバール[Sorvall]遠心機で)5,000 rpm、 4℃にて30分間遠心した。ペレット 5mg ml-1リゾチームを含む25mMトリス−10mM EDTA(pH 8.0)中に50mM D−グルコースを含む溶液 0.2mlに再懸濁し、VTi65ポリアロマークイックシールチューブに移した。この懸濁液に、20mg ml-1プロテイナーゼKの溶液 0.2ml及び 5M過塩素酸ナトリウム0.02mlを添加した。 0.5M EDTA−10%(W/V)ザルコシル0.65mlを添加することによって細胞を溶解し、懸濁液が透明になるまで65℃にてインキュベートした(約5分間)。チューブの容量は 126g塩化セシウム、 1mlアプロチニン、99mlTESバッファー(30mMトリス、5mM EDTA、50mM 塩化ナトリウム(pH 7.5)からなる(100ml当り)塩化セシウム溶液で満たした。溶解液を18℃で15−18時間、 45000rpmで遠心した。全DNAを収集し、TEバッファー(10mMトリス、 1mM EDTA)に対して4℃で透析した。
H.フェリスに由来する染色体DNAを、既に記述されているように(ラビニら、1991)、コスミドベクターpILL575にクローニングした。Sau 3Aでの部分的切断により生じたDNA断片を、(10から40%)ショ糖密度勾配で分画し、BamHIで切断して、脱リン酸化されたpILL575 DNA調製物に連結させた。コスミドをファージラムダ粒子(アマシャム、イン・ビトロ・パッケージングキット)に組込み、大腸菌 HB101 に感染させるために用いた。ウレアーゼ発現をスクリーニングするために、カナマイシン−耐性形質導入株を、マイクロタイタープレート(ベクトン・ディキンソン)の個々のウェルに分配されている、(20μg ml-1)カナマイシンを含む窒素−制限[mimiting]固体培地(上記参照)上にレプリカプレートした[replica-plated]。各々のウェルにウレアーゼ試薬(ハゼールら、1987) 0.1mlを添加する前に、マイクロタイタープレートを 2日間37℃で有酸素的にインキュベートした。尿素分解は、試薬の色調変化によって37℃で 5−6時間以内に検出された。幾つかのウレアーゼ陽性反応コスミドクローンの制限地図が作成され、そのうちの一つがサブクローニングのために選択された。
コスミドDNAの大規模な塩化セシウムプラスミド調製物を、部分的にSau 3Aで切断した。DNA断片( 7−11kb)をアガロースゲルから電気溶出し、フェノール−クロロホルム抽出を用いて精製した。冷却エタノールで沈殿させた後、この断片をBg/III −切断プラスミドpILL570 に連結し(ラビーニら、1991)、その組換えプラスミドを十分な資格を有する大腸菌MC1061細胞の形質転換に用いた。スペクチノマイシン−耐性形質転換体を、窒素−過多(ルリア寒天)および窒素−制限条件下でウレアーゼ発現について選択し、かつスクリーニングした。
37℃で 2.5日間好気的に成育した培養体を集め、0.85% (W/V)塩化ナトリウムで2回洗浄した。ペレットをPEBバッファー(0.01M EDTA含有 0.1Mリン酸ナトリウムバッファー(pH 7.4))に再懸濁し、次いで30W、50%サイクルにセットしたブランソン ソニファイヤー モデル450[Brnaon Sonifier model]を用いて30秒間の破砕を 4回行なうことにより超音波処理した。細胞片は遠心によって破砕物から除いた。破砕物のウレアーゼ活性を、バースロット反応の変法(クーザックら、1992)により、PEBで調製された0.05Mウレアーゼ溶液中において測定した。ウレアーゼ活性は、μmol 尿素 min-1mg-1バクテリア蛋白として表現した。
蛋白質濃度は、ブラッドフォードアッセイの市販品(シグマ化学)で推定した。
MiniTn3 −Kmデリバリー系(ラビーニら、1992)によってクローン化されたH.フェリス中に、無作為挿入突然変異が生じた。簡単に説明すると、トランスポザーゼをコードするプラスミドpTCAを含む大腸菌HB101細胞を、クローン化H.フェリスDNAを含むプラスミドpILL570形質転換した。pILL570 誘導体プラスミドへのMiniTn3−Kmエレメントの移動は接合によって行なわれた。その後、得られた共組込み体[cointefrates]を、高濃度のカナマイシン( 500mg l-1)およびスペクチノマイシン(300mg l-1)の存在下で、解析された構造に対して選択した。
可溶化された細胞抽出物を、 4.5%アクリルアミドスタッキングゲルおよび12.5%解析ゲルを含むスラブゲルで、レムリーの方法(レムリー、1970)に従って分析した。電気泳動は、ミニ−スラブゲル装置(バイオ−ラド)で 200Vにて行なった。
配列決定しようとするDNA断片を、M13mp18およびM13mp19バクテリオファージベクター(ファルマシア)中にクローニングした(メイシングおよびビーラ、1982)。組換えファージDNAを十分な資格を有する大腸菌JM101 細胞に感染させ、X−gal[X-gal](5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトピラノシド)およびイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシドを含む培地上にプレートした。組換えファージDNAで感染されたバクテリアから生じたプラークを、ポリエチレングリコール処理による一本鎖DNAテンプレートの調製(ザンガーら、1977)のために選択した。シークエナーゼキット[Sequenase kit](ユナイテッド・ステイト・バイオケミカル社)を用いたジデオキシヌクレオチド・チェイン・ターミネイション法に従って、一本鎖DNAの配列を決定した。
ヌクレオチドアクセッション番号[accession number]は、X69080 (EMBデータライブラリー)である。
H.フェリス・コスミド・クローンによるウレアーゼ活性の発現:
コスミドベクターpILL575 中にH.フェリス染色体DNAの部分的に切断された断片(大きさが30から45kb)をクローニングした結果、約 700のコスミドクローンが単離された。ウレアーゼ発現を誘発させるために、窒素−制限培地でクローンをサブカルチャーした(クザックら、1992)。これらのうちの 6株については、 5− 6時間のインキュベーションの後(実験手順の項に記載したように)ウレアーゼ−陽性になることが同定された。さらに一晩インキュベーションを行なったものの、他にウレアーゼ−陽性コスミドクローンは同定されなかった。ウレアーゼをコードするコスミドを持つ3つのクローンの制限酵素の分析により、共通の28kdDNA断片が示された。両末端に共通の断片のDNA領域を有するコスミド(消化されたpILL199)を、サブクローニングのために選択した。
大腸菌細胞において、ウレアーゼ発現に対して必要な最小DNA領域を明らかにするために、ウレアーゼをコードするコスミドpILL199をSau 3Aで部分的に切断し、その断片をプラスミドpILL570にサブクローニングした。この形質転換株を窒素−過多および窒素−制限培地でサブカルチャーし、ウレアーゼ陽性表現型についてスクリーニングを行なった。窒素−制限状態下で成育した場合には、5つの形質転換導入株がウレアーゼ活性を発現した。一方、窒素−過多培地での成育の後には活性は検出されなかった。制限マッピング分析により、ウレアーゼをコードするプラスミドは7および11kb間にインサートを含んでいることが示された。pILL205 と呼ばれるプラスミドが、さらなる実験のために選ばれた。
pILL205を有する大腸菌細胞の抽出物のウエスタンブロット分析により、ポリクローナルH.フェリスウサギ抗体と交叉反応する約30および66kDaの2つのポリペプチドの存在が示された(図2A)。これらの蛋白質は、ベクター (pILL570)を有する細菌によっては生産されなかった。本来のH.フェリスウレアーゼは、算出分子量30および69kDaの繰り返しモノマーサブユニットからなることが報告されている(ターベットら、1992)。このため、30および66kDa蛋白は、各々ureAおよびureB遺伝子産物に対応するものと思われた。興味深いことに、ヘリコバクター・ピロリ ureAおよびureB遺伝子を含む組換えプラスミドpILL763を有する大腸菌細胞の抽出物(クザックら、1992)は、抗- H.フェリス抗体と交叉反応する約30および62kDaの分子サイズを有する2つのポリペプチドを発現した(図2B)。
トランスポゾン挿入部位“a”に隣接したH.フェリスDNAの 2.4kb領域の配列決定分析により、同じ方向に転写されるureAおよびureBと呼ばれる2つのオープンリーディングフレーム(ORF)が同定された(図3)。トランスポゾンはureBの末端から 240bp上流に局在していることが確かめられた。両方のORFはATG開始コドンで始まり、大腸菌コンセンサス・リボゾーム結合配列に類似する部位が先行する(シャインおよびダルガーノ、1974)。これらのH.フェリス構造遺伝子間に介在する遺伝子[intergenic space]は3つのコドンからなっており、それらは隣接するオープンリーディングフレームと同位相である。すでにヘリコバクター・ピロリに対するcas(ラビニーら、1991)において観察されているように、これはureA遺伝子の停止コドンにおける単一突然変異により、理論的には融合した単一ポリペプチドが生じるであろうということを示唆している。
この研究の目的はH.ピロリとH.フェリスのウレアーゼサブユニットに由来する組換え抗原の開発と、H.フェリス/マウスモデルでのこれらの抗原の免疫防御効果の評価である。H.ピロリとH.フェリスのウレアーゼサブユニットをコードしているそれぞれの構造遺伝子を、Escherichia coli(大腸菌)に別個にクローニングし、過剰発現[over-expressed]させた。その結果得られた組換えウレアーゼ抗原(大腸菌の42kDaマルトース結合蛋白質と融合している)を大腸菌培養物から大量に精製した。これらは免疫原性ではあったが酵素的には不活性だった。この発見はH.ピロリの感染に対する組換えワクチンを開発することが可能であることを示した。
バクテリア株、プラスミドと成育条件:
H.フェリス(ATCC49179 )を、10%の分解したウマ血液(BioMerieux)を加えた血液寒天ベース no.2 (Oxood)を含み、バンコマイシン(10μg/mL)、ポリミキシンB(25ng/ml)、トリメトプリム(5μg/mL)と、アンホテリシンB(2.5μg/mL)の抗生物質を補足した血液寒天培地で培養した。バクテリアを微好気条件で37℃で 2日、前述したように培養した。大腸菌株MC1061とJM101は、クローニングと発現の実験で使ったが、37℃で寒天を加え、または加えないルリア培地で機械的に培養した。抗生物質のカルベニシリン(100μg/mL)とスぺクチノマイシン(100μg/mL)を必要量加えた。
全てのDNA操作と分析は、他の方法に言及しない限り標準的な方法で行った。制限酵素と修飾酵素はアマシャム(フランス)から購入した。クローニングするDNA断片は、アガロースゲルから電気抽出し、エルチップ[Elutip]ミニカラム(Schleicher and Schull 、ドイツ)で精製した。単鎖DNAの配列決定は、M13mp18とM13mp19バクテリオファージベクター(ファルマシア、フランス)を使って行なった。単鎖DNAのテンプレートは、組換えファージDNAをポリエチレングリコール処理して調製した。テンプレートの配列決定は、ジデオキシ鎖終結法によってシークエンスキット(米国バイオケミカル社、U.S.A.)を使って行なった。
H.ピロリとH.フェリスのureA遺伝子をクローニングするために、変性した36マー[36-mer]のプライマーを、公表されたウレアーゼ配列(Labigne et al., 1991:Ferrero and Labigne, 1993)から推測した。(プライマーセット#1;表2参照)。プラスミドpILL763とpILL203(表3)を有する大腸菌クローンから得た精製DNAは、H.ピロリとH.フェリスのウレアーゼの構造遺伝子をコードしており、PCR反応のテンプレートとして使用した。反応試料に含まれていたのは、10-50ngの変性DNA、PCR緩衝液(10mmol/L トリス−HCl[pH8.3]中に50mmol/L KCl)、dATP、dGTP、dCTP、dTTP(それぞれ最終濃度が1.25mmol/L)、2.5mmol/L MgCl2、それぞれのプライマーが25pmol、および0.5μL Taqポリメラーゼである。試料は次のプログラムを30回行なった。94℃で2分間、40℃で1分間。
発現ベクターpMALは、誘導性プロモーター(Plac )の制御下にあり、MalE(マルトース結合蛋白質)の生産をコードするオープン・リーディング・フレーム(ORF)を含んでいる。後者のORFとクローニングした配列によって、MBP融合蛋白質が合成された。これはアミロースレジンで容易に精製された。商業的に有用なpMALの2つのバージョンのうち、シグナル配列(すなわちpMAL−c2)をコードしていないバージョンが組換え蛋白質をより多く合成したので終始使用した。
カルベニシリン[carbenicillin](100μg/mL)と 2%(wt/vol)グルコースを含む新鮮な 500mLのルリアブロスに、一晩培養した大腸菌クローンの培養物(5mL)を接種した。A600=0.5になるまで、培地を37℃ででインキュベートし、250rpmで振盪した。1mmol/L (最終濃度)イソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド(IPTG)を培養液に加える前に、 1.0mLのサンプルをとった(非誘導細胞)。培養株は、さらに4時間インキュベートし、別に1.0mLのサンプル(誘導細胞)をとった。この非誘導細胞と誘導細胞を、後でSDS−PAGEで分析した。
H.ピロリ85P株(Labigne et al., 1991)とH.フェリス(ATCC49179 )の全細胞抽出物に対するポリクローナルなウサギ抗血清を調製した。H.ピロリとH.フェリスのウレアーゼサブユニットの組換え蛋白調製物に対するポリクローナルウサギ抗血清は、フロイント完全アジュバント(シグマ)中の100μgの精製組換え蛋白質でウサギに免疫することによって生産した。 4週間後、ウサギをフロイント不完全アジュバント中、100μgの蛋白質で追加免疫した。6週間目に、最終的にこの動物から血を取り、血清を-20℃で保存した。
Laemmliの方法に従って、可溶化した細胞抽出物を 4.5%アクリルアミド・スタッキング・ゲルと10%の解像ゲル[resolving gel]からなるスラブゲルで分析した。ミニスラブゲル装置(バイオラッド、USA )で200Vで電気泳動を行った。
6週令のメスのスイス特定病原体フリー(SPF)マウスを得て(Centre d'Elevage R. Janvier, Le-Genest-St-Isle, フランス)、市販の固形飼料と水で任意に飼育した。この動物の腸でヘリコバクター・ムリダルム[Helicobacter
muridarum]がいないものを選んだ。全ての胃への投薬は、 1.0mLのポリエチレンカテーテル(Biotrol、パリ、フランス)のついた使い捨ての注射器を使って 100μLをマウスに与えた。
H.フェリスバクテリアをPBSに回収し、5000rpmで10分間、4℃でソーバルRC-5遠心分離機(Sorvall 、USA)で遠心分離した。沈殿物を2回洗浄し、PBSに再懸濁した。バクテリア懸濁液を前述したように音波処理し、少なくとも一回凍結融解した。蛋白質の同定を音波処理物について行った。
50μgの組換え抗原と10μgのコレラ全毒素(シグマ化学社)をHCO3に再懸濁し、0、1、2、3週にマウスの胃に投与した。音波処理したH.フェリス抽出物(全蛋白質を 400-800μg含む)で免疫したマウスに10μgのコレラ毒も投与した。5週目に、それぞれのグループの半分のマウスに、有毒なH.フェリスの接種物を抗原投与した。残りのマウスには15週にさらなる“追加”免疫をした。17週に、後者にH.フェリスの培養株を抗原投与した。
免疫用量を受けてから 2週間後(つまり、それぞれ7週目と19週目)、脊椎脱臼で死亡させた。胃を殺菌した0.8% NaClで洗浄し、それぞれの胃から胃腔の一部を、尿素指示培地(2%尿素、120mg Na2 HPO4 、80mg KH2 PO4 、1.2mg フェノールレッド、 1.5g 寒天を1000mLに調製)を含む12cm×12cmの寒天プレートの表面に置いた。それぞれの胃の残りはホルマリン−生理食塩水に入れ、組織学用に処理するまで保存した。胃の縦の切片 ( 4μm)を切り取り、ギムザ法で機械的に染色した。必要なときは、切片を更に、ヘマトキシリン−エオシンおよびウォーシン−スターリー銀染色法で染色した。
大腸菌におけるヘリコバクターウレアーゼポリペプチドの発現:
H.フェリスとH.ピロリのそれぞれのureA遺伝子生産物をコードしている配列を含む断片をPCRで増幅し、発現ベクターpMAL上に存在する、42kDaのMBPをコードしているORFとクローニングした。PCR生成物の配列決定により、わずかなヌクレオチドの変化が明らかになったが、それぞれの遺伝子生成物の推定アミノ酸配列を変えるものではなかった。これらの組換えプラスミド(それぞれpILL919とpILL920 )で形質転換した大腸菌MC1061細胞は、およそ69kDaの予想分子量の融合蛋白質を発現した。続くアフィニティクロマトグラフィー(アミロースレジン)と陰イオン交換ゲルメディア(Q−セファロース)のクロマトグラフィーにより、これらの蛋白質は高純度に精製された(図1)。組換え大腸菌細胞の2-L培養物からの収量は精製抗原がおよそ40mgだった。
H.ピロリおよびH.フェリスの全抽出物に対して生じたウサギポリクローナル抗血清を用いた抗原調製物のウェスタンブロット分析は、抗原が、非相同な抗血清と同様に相同な抗血清に対しても免疫原性を保持していることを示した(図14および15)。抗血清はMBP成分だけを認識したのではなかった。H.ピロリとH.フェリスのウレアーゼポリペプチド間の交叉反応性は、これらの蛋白質のアミノ酸配列の同一性が高いことと一致している。
H.フェリスバクテリアの接種物の有毒性を確かめるために、H.フェリスに感染したマウスの胃からバクテリアを再び単離した(材料と方法参照)。バクテリアはイン・ビトロで、最小の回数継代した。これらのバクテリアから調製して -80℃で保存した手持ちの培養株を、他のマウスの防御研究のための新鮮な接種物を調製するために用いた。この方法によって、連続した実験で使った接種物は再生産できることが確かめられた。
所定の抗原調製物で 3週間免疫したマウスを2つのロットに分け、 2週間の後、これらの一方に107 バクテリア/mLを含むH.フェリスの接種物を抗原投与した。組換えH.フェリスureAで免疫した動物の一つのグループにも、接種物を抗原投与したが、他の動物とは異なり、19週まで殺さなかった。
音波処理したH.フェリス調製物で免疫化したマウスのコントロールグループから取った胃の生体組織検査試料の85%はウレアーゼ陰性であり、したがってH.フェリス感染を防御したようだった(表4)。これは、MBPだけ投与した動物の他のコントロールグループからのそれが20%であることと比較された。組換えウレアーゼサブユニットが投与されたマウスのグループのウレアーゼ陰性の胃の割合は、70%(H.ピロリureB)から20%(H.ピロリureA)まで変化した。H.フェリスによる細菌性コロニー形成のレベルも、胃の組織から作った組織切片から評価した。H.フェリスバクテリアは、目立つらせん状の形態をしているので、胃の窪み部分と腺部分の両方の粘膜表面にあるこの生物体を簡単に見ることができた。組織学的な証拠からマウスでの防御のレベルは生体組織検査のウレアーゼテストで観察されたものより低いことがわかった。すなわち、H.フェリスの音波処理した調製物とH.ピロリureBで免疫したマウスのそれぞれ25%および20%の胃の組織が、H.フェリスバクテリアに感染していなかった。
それぞれの動物グループの残りのマウスに、15週目に追加免疫した。これらのマウスに、17週目に、以前使ったもののおよそ100分の1以下のバクテリアを含むH.フェリス接種物を抗原投与した。 2週間後、MBPで免疫した全てのマウスの胃の生態組織検査の結果はウレアーゼ陰性であった(表4)。対照的に、組換えウレアーゼサブユニットで免疫したマウスの胃の生態組織検査のウレアーゼ活性は、H.ピロリureAの50%からH.フェリスureBの100%と様々であった。後者はH.フェリスの音波処理した抽出物で免疫した動物グループで観察された防御に匹敵した。組織学的な証拠から、H.フェリスとH.ピロリのureBサブユニットは、それぞれ免疫した動物の60%と20%を防御した。これを、H.フェリスの音波処理した抽出物で免疫したマウスの防御のレベルが85%であったことと比較した。組換えH.ピロリureAによるマウスの免疫は、この動物を防御しなかった。同様に、全てのH.フェリスureAで免疫したマウスの胃には、5週目に抗原投与したものの、19週目にはH.フェリスバクテリアがかなりコロニーを形成していた(表4)。
H.フェリスのコロニー形成の組織学的な評価に加えて、マウスの胃組織を単核細胞応答の存在についても評価した(0から3)。MBPだけで免疫したマウスでは、穏やかな慢性の胃炎が、筋粘膜と胃上皮粘膜下組織だけに少数の単核細胞と共に見られた。対照的に、組換えウレアーゼポリペプチドや、H.フェリスの音波処理した調製物で免疫した動物の胃の粘膜には、多くの単核細胞が存在した。炎症性の細胞は合体して、組織の粘膜下組織でゆるい凝集体を作るか、結節性の構造を作り胃上皮の粘膜領域に広がった。H.フェリスureAで免疫したマウスの胃粘膜は、H.フェリスバクテリアがかなりコロニーを形成していたが、単核細胞を僅かか、もしくは全く含まなかったので、単核細胞の応答はバクテリアの存在とは関係がないようだった。
ヘリコバクター・ピロリのウレアーゼ(ニッケル金属酵素)と密接な関連があると報告されたGroELクラスの熱ショック蛋白質(HSP)の相同体が、最近になって DunnらとEvansらによりH.ピロリの細胞から精製された(それぞれInfect. Immun., 60:1946, 1992, 1946 及び 2125 参照)。この免疫学的に優勢な[immunodominant]蛋白質の報告されたN末端のアミノ酸配列に基づき、H.ピロリ85P株の染色体中のGroEL様蛋白質をコードする遺伝子(hspB)を標的とするために、変性オリゴヌクレオチドが合成された。遺伝子増幅の後、HspB蛋白質の初めの36アミノ酸をコードする 108塩基対断片が精製され、H.ピロリ・ゲノミックバンク[genomic bank]中でHspBをコードしている全遺伝子をもつ組換えコスミドを同定するためのプローブとして用いられた。hspB遺伝子はpILL684 コスミドのBglII制限酵素切断断片の3.15キロベース(Kb)に存在した。pILL570 プラスミドベクターにサブクローニングされたその断片(pILL689 )の塩基配列により、hspA及びhspBと命名された2つのオープンリーディングフレーム(OFR)の存在が明らかにされ、その構成は他の細菌種におけるgroESLバイシストロン性オペロン[bicistronic operons ]と非常に類似したものであった。hspA及びhspBはそれぞれ 118及び 545アミノ酸のポリペプチドをコードしており、それぞれ13.0キロダルトン (kDa)及び58.2kDaの分子量に相当する。アミノ酸配列の比較研究により以下のことが明らかとなった。i)H.ピロリのHspA及びHspB蛋白質はそれらの細菌の相同物に非常に類似していた;ii)H.ピロリのHspA蛋白質は他の細菌のGroEs相同物にはないカルボキシル基末端での顕著なモチーフを特徴とする;この独特なモチーフは、ニッケル結合のような金属結合ドメインに似た、一連の8個のヒスチジン残基からなる。驚くべきことに、遺伝子クラスターのすぐ上流にIS5挿入エレメントが見いだされた。それはH.ピロリのゲノムには存在せず、コスミドクローニングの過程で積極的に選択されたものであった。そのIS5はpILL689 内でhspA及びhspB遺伝子の発現に関連していることが見いだされた。pILL689プラスミドでのHspA及びHspB蛋白質の発現は、ミニ細胞生産株にて分析された。2つのポリペプチドは大腸菌細胞内で構成的に発現されることが示された。pILL689組換え体プラスミドがH.ピロリウレアーゼ遺伝子クラスターとともに大腸菌宿主株に導入されると、ウレアーゼ活性の増加が観察された。そのことは熱ショック蛋白質とウレアーゼ酵素との間の密な相互作用を示唆する。HspAシャペロンに関する特異的な機能の概念を支えているのは、hspBのコピーがH.ピロリゲノム内では1つだけ見いだされる一方で、hspAのコピーはゲノム内に2つ見いだされ、その内の1つはhspB遺伝子にリンクし、もう1つはhspB遺伝子にリンクしていないという事実である。H.ピロリと同遺伝子型のhspA及びhspB遺伝子における変異株を構築する試みは不成功に終わり、このことはこれらの遺伝子が細菌の生存に関して必須であることを示唆する。
細菌の株、プラスミド、及び培養条件:
クローニング実験はH.ピロリ85P株から調製されたゲノムDNAにより行われた。H.ピロリN6 株は、それらが好都合な形質転換能をもつという理由からエレクトロポーレーション実験の受容株として用いられた。大腸菌HB101 株もしくは大腸菌MC1061株はそれぞれコスミドクローニング及びサブクローニングの実験用宿主として用いられた。大腸菌P678-54株はミニ細胞の調製用に用いられた。本研究に用いられたベクター及び組換えプラスミドを表1に示した。H.ピロリ株は、バンコマイシン(10mg/l)、ポリミキシンB(2,500U/I)、トリメトプリム(5mg/l)、及びアンファテリシンB(4mg/l)を添加したウマ血液寒天培地上で生育された。プレートはCO2発生器[carbon dioxide generator envelope ](BBL70304 )を備えた嫌気性ジャー内で微好気性条件下、37℃にてインキュベートした。大腸菌株はグルコース無添加のL- ブロース中( 1L中に10gのトリプトン、5gの酵母抽出物及び5gの塩化ナトリウム;pH 7.0)、もしくはL-寒天培地(1.5%寒天)上で37℃にて生育された。ウレアーゼ活性測定のために用いられた窒素制限培地は、炭素源として0.4%D-グルコースを含み、新しく調製された濾過滅菌したL- アルギニンが最終濃度10mMになるように加えられた、アンモニウムフリーのM9 最小寒天培地(pH 7.4)よりなる。組換え体クローンの選択のための抗生物質の濃度は以下のとおりである(1L中のミリグラム):カナマイシン、20;スペクチノマイシン、 100;カーベニシリン、 100。
H.ピロリ由来のゲノムDNAは、従来記述されているようにして調製した。コスミドDNAとプラスミドDNAは、アルカリ溶菌法により調製し、引き続いて従来記述されているセシウムクロライド-臭化エチジウム勾配により精製した。
H.ピロリhspA−B遺伝子クラスターのクローニングに用いられた、大腸菌HB101内でのH.ピロリ85Pのコスミド遺伝子バンクの構築は以前に示された通りである。
制限エンドヌクレアーゼ、T4 DNAライゲース、DNAポリメラーゼI 大(クレノウ)フラグメント及びTaqポリメラーゼはアマシャム[Amersham]社から購入し、T4 DNAポリメラーゼはバイオラブ[Biolabs ]から、及びコウシ腸ホスファターゼ[calf intestinal phosphatase ]はファルマシア[pharmacia]から購入した。全ての酵素は製品の使用説明書に従って用いた。DNA断片はトリス酢酸緩衝液の存在下で泳動させるアガロースゲル上で単離した。ベテスダ研究所[Bethesda Research Laboratories]からの1kbのラダーを断片サイズ標準として用いた。必要な場合には、DNA断片は、従来記載されるようにアガロースゲル上から電気溶出により単離し、イルティップデー・ミニカラム[Elutip-d minicolum](Schleicher and Schuell, Dassel, ドイツ)により移動緩衝液[migration buffer]から回収した。基本的なDNA操作は Sambrook らにより示された実験手順に従い行なわれた。
H.ピロリ・コスミド・バンクのスクリーニング及びサブクローン同定用のコロニーブロットは、Sambrookら(43)の実験手順に従い、ニトロセルロースメンブラン(Schlecher and Schuell, Dassel, ドイツ)上で調製した。PCR産物の放射活性標識は、ファルマシア社のランダムヘキサマーをプライマーとして用い、ランダムプライミング[random priming]により行なった。コロニーハイブリダイゼーションは非常に厳しい条件下で行なった(5×SSC、0.1%SDS、50%ホルムアミド、42℃)( 1×SSC; 150mM塩化ナトリウム、15mMクエン酸ナトリウム、pH 7.0)。サザンブロットハイブリダイゼーションのために、DNA断片をアガロースゲルからニトロセルロースシートへ転写し(0.45μmポアサイズ;Schleicher & Schuell, Inc.)、そしてあまり厳しくない条件下( 5×SSC、 0.1%SDS、30%もしくは40%ホルムアミド、42℃で32P標識されたデオキシリボヌクレオチドプローブ添加)でハイブリダイズした。ハイブリダイゼーションはアマシャム・ハイパーフィルム−MP(Amersham Hyperfilm-MP )を用い、オートラジオグラィーにより示された。
プラスミドDNAの適当な断片をM13mp18/19 ベクターにサブクローニングした。1本鎖のDNAを大腸菌JM101 株のファージ感染により調製した。配列決定は、アメリカ合衆国バイオケミカルシークエナーゼキット[United States Biochemicals Sequenase kit]を用い、ジデオキシヌクレオチド鎖終結法により行なった。M13ユニヴァーサルプライマー[M13 universal primer]と補助的な特異的プライマーの両方(図1)を、コーディングおよびノンコーディングDNA鎖の双方の配列決定に用いた。2本鎖DNAの配列決定は従来記述される通りに行なった。PCR産物の直接配列決定[direct sequencing]を、増幅し、電気溶出したPCR産物をイルティップデー・ミニカラム(Schleicher and Schuell)に通して精製した後に行なった:シークエナーゼ・キットを用いた配列決定に関する標準的な手順は以下の改良を加えてから用いられた:PCR産物は、プライマーとして 200ピコモルのオリゴヌクレオチドを含み、最終濃度を
1%とするDMSOを含むアニーリング混合物を 3分間煮沸することにより変性した;その混合物はすぐに氷上で冷却した;標識段階はマンガンイオン(mM)の存在下で行なった。
H.ピロリ変異株構築のための試みにおいて、カナマイシン耐性遺伝子(aph3'-III)を含むカセットで分断された標的遺伝子を持つ適当なプラスミド構造物で、従来記載されているエレクトロポーレーション手法により、H.ピロリ
N6 株を形質転換した。カナマイシンで分断されたflaA遺伝子をもつプラスミドpSUS10をエレクトロポーレーションのポジティブコントロールとして用いた。エレクトロポーレーションの後、抗生物質耐性を発現させるためバクテリアを非選択培地にて48時間生育し、その後カナマイシン含有培地へ移した。選択培地では 6日目まで培養した。
PCRは、パーキンエルマー・シータス・サーマルサイクラー[Perkin-Elmer Cetus thermal cycler ]を使用したジーンアンプキット[GeneAmp kit ](Perkin-Elmer cetus)を用いて行なった。標準的な増幅反応は、50ピコモルの各プライマーと少なくとも5ピコモルの標的DNAを必要とする。標的DNAは増幅反応に加えられる前に熱変性させた。反応は以下に示す3つの段階の25サイクルから構成された:変性(94℃、1分間)、アニーリング(算出されたプライマーの融解温度[melting temperatures]により、42℃から55℃の範囲の温度で、2分間)、伸長(72℃、2分間)。変性されたオリゴヌクレオチドを厳しくない条件下で用いた場合には、それぞれのオリゴヌクレオチドは1000ピコモルまで加え、50サイクル実行し、アニーリングは42℃で行なった。
適当なハイブリッドプラスミドを有するミニ細胞を単離し、[35S]メチオニン(50μCi/ml)で標識した。アセトン沈殿性物質約100,000 cpmを12.5%のゲルでドデシル硫酸ナトリウム(SDS)-ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた。94,000から14,000までの範囲の分子量をもつ標準蛋白質(Bio-Rad Laboratories社の低< 分子量キット[low< molecular-weights kit])を並行に流した。ゲルを染色し、En3 Hance (New England Nuclear)を用いて蛍光間接撮影法により検査した。
ウレアーゼ活性は従来記載されている手法に修正を加え、ベルテロット[Berthelot ]反応により定量した。ウレアーゼ活性は細菌の蛋白質のミリグラム当り、 1分間に加水分解される尿素のマイクロモルとして示した。
ヘリコバクター・ピロリのGroEL様熱ショック蛋白質をコードする遺伝子を持つ組換え体コスミドの同定:
H.ピロリの精製熱ショック蛋白質の公表されたN末端のアミノ酸配列を基に、2つの変性されたオリゴヌクレオチドを、H.ピロリ85P株の染色体中の目的の遺伝子を標的とするために合成した。初めの1つは5'-GCNAARGARATHAARTTYTCNG-3'である。ここでNは4つのヌクレオチドを表し、RはAとGを、YはTとCを、HはT、C及びAを表す。このオリゴヌクレオチドは蛋白質(AKEIKFSD)の初めの8アミノ酸に由来する;2番目は5'-CRTTNCKNCCNCKNGGNCCCAT-3'である。ここでKはGとTを表し、それは29番目から36番目のアミノ酸を指定する相補的なコドン(MGPRGRNV,参照)に相当する。PCR産物について期待される大きさは 108塩基対(bp)であった。増幅反応は、“材料と方法”の項で示された、あまり厳しくない条件下で行なわれ、400bpから100bpまでの範囲の大きさを持つ6つの断片が合成された。3つの最も小さな断片をアクリルアミドゲルから電気溶出し、精製した。PCR産物の直接配列決定により、公知の配列に相当するアミノ酸をコードするDNA断片の同定が可能となった。そこで、この断片を標識し、H.ピロリのGroEL様蛋白質をコードする遺伝子の5'部分と相同性を示す組換え体コスミドを同定するために、コロニーハイブリダイゼーションにおけるプローブとして用いた;さらにこの遺伝子はhspBと名付けられた。遺伝子バンクは、組換え体コスミドを持つ 400個の独立したカナマイシン耐性大腸菌形質導入体からなる。それらのうち、1つの単一コロニーがプローブとハイブリダイズした。それはpILL684 と命名された組換えプラスミドを持ち、その大きさは46kbであった。hspB遺伝子を検出する際に見られた低い頻度(400分の1)は、幾つかのクローン化された遺伝子が 5から7個の組換え体コスミドで確実に検出されるのと比較すると異常なものであった。hspB遺伝子を同定するために、3kbから4kbまでの大きさを持つ断片をエンドヌクレアーゼSau 3AによるpILL684コスミドDNAの部分制限により生成させ、精製し、プラスミドベクターpILL570 のBglII部位に連結した。100個のサブクローンのうち、xがポジティブクローンであった。このうち1つをさらに研究した(pILL689);それは2つのBglII制限酵素サイトにより広げられた3.15kbのインサートを持ち、その部分は詳細にマップされた( 図5参照)。PCR32P標識されたプローブを用いることにより、hspB遺伝子の5'末端がpILL689の632bpのHindIII−SphI中央の制限酵素断片に存在することが見い出された。これは、pILL689 組換え体プラスミド中にhspBの全遺伝子が存在することを期待できることを示している。
図5で示された3200bpのpILL689は、非対称的な制限酵素断片であるBglII−SphI、SphI−HindIII 、HindIII−BglIIをM13mp18及びM13mp19にクローニングすることにより配列決定した:それぞれのクローン化された断片は二本鎖のそれぞれで別々に配列決定した。16個のオリゴヌクレオチドプライマー(図1)を、解読の確認をするため、及び/または別々に配列決定された断片をオーバーラップする配列を作製するために合成した;これらは2本鎖DNAの配列決定分析におけるプライマーとして用いた。
i)H.ピロリ85P株の染色体中、ii)初めのコスミドpILL684中、及び iii)pILL684組換え体コスミドのSau 3A部分的制限酵素分解の結果生じた100個のサブクローン中の推定配列を標的とするために、2つのオリゴヌクレオチドを用いた遺伝子増幅によりIS5 の存在を検査した。その2つのオリゴヌクレオチドの1つはIS5 エレメントの内部に存在するもので、もう1つはIS5エレメントの下流に存在するものである(オリゴ#1及び#2、図6)。IS5はH.ピロリの染色体には存在せず、コスミドpILL684 を有する大腸菌株のごく初期のサブカルチャー中に存在していた。IS5 配列の全部もしくは一部を含んでいると推定される100個のpILL684サブクローン誘導体において、我々はIS5 の左末端に加えて、元来のhspA−hspB遺伝子クラスターの上流配列を探した。このスクリーニングは、異なったSau 3Aで部分的に生成されたサブクローンの制限酵素分析をすることにより行なった。これらの基準を満たしているプラスミドの1つ(pILL694)の制限酵素地図を図5に示す。IS5 の左末端側のヌクレオチド配列が決定された;IS5エレメントの16bpの逆方向反復配列の両端における4bpの重複CTAAの存在(図6)により、我々は、IS5エレメントは転移により最近取り込まれたことを確信することができた。その後、IS5エレメントのすぐ上流に位置する245個のヌクレオチド配列を決定した(図6に示す)。この配列は非コード領域からなり、その中には推定される共通の熱ショックプロモーター配列[heat shock promoter sequence]の存在が検出された;そこには完全に保存された-35領域(TAACTCGCTTGAA)と、一致の程度が低い-10領域(CTCAATTA)が存在した。組換え体コスミド中に存在するIS5 エレメントの両端に位置する配列に対応する2つのオリゴヌクレオチド(図2に示される#3と#4)を合成した;これらの2つのオリゴヌクレオチドはIS5配列が存在する場合にはXXXXbpの断片を増幅させるはずであり、IS5が存在しない場合にはある断片を増幅させるはずである。標的DNAとしてpILL684コスミド、pILL694プラスミド、及びH.ピロリ85P株染色体を用いたPCR反応の結果は予測に適合した(結果は記載せず)。さらにH.ピロリ染色体から得られたPCR産物の直接配列決定を行ない、図6(B)に示される再構築されたhspA−hspB上流配列が確認された。配列決定された全ての領域の遺伝子構成をさらに確認にするために、オリゴヌクレオチドの#5及び#6、並びに#7及び#8(図6)を用い、プラスミドpILL689 の遺伝子を増幅することにより2つのプローブを調製した;それらを、H.ピロリ85P株染色体のHindIII制限酵素消化物に対するあまり厳しくない条件下でのサザンハイブリダイゼーション実験において、プローブとして用いた。その結果、クローニング過程において検出可能な転位は他には存在しないことが明らかとなった(データは記載せず)。これらの実験により、H.ピロリ85P株の染色体中にhspB遺伝子のコピーは1つしか存在しないのに対して、サザンハイブリダゼーションによりhspA遺伝子の2つのコピーが検出されることを我々は示し得た。
pILL689 組換えプラスミドとpILL692 組換えプラスミド及びそれぞれのクローニングベクターpILL570とpACYC177が、ミニ細胞生産株である大腸菌p678-54への形質転換により導入された。pILL689とpILL692プラスミド(図5)は、2つのベクターにクローン化された、同じ3.15kbのインサートを有する。pILL570はポリクローニングサイトの上流に転写及び翻訳の終結点をもつ;pILL689内でのインサートの向きは、転写の終結点がIS5断片の上流に位置し、従ってhspA及びhspB遺伝子の上流に位置するような方法で作製された。見かけ上の分子量が60kDaと14kDaであるポリペプチドと同様に泳動した2つのポリペプチドがミニ細胞実験においてpILL689 及びpILL692 から明らかに検出されたが(結果は示さず)、一方それらは当該のベクターからは検出されなかった;これらの結果により、hspA及びhspB遺伝子はIS5エレメント内に位置するプロモーターから構造的に発現していることが示された。さらに、SDSゲル上で視認されたポリペプチドの量はそれぞれのベクターのコピー数に十分に一致していたが、一方で、2つのポリペプチドのバンドの強度は2つの遺伝子のポリシストロン性転写[polycistronic transcription ]を示唆していた。
大腸菌内のプラスミドpILL686 及びプラスミドpILL691 のhspA遺伝子もしくはhspB遺伝子内に、従来記述されているKmカセットを挿入することにより、遺伝子を2箇所で分断した。これは、エレクトロポーレーションによりH.ピロリ内で分断された遺伝子を元に戻すため、そして対立遺伝子の置換に関して選択するために行なった。結果として生じたpILL696 プラスミドは、C末端のアミノ酸配列の欠失に相当する、一部が欠けた形態のHspA蛋白質をコードしていた;そのプラスミドにおいて、Kmカセットは、Km遺伝子のプロモーターがhspBの下流遺伝子のプロモーターとして働くような方法で挿入された。pILL687 プラスミドとpILL688 プラスミドは、hspB遺伝子内でKmカセットをいずれかの向きで挿入することにより生じた。精製されたpILL687 プラスミド、pILL688 プラスミド及びpILL696 プラスミド(表2、図5)をエレクトロポーレーション実験に用いた際には、これらのどの構築物からも、H.ピロリN6 株のカナマイシン形質転換株を単離することはできなかった。一方ポジティブコントロールとして用いられたpSUS10プラスミドでは常に単離することができた。これらの結果により、H.ピロリのHspA及びHspB蛋白質はH.ピロリの生存に必須な蛋白質であることが示唆された。
パートIVの実験手順:
組換え融合蛋白質の発現と精製:
“結果”の項で示したようにpMAL- c2 ベクター内への2つの遺伝子のクローニングに引き続いて、以下に示すプライマーを用いてMalE−HspA及びMalE−HspB融合蛋白質を発現させた。
オリゴ#2 acgttctgcagTTTAGTGTTTTTTGTGATCATGACAGC
オリゴ#3 ccggagaattcGCAAAAGAAATCAAATTTTCAGATAGC
オリゴ#4 acgttctgcagATGATACCAAAAAGCAAGGGGGCTTAC
グルコース(30%)とアンプシリン(100μg/ml)を含む2Lのルリア培地に、融合プラスミドを含む一晩培養したMC1061株20mlを接種し、37℃で震盪培養した。培養液のOD600が0.5に達した時、IPTG(最終濃度で10mM)を添加し、細胞をさらに 4時間インキュベートした。細胞を遠心分離(5000rpm、30分間、4℃)により集め、プロテアーゼ阻害剤[ロイペプチン(2μM)- ペプスタチン(2μm)- PMSF( 1mM)- アプロチニン(1:1000希釈)]が添加された、10mMトリス−HCl、 200mM NaCl、1mM EDTAから成る 100mlのカラム緩衝液に再懸濁し、フレンチプレスに通した。遠心分離(10,000rmp、20分間、4℃)後、上澄み液を回収し、カラム緩衝液で希釈した(2倍)。予め平衡に達したアミロース樹脂(22×2.5cm)にのせる前に、溶解物を 0.2μmのニトロセルロースフィルターに通した。カラム緩衝液にて調製された10mMマルトースを用いて融合蛋白質を溶出して、融合蛋白質を含む画分を貯留し、蒸留水で透析し、凍結乾燥した。融合蛋白質をml当り凍結乾燥物 2mgの最終濃度で蒸留水に再懸濁させ、-20℃で保存した。調製物の濃度と純度は、ブラッドフォルド蛋白質分析[Bradford protein assay](sigma Chemicals)とSDS−PAGE分析により制御した。
pMAL−c2ベクターもしくは誘導組換えプラスミドのいずれかを含んでいる大腸菌MC1061細胞を、カーベニシリン存在下(100μg/ml)、100mlのルリアブロス中で生育した。遺伝子の発現はIPTGを用いて 4時間誘導した。細胞を遠心分離し、そのペレットを2mlの緩衝液A( 6M塩酸グアニジン、0.1M NaH2PO4、0.01トリス、pH 8.0)に再懸濁した。室温で1時間穏やかに撹拌した後、この懸濁液を10,000g、15分間、4℃で遠心分離した。予め緩衝液Aで平衡に達しているニッケル- ニトリロ三酢酸樹脂(Nickel-NTA, QIA express)のアリコート1.6mlを上清に加え、この混合物をカラムにのせる前に室温で1時間撹拌した。カラムは20mlの緩衝液A、次いで30mlの緩衝液B(8M尿素、0.1Mリン酸ナトリウム、0.01Mトリス−HCl、pH 8.0)で洗浄した。蛋白質は、pH 6.3(緩衝液C)、pH 5.9(緩衝液D)及びpH 4.5(緩衝液E)に調整された緩衝液Bと同等の緩衝液、並びに緩衝液F( 6M塩酸グアニジン、 0.2M酢酸)で連続的に溶出した。それぞれの画分の15μlを50μlのSDS緩衝液と混合し、SDSゲル上にのせた。
血清サンプルは40個体から得られた。そのうち28サンプルは、H.ピロリの培養で陽性であることと生検の組織学的な考察によりH.ピロリ感染患者であることが確認され、12サンプルは未感染患者であった。この血清は、R. J. Adamek(Bochum大学、ドイツ)の好意により提供を受けた。
ミニ・プロテインII・エレクトロフォレシス・セル[Mini PROTEAN II electrophoresis cell]中でのSDS−PAGEが終了した時点で、1時間、100Vに調節されたミニ・トランスブロット・トランスファー・セル[Mini Trans-Blot transfer cell](Bio-Rad)で蛋白質をニトロセルロース紙に(冷却しながら)転写した。免疫学的染色
[immunostaining]を、反応産物を視認するためにECLウェスタン・ブロッティング検出システム(Amersham)を用いたことを除いて、従来記述されているように(Ferreroら,1992) 行なった。H.ピロリ85P株の全細胞抽出液に対して生じたヒト血清とウサギ抗血清を、リン酸緩衝溶液(PBS、pH 7.4)中に調製された 1%(w/v)カゼインで1:1000及び 1:5000にそれぞれ希釈した。
以下の量の抗原を96穴プレート(Falcon 3072)に吸収させた:2.5μgの蛋白質MalE、5μgのMalE−HspA、もしくは 2.5μgのMalE−HspB。プレートを一晩、4℃にて放置し、その後ELISA洗浄溶液(EWS)[0.05%(v/v)のトゥィーン20[Tween 20]を含む1%のPBS]で 3回洗浄した。プレートを、 1%の粉末ミルクを添加されたEWS中において、37℃で、90分間インキュベーションすることにより飽和させた。ウェルを再びEWSで 3回洗浄し、その後振とう条件下において、ヒト血清(0.5%粉末ミルクを含むEWSで1:500希釈)の存在下で37℃、90分間穏やかに撹拌した。結合した免疫グロブリンは、ストレプトアビジンーペルオキシダーゼ(1:500 )
(Kirkegaard and Perry Lab.)と組み合わせたビオチニル化2次抗体(0.5%の粉末ミルクを添加したEWS中に希釈(1:1000)されたヤギの抗ヒトIgG、IgAもしくはIgM)と共に37℃で、90分間インキュベートすることにより検出した。結合したペルオキシダーゼは、基質であるクエン酸塩と過酸化水素との反応により検出した。プレートを暗条件下で室温にてインキュベートし、ELISAプレートレーダー 5分、15分、30分間隔で492nmでの吸光度を読み取った。30分後、最終濃度0.5Mになるまで塩酸を添加することにより反応を停止させた。
誘導しうるMalE−HspA及びHspB融合蛋白質を生産する組換えプラスミドの構築:
hspA及びhspBの全遺伝子をPCRにより増幅するために、オリゴヌクレオチド#1と#2(hspA)及び#3と#4(hspB)をそれぞれ用いた。PCR産物を電気溶出し、精製し、EcoRIとPstIで切断した。切断により生じた断片(それぞれ大きさとして360bp及び1600bp)を、次にそれぞれpILL933とpILL934と命名されたプラスミドを生じさせるために、EcoRI−PstIにより切断されたpMAL−c2ベクターに連結させた。IPTGによる誘導とアミロースカラム上での可溶性蛋白質の精製の後、予測された大きさの融合蛋白質(pILL933に関しては55kDa[図17]、及びpILL934に関しては100kDa)がSDS−PAGE上で視覚化された。これらの各々は、MalE蛋白質とHspポリペプチドのそれぞれの 2番目のアミノ酸との融合に相当する。融合蛋白質の発現収量は、2リットルのブロス培養液から調製された場合、MalE−HspAについては100mgであり、MalE−HspBについては20mgであった。
この融合蛋白質が依然として抗原性を有するか否かを決定するために、MalE蛋白質とH.ピロリ85P株の全細胞の抽出液に対して生じたウサギ抗血清を用いたウェスタンブロットによりそれぞれを分析した。どちらの融合蛋白質も、MalEに対する抗体(結果は示さず)、及び抗-H.ピロリ抗血清に対して免疫反応があった。抗-H.ピロリ抗血清は精製されたMalE蛋白質を認識しなかった(図18)。これらの結果により、融合蛋白質はそれらの抗原性を維持していることが示された;さらに、HspB蛋白質が免疫原性であることは知られているものの、HspAそれ自体がウサギにおいて免疫原性であるというこの事実はここで初めて示された。
IPTGでの誘導に引き続いて発現したMBP−HspA組換え蛋白質を、ニッケル親和性カラムでの一段階精製により細胞全体の抽出液から精製した。これに対して、MBP単独及びMBP−HspBはこの特性を示さなかった。図18は、pH 6.3でモノマーとして、またpH 4.5でモノマーとして溶出されたMBP−HspA蛋白質の一段階精製を示す。パネル7で見られる独特のバンドとパネル5 で見られる2つのバンドは、ともに抗HspAウサギ血清により特異的に認識された。これは、融合MBP−HspA蛋白質のニッケル結合特性が、ヒスチジンとシステイン残基が豊富であるHspAのC末端の配列に起因するかもしれないことを示唆した。
Claims (41)
- ヘリコバクター感染に対する抗体を誘発し得る免疫組成物であって、
i )ヘリコバクター・ピロリ由来のウレアーゼ構造ポリぺプチドの少なくとも1つのサブユニット、もしくはヘリコバクター・フェリスウレアーゼと反応する抗体によって認識されるそれらの断片、および/またはヘリコバクター・フェリス由来のウレアーゼ構造ポリぺプチドの少なくとも1つのサブユニット、もしくはヘリコバクター・ピロリウレアーゼと反応する抗体によって認識されるそれらの断片;
ii)および/またはヘリコバクター由来の熱ショック蛋白質(HSP)、すなわちシャペロニン、もしくは該蛋白質の断片、
を含有することを特徴とする免疫組成物。 - 防御抗体を誘発し得る請求項1に記載の免疫組成物。
- プラスミドpILL205 (CNCM I−1355)ureAおよび/またはureB遺伝子によってコードされるヘリコバクター・フェリスウレアーゼ構造ポリぺプチド、該ポリぺプチドと少なくとも90%の相同性を示すポリぺプチド、または少なくとも 6個のアミノ酸を有し、ヘリコバクター・ピロリウレアーゼと反応する抗体によって認識されるそれらの断片を含み、あるいはそれらからなる成分 (i)を包含する請求項1に記載の免疫原性組成物。
- ヘリコバクター・ピロリ由来のHSP、またはそれらの断片である成分(ii)を包含することを特徴とする請求項1に記載の免疫原性組成物。
- HSPが、プラスミドpILL689 (CNCM I−1356)のhspAおよび/またはhspBによって各々コードされるHSP Aおよび/またはHSP B、または該HSPと少なくとも75%の相同性を示すポリぺプチド、または少なくとも 6個のアミノ酸を有する、これらの蛋白質のいずれかもしくは両方の断片であることを特徴とする請求項1〜4のいずれか1項に記載の免疫原性組成物。
- ヘリコバクター感染、特にヘリコバクター・ピロリおよびヘリコバクター・フェリスに対する防御においてワクチンとして用いられる医薬組成物であって、生理学的に許容し得る賦形剤および、可能であればアジュバントとの組合せで、請求項1〜5のいずれか1項に記載の免疫原性組成物を包含することを特徴とする医薬組成物。
- プラスミドpILL205 (CNCM I−1355)のウレアーゼ遺伝子クラスターによってコードされるヘリコバクター・フェリスポリぺプチドの少なくとも1つを含むことを特徴とする蛋白質様物質であって、構造およびアクセサリーウレアーゼポリぺプチド、または該ポリぺプチドと少なくとも90%の相同性を有するポリぺプチド、またはそれらの断片を含む蛋白質様物質。
- 図3に示されるureAおよび/またはureBの遺伝子産物、または少なくとも 6個のアミノ酸を有する断片、もしくは少なくとも90%の相同性を有する該遺伝子産物の変異体からなり、またはこれらを包含することを特徴とする請求項7に記載の蛋白質様物質であって、該断片および該変異体が、ヘリコバクター・ピロリウレアーゼと反応する抗体によって認識される蛋白質様物質。
- 図9に示されるureIの遺伝子産物、または少なくとも 6個のアミノ酸を有するそれらの断片、または少なくとも75%の相同性を有する該遺伝子産物の変異体からなり、あるいはそれらを包含する請求項7に記載の蛋白質様物質であって、該断片および該変異体が、残余のウレアーゼ“アクセサリー”遺伝子産物の存在下において、ureAおよびureB遺伝子産物を活性化する能力を有する蛋白質様物質。
- (i) 請求項6〜9のいずれか1項に記載される蛋白質様物質をコードする少なくとも1つの配列;または (ii) 配列 (i) に相補的な配列;
または (iii) 過酷な条件下において、配列 (i) もしくは (ii) とハイブリダイズし得る配列;
または (iv) 少なくとも10個の連続したヌクレオチドを含む配列 (i)、(ii) もしくは (iii) のいずれかの断片、
を包含することを特徴とする核酸配列。 - プラスミドpILL205 (CNCM I−1355)の配列、例えば図3の配列、特にureAの遺伝子産物およびureBをコードする配列、または図9(ureI)の配列、または過酷な条件下でこれらの配列とハイブリダイズし得る配列、またはこれらの配列に相補的な配列、またはこれらの配列の少なくとも10個の連続したヌクレオチドを含む断片を包含することを特徴とする請求項9に記載の核酸配列。
- 請求項10または11に記載の核酸配列を包含することを特徴とする発現ベクター。
- プラスミドpILL205 (CNCM I−1355)。
- 核酸増幅反応におけるプライマーとしての利用に適しているオリゴヌクレオチドであって、請求項10または11に記載の配列の10ないし 100個の連続したヌクレオチドを包含することを特徴とするオリゴヌクレオチド。
- 適切な標識手段を有する、請求項9〜10のいずれか1項に記載の配列を包含することを特徴とするヌクレオチドプローブ。
- 請求項12〜13に記載の発現ベクターによって安定に形質転換された原核もしくは真核宿主細胞。
- 請求項8〜10のいずれか1項に記載の蛋白質様物質にたいするモノクローナルもしくはポリクローナル抗体、またはそれらの断片であって、ヘリコバクター・フェリス物質に対して特異的であるか、あるいはヘリコバクター・ピロリのウレアーゼ遺伝子クラスターの遺伝子産物と交叉反応するかのいずれかであることを特徴とする抗体またはそれらの断片。
- ヘリコバクター・フェリス ureAおよび/またはureB遺伝子産物、並びにヘリコバクター・ピロリ ureAおよび/またはureB遺伝子産物の両者を認識することを特徴とする請求項18項に記載のモノクローナルまたはポリクローナル抗体。
- ヒトおよび動物における使用に適した、ヘリコバクター感染、特にヘリコバクター・ピロリおよびヘリコバクター・フェリスに対するワクチンの調製への、請求項1に記載の免疫原性組成物の使用。
- ヒトまたは動物での、ヘリコバクター、特にヘリコバクター・ピロリ、ヘリコバクター・ヘイルマンニーおよびヘリコバクター・フェリスによる感染を治療するための治療組成物における、請求項17または18に記載の抗体の使用。
- 請求項6に記載の医薬組成物の製造方法であって請求項16に記載の形質転換された微生物を培養し、ヘリコバクターウレアーゼポリぺプチド物質、および適用可能である場合にはHSP物質をも収集して精製し、かつこれらの物質を適切な賦形剤、アジュバントおよび、任意に、他の添加剤と組合わせることを特徴とする製造方法。
- 任意に遺伝子増幅反応を行なった後の、生物学的試料におけるヘリコバクターによる感染のイン・ビトロ検出への、請求項15に記載のヌクレオチド配列の使用。
- ヘリコバクター感染のイン・ビトロ検出のためのキットであって:
−請求項15に記載のヌクレオチドプローブ;
−ヘリコバクターの核酸と該プローブとのハイブリダイゼーション反応を行なうための適切な培地;
−形成されるあらゆるハイブリッドを検出するための試薬、
を包含することを特徴とするキット。 - ヘリコバクター・ピロリ由来のウレアーゼ構造ポリぺプチドのサブユニットまたはそれらの断片、請求項1〜3、5、7〜9に記載のヘリコバクター・フェリス由来のウレアーゼ構造ポリぺプチドのサブユニットまたはそれらの断片の少なくとも1つを含む融合もしくは混合蛋白質を包含することを特徴とする蛋白質様物質。
- 動物を、請求項1〜5に記載の免疫原性組成物、または請求項7〜9に記載の蛋白質様物質もしくは断片、または請求項36に記載の融合もしくは混合蛋白質で免疫することにより得られる、精製された抗体もしくは血清。
- 少なくとも請求の範囲第37項に記載の精製された抗体もしくは血清を含有し、かつ該抗体を投与するための適切な媒体もしくは賦形剤、または該抗体の標識もしくは検出手段を任意に包含するキット。
- ヘリコバクター感染に対する保護においてワクチンとして使用するための薬学的組成物であって、
ヘリコバクター感染に対する抗体を誘発することができる免疫原性組成物であって、
i )配列番号4に記載した配列の、プラスミドpILL689 (CNCM I−1356)のhspAによって各々コードされるHSP A、または
ii)前記HSP Aのポリペプチドの変異体であって、1つもしくは数個のアミノ酸が置換され、または欠失され、または挿入されたアミノ酸配列を有し、前記変異体は、活性なウレアーゼを発現することができる微生物においてウレアーゼ活性を増強するHSP Aのポリペプチドの変異体、
のいずれかを含み、該免疫原性組成物は、保護抗体を誘導することができることを特徴とする免疫原性組成物を含むことを特徴とする薬学的組成物。 - 請求項27に記載の免疫原性組成物を、生理学的に許容される賦形剤およびおそらくアジュバントと組み合わせて含むことを特徴とする、ヘリコバクター感染に対する保護においてワクチンとして使用するための薬学的組成物。
- 蛋白質様物質であって、少なくとも
(i) 以下のアミノ酸配列を有するヘリコバクター・ピロリの熱ショック蛋白質(HSP)A:
met lys phe gln pro leu gly glu arg val leu val glu arg leu glu glu glu
asn lys thr ser ser gly ile ile ile pro asp asn ala lys glu lys pro leu met
gly val val lys ala val ser his lys ile ser glu gly cys lys cys val lys glu gly
asp val ile ala phe gly lys tyr lys gly ala glu ile val leu asp gly val glu tyr
met val leu glu leu glu asp ile leu gly ile val gly ser gly ser cys cys his
thr gly asn his asp his lys his ala lys glu his glu ala cys cys his asp his
lys lys his
(ii) 前記HSP Aの断片であって、(i)に記載のアミノ酸配列の少なくとも6個のアミノ酸を有する断片;または、
(iii) 前記HSP Aと少なくとも75%の相同性を有するポリペプチドを含み、またはからなり、
前記断片またはポリペプチドの変異体は、活性なウレアーゼを発現することができる微生物においてウレアーゼ活性を増強するか、および/またはウレアーゼをブロックして、HSP Aによって通常示される効果を増強する抗体を生成することができることを特徴とする蛋白質様物質。 - 請求項29に記載の蛋白質様物質であって、
(i)配列番号4に記載したHSP Bのアミノ酸配列を有するヘリコバクター・ピロリのHSP B:
(ii) 前記HSP Bの断片であって、(i)に記載のアミノ酸配列の少なくとも6個のアミノ酸を有する断片
(iii) 前記HSP Bと少なくとも75%の相同性を有するポリペプチドを含み、またはからなり、
前記断片またはポリペプチドの変異体は、活性なウレアーゼを発現することができる微生物においてウレアーゼ活性を増強するか、および/またはウレアーゼをブロックして、HSP Bによって通常示される効果を増強する抗体を生成することができることを特徴とする蛋白質様物質。 - 請求項30または31に記載の蛋白質様物質であって、前記HSP AまたはHSP Bポリペプチド変異体は、対応する野生型の配列と少なくとも80%の相同性を有する蛋白質様物質。
- 請求項29〜31のいずれか1項に記載の蛋白質様物質に対する抗体またはその断片であって、請求項29に記載のヘリコバクター・ピロリのHspAに対して特異的であるか、あるいはヘリコバクター以外のバクテリアに由来するGroES様蛋白質と免疫学的に交叉反応するかのいずれかであることを特徴とする抗体またはその断片。
- HSP AのC末端配列を特異的に認識することを特徴とする、請求項32に記載の抗体。
- ヒトおよび動物において使用するために適した、ヘリコバクター・ピロリ感染に対するワクチンの製造方法であって、請求項27に記載の免疫原性組成物の使用を含む方法。
- 前記ワクチンが、ヘリコバクター・ピロリおよびヘリコバクター・フェリス感染に対して、ヒトおよび動物において使用するために適した、請求項34に記載の方法。
- ヒトおよび動物において、ヘリコバクターによる感染を治療するための治療的組成物の製造方法であって、請求項32または33に記載の抗体の使用を含む方法。
- 前記治療的組成物が、ヘリコバクター・ピロリ、ヘリコバクター・ハイルマニー(Heilmannii)、およびヘリコバクター・フェリスによる感染を治療することが意図される、請求項36に記載の方法。
- 請求項27または28に記載の薬学的組成物の製造方法であって、プラスミドpILL689で安定に形質転換された微生物を培養し、プラスミドpILL689によって提供されるヘリコバクターHSP物質を収集して精製し、およびこれらの物質を適切な賦形剤、アジュバント、および、任意にその他の添加剤と組合わせることを特徴とする製造方法。
- 請求項4に記載の薬学的組成物を、または請求項29に記載の蛋白質様物質もしくは断片を動物に免役することによって得られることを特徴とする血清であって、前記血清は、以下のアミノ酸配列を有するHSP Aシャペロニンに特異的であるか、またはヘリコバクター・ピロリ以外のバクテリアに由来するGroES様蛋白質と免疫学的に交叉反応する血清:
met lys phe gln pro leu gly glu arg val leu val glu arg leu glu glu glu
asn lys thr ser ser gly ile ile ile pro asp asn ala lys glu lys pro leu met
gly val val lys ala val ser his lys ile ser glu gly cys lys cys val lys glu gly
asp val ile ala phe gly lys tyr lys gly ala glu ile val leu asp gly val glu tyr
met val leu glu leu glu asp ile leu gly ile val gly ser gly ser cys cys his
thr gly asn his asp his lys his ala lys glu his glu ala cys cys his asp his
lys lys his。 - 請求項39に記載の血清から得られる生成された抗体であって、前記生成された抗体は、以下のアミノ酸配列を有するHSP Aシャペロニンに特異的である抗体:
met lys phe gln pro leu gly glu arg val leu val glu arg leu glu glu glu
asn lys thr ser ser gly ile ile ile pro asp asn ala lys glu lys pro leu met
gly val val lys ala val ser his lys ile ser glu gly cys lys cys val lys glu gly
asp val ile ala phe gly lys tyr lys gly ala glu ile val leu asp gly val glu tyr
met val leu glu leu glu asp ile leu gly ile val gly ser gly ser cys cys his
thr gly asn his asp his lys his ala lys glu his glu ala cys cys his asp his
lys lys his。 - 少なくとも請求項40に記載の生成された抗体、および抗体を投与するための適切な媒体または賦形剤、並びに任意に、抗体のラベリングまたは検出手段を含むキット。
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